KỸ THUẬT LÊN MEN CÔNG NGHIỆP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KỸ THUẬT LÊN MEN
CÔNG NGHIỆP
(Bản thảo)

TS. HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2016


MỤC LỤC

1. Khái niệm lên men ............................................................................................3
2. Ứng dụng của các quá trình lên men ................................................................4
2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật ........................................................................4
2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật ..........................................................................4
2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật ............................................................4
2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp ..................................................................5
2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp .......................................................................8
3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men .................................................8

CHƯƠNG 2. ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT
QUÁ TRÌNH LÊN MEN

TRONG
10

1. Phân loại phương pháp lên men ........................................................................ 10
2. Phương pháp lên men mẻ .................................................................................. 10

3. Phương pháp lên men liên tục ........................................................................... 14
4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch)................................................. 16
5. Lên men mật độ cao ........................................................................................... 19

CHƯƠNG 3. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ...................... 20
1. Giới thiệu ............................................................................................................ 20
2. Các công đoạn của qui trình lên men ................................................................. 21
3. Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men ............................................ 29

CHƯƠNG 4. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ....... 34
1. Giới thiệu ............................................................................................................ 34
2. Thiết kế môi trường lên men ............................................................................. 35
3. Các thành phần của môi trường lên men........................................................... 38
4. Đánh giá môi trường .......................................................................................... 52
5. Phương pháp đường hóa tạo dung dịch glucose từ tinh bột ............................. 52
6. Xử lý mật rỉ mía đường tạo dung dịch đường phục vụ cho lên men ................. 54

CHƯƠNG 5. KHỬ TRÙNG TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ........................... 56
1. Mục đích khử trùng trong lên men .................................................................... 56
2. Yêu cầu khi khử trùng ........................................................................................ 57
3. Phương pháp khử trùng..................................................................................... 57
4. Động học sự chết của vi sinh vật bởi nhiệt ........................................................ 59
5. Khử trùng môi trường........................................................................................ 62
5.1. Khử trùng theo phương pháp liên tục .......................................................... 63
5.2. Khử trùng theo phương pháp mẻ ................................................................. 66
6. Khử trùng nồi lên men ....................................................................................... 66
7. Lọc không khí ..................................................................................................... 68

CHƯƠNG 6. KIỂM SOÁT NUÔI CẤY ................................................................... 70
1. Kiểm soát tăng trưởng tế bào ............................................................................ 70

2. Kiểm soát pH ...................................................................................................... 74
3. Kiểm soát nhiệt độ ............................................................................................. 75
4. Kiểm soát hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men .................... 78
5. Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng trong quá trình lên men .... 82
6. Phá bọt trong quá trình lên men ........................................................................ 85
6. 1. Tạo bọt và các nhân tố gây tạo bọt.............................................................. 85
6.2. Những trở ngại gây nên bởi bọt ................................................................... 86
6.3. Kiểm soát bọt ................................................................................................ 86
7. Theo dõi và tính toán kết quả lên men .............................................................. 89

1


1. Nồng độ sản phẩm........................................................................................... 89
2. Sản lượng ........................................................................................................ 89
3. Hiệu suất ......................................................................................................... 90

CHƯƠNG 7. TỐI ƯU HOÁ HỆ THỐNG LÊN MEN ............................................... 95
1. Cải tiến giống ...................................................................................................... 95
2. Cải tiến thiết bị ................................................................................................... 96
3. Tăng cường các điều kiện thích hợp trong quá trình nuôi cấy ......................... 96
4. Phương pháp thiết kế thí nghiệm để xác định các điều kiện tối ưu cho lên men
.............................................................................................................................. 102

CHƯƠNG 8. NHIỄM TẠP KHUẨN VÀ NGUYÊN TẮC PHÒNG CHỐNG TẠP
NHIỄM TRONG LÊN MEN .................................................................................. 103
1. Hậu quả của sự nhiễm tạp khuẩn .................................................................... 103
2. Phát hiện tạp nhiễm ......................................................................................... 103
3. Nguyên nhân tạp nhiễm ................................................................................... 104
4. Nguyên tắc phòng chống nhiễm trong lên men ............................................... 105

5. Cách phát hiện - đánh giá nguồn gốc tạp nhiễm .............................................. 106
6. Một số điểm cần lưu ý khi truy tìm nguồn gốc gây tạp nhiễm ........................ 108

CHƯƠNG 9. THU HỒI VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM LÊN MEN ........................... 109
1. Giới thiệu ....................................................................................................... 109
2. Các phương pháp tách tế bào........................................................................... 113
2.1. Phương pháp lắng tủa ............................................................................... 113
2.2. Phương pháp ly tâm .................................................................................. 113
2.3. Phương pháp lọc........................................................................................ 114
2.4. Phương pháp tạo bọt ................................................................................. 118
3. Phương pháp phá màng tế bào ........................................................................ 119
3.1. Phương pháp vật lý ................................................................................... 119
3.2. Phương pháp hóa học................................................................................ 123
- Dùng dung môi........................................................................................... 126
3.3. Phương pháp sinh học-Enzyme ................................................................ 126
4. Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm .................................................. 127
4.1. Phương pháp chiết lỏng - lỏng .................................................................. 127
4.2. Phương pháp thẩm tích ............................................................................. 128
4.3. Phương pháp kết tủa ................................................................................. 130
5. Phương pháp sắc ký tinh sạch sản phẩm lên men ........................................... 134
5.1. Sắc kí lọc gel (Gel Permeation Chromatography Size Exclusion
Chromatography)............................................................................................. 135
5.2. Sắc kí ái lực (Affinity Chromatography) ................................................... 137
5.3. Phương pháp sắc ký trao đổi ion .............................................................. 138

CHƯƠNG 10. XỬ LÝ CHẤT THẢI CỦA QUI TRÌNH LÊN MEN ...................... 141
1. Giới thiệu về xử lý chất thải và các phương pháp xử lý................................... 141
1.1. Giới thiệu ................................................................................................... 141
1.2. Các phương pháp xử lý chất thải............................................................... 143
2. Tiếp cận xử lý chất thải của qui trình lên men công nghiệp............................ 147

3. Triết lý “không phát thải”................................................................................. 148

CHƯƠNG 11. BÀI TẬP ÁP DỤNG ................................................................... 149
1. Bài tập............................................................................................................... 149
2. Bài giải .............................................................................................................. 151

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 157
PHẦN PHỤC LỤC ................................................................................................ 158
2


CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG
1. Khái niệm lên men
Thuật ngữ “lên men” bắt nguồn từ động từ “fervere” trong tiếng Latin, có
nghĩa là làm sôi bọt (nổi bọt), nhằm mô tả hiện tượng hoạt động của nấm men
trong dịch chiết trái cây hoặc dịch chiết đại mạch. Hiện tượng sôi bọt này là do
CO2 sinh ra bởi sự phân giải hiếu khí của các loại đường có trong dịch chiết. Tuy
nhiên, đối với các nhà sinh hoá và các nhà sinh vật học thì thuật ngữ lên men còn
có ý nghĩa khác. Về phương diện sinh hóa thì lên men có ý nghĩa liên quan đến sự
sinh năng lượng bởi quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ, trong khi đó, về
phương diện vi sinh vật học trong công nghiệp thì nghĩa của lên men rộng hơn.
Sự phân giải đường là một quá trình oxy hoá dẫn đến việc tạo thành các
phân tử pyridine nucleotides ở dạng khử và sau đó các phân tử này lại tiếp tục bị
oxy hoá cho các quá trình tiếp theo. Trong điều kiện hiếu khí, sự oxy hóa các phân
tử pyridine nucleotides diễn ra bằng sự chuyển điện tử thông qua hệ thống
cytochrome mà trong đó oxygen đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng. Tuy
nhiên, trong điều kiện kỵ khí, sự oxy hoá các pyridine nucleotides dạng khử diễn
ra cùng với sự khử của một hợp chất hữu cơ mà thường là sản phẩm trung gian
của một quá trình phân giải. Đối với trường hợp về sự hoạt động của nấm men
trong dịch nước trái cây hoặc dịch chiết ngũ cốc, NADH được hình thành nhờ sự

khử của acid pyruvic thành ethanol. Các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng
khử pyruvate thành các sản phẩm khác nhau và rất đa dạng. Do vậy, thuật ngữ lên
men được sử dụng đúng theo ý nghĩa sinh hóa là một quá trình sinh năng lượng
trong đó các chất hữu cơ đóng vai trò vừa là chất cho vừa là chất nhận điện tử.
Quá trình sinh tổng hợp alcohol nhờ tác động của nấm men trong dịch chiết
đại mạch hoặc dịch chiết trái cây đã được thực hiện với qui mô lớn từ rất lâu và
đã trở thành chất trao đổi của vi sinh vật được sản xuất công nghiệp đầu tiên. Do
vậy, các nhà vi sinh vật học công nghiệp đã mở rộng khái niệm lên men để mô tả
bất kỳ qui trình sản xuất nào mà sản phẩm được sinh ra nhờ nuôi cấy vi sinh vật.
Việc sản xuất bia hoặc các dung môi hữu cơ được xem như là quá trình lên men
theo cả nghĩa về sinh hoá học và vi sinh vật học. Trong tài liệu này, thuật ngữ lên
men được sử dụng theo nghĩa rộng bao hàm cả hai.
Cần phân biệt các khái niệm:
Chất cho điện tử Chất nhận điện tử cuối cùng

Lên men (sinh hoá) Chất hữu cơ
Hô hấp hiếu khí
Chất hữu cơ
Hô hấp kỵ khí
Chất hữu cơ

Hợp chất hữu cơ
Oxygen
Hợp chất vô cơ (nitrate, sulphate)

Thuật ngữ lên men mở rộng bao gồm cả ba khái niệm trên.
3


2. Ứng dụng của các quá trình lên men

2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật
Công nghiệp sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể được chia thành hai qui trình
chính. (1) sản xuất nấm men dùng trong công nghiệp bánh mì, (2) sản xuất tế bào
vi sinh vật dùng trong thực phẩm cho con người và cho động vật (protein đơn
bào). Nấm men bánh mì được sản xuất theo qui mô công nghiệp từ những năm
1900 và nấm men được sản xuất dùng làm thực phẩm cho con người ở Đức trong
Đại thế chiến thứ I. Tuy nhiên mãi đến những năm 1960 thì sản xuất sinh khối vi
sinh vật mới được khai thác mạnh mẽ. Và do vậy từ những năm 1970, các qui
trình sản xuất liên tục theo qui mô lớn đã được thiết lập và đưa vào sản xuất sinh
khối vi sinh vật phục vụ cho chăn nuôi và thực phẩm cho con người.

2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật
Enzyme thương mại được sản xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy
nhiên, enzyme vi sinh vật có nhiều ưu thế vượt trội hơn do có thể sản xuất với
lượng rất lớn bằng kỹ thuật lên men. Bên cạnh đó, nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật
DNA tái tổ hợp nên có thể sản xuất các enzyme có nguồn gốc động vật bằng các
chủng vi sinh vật. Các enzyme này được dùng chủ yếu trong công nghiệp thực
phẩm và các ngành công nghiệp có liên quan khác (Bảng 1. 1). Quá trình nuôi cấy
vi sinh vật để sản xuất enzymes được kiểm soát rất chặt chẽ. Ngày nay, người ta
sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử để tăng cường năng suất sản xuất của
các chủng như tăng cường chất cảm ứng, đột biến genes, hay kỹ thuật tái tổ hợp
gene.
2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật
Cùng với các giai đoạn tăng trưởng, sự thay đổi trong quá trình nuôi cấy một
chủng vi sinh vật có thể được mô tả thông qua sản phẩm mà chúng sinh ra trong
các phase khác nhau của đường cong tăng trưởng. Ở log phase, sản phẩm được
sinh ra chủ yếu là phục vụ cho tăng trưởng của tế bào, bao gồm các amino acids,
nucleotides, lipids, carbohydrates… Những sản phẩm này được xem là sản phẩm
sơ cấp của sự biến dưỡng, và phase này được gọi là trophophase.

Rất nhiều sản phẩm sơ cấp có giá trị kinh tế cao và ngày nay được sản xuất
bằng phương pháp lên men (Bảng 1. 2).

Sự tổng hợp các chất trao đổi sơ cấp của các chủng vi sinh vật hoang dại chỉ
đủ cho nhu cầu trong tế bào của chúng. Do vậy nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật
học công nghiệp là phải làm sao cải biến các chủng này và cung cấp các điều kiện
nuôi cấy cần thiết để cải thiện năng suất sinh tổng hợp các chất này.

Trong phase ổn định, một số chủng tổng hợp ra các hợp chất mà chúng
không tổng hợp được trong log phase, các chất này không có vai trò rõ ràng đối
4


với quá trình biến dưỡng của tế bào và chúng được xem là chất trao đổi thứ cấp,
và phase này gọi là idiophase. Vi sinh vật tăng trưởng trong môi trường tự nhiên
ở tốc độ thấp, điều này khiến người ta cho rằng, trong tự nhiên thì idophase
chiếm ưu thế hơn trophophase. Không phải toàn bộ vi sinh vật đều có biến dưỡng
thứ cấp, ví dụ như đối với trường hợp của vi khuẩn Enterobacteriaceae thì không
tìm thấy có sản phẩm thứ cấp. Đôi khi rất khó để phân biệt một sản phẩm là sơ
cấp hay thứ cấp và động học sinh tổng hợp của những hợp chất nhất định có thể
thay đổi tùy thuộc vào các điều kiện nuôi cấy.

Vai trò sinh lý của biến dưỡng thứ cấp trong các tế bào vi sinh vật được
tranh luận nhiều, nhưng người ta quan tâm đến vai trò quan trọng của các chất
trao đổi trung gian nhiều hơn. Có rất nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính
kháng khuẩn, là các enzyme ức chế, một số chất thúc đẩy tăng trưởng và rất nhiều
chất có dược tính. Do vậy, sản phẩm của biến dưỡng thứ cấp đã hình thành nên cơ
sở của nhiều qui trình lên men khác nhau. Cũng giống như trường hợp đối với các
chất trao đổi sơ cấp, các chủng vi sinh vật hoang dại có khuynh hướng tổng hợp
các chất trao đổi thứ cấp với nồng độ thấp và sự tổng hợp này được kiểm soát bởi

sự cảm ứng, sự ức chế dị hóa và hệ thống phản hồi.

2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp
Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở rộng tiềm năng ứng dụng
của công nghệ lên men, tạo ra các sản phẩm lên men khác nhau, phục vụ cho cuộc
sống của con người. Các genes của các sinh vật bậc cao có thể sẽ được đưa vào tế
bào vi sinh vật và các chủng này có khả năng tổng hợp ra các protein ngoại. Có
nhiều chủng vi sinh vật khác nhau được dùng làm tế bào chủ cho những hệ thống
biểu hiện bao gồm E.coli, Sac. cerevisiae và các nấm sợi. Các sản phẩm được sinh
ra từ các chủng được biến đổi di truyền gồm: interferon, insulin, albumin của
huyết thanh người, các nhân tố tăng trưởng biểu bì, chymosin của bê, và
somatostatin của bò. Khi thiết kế các hệ thống biểu hiện các sản phẩm tái tổ hợp
cần chú ý đến một số vấn đề: sự tiết của sản phẩm, giảm thiểu sự phân hủy sản
phẩm và sự kiểm soát sinh tổng hợp trong toàn bộ tiến trình lên men, cũng như
tối ưu hóa biểu hiện của gene ngoại.

5


Bảng 1. 1. Các ứng dụng của enzyme trong thương mại.
Công nghiệp
Ứng dụng
Công nghiệp bánh mì Giảm độ nhớt trong quá trình nhào bột, tăng cường độ mềm
và xay bột
mại, và duy trì độ tươi của bột
Cải thiện cấu trúc, giảm thời gian trộn, tăng thể tích của ổ
Công nghiệp bia
bánh mì
Tăng cường độ nghiền nhừ
Chống lại ảnh hưởng của khí lạnh

Cải thiện độ lọc tinh
Công nghiệp ngũ cốc
Xử lý các thực phẩm ăn nhanh
Trong chế biến socola
Sản xuất các dịch si-rô
Coffee
Lên men hạt cà-fé
Trong xay café
Làm chế phẩm cà-fé cô đặc
Sản xuất các lọai bánh kẹo
Sản xuất các lọai siro có hàm lượng maltose cao
Siro bắp
Sản xuất các loại siro có chỉ số DE thấp
Sản xuất glucose từ siro bắp
Sản xuất siro fructose
Sản xuất dịch thủy phân protein
Chế biến sữa
On định sửa bay hơi
Sản xuất sữa đặc, kem, và các thức ăn tráng miệng dạng
động lạnh
Sản xuất sữa thô
Tách lọai glucose
Trong chiên-xào
Làm trong các loại dịch
Nước ép trái cây
Loại oxygen
Sử dụng làm chất tẩy
Giặt ủi
Thuộc da
Chống mọc lông

Thịt
Làm mềm mại

Amylase

Enzyme

Protease
Amylase
Protease
b-glucanase
Amylase
Pectinase
Pectinase
Pectinase, hemicellulase
Invertase, pectinase
Amylase
Amylase
Amyloglycosidase
Glucoseisomerase
Protease
Protease
Lactase
Protease
Glucose oxidase
Pectinase
Glucose oxidase
Protease, lipase
Protease
Protease

Nguồn gốc
Nấm

Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm
Nấm/vi khuẩn

Nấm
Vi khuẩn
Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm men
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm
Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
6

Trong y dược

Hổ trợ tiêu hóa
Chống đông máu
Trong các thử nghiệm lâm sàng
Tráng ảnh
Thu hồi bạc từ film đã sử dụng
Dịch thủy phân protein Trong sản xuất dịch thủy phân
Tạo sự ổn định
Chế biến thức uống
Chống sự xắp xếp theo kích thước của các sợi
Công nghiệp dệt
Rau quả
Các chế phẩm dạng soup hoặc nghiền nhừ

Amylase, protease
Steptokinase
Numerous
Protease
Proteases
Glucose oxidase, catalase
Amylase
Pectinase,
amylase,
cellulase

Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn

Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Vi khuẩn
Nấm

Bảng 1. 2. Các sản phẩm sơ cấp của biến dưỡng vi sinh vật và ứng dụng trong thương mại
Chất trao đổi sơ cấp
Ethanol
Citric acid
Glutamic acid
Lysine
Nucleotides
Phenylalanine
Polysaccharides
Vitamins

Ý nghĩa thương mại
Thành phần hoạt tính trong các thức uống có cồn, sử dụng làm nhiên liệu thay thế xăng dầu.
Có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
Chất tăng vị
Chất hổ trợ thực phẩm
Chất tăng vị
Chất tiền thân của aspartame, chất gây ngọt
Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tăng cường khả năng thu hồi dầu béo
Chất hổ trợ thực phẩm

7

2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp
Các tế bào vi sinh vật có thể được sử dụng để chuyển một hợp chất vào một
cấu trúc liên quan có giá trị hơn vì chúng có tác dụng như các chất xúc tác với tính
đặc trưng vị trí và lập thể cao. Các quá trình vi sinh vật đặc trưng hơn các quá trình
hóa học và cho phép có thể thêm, loại bỏ hoặc thay đổi từng nhóm chức năng ở
những vị trí đặc trưng nhất định trên các phân tử phức tạp mà không cần dùng đến
các hoá chất. Các phản ứng được xúc tác bởi enzyme bao gồm phản ứng khử
hydrogen, phản ứng oxy hoá, phản ứng hydroxyl hoá, phản ứng khử nước, phản ứng
khử carboxyl, amin hoá, khử amin, phản ứng chuyển vị. Các quá trình chuyển hóa
nhờ vi sinh vật còn có thêm một thuận lợi nữa là thực hiện ở nhiệt độ và áp suất
phản ứng thấp, không đòi hỏi các chất xúc tác như các kim loại nặng.

3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men
Quá trình phát triển của công nghiệp lên men diễn ra qua năm giai đoạn được mô
tả trong Bảng 1. 3. Quá trình phát triển ngành công nghiệp lên men trước giai đoạn
1900 được mô tả là giai đoạn 1, các sản phẩm trong giai đoạn này chỉ đơn thuần giới
hạn ở dạng alcolhol uống được, hoặc dấm ăn.
Bảng 1. 3. Quá trình phát triển của ngành công nghiệp lên men.

8


9

Dấm

Alcohol

Sản phẩm chính
- Bằng gỗ, đạt đến 1500

barrels
- Bằng đồng thau
Bằng các thùng phuy, khay
hay trong các lớp lọc chảy
dòng

Loại bồn

Phương pháp nuôi cấy

Dạng mẻ, fed-batch, hoặc Rất quan trọng
liên tục.
Phát triển nuôi cấy liên tục
dạng chảy tràn để nuôi cấy
tế bào động vật

Rất quan Sử dụng kỹ
trọng thuật tái tổ hợp

Rất quan Sử dụng kỹ
trọng thuật di truyền

Sử dụng giống
thuần nhất

Chọn lọc chủng
lên men dấm tốt

Nuôi cấy liên tục với việc
hồi lưu môi trường nuôi Rất quan trọng

cấy

Hầu như
không
có

Không có

Các thiết
Chọn lọc giống
bị pilot
Nấm men thuần
Không có nhất sử dụng ở
Carlberg (1886)

Sử dụng các
Trở nên
chương trìnhđột
thông
biến và chọn lọc
dụng
cơ bản

Hầu như không
kiểm soát

Hầu như không
kiểm soát

Hầu như không

kiểm soát

Kiểm soát
chất lượng

- Thông thường là dạng mẻ
và fed-batch.
- Phát triển nuôi cấy liên Rất quan trọng
tục cho lên men bia và một
vài chất trao đổi sơ cấp

Dạng mẻ và hệ thống
fed- batch

Dạng mẻ

Sử dụng thiết bị đo
nhiệt độ, báo mực, Dạng mẻ
trao đổi nhiệt

Kiểm soát quá trình

Bồn bằng kim loại 200m3 cho
sản xuất acetone/butanol
Nấm men bánh mì,
Sử dụng đầu dò pH,
Sử dụng hệ thống phân phối
2. 1900-1940 glycerol, citric acid, lactic
đầu dò kiểm soát
Khuấy trộn được sử dụng

nhiệt độ
acid, acetone/butanol
trong trường hợp bồn lên men
có kích thước nhỏ.
Pennicillin, Streptomicin
Sử dụng đầu dò pH,
các kháng sinh khác
DO có thể thanh
Các bồn lên men có trang bị hệ
gibberelin,
trùng được. Sử dụng
thống sục khí, vận hành trong
3. 1940 đến nay amino acid,
các thiết bị kiểm
điều kiện vô trùng- đúng nghĩa
soát mà sau này có
nucleotides,
bồn lên men
các chất chuyển hoá,
thể kiểm soát trên
enzyme
máy tính
Sử dụng máy tính
Sinh khối đơn bào,
Các bồn lên men chịu áp lực,
kiểm
4. 1964- nay
protein, hydrocarbon, các được thiết kế để giải quyết vấn
soát các thông số
chất phục vụ chăn nuôi

đề trao đổi khí, nhiệt độ
vận hành
Sản xuất các protein khác Sử dụng nồi lên men được phát Phát triển các điều
dòng (heterologous) bởi vi triển trong giai đoạn 3, 4. Và kiện kiểm soát và
sinh vật và tế bào động vật, phát triển thêm nồi nuôi cấy tế đầu dò như trong
5. 1979- nay
Sản xuất kháng thể đơn
giai đoạn 3, 4
bào động vật
dòng bởi tế bào động vật

1. Trước 1900

Giai đoạn


ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT
TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN

CHƯƠNG 2.

1. Phân loại phương pháp lên men
Tuỳ theo đặc điểm mà việc phân loại lên men có khác nhau
1. Theo tính chất môi trường: lỏng; rắn; bán rắn
2. Theo đặc tính sử dụng oxygen của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí; lên
men kỵ khí
3. Theo trạng thái: trạng thái tĩnh (không khuấy trộn/sục khí); trạng thái
động (có khuấy trộn/sục khí)
4. Theo mức độ kiểm soát của qui trình: có kiểm soát (độ tạp nhiễm, cơ chất,
pH,…); không kiểm soát (tự nhiên)

5. Theo qui trình lên men: lên men theo mẻ (batch); lên men theo dạng liên
tục (continuous); lên men theo dạng bán liên tục (fed-batch, dạng mẻ-bổ
sung)
Nhằm đánh giá diễn tiến cụ thể của một chu kỳ lên men, phương pháp lên
men theo mẽ được chọn làm kiểu mẫu để đánh giá, trên cơ sở đó sẽ mở rộng đánh
giá đối với các phương pháp lên men còn lại.

2. Phương pháp lên men mẻ
Đây là một hệ thống nuôi cấy khép kín, giới hạn về dinh dưỡng, nghĩa là cơ
chất dinh dưỡng không được bổ sung trong suốt quá trình lên men, trải qua bốn
phase khác nhau.
Trong giai đoạn đầu (lag phase, (a)) của quá trình nuôi cấy, hầu như không có
sự tăng trưởng đáng kể nào xảy ra, chủ yếu là giai đoạn thích nghi của tế bào trong
môi trường mới. Trong thực tế sản xuất cần phải rút ngắn thời gian của phase này
càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào giai đoạn tăng
trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm quan tâm. Tiếp theo, vi sinh vật dần dần thích
nghi, tăng trưởng nhanh dần và đạt đến tốc độ tối đa - log phase (b).
Sự tăng trưởng trong phase này có thể được biểu diễn theo phương trình toán
học sau:
dx/dt = µx (2.1)
Trong đó x sinh khối vi sinh tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc
độ tăng trưởng đặc trưng (hr-1), tốc độ này khác nhau tùy theo các giai đoạn trong
chu kỳ tăng trưởng.
10


Xo, So
Môi trường

X, Sr

Hình 2. 1. Hệ thống lên men theo phương pháp mẻ.
Từ phương trình trên ta có:
dx/x = µdt


t

t

to

to

∫ dx / x = µ ∫ dt

Ln(nồng độ tế bào)

(2.2)

(ln xt - ln x0) = µ (t - t0)
x0: lượng sinh khối ban đầu, xt: lượng sinh khối sau thời gian ni cấy t (giờ).
0.8
0.6
(a)

(b)

(d)

(c)

0.4
0.2
Thời gian nuôi cấy (giờ)
0
0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

Hình 1. 1. Sơ đồ động học tăng trưởng của vi sinh vật khi ni cấy dạng mẻ. (a) lagphase, (b) log- phase, (c) phase ổn định, (d) phase suy vong.
Trong log- phase, giàu dinh dưỡng, µ sẽ đạt µmax. Mỗi chủng vi sinh vật trong
những điều kiện tối thích nhất định sẽ có µmax khác nhau. Tốc độ tăng trưởng phụ
thuộc rất lớn vào nguồn dinh dưỡng của mơi trường ni cấy và thành phần các sản

phẩm do chính hoạt động của vi sinh vật tạo ra trong mơi trường. Nếu duy trì việc bổ
11


sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy thì tăng trưởng sẽ vẫn đạt được ở tốc độ
cao.
Bảng 2. 1. Một số giá trị µmax của một số chủng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy đặc
trưng.

Chủng vi sinh vật

µmax (giờ-1)

Nguồn tham khảo

Vibrio natriegents
Methylomonas methanolytica
Aspergillus nidulans
Penicilium chrysogenum
Fusarium graminearum Schwabe
Nuôi cấy tế bào thực vật

4,24
0,53
0,36
0,12
0,28
0,01-0,046

Eagon (1961)

Dostalek et al (1972)
Trinci (1969)
Trinci (1969)
Trinci (1992)
Petersen & Alfermann (1993)

Nuôi cấy tế bào động vật

0,01-0,05

Lavery (1990)

Sự tăng số lượng tế bào diễn ra trong log phase theo cấp số nhân với cơ số 2
theo phương trình:
N = N0 × 2n (2.3)
trong đó, N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ.

lg(N/N0) = n.lg2

n = 3,32 × lg(N/N0) (2.4)
Thời gian thế hệ tg
(2.5)
tg = t/n
với t là thời gian mà vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ.
Đối với vi khuẩn tg thường khoảng 20-60 phút, đối với nấm men tg thường
khoảng 1-3 giờ.
Hằng số tốc độ phân chia k là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy
k = 1/g = n/t (2.6)
Trong giai đoạn ổn định (stationary phase, c), lượng sinh khối tạo thành có
thể mô tả bằng phương trình:

x = Y×(si - sr) (2.7)
trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, si là hàm lượng
cơ chất ban đầu, sr là hàm lượng cơ chất còn lại. Tăng trưởng của vi sinh vật sẽ dừng
lại khi sr = 0 hoặc khi mà trong môi trường có sự tích lũy các chất có thể gây độc hại
cho chủng. Giá trị Y nhằm giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi một cơ chất thành sinh
12


khối vi sinh vật. Do vậy có thể dùng Y để tính tốn lượng cần thiết của một cơ chất
khi muốn tổng hợp một lượng sinh khối nhất định. Hiệu suất Y khơng phải là một
hằng số ổn định mà thay đổi tùy thuộc vào điều kiện ni cấy như nhiệt độ, độ pH,
hàm lượng oxygen hồ tan, sự giới hạn của các cơ chất,... Sự suy giảm tăng trưởng
phụ thuộc vào cơ chất giới hạn khi cạn kiệt trong mơi trường có thể được mơ tả theo
phương trình (theo Monod, 1942):
(2.8)
µ = µmax× sr/(Ks + sr)
Trong đó Ks là hằng số sử dụng cơ chất, Hình 2. 2. Đối với một cơ chất nhất
định thì mỗi chủng vi sinh vật có Ks khác nhau (Bảng 2. 2).
Khi sr = Ks thì µ = 1/2µmax. Khi µ = 0, bước vào giai đoạn phase ổn định. Đây là
giai đoạn chính của việc sản xuất các chất trao đổi.

Bảng 2. 2. Một số giá trị Ks của một số chủng vi sinh vật thơng thường.
Chủng vi sinh vật

Cơ chất Ks (mg/dm3)

E.coli

Glucose

Sac. cerevisiae

Glucose

Nồng độ cơ chất giới hạn

Pseudomonas sp. Methanol

6,8.10 -2
25,0
0,7

Tham khảo
Shehata and Marr (1971)
Pirt and Kurowski (1970)
Harison (1973)

si
Ks
sr
Thời gian nuôi cấy

Hình 2. 2. Sơ đồ biểu thị trị số Ks.
Sự thay đổi hàm lượng các chất trao đổi có thể biểu diễn:
dp/dt = ρx (2.9)
trong đó, p là nồng độ sản phẩm, ρ là tốc độ sinh tổng hợp đặc trưng. Mặt khác, sự
tạo thành sản phẩm tùy thuộc vào hoạt tính của chủng (hiệu suất trên một đơn vị tế
bào):
dp/dx = Yp/x (2.10)
với Yp/x là hiệu suất tạo sản phẩm trên một đơn vị sinh khối (năng suất sản xuất).

13


Từ hai phương trình trên ta có:
dx/dt = ρx/Yp/x
mà dx/dt = µx
Do vậy ta có: ρ = µ × Yp/x (2.11)
Như vậy tốc độ sản xuất đặc trưng phụ thuộc vào µ, và đạt giá trị cao nhất khi µ =
µmax.

3. Phương pháp lên men liên tục
Khác với các giai đoạn trong nuôi cấy theo mẻ (gồm 4 pha riêng biệt lag phase,
log phase, phase ổn định và phase suy vong), đối với nuôi cấy liên tục, log phase
được duy trì bằng cách bổ sung nguyên liệu vào nồi lên men và quá trình này được
lặp đi lặp lại cho đến khi nồi lên men đầy. Trong nhiều trường hợp, người ta lắp đặt
thêm hệ thống thông lưu nhằm giữ mực (thể tích) của dịch lên men trong nồi luôn ở
mức độ ổn định cao nhất, và khi đó tốc độ nạp liệu và tốc độ chiết dịch được cân
bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ nạp liệu.
Ta có:
D = F/V
(2.12)
Trong đó, F: tốc độ nạp liệu (KL/hr), V là thể tích dịch lên men trong nồi (KL), D là độ
pha loãng (giờ-1).
Sự thay đổi mật độ tế bào trong dịch lên men có thể biểu diễn:
dx/dt = growth – output
dx/dt = µx – Dx
(2.13)
Trong điều kiện ổn định, nồng độ tế bào trong dịch không đổi, dx/dt = 0.
Lúc đó: µ = D

(2.14)
Tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ thuộc vào độ pha loãng và như vậy trong
nuôi cấy liên tục thì µ ≤ µmax.
Trong một số trường hợp, người ta dùng D để kiểm soát µ. Tăng trưởng của vi
sinh vật trong nuôi cấy liên tục được điều khiển bởi các chất trong thành phần của
môi trường nuôi cấy. Lên men theo cách này còn được gọi là chemostat. Theo Monod
ta có:
µ = µmax. s /(Ks + s ) (2.15)

Ở trạng thái cân bằng, D = µ, nên D = µmax. s r/(Ks + s r), s r: nồng độ cơ chất ở
trạng thái cân bằng.

(2.16)
s = Ks × D/(µmax - D)
Như vậy, nồng độ cơ chất còn lại phụ thuộc vào độ pha loãng. Trong thực tế,
điều này xảy ra do sự tăng trưởng của tế bào làm cạn kiệt nguồn dinh dưỡng khi mà
14


nguồn cung cấp cho tăng trưởng ngang bằng với độ pha loãng. Nếu tốc độ sử dụng
cơ chất của vi sinh vật nhỏ hơn tốc độ nạp liệu cho sự tăng trưởng tế bào thì một số
đặc điểm sau sẽ xảy ra: Tốc độ tăng trưởng của tế bào nhỏ hơn tốc độ pha loãng, và
do vậy tế bào sẽ bị chiết ra khỏi nồi lên men với tốc độ cao hơn tốc độ mà chúng
được sinh ra. Điều này gây nên suy giảm mật độ tế bào trong nồi lên men. Nồng độ
cơ chất trong nồi lên men sẽ tăng dần vì trong nồi lên men còn ít tế bào hơn để sử
dụng. Khi nồng độ cơ chất cao hơn, tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật tăng lên và cao
hơn tốc độ pha loãng và khi đó, sinh khối tăng dần lên và trong trường hợp này thì
trạng thái ổn định mới được thiết lập.
x, So, F

x, So, F

Moâi tröôøng

Moâi tröôøng

x, Sr, F

x, Sr, F
Theå tích
dòch, V

(B)

(A)
S, F
x, So, F
Moâi tröôøng

x, Sr, F

Theå tích
dòch, V

(C)

Hình 2. 3: Sơ đồ hệ thống lên men liên tục.
(A): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, không hồi lưu sinh khối;

15

(B): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, hồi lưu sinh khối;
(C): Hệ thống lên men liên tục đa tầng.
Do vậy, người ta còn gọi chemostat là hệ thống nuôi cấy tự cân bằng theo giới
hạn dinh dưỡng, và có thể duy trì trong một giới hạn rộng của tốc độ tăng trưởng
đặc trưng phụ (sub- µmax).
Nồng độ tế bào trong nuôi cấy liên tục ở giai đoạn cân bằng ( x ) có thể được
biểu diễn:
x = Y × (si + sf - sr) (2.17)
Phương trình tạo sản phẩm:
Sự thay đổi nồng độ sản phẩm = (tổng sản phẩm – lượng sản phẩm đã chiết);

dp/dt = ρ.x – D.p (2.18)
Ở giai đoạn ổn định, dp/dt = 0. Khi đó:
(2.19)

p = ρ × x /D
trong đó p là nồng độ sản phẩm ở giai đoạn ổn định. Trong nuôi cấy liên tục, người

ta còn chia ra nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau:
1. Nuôi cấy dạng đa hệ thống: Dịch chiết ra từ hệ thống lên men này được đưa
ngay vào một hệ thống lên men khác. Ưu điểm của phương pháp này là có thể thay
đổi được nguồn nguyên liệu ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình lên men.
2. Phương pháp hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: Dịch chiết ra
trong quá trình lên men ngoài sản phẩm còn chứa một lượng rất lớn tế bào vi khuẩn.
Nếu lượng tế bào này được thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ tăng
cường được sản lượng của hệ thống. Có thể dùng phương pháp lọc hay ly tâm tách tế
bào rồi cho hồi lưu vào hệ thống. Tuy nhiên, rất khó thực hiện việc hồi lưu toàn bộ tế
bào theo dịch chiết và vấn đề chống tạp nhiễm đối với hệ thống theo kiểu này cũng là

một trở ngại lớn.

4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch)
Lên men mẻ-bổ sung là phương pháp nuôi cấy mà nguyên liệu được bổ sung
vào nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, dịch lên men có thể được chiết ra trong quá
trình nuôi cấy. Ban đầu nuôi cấy theo mẻ, sau đó nguyên liệu được nạp vào nồi lên
men. Các cơ chất khi được bổ sung vào môi trường đang nuôi cấy có thể là (1) giống
như thành phần môi trường ban đầu hoặc chỉ một số cơ chất giới hạn. Đối với cơ
chất giới hạn khi bổ sung vào có thể (2) nồng độ tương đương với môi trường ban
đầu, hoặc (3) cao hơn hoặc (4) rất đậm đặc. Hệ thống mẻ-bổ sung theo cách (1), (2)

16


gọi là mẻ-bổ sung thay đổi thể tích; theo cách (3), (4) gọi là hệ thống mẻ-bổ sung cố
định thể tích.

4.1. Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích
Động học của hệ thống này được mô tả lần đầu bởi Pirt (1975), được xem như
hệ thống nuôi cấy mẻ nhưng bị giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất. Sinh khối tại
bất kỳ thời điểm nào trong quá trình nuôi cấy được trình bày theo phương trình:
xt = xo + Y(si - sr) (2.20)
trong đó xo là nồng độ giống nạp vào hệ thống.
Khi sr = 0 và xt = xmax; do x0 << xmax
(2.21)

xmax = Y × si
Nếu tại thời điểm sr = 0, môi trường được bổ sung vào với D < µmax thì toàn bộ
môi trường vừa mới được bổ sung sẽ được sử dụng ngay (ds/dt = 0), và ta có:
F.si = µ × (X/Y)

(2.22) với X = x × V.
F

F

xt, Sr

Vfeed

Vo, xo, So

(A)

(B)

Hình 2. 4. Sơ đồ tệ thống lên men mẻ-bổ sung.
(A): Lên men mẻ-bổ sung giới hạn thể tích
(B): Lên men mẻ-bổ sung không giới hạn thể tích
Theo cách này, tổng sinh khối sẽ tăng dần trong khi đó nồng độ tế bào hầu
như không tăng (dx/dt = 0), do vậy µ = D. Đây được xem như là trạng thái cân bằng.
Khi thể tích dịch lên men trong nồi tăng, tỷ lệ pha loãng giảm xuống, và như vậy:
D = F/(V0 + F × t) (2.23)
17


Theo phương trình Monod, Khi sr giảm thì D sẽ giảm, do vậy sẽ x tăng lên. Tuy
nhiên trong hệ thống nuôi cấy mẻ-bổ sung thì ở bất kỳ giá trị nào của µ thì si >> Ks
nên trong thực tế sr thay đổi rất nhỏ. Do vậy, ở trạng thái được coi như là cân bằng
ổn định thì D < µmax và Ks << si.
Sự thay đổi nồng độ sản phẩm trong hệ thống này tương tự như trong nuôi

cấy liên tục được biểu diễn theo cân bằng:
dp/dt = ρx – D.p (2.24)
Ở trạng thái cân bằng tức là lượng sản phẩm sinh ra cân bằng với độ pha
loãng do nạp dịch bổ sung vào thì nồng độ sản phẩm trong hệ thống sẽ không thay
đổi, dp/dt = 0, khi đó:
p = ρ.x/D
(2.25)

4.2. Lên men mẻ-bổ sung không thay đổi thể tích
Theo Pirt (1979), cơ sở của hệ thống này được xem như trong trường hợp
nuôi cấy mẻ trong đó do sự tăng trưởng của chủng đã gây nên sự cạn kiệt cơ chất
giới hạn đạt đến một mức nhất định. Sau đó cơ chất này được bổ sung với nồng độ
cao, không làm thay đổi đến thể tích dịch lên men. Động học trong hệ thống này
được mô tả như sau:
dx/dt = G.Y (2.26)
trong đó G là tốc độ nạp cơ chất.
Do dx/dt = µx, nên:
G.Y = µx

µ = G.Y/x
(2.27)
Nếu GY/x < µmax thì khi bổ sung cơ chất vào chúng sẽ được sử dụng ngay, lúc
đó ds/dt = 0. Tuy nhiên do dx/dt > 0 vì x và X tăng theo thời gian nên:
(2.28)
xt = x0 + G.Y.t
Trong đó x0, xt là nồng độ tế bào khi bắt đầu và sau khi vận hành hệ thống mẻ-bổ
sung được t giờ nuôi cấy.
Khi x tăng lên, µ giảm dần. Nồng độ của cơ chất giới hạn hầu như không thay
đổi, sinh khối tăng dần và nồng độ các chất không giới hạn trong môi trường giảm
dần.

Sự cân bằng sản phẩm trong hệ thống này được biểu diễn như sau:
dp/dt = ρ.xt
(2.29)
dp/dt = ρ.(x0 + G.Y.t)
(2.30)

18


5. Lên men mật độ cao
Như đã đề cập trong phương pháp lên men mẻ, tổng lượng sinh khối sinh ra
trong quá trình lên men là từ nguồn dinh dưỡng nhất định trong môi trường chuẩn
bị ban đầu. Nồng độ các thành phần môi trường được thiết kế để bảo đảm tốc độ
tăng trưởng là tốt nhất. Do vậy, để tăng mật độ tế bào cần phải bổ sung dinh dưỡng
trong quá trình nuôi cấy và như vậy, lên men mật độ cao chỉ có thể đạt được trong
trường hợp nuôi cấy mẻ-bổ sung và thành phần bổ sung vào phải có nồng độ cao để
thể tích dịch lên men hoặc không thay đổi hoặc thay đổi ít.
Trong lên men sản xuất công nghiệp, cho dù sản phẩm sinh ra là nội bào hay
ngoại bào, với một điều kiện thích hợp thì chủng nuôi cấy sẽ có một giá trị về tốc độ
sản xuất đặc trưng (ρ) nhất định:
ρ = (P/X)/t (2.31)

P = ρ.X.t
(2.32)
trong đó P là tổng lượng sản phẩm thu được sau thời gian nuôi cấy t, X là tổng lượng
sinh khối tham gia sản xuất. Từ phương trình trên ta thấy, để thu được P nhiều, cần
phải tăng X.
X = x.V
(2.32)
với V là thể tích dịch lên men, x là nồng độ tế bào trong dịch lên men. Do thể tích

dịch lên men bị giới hạn bởi dung tích nồi lên men nên để đạt X cao cần phải tăng
nồng độ tế bào x trong quá trình lên men.
Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng nồng độ tế bào và nồng độ tế bào này có
thể tăng được tới mức nào? Chúng ta sẽ đề cập vấn đề này trong những chuyên đề
sau.

19


CHƯƠNG 3. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN CÔNG NGHIỆP
1. Giới thiệu
Trong phần này, chúng ta tập trung phân tích qui trình lên men công nghiệp
theo phương pháp chìm, hiếu khí, có kiểm soát vì đây là qui trình bao gồm đầy đủ
các thành tố của một qui trình lên men tiêu chuẩn. Qui trình này thường bao gồm các
công đoạn sau:
- Giữ giống
- Hoạt hóa giống
- Nhân giống (sơ cấp, thứ cấp)
- Lên men sản xuất
- Thu hồi sản phẩm lên men
- Xử lý các chất thải sinh ra trong quá trình sản xuất sản phẩm lên men
Tùy theo chủng vi sinh vật, yêu cầu của sản phẩm mục tiêu và hệ thống công
nghệ thiết bị mà điều kiện của từng bước trong qui trình lên men có thể khác nhau.
Tuy nhiên, để đảm bảo được hiệu quả sản xuất tốt và ổn định nhất thì toàn bộ các
hoạt động có liên quan đến lên men có một đặc điểm chung là cần được thực hiện
trong điều kiện có kiểm soát vô trùng.
Nếu không đề cập đến các yếu tố về kiểu nồi lên men, về cơ bản một hệ thống
lên men bao gồm sáu thành phần sau:
1. Công thức môi trường sử dụng trong qui trình nuôi cấy vi sinh vật từ giai
đoạn nhân giống cho đến giai đoạn lên men sản xuất.

2. Điều kiện vô trùng của môi trường nuôi cấy, nồi lên men và các thiết bị liên
quan trong hệ thống.
3. Bảo đảm nhân giống đủ số lượng với độ thuần nhất và chất lượng cao
trước khi nạp vào nồi lên men chính.
4. Sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật trong sản xuất dưới điều kiện tối ưu
để tạo thành các sản phẩm mong muốn.
5. Chiết tách, tinh sạch và kết tinh sản phẩm.
6. Xử lý chất thải của quá trình sản xuất.
Các yếu tố này liên quan chặt chẽ với nhau theo một qui trình được mô tả
trong Hình 3. 2. Từng yếu tố độc lập có thể được nghiên cứu cải tiến phù hợp để cuối
cùng nâng cao hiệu quả sản xuất của toàn hệ thống.
Trước khi tiến hành xây dựng hệ thống lên men cần phải chọn lọc chủng giống
vi sinh vật bảo đảm sinh tổng hợp đúng sản phẩm mong muốn với hàm lượng cao.
20


Việc chọn lọc chủng giống thường được thực hiện bởi các phòng nghiên cứu có năng
lực và kinh nghiệm trong lĩnh vực phát triển chủng giống. Ngoài ra, cần phải thực
hiện đánh giá hiệu quả và tính ổn định của chủng trước khi đưa vào ứng dụng cho
sản xuất. Việc tuyển chọn chủng giống phục vụ sản xuất công nghiệp dựa trên một số
tiêu chí sau:
- Đặc tính dinh dưỡng của chủng (dùng cơ chất thông dụng, rẻ tiền)
- Nhiệt độ tối thích của chủng (chọn chủng có nhiệt độ tối thích cao, giảm chi
phí hệ thống giải nhiệt trong lên men công nghiệp)
- Tính ổn định của chủng trong quá trình sử dụng
- Năng suất sinh tổng hợp sản phẩm cao
Dựa vào loại sản phẩm lên men và các yêu cầu về độ tinh sạch của sản phẩm,
hệ thống thu hồi chiết tách và tinh sạch sản phẩm được thiết kế để bảo đảm hiệu
suất cao, đạt tiêu chuẩn như mong muốn. Trong quá trình vận hành sản xuất, cả ba
yếu tố chính: chủng giống, qui trình lên men, qui trình thu hồi cần phải được nghiên

cứu cải tiến liên tục nhằm thu nhận được nhiều sản phẩm với chất lượng cao.
Chủng giống vi sinh vật được thu thập (phân lập, tuyển chọn) và phân phối từ
các trung tâm lưu trữ giống danh tiếng trên thế giới (Xem phụ lục 4).

2. Các công đoạn của qui trình lên men
2.1. Giữ giống
Việc giữ giống có vai trò rất quan trọng đối với một qui trình lên men nhằm
bảo đảm được nguồn cung cấp giống ổn định cho nghiên cứu và sản xuất.
Quá trình giữ giống cần phải bảo đảm một số yêu cầu sau:
- Duy trì hoạt tính giống trong thời gian dài, không xảy ra hiện tượng thoái
hóa giống, giảm khả năng tăng trưởng hoặc/và giảm năng lực sản xuất của giống.
- Không bị tạp nhiễm
Các phương pháp giữ giống khác nhau trong công nghiệp bao gồm:

a. Giữ giống ở nhiệt độ thấp
a1. Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng. Giống vi sinh vật có thể được giữ
trên bề mặt môi trường thạch nghiêng (đối với các chủng hiếu khí) với nhiệt độ giữ
giống từ –20 ~ 50C. Trong quá trình giữ giống, phải cấy chuyền theo chu kỳ khoảng 6
tháng một lần. Phương pháp cấy chuyền tuy đơn giản nhưng lại có những nhược điểm
sau:
+ Dễ bị tạp nhiễm và dễ mất chủng giống gốc.
+ Tốn nhiều công sức cấy chuyền.
21


hợp.

+ Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy chuyền không thích

+ Chủng vi sinh vật có thể bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến phát

sinh qua nhiều lần cấy chuyền.
+ Phải nghiên cứu, theo dõi môi trường và thời gian cấy chuyền thích hợp đối
với các chủng bảo quản.
+ Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản.
Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền, giúp giữ giống trong
thời gian dài người ta thường giữ giống trên bề mặt môi trường thạch nghiêng có
phủ một lớp dầu bảo vệ, thời gian giữ giống có thể kéo dài đến 1 năm.
a2. Giữ giống trong nitơ lỏng (đông sâu). Khi giữ giống ở nhiệt độ thấp (-150 ~
-196oC), hoạt động biến dưỡng của vi sinh vật giảm hẳn, hầu hết các phản ứng sinh
hoá đều không xảy ra, các phân tử nước tồn tại ở dạng liên kết hoặc tinh thể. Đây là
phương pháp giữ giống khá an toàn cho nhiều loài vi sinh vật khác nhau như vi
khuẩn, nấm mốc, nấm men, virus, tảo và cả tế bào động vật, thực vật. Tuy nhiên khi
giữ giống bằng phương pháp này thì tế bào có thể bị phá vỡ và làm tan mẫu trong
quá trình bảo quản lạnh do tích luỹ các chất điện giải và hình thành các tinh thể
nước trong tế bào. Thông thường người ta cho chủng vi sinh vật cần giữ phát triển
đến phase ổn định, bổ sung chất bảo vệ (thường là glycerol 10%; DMSO: dimethyl
sulfoxide), sau đó làm lạnh và giữ. Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp này khá tốn
kém cho thiết bị, nguồn nitơ lỏng và một số rủi ro về vấn đề an toàn như cháy nổ.

Hình 3. 1. Hệ thống bình nitơ lỏng dùng để giữ giống.

22


b. Giữ trong điều kiện khử nước
b1. Nuôi cấy khô. Phương pháp này thường được áp dụng đối với bào tử nấm
sợi. Các bước tiến hành bao gồm ủ đất vô trùng với bào tử nấm khoảng vài ngày cho
phát triển, làm khô ở nhiệt độ phòng khoảng 2 tuần, sau đó cất giữ ở điều kiện
không khí khô hoặc tủ lạnh.
b2. Giữ ở điều kiện khử nước trong giá thể

+ Giữ giống trong cát
Phương pháp này thường dùng để giữ các vi sinh vật có bào tử. Các bước tiến
hành như sau:
- Cát sông được đem rửa sạch bằng nước nhiều lần, sấy khô, rây để bỏ các hạt
lớn; xử lý ngâm trong HCl đậm đặc sau đó đem đun sôi 1-2 giờ, rửa nhiều lần cho
đến khi pH đạt trung tính, có thể trung hòa bằng NaOH hoặc NaHCO3 nếu pH còn
thấp; sấy khô 100oC từ 3 - 4 giờ; chia cát khô vào các ống nghiệm và khử trùng trong
tủ sấy 160 - 180oC từ 2-3 giờ hoặc khử trùng trong autoclave 130oC trong 90 phút.
Trước khi sử dụng phải kiểm tra độ vô trùng bằng cách cho môi trường LB vào cát
đã vô trùng, nếu môi trường vẫn trong sau 48 giờ nuôi trong tủ ấm nghĩa là cát
không chứa các vi sinh vật lạ nên có thể dùng; nếu môi trường bị đục thì phải đem
cát khử trùng lại.
- Chuẩn bị bào tử: các chủng vi sinh vật được nuôi trên môi trường agar thích
hợp để tạo nhiều bào tử, thời gian thường đối với một số loài như sau: vi khuẩn 7
ngày, nấm mốc 7-8 ngày, xạ khuẩn 14 ngày.
- Trộn bào tử vào cát: cho 1-2g cát đã vô trùng vào ống giống vi sinh vật đã
hình thành bào tử dùng que cấy trộn đều bào tử với cát, tránh làm cát bị ướt quá vón
cục, cho cát đã có bào tử vào ống nghiệm vô trùng, đậy nút bông và cho vào tủ sấy,
giữ ở 40oC hoặc tủ sấy chân không có chất hút ẩm như CaCl2 trong thời gia 2-3 ngày
cho đến khi cát thật khô, dùng paraffin đặc đun nóng chảy phết lên nút bông để
tránh trường hợp hút ẩm trở lại, bảo quản trong phòng mát, hoặc trong tủ lạnh 4oC,
thời gian bảo quản từ 1 đến nhiều năm, giống trước khi dùng được cấy ria trên môi
trường thạch và chọn các khuẩn lạc điển hình.
+ Giữ giống trong đất
Một số vi sinh vật có bào tử Clostridium pastetianum thường được bảo quản
tốt trong đất. Các bước tiến hành: đất vườn đem nghiền nhỏ, rây lấy những hạt nhỏ
bằng nhau cỡ 1 mm. Nếu đất chua thì cần bổ sung 1-2% CaCO3 và thêm cát hoặc than
hoạt tính khoảng 2% để làm cho đất được tơi xốp. Cho vào mỗi ống nghiệm vô trùng
khoảng 1-2 g đất, đậy nút bông, khử trùng 121oC trong 1 giờ với 2 lần liên tiếp mỗi
lần cách nhau 24 giờ. Cần phải kiểm tra vô trùng trước khi đem trộn với bào tử vi

23


sinh vật, sấy khô, bảo quản như phương pháp bảo quản trong cát. Thời gian bảo
quản có thể đến 10 năm.
+ Giữ giống trên silicagel
Cách làm: Silicagel nghiền mịn cỡ 1 mm, phương pháp tương tự như giữ giống
trên cát.
+ Giữ giống trên hạt ngũ cốc
Các hạt như lúa, ngô, kê… đều có thể được sử dụng để giữ giống vi sinh vật.
Cách làm: chọn loại hạt tốt, loại bỏ tạp chất, rửa sạch cho vào nước sôi theo tỷ lệ
100g hạt / 30 ml nước sôi, khuấy đều, ngâm 30 phút, lọc bỏ nước, rải hạt lên khay
sạch để ráo nước, cho vào bình tam giác khoảng 15-16g/ bình 250ml, đậy nút bông,
khử trùng 121oC trong 40 phút, 3 lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ. Bào tử của vi sinh
vật đem hòa vào nước vô trùng, dùng pipet cấy vào mỗi bình 3 ml, lắc đều nuôi ở
nhiệt độ thích hợp cho từng loại chủng trong thời gian 8-10 ngày, hằng ngày lắc nhẹ
để phá vỡ các khối hạt bết lại, làm khô trong tủ hút chân không cho đến khi độ ẩm
còn khoảng 8%. Kiểm tra độ thuần khiết và khả năng sống của giống trước khi dán
paraffin trên nút bông và bảo quản trong phòng mát.

b3. Phương pháp đông khô. Làm đông một dung dịch tế bào trong điều kiện
chân không, kéo theo sự thăng hoa của các phân tử nước. Huyền phù dịch nuôi cấy
được trong các môi trường bảo vệ như sữa, serum, hoặc glutamate natri, sau đó làm
đông khô và giữ trong tủ lạnh. Thời gian bảo quản có thể đến hơn 10 năm. Ưu điểm
của phương pháp này là tỷ lệ sống sót của vi sinh vật rất cao, các đặc tính di truyền
của vi sinh vật không bị biến đổi và thời gian giữ giống được kéo dài khá lâu, ít tốn
công sức để cấy chuyền nhiều lần.
Cách làm: nuôi vi sinh vật trên các môi trường thích hợp cho đến phase log, thu tế
bào và trộn với các chất bảo vệ, dùng pipet vô trùng phân từng 0,2 ml huyền phù vi
sinh vật vào các ống đông khô chuyên dùng, cho các ống giống vi sinh vật đã chuẩn

bị vào làm lạnh trong băng khô cacbonic + cồn etylic ở nhiệt độ -70oC đến -80oC,
trong khoảng 1-5 phút. Tiếp theo đưa vi sinh vật vào làm khô trong thiết bị đông khô
ở áp suất thấp, thời gian làm khô tùy thuộc vào thiết bị và số lượng giống cần làm
khô, trung bình 8-14 giờ, độ ẩm sau khi làm khô còn lại 1-4% . Để xác định độ ẩm
còn lại người ta dùng chất chỉ thị là CoCl2 tẩm trên các miếng giấy lọc, sấy khô và bỏ
các miếng giấy có tẩm CoCl2 vào các ống nghiệm kiểm tra, nếu giống đã được làm
khô thì giấy có màu xanh còn nếu độ ẩm còn thì miếng giấy sẽ có màu hồng. Các ống
giống khi đã khô được hàn kín để tránh bị ẩm trở lại và có thể bảo quản ở nhiệt độ
phòng hoặc trong tủ lạnh. Một số chất bảo vệ được trộn vào giống vi sinh vật để khi
đông khô tế bào không bị chết do sự hình thành các tinh thể nước cũng như chống

24