Tuyển chọn một số chủng probiotic tiềm năng có hoạt tính đối kháng với vibrio parahaemolyticus gây bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng (litopenaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYẾN THỊ CHÍNH

TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG PROBIOTIC TIỀM NĂNG
CÓ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH CHẾT SỚM Ở TÔM THẺ
CHÂN TRẮNG (LITOPENAEUS VANNAMEI)”

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ CHÍNH

TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG PROBIOTIC TIỀM NĂNG
CÓ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH CHẾT SỚM Ở TÔM THẺ
CHÂN TRẮNG (LITOPENAEUS VANNAMEI)”
LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngành đào tạo:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60420201

Quyết định giao đề tài:

927/QĐ – ĐHNT ngày 26/09/2014

Quyết định thành lập HĐ:

77/QĐ-ĐHNT ngày 01/02/2016
09/3/2016

Ngày bảo vệ:
Người hướng dẫn khoa học:
TS. PHẠM THU THỦY
Chủ tịch hội đồng
PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa
Khoa sau đại học

KHÁNH HÒA –2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Tuyển chọn một số chủng probiotic tiềm
năng có hoạt tính đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh chết sớm ở tôm thẻ
chân trắng (Litopenaeus vannamei)” là kết quả nghiên cứu nghiêm túc của bản thân tôi
trong suốt thời gian từ năm 2014 – 2015 dưới sự hướng dẫn tận tình của Thầy Cô hướng
dẫn. Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào.
Khánh Hòa, ngày 24 tháng 03 năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Chính

iii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường,
và Khoa Sau đại học, Trường Đại học Nha Trang đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn,
chỉ dạy và truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Duy đã nhiệt tình
giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Qua đây, tôi cũng xin
gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Thị Thùy Giang đã giúp đỡ tôi trong thử nghiệm in
vivo trên tôm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học & Môi
trường và tập thể lớp CHSH2013 đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, động viên trong quá
trình học tập, nghiên cứu và các hoạt động khác tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Công ty TNHH Nghiên cứu, sản xuất giống và dịch vụ
Nuôi trồng Thủy sản Cát Lợi đã tạo các điều kiện về cơ sở vật chất và những ý kiến
đóng góp quý báu để tôi thực hiện tốt đề tài tốt nghiệp của mình.
Con xin gửi tới bố mẹ sự biết ơn sâu sắc. Bố mẹ luôn bên cạnh động viên, ủng hộ
và yêu thương con nhất. Con sẽ luôn cố gắng sống tốt, xứng đáng với niềm tin yêu của
bố mẹ. Con xin cảm ơn bố mẹ!
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Khánh Hòa, ngày 29 tháng2 năm 2016
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Chính

iv


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... ix
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ..............................................................................................x
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
1.1. Probiotic và cơ chế hoạt động ............................................................................................ 4
1.1.1. Loại trừ cạnh tranh..........................................................................................4
1.1.2. Sản xuất các chất kháng vi sinh vật ................................................................5
1.1.3. Điều hòa miễn dịch .........................................................................................6
1.1.4. Sản sinh enzyme và các sản phẩm trao đổi chất khác ....................................7
1.1.5. Ức chế cơ chế kiểm soát mật độ tới hạn (quorum sensing) ...........................7
1.2. Tiêu chuẩn tuyển chọn vi sinh vật probiotic....................................................................... 8
1.2.1. Tiêu chuẩn sức sống và chiếm lĩnh ruột .........................................................8
1.2.2. Tiêu chuẩn sức khỏe động vật chủ .................................................................8
1.2.3. Tiêu chuẩn sản xuất ........................................................................................9
1.2.4. Tiêu chuẩn an toàn ..........................................................................................9
1.3. Ứng dụng của probiotic trong điều trị các bệnh ở tôm ...................................................... 9
1.4. Tình hình nghiên cứu dịch bệnh EMS gây bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng .......... 11
1.4.1. Nguyên nhân bệnh EMS ...............................................................................11
1.4.2. Triệu chứng của tôm bị bệnh EMS ...............................................................13
1.4.3. Vấn đề phòng và điều trị bệnh EMS ............................................................14
1.4.4. Tình hình nghiên cứu dịch bệnh EMS ..........................................................18

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................21
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................................ 21
2.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ......................................................................................... 22
2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................................ 22
2.3.1. Chủng vi khuẩn chỉ thị .................................................................................22
2.3.2. Tôm thẻ chân trắng ......................................................................................23
2.3.4. Nguồn nước dùng cho thí nghiệm nuôi tôm ................................................24
v


2.3.5. Thức ăn dùng cho tôm thí nghiệm nuôi tôm ................................................25
2.3.6. Hóa chất, môi trường ...................................................................................26
2.3.7. Thiết bị chuyên dụng....................................................................................28
2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 28
2.4.1. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn ...............................................28
2.4.2. Xác định khả năng chịu muối mật ................................................................28
2.4.3. Xác định khả năng chịu pH thấp ..................................................................29
2.4.4. Xác định hoạt tính kháng khuẩn ..................................................................29
2.4.5. Định danh chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS trên tôm thẻ chân
trắng ......................................................................................................................29
2.4.6. Bố trí các thí nghiệm in vivo với tôm nuôi ..................................................29
2.4.7. Xác định chiều dài cơ thể và khối lượng trung bình của tôm ......................31
2.4.8. Xác định tỷ lệ sống và tỷ lệ chết tích lũy của tôm .......................................31
2.3.9. Xử lý số liệu..................................................................................................31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................32
3.1. Khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn nghiên cứu ........................................ 32
3.2. Khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn nghiên cứu.................................................. 34
3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu ........................................... 36
3.3. Kết quả định danh chủng V. parahaemolyticus XN9 gây bệnh EMS trên tôm thẻ chân
trắng ............................................................................................................................................ 39

3.4. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn bổ sung vào thức ăn lên sinh trưởng về chiều dài và
khối lượng của tôm thí nghiệm ................................................................................................. 39
3.5. Tỷ lệ chết tích lũy trung bình của tôm sau khi thử thách vi khuẩn V. parahaemolyticus
gây bệnh EMS............................................................................................................................ 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................46
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
KÝ HIỆU

CHỮ VIẾT TẮT

AHPNS

Acute hepatopancreatic nerosis syndrome (Hội chứng
gan tụy cấp tính)

ĐC
EMS
NT
FAO

Đối chứng
Early mortality syndrome (Hội chứng chết sớm)
Nghiệm thức
Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương

thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

TN

Thí nghiệm

W

Weight (Khối lượng)

CFU

Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

OD

Optical Density (Mật độ quang)

GRAS

Generally recognized as safe (Được công nhận rộng rãi
là an toàn)

TCBS

Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose

MB

Marine Broth

MRS

de Man – Rogosa – Sharpe

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách các chủng vi khuẩn nghiên cứu .....................................................21
Bảng 2.2. Danh sách các chủng vi khuẩn chỉ thị .............................................................23
Bảng 2.3. Các yếu tố môi trường trong quá trình nuôi thí nghiệm..................................24
Bảng 3.1. Khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn nghiên cứu ........................33
Bảng 3.2. Khả năng chịu axit của Lactobacillus plantarum T8 và T13 ..........................35
Bảng 3.3. Kết quả định danh chủng XN9 theo kit API 20E ............................................39

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc mô tôm thẻ bị bệnh chết sớm ...........................................14
Hình 2.1. Hệ thống bể compozit 500 lit dùng cho thí nghiệm ......................................25
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thời gian các thí nghiệm in vivo.................................................29
Hình 3.1. Vòng kháng khuẩn của các chủng T8 và T13 với chủng vi khuẩn chỉ thị XN9
............................................................................................................................37
Hình 3.2. Vòng kháng khuẩn của các chủng T8 và T13 với một số chủng vi khuẩn chỉ
thị khác ...............................................................................................................38
Hình 3.3. Đường kính vòng kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum kháng chủng V.
parahaemolyticus XN9.......................................................................................38
Hình 3.4. Kích thước trung bình của tôm ở các nghiệm thức sau các tuần nuôi .........40

Hình 3.5. Khối lượng trung bình của tôm ở các nghiệm thức sau các tuần nuôi ..........40
Hình 3.6. Tỷ lệ % tôm chết tích lũy trung bình ở các nghiệm thức sau cảm nhiễm chủng
Vibrio parahaemolyticus XN9 ở mật độ 105 CFU/ml ........................................42
Hình 3.7. Tỷ lệ tôm chết tích lũy trung bình (%) ở các nghiệm thức sau cảm nhiễm vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus XN9 ở mật độ 106 CFU/ml .............................43

ix


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tôm thẻ chân trắng được đưa vào Việt Nam năm 2001 và được nuôi thử nghiệm ở
3 công ty tại Việt Nam. Từ năm 2008, diện tích và sản lượng tôm thẻ chân trắng không
ngừng được tăng lên. Bên cạnh những thành quả đạt được, ngành nuôi tôm Việt Nam
đang phải đối mặt với nhiều khó khăn. Trước những áp lực cạnh tranh gay gắt của cơ
chế thị trường, một bộ phận người nuôi chạy theo lợi nhuận đã lạm dụng nhiều loại
thuốc, hóa chất… làm ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng kháng dịch bệnh và khả năng
hấp thu của tôm, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất thu hoạch. Cùng với sự gia
tăng diện tích nuôi, lượng chất thải từ các ao nuôi được thải ra ngoài môi trường sau mỗi
vụ nuôi ngày càng tăng, làm cho môi trường nước, không khí bị ngày càng bị ô nhiễm
nặng, dịch bệnh xảy ra và lây lan khó kiểm soát. Trong số các dịch bệnh gây chết hàng
loạt hiện nay, hội chứng chết sớm EMS do tác nhân vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây ra trên tôm nuôi ảnh hưởng nặng nề tới năng suất, sản lượng của nghề nuôi tôm
chân trắng. Vì vậy, việc nghiên cứu tuyển chọn một số chủng probiotic tiềm năng có hoạt
tính đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS ở tôm thẻ chân trắng là rất cấp
thiết.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tuyển chọn một số chủng probiotic tiềm
năng có hoạt tính đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS ở tôm thẻ chân
trắng trong điều kiện in vitro và in vivo.
Mục tiêu của đề tài:


Tuyển chọn một số chủng probiotic có nguồn gốc từ Việt Nam có khả năng chịu

axit, chịu muối mật và hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh EMS trên tôm thẻ
chân trắng trong điều kiện in vitro và in vivo.


Định danh chủng vi khuẩn gây bệnh EMS trên tôm thẻ chân trắng phân lập từ

tôm bị bệnh nuôi ở Ninh Thuận.
Để đạt được mục tiêu này chúng tôi tiến hành các thử nghiệm in vitro bao gồm: khả năng
chịu axit bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường có pH khác nhau, khả năng chịu
muối mật bằng phương pháp xác định khả năng mọc khuẩn lạc sau khi ủ trong môi trường
có bổ sung muối mật với nồng độ khác nhau và hoạt tính kháng của các chủng vi khuẩn thí
nghiệm với vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Đồng thời, chúng
tôi tiến hành định danh chủng vi khuẩn gây bệnh EMS có độc lực mạnh nhất.
x


Sau cùng, các chủng probiotic được lựa chọn ở trên được xác định hoạt tính in vivo
bằng cách bổ sung vào thức ăn nuôi tôm, tiến hành theo dõi khả năng sinh trưởng và tỷ lệ
chết của tôm khi cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh.
Kết quả chúng tôi đã thu được 27 chủng vi khuẩn thí nghiệm cho thấy có 17/27
chủng chịu muối mật 0,1%. Trong số 17 chủng vi khuẩn này có 2 chủng Lactobacillus
plantarum T8 và T13 chịu pH 2 trong 1 h và pH 3, pH 4 sau 2 h. Thử nghiệm khảo sát
khả năng kháng khuẩn của 27 chủng vi khuẩn thí nghiệm cũng cho thấy chỉ có 2 chủng
(T8, T13) có hoạt tính kháng với các chủng Vibrio gây bệnh EMS phân lập tại Việt Nam.
Trong số các chủng Vibrio gây bệnh thì chủng XN9 có độc tính cao nhất và được xác
nhận bằng kit API 20E thuộc loài Vibrio parahaemolyticus.
Sau khi tuyển chọn trong điều kiện in vitro, 2 chủng Lactobacillus plantarum T8 và

T13 được sử dụng cho nghiên cứu in vivo tiếp theo. Khi bổ sung chủng probiotic
Lactobacillus plantarum T8 vào thức ăn của tôm chân trắng Litoenaeus vannamei liên
tục trong 3 tuần đã có tác dụng làm tăng sinh trưởng về chiều dài và khối lượng của loài
tôm này sau 12 tuần. Chủng T13 không thể hiện tác dụng có lợi này trong điều kiện
tương tự.
Tôm chân trắng khi được dùng loại thức ăn tổng hợp (hiệu Thăng Long) bổ sung
sinh khối T8 và T13 liên tục trong 3 tuần đã có tác dụng làm giảm tỷ lệ chết khoảng 20
– 28% sau khi cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus XN9 ở mật độ 105 – 106 CFU/ml
sau 48 h và 24 h tương ứng.
Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học về các hoạt tính sinh học
của vi khuẩn probiotic dùng cho động vật thủy sản, mở ra tiềm năng sử dụng công nghệ
probiotic trong điều trị bệnh EMS ở tôm. Chủng T8 và T13 trong nghiên cứu này có thể
được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản để điều trị bệnh EMS gây bệnh trên tôm thẻ
chân trắng, góp phần dần thay thế sử dụng kháng sinh và các hóa chất bị cấm hoặc hạn
chế sử dụng.
Từ khóa: EMS; Lactobacillus plantarum, Litopenaeus vannamei; probiotic; Vibrio
parahaemolyticus.

xi



LỜI MỞ ĐẦU
Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) bắt đầu được nuôi vào khoảng những
năm 1990 (FAO Fisherry Statistic, 2011). Đến năm 1992, chúng đã được nuôi phổ biến
trên thế giới, nhưng chủ yếu tập trung ở các nước Nam Mỹ (Wedner & Rosenberry,
1992). Tôm thẻ chân trắng được đưa vào Việt Nam năm 2001 và được nuôi thử nghiệm
tại 3 công ty tại Việt Nam. Từ năm 2008, diện tích và sản lượng tôm thẻ chân trắng
không ngừng được tăng lên. Hiện nay diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng tập trung chủ
yếu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (chiếm khoảng 94% diện tích của cả nước). Cùng với

tăng nhanh về diện tích và sản lượng thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm dẫn đến tình
hình dịch bệnh xảy ra nhiều hơn. Đặc biệt vấn đề dịch bệnh do vi sinh vật gây ra ảnh
hưởng rất lớn đến tính ổn định và năng suất nuôi tôm. Chúng làm giảm năng suất, tăng
tỷ lệ chết và làm giảm chất lượng thịt, cũng như giảm mức độ an toàn thực phẩm của
sản phẩm gây thiệt hại lớn. Gần đây, việc nuôi tôm trên khắp thế giới thường xuyên bị
ảnh hưởng bởi các bệnh do vi khuẩn, gây ra tổn thất nặng nề.
Vi sinh vật gây bệnh liên quan đến các bệnh dịch thường là virus, vi khuẩn, tảo,
nấm và ký sinh trùng đơn bào. Trong đó điển hình là nhóm vi khuẩn Vibrio, đặc biệt là
Vibrio parahaemolyticus đã được chứng minh là tác nhân gây bệnh chết sớm ở tôm sú
và tôm thẻ chân trắng. Để kiểm soát vi sinh vật gây hại, phương pháp truyền thống là
dùng các hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh. Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc kháng sinh
và sự thiếu hiểu biết về kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nói chung đã gây ảnh
hưởng xấu tới sức khỏe động vật nuôi, môi trường sinh thái và đặc biệt là tạo ra các
chủng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh và tăng
nguy cơ nhiễm khuẩn có khả năng kháng thuốc cho con người, động vật và tồn dư trong
thịt động vật thủy sản (Brown, 1989).
Việc sử dụng probiotic để kiểm soát mầm bệnhvà tăng cường sức khỏe động vật
thông qua một loạt các cơ chế, đang ngày càng được xem như là một giải pháp thay thế
cho điều trị kháng sinh. Sử dụng các chế phẩm probiotic trong nuôi thủy sản nói chung
và trong nuôi tôm nói riêng ở nước ta là một xu hướng tích cực và ngày càng mở rộng,
dựa trên cơ sở khoa học của việc sử dụng các chế phẩm vi sinh để tạo được sự cân bằng
hệ vi sinh vật đường ruột, nâng cao sức khỏe của động vật, cải thiện môi trường nuôi và
khống chế mật độ vi sinh gây bệnh (Farzanfar, 2006).
1


Một trong những bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới nghề nuôi tôm hiện nay là bệnh
chết sớm. Bệnh chết sớm ‘‘early mortality syndrome’’ (EMS) hay còn gọi là bệnh hoại tử
gan tụy cấp tính AHPNS /EMS xảy ra trên tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng
(Litopenaeus vannamei), đã được báo cáo lần đầu tiên tại Trung Quốc vào năm 2010 và sau

đó lan rộng ra các nước Việt Nam, Thái Lan và Malaysia (FAO, 2013).
Tác nhân của bệnh EMS được báo cáo do Vibrio parahaemolyticus (Tran và cs,
2013). Tác nhân vi khuẩn được truyền bằng đường miệng và dẫn qua đường tiêu hóa
của tôm, tạo ra một chất độc phá hủy mô và hủy hoại cơ quan tiêu hóa của tôm là gan
tụy. Nghiên cứu cũng chỉ ra EMS không ảnh hưởng đến con người. Ngoài ra, nghiên
cứu trên chỉ mô tả nguyên nhân của bệnh EMS. Vì vậy, các chiến lược để điều trị bệnh
này rất cần thiết và cấp bách.
Hiện nay, chưa có biện pháp trị bệnh EMS, chiến lược chủ yếu tập trung vào việc
kiểm soát sự có mặt hoặc hoạt động của vi khuẩn Vibrio nhằm giảm nguy cơ bùng phát
của EMS. FAO (2013) khuyến cáo tẩy uế toàn bộ nền đáy ao nuôi và nguồn nước để
tiêu diệt mầm bệnh EMS. Các chiến lược quản lí hệ vi sinh vật có thể là chìa khóa để
giảm thiểu nguy cơ của sự bùng phát EMS. FAO khuyến nghị nuôi tôm postlarvae trong
các hệ thống với hệ vi sinh vật điều chỉnh (như các hệ thống nước sạch giàu vi tảo và
các hệ thống nước được điều chỉnh vi sinh vật), đó là những môi trường sơ cấp làm giảm
sự phát sinh của EMS.
Do đó, việc nghiên cứu tuyển chọn một số chủng probiotic tiềm năng có hoạt tính
đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS ở tôm thẻ chân trắng là rất cấp
thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Vì vậy, dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Thu
Thủy, tôi đã chọn đề tài: “Tuyển chọn một số chủng probiotic tiềm năng có hoạt tính
đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng
(Litopenaeus vannamei)”.
Đề tài thực hiện nhằm những mục tiêu sau đây:
i. Tuyển chọn một số chủng probiotic có nguồn gốc từ Việt Nam có khả năng chịu axit,
chịu muối mật và hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh EMS trên tôm thẻ chân
trắng trong điều kiện in vitro và in vivo.
ii. Định danh chủng vi khuẩn gây bệnh EMS trên tôm thẻ chân trắng phân lập từ tôm bị
bệnh nuôi ở Ninh Thuận.
2

Các nội dung chính của đề tài:
1. Xác định khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2. Xác định khả năng chịu acid của các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
3. Xác định hoạt tính đối kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của các chủng
vi khuẩn nghiên cứu.
4. Định danh chủng vi khuẩn gây bệnh EMS phân lập từ tôm bị bệnh EMS nuôi ở
Ninh Thuận.
5. Xác định hoạt tính probiotic in vivo trên tôm thẻ chân trắng trong điều kiện thí
nghiệm.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Ý nghĩa khoa học
Việc nghiên cứu tuyển chọn một số chủng probiotic tiềm năng có hoạt tính đối
kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS nhằm cung cấp dữ liệu khoa học về
các hoạt tính sinh học của vi khuẩn probiotic dùng cho động vật thủy sản, mở ra tiềm
năng sử dụng công nghệ probiotic trong điều trị bệnh EMS ở tôm.
- Ý nghĩa thực tiễn
Chủng T8 và T13 trong nghiên cứu này có thể được ứng dụng trong nuôi trồng
thủy sản để điều trị bệnh EMS gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng, góp phần dần thay thế
sử dụng kháng sinh và các hóa chất bị cấm hoặc hạn chế sử dụng.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Probiotic và cơ chế hoạt động
Probiotic bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (for life). Theo
định nghĩa của Tổ chức Y tế thế giới WHO và Tổ chức lương nông thế giới FAO (2001)
thì Probiotic là “những chất lợi khuẩn” bao gồm các vi sinh vật sống được dùng theo
đường tiêu hóa với hàm lượng nhất định làm cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột có lợi
cho sức khỏe người và động vật. Theo Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2015) việc tăng

cường khả năng chống xâm nhập và tác dụng ức chế trực tiếp đối với các vi khuẩn gây
bệnh là hai nhân tố quan trọng giúp cho probiotic làm giảm sự ảnh hưởng cũng như thời
gian nhiễm bệnh của các vi khuẩn gây bệnh. Các chủng probiotic thể hiện khả năng ức
chế vi khuẩn gây bệnh trong cả các thử nghiệm in vitro và in vivo thông qua một số cơ
chế khác nhau.
1.1.1. Loại trừ cạnh tranh
Trong sinh thái học, nguyên lý loại trừ cạnh tranh hay còn gọi là định luật Gause,
cho rằng hai loài cạnh tranh vì cùng một nguồn sống thì không thể cùng tồn tại nếu các
yếu tố sinh thái khác là không đổi. Khi một trong hai loài có những lợi thế nhỏ thì sau
đó có thể chiếm ưu thế trong dài hạn. Một trong hai đối thủ cạnh tranh sẽ luôn phải vượt
qua đối thủ còn lại, dẫn đến sự loại trừ của một trong hai đối thủ cạnh tranh này hoặc
dẫn tới sự thay đổi tiến hóa hoặc tập tính để chuyển sang một ổ sinh thái khác nhằm
giảm áp lực cạnh tranh.
Đối với vi sinh vật probiotic trong hệ vi sinh vật đường ruột, cạnh tranh loài trừ là
đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật. Hình thức cạnh tranh loại trừ
thường thấy ở các vi sinh vật trong ruột là cạnh tranh vị trí bám dính. Các vi sinh vật
probiotic cư trú và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám
dính của các vi sinh vật khác như E. coli, Samonella… Một số nấm men probiotic
(Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii) không chỉ cạnh tranh vị trí bám dính của các
vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại)
thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm
mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002).

4


Hơn nữa, probiotic còn có khả năng cạnh tranh chất dinh dưỡng, chẳng hạn như
sự hấp thụ các monosaccarit của các vi sinh vật probiotic có thể làm giảm sự phát triển
của Clostridium difficile gây bệnh tiêu chảy trên vật nuôi bởi vì sự phát triển của
Clostridium difficile phụ thuộc vào các monosaccarit này.

Cơ chế cạnh tranh loại trừ của vi sinh vật là một tiêu chí quan trọng nhằm tuyển
chọn các chủng probiotic trong phòng trị các tác nhân gây bệnh trong gia cầm và các
chủng thuộc loài Vibrio trong nuôi trồng thủy sản. Balcaza và Rojas – Luna (2007) cho
thấy chủng B. subtilis UTM 126 có hoạt tính kháng lại các chủng Vibrio gây bệnh và
khi được bổ sung vào thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng đã làm giảm tỷ lệ chết
của tôm sau khi nhiễm V. harveyi, do vậy có thể giúp tôm chống lại các bệnh do Vibrio.
Hơn nữa, thức ăn nuôi tôm có bổ sung probiotic là các chủng vi khuẩn V. alginolyticus
UTM 102, Roseobacter gallarciensis SLV03 và Pseudomonas aestumarina SLV22
còn giúp giảm hệ số chuyển hóa thức ăn và tỷ lệ chết sau khi cảm nhiễm V.
parahaemolyticus Ps – 017.
1.1.2. Sản xuất các chất kháng vi sinh vật
Khả năng ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh của probiotic (đặc biệt là các
loài vi khuẩn lactic) đã được biết đến từ rất lâu. Hầu hết các thực phẩm lên men (sữa
chua, rau quả muối chua, nem chua…) chứa rất nhiều vi khuẩn probiotic, được công
nhận là an toàn do được lên men bởi vi khuẩn lactic. Cơ sở khoa học cho quá trình bảo
quản này là các quá trình lên men lactic, lên men ethanol… Các quá trình này tạo ra một
môi trường pH thấp và hàng loạt các chất kháng khuẩn khác nhau.
Ngày nay, cơ chế sản sinh các chất kháng vi sinh vật của vi khuẩn probiotic đã
được làm sáng tỏ. Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng probiotic có khả năng sản sinh
hàng loạt các chất ức chế như acid hữu cơ, H2O2, CO2, bacteriocin, các hợp chất kháng
khuẩn phân tử lượng thấp, và một số hợp chất khác. Các chất này được sinh ra bên trong
đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi
khuẩn gây bệnh.
Vi khuẩn lactic từ lâu được biết là chủng vi khuẩn tiết ra chất kháng khuẩn
(bacteriocin). Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản là nhóm Gram âm. Nhiều
vi khuẩn tiết ra chất ức chế chống lại các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila
và Vibrio parahaemolyticus (Nair và cs, 1985). Cơ chế tiết ra chất chống lại vi khuẩn
5

gây bệnh trong các thử nghiệm mức tế bào in vitro rất phổ biến trong môi trường nước.
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng có nhiều dòng vi khuẩn in vitro kìm hãm được
các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Những nghiên cứu này cũng chứng minh rằng
khả năng kìm hãm của những dòng vi khuẩn thông thường dễ tìm thấy trong môi trường
nước (Fuller, 1989). Những quần thể sinh vật này có thể tiết vào môi trường những chất
có tính sát khuẩn hoặc kìm khuẩn, gây ảnh hưởng đến quần thể vi sinh khác, nhằm gián
tiếp cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường. Sự hiện diện của
những vi khuẩn này sản sinh chất kìm hãm, có thể tiết trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật
chủ hay ra môi trường nước làm rào cản gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh (Vine và
cs, 2006). Antony và cộng sự (2011) đã tuyển chọn được 2 chủng nấm men C.
haemulonii S27 và vi khuẩn Bacillus sp. MCCB101 thông qua cơ chế kích thích sản
sinh một loại peptide kháng khuẩn (AMP). Đây là loại peptide tương tự crustin gồm 99
acid amin được phát hiện ở tế bào máu tôm sú. Khi bổ sung 2 chủng probiotic này đã
kích thích tôm sú tăng trưởng sản sinh loại peptide này, dẫn tới tăng tính đề kháng với
virut gây bênh đốm trắng (WSSV). Nghiên cứu của Kongnum và Hongpattara (2012)
khi tiến hành bổ sung chủng probiotic L. plantarum MRO3.12 cũng giúp nâng cao tỷ lệ
sống khi lây nhiễm V. harveyi nhờ sản sinh chất kháng khuẩn.
1.1.3. Điều hòa miễn dịch
Theo Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2015) vi khuẩn probiotic tăng cường đáp ứng
miễn dịch tự nhiên bằng cách kích thích miễn dịch niêm mạc. Ví dụ vi khuẩn
Lactobacillus có khả năng hoạt hóa đại thực bào, kích thích thành bạch cầu, tăng tổng
hợp IgA và tăng khả năng tổng hợp interferon gamma. Vi khuẩn probiotic đáp ứng miễn
dịch chống dị ứng kích thích tổng hợp IgA đặc hiệu ở niêm mạc ruột thông qua việc
phục hồi hệ vi sinh vật bình thường, gây tác động biến đổi các yếu tố tăng trưởng beta
và sự sảnh sinh IL-10 cũng như các cytokine kích thích sản xuất kháng thể IgE. IL-10
là chất do tế bào Th2 sinh ra do tác động lên đại thực bào gây ức chế sự sinh sản cytokine
và do đó gián tiếp làm giảm sự sinh sản tế bào cytokine của Th1.
Sử dụng probiotic ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch ở tôm thẻ, mặc dù cơ chế
chính xác hiện vẫn chưa được giải thích rõ ràng. Nhiều nghiên cứu khẳng định vi sinh
vật probiotic có thể tăng cường hoạt tính phenol oxidase ở tôm thẻ chân trắng. Ví dụ,

sử dụng Bacillus lichenoformis có thể làm gia tăng số lượng bạch cầu ở tôm. Ngược
6


lại, số lượng bạch cầu giảm ở các con tôm có bổ sung L. plantarum và trong trường hợp
sử dụng vi khuẩn B. subtilis E20 thì không thấy có sự thay đổi đáng kể nào của hệ miễn
dịch ở tôm. Ngoài ra, vi khuẩn B. lichenoformis còn thể hiện khả năng tăng cường đáp
ứng miễn dịch tự nhiên và nâng cao tỷ lệ sống của tôm thẻ sau khi bị nhiễm V.
alginolyticus (Tseng và cs, 2009; Liu và cs, 2010).
1.1.4. Sản sinh enzyme và các sản phẩm trao đổi chất khác
Các vi sinh vật probiotic có thể giúp con người và động vật chủ tiêu hóa tốt hơn
và tăng cường hấp thu các chất dinh dưỡng, làm giảm hệ số chuyển hóa thức ăn bằng
cách tiết ra một số enzyme tiêu hóa và các sản phẩm trao đổi chất khác. Chúng có thể
tiết amylase, lipase và protease và tăng cường hoạt động của enzyme tiêu hóa của người
và động vật. Chẳng hạn một thử nghiệm trên cá chép bột cho thấy khi cho cá uống 200
– 300 mg chế phẩm probiotic Bacillus licheniformis trong mỗi kg thức ăn có thể làm
tăng hoạt động enzyme tiêu hóa, tăng khả năng sinh trưởng của cá. Ngoài ra, các vi sinh
vật probiotic còn có thể sản sinh các vitamin, nhất là các loại vitamin B.
Nghiên cứu của Olmos và cộng sự (2011) tiến hành bổ sung chủng probiotic B.
subtilis cùng với bột đậu tương vào thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng. Kết quả thử nghiệm
làm tỷ lệ sống, tỷ lệ tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn của tôm nhờ cơ chế sản
sinh enzyme để đồng hóa thức ăn. Tương tự, Liu và cộng sự (2009) thông báo chủng B.
subtilis E20 khi bổ sung vào thức ăn đã cải thiện tốc độ sinh trưởng của ấu trùng thông
qua hoạt tính thủy phân protein, thúc đẩy quá trình chuyển giai đoạn của ấu trùng, cải
thiện khả năng miễn dịch ở ấu trùng tôm thẻ.
1.1.5. Ức chế cơ chế kiểm soát mật độ tới hạn (quorum sensing)
Theo Đặng Tố Vân Cầm (2009), mỗi vi khuẩn có thể phóng thích ra một loại phân
tử hóa học đặc trưng. Các phân tử này sẽ khuếch tán vào trong môi trường nước. Khi
tích lũy tới một nồng độ tới hạn nào đó, các phân tử hóa học sẽ trở thành một loại tín
hiệu giúp vi khuẩn có thể dò tìm và nhận biết đồng loại. Nói cách khác, quorum Sensing

là cơ chế vi khuẩn điều khiển gene liên quan đến mật độ quần thể bằng cách tạo ra
(producing) phóng thích (releasing) và dò tìm (detecting) các phân tử tín hiệu; là tiến
trình các tế bào vi khuẩn thông tin liên lạc với nhau bằng các phân tử tín hiệu.

7


Nhờ quorum sensing, vi khuẩn có thể kích hoạt sự hoạt động của các gen mã hóa
các tiến trình như: tạo màng sinh học, tạo bào tử, phát sáng, sản xuất kháng sinh, tiết ra
các độc tố,... Hệ thống quorum sensing của vi khuẩn đã được phát hiện từ lâu. Chúng có
chức năng điều khiển độc lực của rất nhiều loài vi khuẩn và là tác nhân gây bệnh cho
người, cho vật nuôi và cho cây trồng. Các phân tử tín hiệu của vi khuẩn Gram âm là acyl
homoserine lactone (AHL). Việc phá hủy hệ thống quorum sensing của các tác nhân gây
bệnh nhằm làm bất hoạt mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của các tác nhân gây bệnh,
là hướng nghiên cứu – ứng dụng hoàn toàn mới trong lĩnh vực phòng trị bệnh bằng
probiotic.

1.2.

Tiêu chuẩn tuyển chọn vi sinh vật probiotic
Hầu hết các chủng probiotic được tuyển chọn nhằm sử dụng trong công nghiệp

sản xuất sữa, nhưng hiện nay chúng cũng được sử dụng trong các loại thực phẩm khác
cho người, trong thức ăn cho động vật trên cạn và dưới nước. Việc tuyển chọn một
chủng probiotic thích hợp là yêu cầu bắt buộc và phải dựa vào bốn tiêu chuẩn: (i) tiêu
chuẩn sức sống và chiếm lĩnh ruột, (ii) tiêu chuẩn sức khỏe động vật chủ, (iii) tiêu chuẩn
sản xuất và (iv) tiêu chuẩn an toàn (Nguyễn Văn Duy và cs, 2015).
1.2.1. Tiêu chuẩn sức sống và chiếm lĩnh ruột
Hoạt tính probiotic phụ thuộc vào hoạt tính trao đổi chất và môi trường vi sinh
thái của probiotic trong ruột. Ngoài ra, đối với probiotic sử dụng cho động vật thủy sản,

hoạt tính probiotic còn phụ thuộc vào môi trường sinh thái vi sinh vật dưới nước. Do
vậy, để những hoạt tính này tác động có lợi đến sức khỏe vật chủ, các chủng probiotic
phải có số lượng tế bào sống đủ lớn tại thời điểm tiêu thụ (sau quá trình bảo quản) và
chiếm lĩnh được bề mặt niêm mạc ruột.
Tiêu chuẩn này thường bao gồm các đặc điểm sau:
- Có sức sống cao trong các điều kiện bảo quản khác nhau
- Có khả năng chịu được môi trường tiêu hóa trong hệ đường ruột, nhất là điều kiện
muối mật 0,1 – 0,3% và pH 2 – 3.
- Có khả năng bám dính và chiếm lĩnh một vị trí cụ thể trên bề mặt niêm mạc ruột
1.2.2. Tiêu chuẩn sức khỏe động vật chủ
Tiêu chuẩn này bao gồm một vài trong số các đặc điểm sau:

8


- Có khả năng sử dụng prebiotic cho sinh trưởng
- Có khả năng sinh tổng hợp vitamin
- Có khả năng ức chế hoặc loại bỏ các tác nhân gây bệnh (loại trừ cạnh tranh)
- Có khả năng đề kháng đa kháng sinh
- Có khả năng sinh tổng hợp β- glactosidase
- Có khả năng đề kháng với acid mật
- Có khả năng sản sinh các hợp chất kháng vi sinh vật
- Có khả năng điều hòa đáp ứng miễn dịch
- Cảm ứng đặc hiệu cái chết của tế bào khối u.
1.2.3. Tiêu chuẩn sản xuất
Để trở thành một chủng probiotic thực sự, trước tiên, chủng này phải có khả năng
chống chịu được các điều kiện trong quá trình sản xuất công nghiệp. Tiêu chuẩn này
thường bao gồm các đặc điểm sau:
-

Dễ duy trì ổn định hoạt tính và tỷ lệ sống trong quá trình bảo quản

- Có khả năng hoạt hóa và sinh trưởng nhanh đến mật độ cực đại trong điều kiện môi
trường lên men đơn giản và rẻ tiền
-

Có khả năng chống chịu tương đối tốt với các tác nhân vật lý

-

Có khả năng sống sót trong hệ thực phẩm và trong quá trình chế biến
Ngoài ra, nếu bổ sung vào thực phẩm thì sinh khối vi khuẩn probiotic cũng cần có

hương vị dễ chịu và tính chất cảm quan phù hợp.
1.2.4. Tiêu chuẩn an toàn
Độ an toàn của vi khuẩn lactic sử dụng trong y học và thực phẩm có ý nghĩa rất
quan trọng. Nhìn chung các vi khuẩn lactic có “thành tích” tốt về tiêu chuẩn an toàn
trong suốt quá trình sử dụng lâu đời và cho đến nay chưa xảy ra những vấn đề lớn mặc
dù có những trường hợp lây nhiễm gây ra bởi một số chủng được thông báo ở những
bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Đặc biêt, độ an toàn đã được nghiên cứu kỹ ở những
chủng có nguồn gốc từ sữa. Tuy nhiên, đối với các chủng mới thì cần phải đảm bảo tiêu
chuẩn an toàn và tuân thủ tất cả các quy định của mỗi quốc gia và từng khu vực.

1.3. Ứng dụng của probiotic trong điều trị các bệnh ở tôm
Nuôi tôm trên thế giới bị sụt giảm do dịch bệnh. Thuốc kháng sinh được sử dụng
với số lượng lớn trong nhiều trường hợp không hiệu quả, hoặc dẫn đến sự gia tăng độc
9


lực của tác nhân gây bệnh và hơn nữa là nguyên nhân của mối quan tâm về sự thúc đẩy

chuyển sang đề kháng kháng sinh gây bệnh ở người. Việc sử dụng probiotic có thể được
xem là một giải pháp cho những vấn đề này.
Rengpipat và cộng sự (1998) đã phân lập chủng probiotic Bacillus S1 từ ruột của
tôm giống bố mẹ ở vịnh Thái Lan, đã chứng minh có hiệu quả. Thử nghiệm được tiến
hành đối với tôm sú PL30. Một nhóm được nuôi bằng thức ăn có bổ sung chế phẩm sinh
học và nhóm còn lại được nuôi bằng thức ăn thông thường. Sau 100 ngày có sự khác
biệt lớn về mức độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và hình dáng giữa hai nhóm. Sau khi cảm
nhiễm tôm với Vibrio harveyi trong 10 ngày, toàn bộ nhóm được nuôi thức ăn có bổ
sung chế phẩm sinh học có tỷ lệ sống 100%, trong khi nhóm còn lại có tỷ lệ sống là
26%. Tương tự, chủng Bacillus BP11 phân lập từ ruột tôm sú được bổ sung vào thức ăn
nuôi tôm với mật độ 109 CFU/ml cải thiện tốc độ tăng trưởng, đồng thời tăng khả năng
kháng Vibrio harveyi 639 của tôm (Utiswannakul và cs, 2011).
Nghiên cứu của Sivakumar và cộng sự (2012), đánh giá tiềm năng probiotic của L.
acidophilus 04 đối với tác nhân gây bệnh Vibrio ở tôm sú ở giai đoạn juvenile. Chủng
L. acidophilus thể hiện hoạt tính kháng với Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae,
Vibrio harveyi và Vibrio alginolyticus. Tác dụng của probiotic của L. acidophilus được
thử nghiệm bằng cách cho tôm sú giai đoạn juvenile ăn thức ăn với hàm lượng 105
CFU/g trong vòng 30 ngày trước khi cảm nhiễm với V. alginolyticus nồng độ 105
CFU/mL. Tỷ lệ chết của tôm cho ăn thức ăn có bổ sung L. acidophilus 04 là 20%, trong
khi ở nhóm đối chứng là 86% (Sivakumar và cs, 2012).
Đầu năm 2014, một thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của một hỗn hợp các chủng
Bacillus trên hội chứng EMS do vi khuẩn trong giai đoạn ươm giống và nuôi tôm đã
được thực hiện tại một trại giống thương mại tại trại giống Fitmar ở Sinaloa, Mexico
(GAA, 2014). Theo đó, việc nuôi ấu trùng tôm được chia làm 2 giai đoạn. Để tăng cường
hệ thống miễn dịch của ấu trùng, trong giai đoạn 1, hỗn hợp Bacillus được cung cấp
hàng ngày nhằm đạt được mật độ 105 CFU/ml, ở giai đoạn 2 của quá trình nuôi, hỗn hợp
đạt mật độ 108 CFU/ml. Việc sử dụng một cách chọn lọc hỗn hợp từ Bacillus cải thiện
rõ rệt tỷ lệ sống. Trong giai đoạn nuôi đầu tiên, tỷ lệ sống tăng từ 32% lên 36%. Cuối
giai đoạn 2, cải thiện tỷ lệ sống dẫn đến tăng tỷ lệ tôm thu hoạch, 1,3 triệu con giống
hậu ấu trùng đại diện cho tỷ lệ tăng 39% về sản lượng (GAA, 2014).

10


Nghiên cứu tại khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ (Pham Thị Tuyết Ngân và cs,
2011) Thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức với đối chứng không bổ sung vi khuẩn được
lặp lại 3 lần, trong đó dòng vi khuẩn Bacillus phân lập được từ ao tôm sú ở Sóc Trăng
(B37) được so sánh với 2 loại chế phẩm sinh học khác là CNSH (do Viện Công nghệ
sinh học, Đại học Cần Thơ sản xuất) và PrawnBac (từ Mỹ). Thí nghiệm được bố trí trong
bể composite 500 L được trải một lớp bùn 10 cm với mật độ tôm sú là 50 con/m2 ở độ
mặn 16‰ trong thời gian 40 ngày.Vi khuẩn được bổ sung với mật độ 105 CFU/mL. Một
số chỉ tiêu chất lượng nước, mật độ vi khuẩn tổng, Bacillus, Vibrio được theo dõi 5
ngày/lần. Mật độ Bacillus ở nghiệm thức B37 và CNSH cao hơn nghiệm thức còn lại.Vi
khuẩn Vibrio sp. bị lấn át ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn. Tỉ lệ sống và tốc độ tăng
trưởng của tôm ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn cao hơn có ý nghĩa thống kê so
với các nghiệm thức còn lại. Trong các dòng vi khuẩn có lợi, B37 cho kết quả xử lý tốt
nhất, tốt hơn có ý nghĩa so với các nghiệm thức khác (p < 0,05).
1.4. Tình hình nghiên cứu dịch bệnh EMS gây bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng
1.4.1. Nguyên nhân bệnh EMS
Châu Á – Thái Bình Dương là khu vực sản xuất hàng đầu về các sản phẩm thủy
sản trên thế giới. Trong vài thập kỉ gần đây, khu vực này liên tục bị ảnh hưởng lớn bởi
những vấn đề về dịch bệnh thủy sản, có tỷ lệ gây chết cao và gây thiệt hại lớn về kinh
tế. Sự xuất hiện của bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, hội chứng Taura...gây ra ảnh hưởng
nặng nề đối với nghề nuôi tôm. Gần đây, một loại bệnh mới nổi được gọi là hội chứng
chết sớm (EMS) còn được gọi là hội chứng hoại tử cấp tính AHPNS gây ra thiệt hại
đáng kể cho người nông dân nuôi tôm ở Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan và Malaysia.
Ở những ngày đầu khi xuất hiện EMS, đã tồn tại rất nhiều quan điểm khác nhau
về tác nhân chính gây ra hội chứng bệnh này. Do bệnh lý trong mô chỉ xuất hiện ở cơ
quan gan tụy mà không tìm thấy các biến đổi bất thường ở các tổ chức khác của tôm
tôm bệnh, nên không ít nhà nghiên cứu đã nghi ngờ tác nhân gây ra bệnh này là độc tố,
có thể từ môi trường (bùn hoặc nước ao), dư lượng của thuốc bảo vệ thực vật, từ tảo độc

hay từ thức ăn chứa độc tố. Vào năm 2011 ở Việt Nam, đã không ít người cho rằng tác
nhân gây bệnh EMS là do nông dược, chất cypermethrin, vì độc chất này tích tụ lâu
trong bùn, khi các yếu tố môi trường bất lợi thì gây nên ngộ độc cho tôm (Báo cáo của
Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, 2011).
11


Nghiên cứu trong năm 2011 tại đại học Arizona (Mỹ) đã chứng minh rằng các loại
độc tố từ môi trường, từ tảo, từ thuốc bảo vệ thực vật và từ thức ăn đã không gây ra EMS
trong điều kiện thực nghiệm và virus cũng không phải là tác nhân gây ra bệnh này qua
cảm nhiễm dịch lọc từ tôm bệnh (Lightner và cs, 2012; Tran và cs, 2012). Các nghiên
cứu tiếp tục của nhóm các nhà khoa học này được thực hiện ở Việt Nam vào năm 2012
đã chứng minh rằng tác nhân gây EMS là vi sinh vật học do bệnh có thể lây nhiễm từ cá
thể bị bệnh sang cá thể khỏe mạnh sau khi bị nhốt chung một thời gian. Đặc biệt khu hệ
vi khuẩn được phân lập từ dạ dày của tôm bị EMS đã gây ra bệnh này trong điều kiện
thực nghiệm bằng cách đưa vi khuẩn vào nước hay đưa vào cơ thể tôm khỏe qua đường
miệng (Lightner và cs, 2012; Tran và cs, 2012).
Kết quả nghiên cứu tiếp tục của các tác gỉa vào năm 2013 đã chứng minh rằng,
một số chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây ra hội chứng hoại tử
gan tụy cấp (AHPNS) ở tôm he nuôi ở châu Á và Mexico. Chủng vi khuẩn này đã cảm
nhiễm và gây bệnh thành công vào tôm he khỏe mạnh bằng cách đưa vi khuẩn vào nước
hay đưa qua con đường miệng. Khi chủng vi khuẩn này xâm nhập vào đường ruột của
tôm, chúng sẽ tiết độc tố gây hoại tử nặng nề gan tụy của tôm he (Lightner và cs, 2013).
Gần đây, người ta đã xác định được nguyên nhân gây bệnh EMS là V.
parahaemolyticus, tên là VPAHPNS, chứa một hoặc nhiều plasmid ngoài nhiễm sắc thể
chưa từng được báo cáo trước đó và có kích thước khoảng 70 kbp (Gomez-Gil và cs,
(2014); Gomez-Jimenez và cs (2014); Kondo và cs (2014); Yang và cs (2014)). Plasmid
này đã được xác định là pVPA3-1, và kích thước của nó có thể thay đổi nhỏ. Lee và
cộng sự (2015) cũng đã báo cáo rằng một chủng V. parahaemolyticus gây bệnh EMS
chứa một plasmid 70 kbp (pVA1). Khả năng gây bệnh của chủng này bị loại bỏ khi

không có hoặc loại bỏ plasmid pVA1 mã hóa 2 độc tố PirA (12,7 kDa) và PirB (50,1
kDa). Nghiên cứu cũng xác định cấu trúc tinh thể của protein V. parahaemolyticus PirA
và PirB và thấy rằng các cấu trúc liên kết cấu trúc tổng thể của PirA/ PirB là rất tương
tự như của các tinh thể protein độc tố của Bacillus ở côn trùng, mặc dù trình tự thấp
nhận dạng (< 10%).
Không phải tất cả các chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập từ tôm he bị bệnh
EMS đều là tác nhân gây bệnh. Những nghiên cứu mới nhất gần đây đã chứng minh sự
khác biệt về bộ gen giữa các chủng V. parahaemolyticus là tác nhân của EMS/AHPNS
12


với các chủng V. parahaemolyticus không phải tác nhân gây ra hội chứng này ở tôm he.
Ở Mexico, Gomez – Gil và cộng sự (2014) đã giải trình tự gen của chủng V.
parahaemolyticus gây EMS tại Mexico và thông báo về việc phát hiện 4 gen mã hóa
tính độc trong bộ gen của chủng vi khuẩn này, đó là: độc tố zona occludens, độc tố
enterotoxin, yếu tố kích hoạt phiên mã ToxR và ToxS. Tại Thái Lan, người ta đã phân
lập được 6 chủng V. parahemolyticus từ các trang trại nuôi tôm. Tuy nhiên, không phải
tất cả các chủng đều gây bệnh EMS. Để phân biệt các chủng gây bệnh, tiến hành giải
trình tự của sáu chủng V. parahaemolyticus, được phân lập từ các vùng khác nhau của
Thái Lan: 3 chủng từ tôm bị bệnh EMS (Litopenaeus vannamei) (TUMSAT_DE1_S1,
TUMSAT_DE2_S2, và TUMSAT_D06_S3) và 3 chủng từ tôm không bị bệnh EMS
chủng từ các trang trại nuôi tôm khác nhau (TUMSAT_H01_S4, TUMSAT_H03_S5,
và TUMSAT_H10_S6) (Kondo, 2014). Kết quả nghiên cứu đã phát hiện 2 gen mã hóa
tính độc pirA và pirB, các gen này không có trong bộ gen của các chủng V.
parahaemolyticus không gây bệnh EMS ở tôm he.
Năm 2015, Nhóm nghiên cứu của Đại học Tokyo cùng Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thủy sản 1 đã xác định một chủng gây bệnh EMS ở Việt Nam không phải là V.
parahaemolyticus mà là V. harveyi KC13.17 (Kondo và cs, 2015). Vì vậy, tác nhân
gây EMS được cho là ngoài vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Tran và cs, 2013) còn
có vi khuẩn V. harveyi (Kondo và cs, 2015).

1.4.2. Triệu chứng của tôm bị bệnh EMS
Bệnh EMS xuất hiện ở tôm postlavae trong vòng 20 – 30 ngày thả nuôi. Cả tôm
sú, tôm he, tôm thẻ chân trắng đều bị ảnh hưởng bởi bệnh này. Tỷ lệ tử vong có thể lên
đến 100% trong các ao nuôi bị nhiễm bệnh, tôm bị bệnh có biểu hiện lờ đờ và biếng ăn.
Sau khi bóc tách lớp vỏ, gan tụy của tôm bị teo, màu trắng với những vệt đen. Ngoài ra,
vỏ tôm mềm, tối màu và có những vết lốm đốm ở vùng giáp đầu ngực.
Cả 2 loại tôm sú P. monodon và tôm thẻ L. vannamei bị bệnh EMS đều thể hiện
bệnh lý giống nhau (Lightner và cs, 2012). Các mẫu tôm dành phân tích mô học đều cho
thấy các tác động của bệnh EMS chỉ giới hạn ở gan tụy (H.P.). Hoạt động khác thường
tiến triển ở gan tụy đã cho thấy các tổn thương thể hiện sự suy thoái và sự bất bình
thường của các tế bào biểu mô ống phát sinh ở gần đầu đến ngoại biên. Sự thay đổi đầu
tiên quan sát được ở gan tụy của tôm bệnh là giảm rõ rệt túi tế bào dữ trự mỡ và mất
13