Bài thực tập tốt nghiệp Tìm hiểu tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV

Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến những người thầy, người
cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã tận
tình và tâm huyết truyền đạt những kiến thức nền tảng về ngành học cho em trong
suốt 4 năm qua. Những kiến thức thầy cô truyền đạt thật sự rất cần thiết và quan
trọng giúp em có cơ sở để viết lên bài Thực tập tốt nghiệp này.
Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Lê Huyền Ái Thúy và cô
Trương Kim Phượng đã chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn
thành đề tài tốt nghiệp của mình. Em mãi trân trọng và biết ơn về điều đó.
Cảm ơn những người bạn cùng lớp, cùng phòng và những bạn cùng nhóm thí
nghiệm đã luôn ở bên động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi những lúc tôi khó khăn nhất.
Cuối cùng, điều không thể thiếu sót, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã sinh
con ra, nuôi dưỡng và đem đến cho con những điều tốt đẹp nhất trong cuộc sống
này. Con biết ơn rất nhiều vì ba mẹ đã tạo cho con điều kiện tốt nhất để con yên
tâm học hành trong suốt 4 năm qua.
Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học, kính mong thầy
cô có thật nhiều sức khỏe, mãi luôn đồng hành cùng sinh viên thân yêu trong sự
nghiệp giáo dục của đất nước.
Tôi xin chúc những người bạn của tôi sẽ hoàn thành xuất sắc đề tài thực tập tốt
nghiệp của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Bình Dương, ngày 01/2016
Sinh viên thực tập
Trần Thị Thùy Trinh

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iv
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN ..............................................................................................3
I.1 Tổng quan về ung thƣ .........................................................................................3
I.1.1 Khái niệm ung thư ........................................................................................3
I.1.2 Phân loại khối u ...........................................................................................4
I.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới ..............................................4_Toc440832480
I.1.4 Tình hình ung thư ở Việt Nam ......................................................................5
I.2 Ung thƣ cổ tử cung .............................................................................................6
I.2.1 Các giai đoạn của ung thư cổ tử cung .........................................................7
I.2.2 Phân loại ung thư cổ tử cung .......................................................................7
I.2.3 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung .................................................8
I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới ..................................................9
I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam ............................10_Toc440832489
I.3 Tổng quan về HPV ...........................................................................................11
I.3.1 Human papillomavirus (HPV) ...................................................................11
I.3.2 Phân loại type HPV....................................................................................12
I.3.3 Ung thư gây ra bởi HPV ............................................................................12
I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư của HPV ............................................................13
I.4 Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG .................................................14
I.4.1 Epigenetics .................................................................................................14

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
I.4.2 Sự methyl hóa DNA ....................................................................................15

I.4.3 Đảo CpG ....................................................................................................16
I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase)...............................................16
I.5.1 Vị trí, cấu trúc ............................................................................................16
I.5.2 Chức năng ..................................................................................................17
I.5.3 Sự methyl hóa trên gen DAPK ...................................................................18
I.6 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) .......................................................19
I.6.1 Vị trí, cấu trúc ............................................................................................19
I.6.2 Chức năng ..................................................................................................20
I.6.3 Sự methyl hóa trên gen RARB ....................................................................21
I.7 Phƣơng pháp xác định trạng thái methyl hóa DNA .........................................22
I.7.1 Phương pháp MSP (Methylation – specific PCR) .....................................22
I.7.2 Phương pháp Nested-MSP .........................................................................24
PHẦN II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................25
II.1 Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................25
II.1.1 Khảo sát dữ liệu ........................................................................................25
II.1.2 Khảo sát in silico ......................................................................................25
PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................27
III.1 Kết quả khai thác dữ liệu ...............................................................................27
III.1.1 Gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) .................................27
III.1.2 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) ..............................................33
III.2 Kết quả khảo sát in silico ...............................................................................39
III.2.1 Gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) .................................39
III.2.2 Gen RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) ..............................................45

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................51
IV.1 Kết luận..........................................................................................................51

IV.2 Đề nghị ..........................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................53
PHỤ LỤC ............................................................................................................... PL1

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

Base pairs

CIS

Carcinomar in situ

CIN

Cervical intraepithelial neoplasia

CpG

Cytosine phosphodiester guanine

DAPK

Death-Associated Protein Kinase

DNA

Deoxyribonucleotic acid

HPV

Human papillomavirus

IARC

International Agency for Research on Cancer

IDT

Integrated DNA Technologies

kD

KiloDalton

MF

Methylated forward

MR

Methylated reverse

MS-MLPA

Methylation specific multiplex ligation-dependent

probe amplification

MSP

Methylation specific PCR

NCBI

National Center for Biotechnology Information

NSCLC

Non-small cell lung carcinoma

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymeration chain reaction

QMSP

Quantitative MSP

RARB

Retinoic Acid Receptor Beta

RNA

Ribonucleic acid

SCC

Squamous cell carcinomar

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang i


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
SIL

Squamous intraepithelial lesion

STT

Số thứ tự

TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

Tm

Temperature melt

UF

Unmethylated forward

UR

Unmethylated reverse

UTCTC

Ung thƣ cổ tử cung

WHO

World Health Organization

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang ii


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Bộ dữ liệu tài liệu về gen DAPK
Bảng 3.2: Tần suất methyl hóa gen DAPK trong các loại ung thƣ
Bảng 3.3: Bộ dữ liệu tài liệu về gen RARB
Bảng 3.4: Tần suất methyl hóa gen RARB trong các loại ung thƣ
Bảng 3.5: Trình tự bộ mồi methyl và unmethyl gen DAPK
Bảng 3.6: Khảo sát thông số vật lý của bộ mồi methyl và unmethyl gen DAPK
Bảng 3.7: Trình tự bộ mồi methyl và unmethyl gen RARB

Bảng 3.8: Khảo sát thông số vật lý của bộ mồi methyl và unmethyl gen RARB

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang iii


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1:

Sự phân chia ở tế bào bình thƣờng và tế bào ung thƣ

Hình 1.2:

Dự đoán về trƣờng hợp ung thƣ trên toàn cầu năm 2012 – 2035

Hình 1.3:

Vị trí cổ tử cung và cổ tử cung bị ung thƣ

Hình 1.4:

Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thƣ tính trên 100.000 ngƣời/ 1

năm trên thế giới (2012)
Hình 1.5:

Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thƣ tính trên 100.000 ngƣời/ 1

năm tại Việt Nam (2012)
Hình 1.6:

Một số bệnh ung thƣ gây ra bởi HPV

Hình 1.7:

Sự methyl hóa bất thƣờng trong ung thƣ

Hình 1.8:

Vị trí gen DAPK trên NST số 9

Hình 1.9:

Gen DAPK trong con đƣờng apoptosis

Hình 1.10:

Vị trí gen RARB trên NST số 3

Hình 1.11:

Một con đƣờng phân tử ức chế tăng sinh tế bào đƣợc kích hoạt bởi

RARB
Hình 1.12:

Một cơ chế chuyển đổi nucleotide từ Cytosine thành Uracil với

sodium bisulfite
Hình 1.13:

Sự biến đổi DNA gốc bởi sodium bisulfite

Hình 1.14:

Bộ mồi cho phƣơng pháp methylation-specific PCR

Hình 1.15:

Sơ đồ phƣơng pháp Nested–MSP

Hình 3.1:

Đồ thị mô tả các phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc sử dụng để khảo

sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK
Hình 3.2:

Đồ thị mô tả các loại mẫu đƣợc sử dụng trong các công trình nghiên

cứu khảo sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang iv


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp

Hình 3.3:

Đồ thị khảo sát các loại ung thƣ liên quan đến tính chất methyl hóa

vùng promoter trên gen DAPK
Hình 3.4:

Đồ thị mô tả các phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc sử dụng để khảo

sát tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen RARB
Hình 3.5:

Đồ thị khảo sát các loại ung thƣ liên quan đến tính chất methyl hóa

vùng promoter trên gen RARB
Hình 3.6:

Định vị gen DAPK trên NST số 9

Hình 3.7:

Định vị đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK (Methprimer)

Hình 3.8:

Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc methyl trên trình tự vùng

promoter gen DAPK
Hình 3.9:

Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc unmethyl trên trình tự

vùng promoter gen DAPK
Hình 3.10:

Cấu trúc đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK, vị trí nhận biết

nhân tố phiên mã trên đảo CpG và vị trí bắt cặp của mồi gen DAPK
Hình 3.11:

Định vị gen RARB trên NST số 3

Hình 3.12:

Định vị đảo CpG trên vùng promoter gen RARB (Methprimer)

Hình 3.13:

Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc methyl trên trình tự vùng

promoter gen RARB
Hình 3.14:

Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc unmethyl trên trình tự

vùng promoter gen RARB
Hình 3.15:

Cấu trúc đảo CpG trên vùng promoter gen RARB, vị trí nhận biết nhân

tố phiên mã trên đảo CpG và vị trí bắt cặp của mồi gen RARB

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang v


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thƣ cổ tử cung (cervical cancer) là bệnh ung thƣ đứng hàng thứ tƣ trong nhóm
ung thƣ gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới. Theo báo cáo của tổ chức Y tế
Thế giới (WHO, 2012), hàng năm có khoảng 528.000 trƣờng hợp mới mắc bệnh
ung thƣ cổ tử cung và có khoảng 266.000 trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung bị tử vong.
Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 5.146 trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung mới đƣợc
phát hiện[81]. Theo WHO, tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thƣ cổ tử cung tăng cao nếu các
trƣờng hợp mắc bệnh đƣợc phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp.
HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae[77], có hơn 100 type HPV.
Nhóm HPV nguy cơ cao là nguyên nhân gây bệnh ung thƣ cổ tử cung, gồm có các
type: 16, 18, 31, 33, 35,... Nhóm HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân dẫn đến bệnh lý
sùi mào gà (Condyloma Acuminata) gồm các type: 6, 11, 42, 43, 44. Đáng lƣu ý,
HPV type 16 và HPV type 18 là yếu tố nguy cơ cao dẫn đến khoảng 70% các
trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung trên toàn thế giới[14][16][76][96]. Bên cạnh đó, một số
yếu tố nguy cơ khác dẫn đến sự hình thành và diễn tiến của ung thƣ cổ tử cung nhƣ
sự biến đổi epigenetics trong bộ gen, sử dụng thuốc tránh thai, hút thuốc lá,…[16].
Một số công trình nghiên cứu xác định tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc
vùng promoter gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến quá trình
sinh ung[52[69][91]. Tính chất methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) DNA ở nhóm
gen nêu trên đƣợc xem là dấu chứng sinh học (biomarker) trong tiên lƣợng, chẩn
đoán sớm nhiều bệnh ung thƣ, trong đó có bệnh ung thƣ cổ tử cung[41.

Sự methyl hóa liên quan đến việc hình thành khối u ở ung thƣ cổ tử cung đã đƣợc
phát hiện trên nhiều gen, ví dụ nhƣ DAPK, RARB, p16,…[91].
Gene DAPK (Death-associated protein kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21.
Protein DAPK là nhân tố điều hòa dƣơng cho cơ chế chết theo chƣơng trình của tế
bào (apoptosis)[100]. Ở trạng thái bình thƣờng, DAPK ức chế khối u, tuy nhiên trong
trƣờng hợp đảo CpG trên vùng promoter bị methyl hóa thì hoạt động của DAPK bị
ức chế dẫn đến ung thƣ cổ tử cung[59][91].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 1


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
Gene RARB (Retinoic Acid Receptor Beta) nằm trên nhiễm sắc thể mã hóa cho thụ
thể Retinoic acid beta. Protein RARB thuộc siêu họ thụ thể hormon thyroid- steroid
điều hòa quá trình phiên mã, tham gia vào đƣờng truyền tín hiệu trung gian nội bào
trong quá trình hình thành phôi, sự phát triển và biệt hóa tế bào[101]. Ở trạng thái
bình thƣờng, RARB ức chế khối u[8], tuy nhiên trong trƣờng hợp đảo CpG trên vùng
promoter bị methyl hóa vƣợt mức thì hoạt động của RARB bị ức chế dẫn đến ung
thƣ cổ tử cung[59][74].
Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Tìm hiểu tính chất methyl hóa
trên vùng promoter thuộc gen DAPK và gen RARB ở bệnh nhân Việt Nam với
yếu tố nhiễm HPV”.
Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen
DAPK và gen RARB liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ
mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/nguy cơ thấp hoặc không nhiễm
HPV (mẫu lành).
Nội dung nghiên cứu:
Khảo sát dữ liệu:

 Thu thập bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa gen DAPK và gen RARB liên quan
đến bệnh ung thƣ cổ tử cung, tập trung xác định tần số methyl hóa bất thƣờng
(hypermethylation) trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen DAPK, RARB.
 Xác định phƣơng pháp sinh học phân tử (MSP, Nested-MSP) phù hợp nhằm
khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB.
Khảo sát in silico:
 Thu thập trình tự các gen DAPK, RARB và các đảo CpG trên vùng promoter
thuộc các gen DAPK, RARB. Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl
phù hợp với sinh học phân tử (MSP, Nested-MSP) phù hợp nhằm khảo sát tính
chất methyl hóa trên các gen DAPK, RARB trên bộ mẫu có tính chất không
nhiễm HPV (mẫu lành)/nhiễm HPV type nguy cơ thấp hoặc nguy cơ cao.

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 2


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
PHẦN I: TỔNG QUAN
I.1 Tổng quan về ung thƣ
I.1.1 Khái niệm ung thư
Ung thƣ là các dạng bệnh lý do một số tế bào thoát khỏi sự kiểm soát dẫn đến sự
tăng sinh bất thƣờng hình thành các khối u (u lành, u ác tính) (hình 1.1). Những tế
bào bất thƣờng có khả năng xâm lấn ở các vùng mô lân cận hoặc di trú đến nhiều cơ
quan khác nhau thông qua hệ thống máu và hình thành sự di căn, cuối cùng gây ung
thƣ gây tử vong[3].
Ung thƣ bao gồm hơn 200 bệnh khác nhau đƣợc đặc trƣng bởi sự tăng sinh bất
thƣờng của tế bào khối u, tế bào ác tính (do vƣợt qua sự kiểm soát ―checkpoint‖
trong chu trình tế bào) để hình thành khối u trong cơ quan hoặc các mô. Trong
trƣờng hợp của bệnh ung thƣ máu, tế bào bình thƣờng bị ―áp chế hoặc chèn lấn‖

trong máu và tủy xƣơng[105].

Hình 1.1: Sự phân chia ở tế bào bình thƣờng và tế bào ung thƣ [105]
Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế giới (WHO, 2013), ung thƣ là các dạng bệnh lý
ảnh hƣởng ở tất cả các đối tƣợng, trẻ em, phụ nữ và đàn ông. Một số dữ liệu ghi
nhận bệnh ung thƣ tập trung chủ yếu ở những nƣớc kém phát triển và đang phát
triển. Đối với nam giới, các loại ung thƣ thƣờng gặp là ung thƣ phổi, ung thƣ tuyến

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 3


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
tiền liệt, ung thƣ đại trực tràng, ung thƣ dạ dày và ung thƣ gan. Trong khi đó, đối
với nữ giới các loại ung thƣ thƣờng gặp là ung thƣ vú, ung thƣ đại trực tràng, ung
thƣ phổi, ung thƣ cổ tử cung, và ung thƣ dạ dày.
I.1.2 Phân loại khối u [6]
Theo công bố của Alison năm 2001, khối u bao gồm khối u lành tính hay khối u ác
tính.
Khối u lành tính là các khối u có mức độ phát triển tạo khối chậm nhƣng không xâm
lấn đến các mô lân cận. Khối u lành tính thƣờng ít đặt ra mối đe dọa và thƣờng dễ
dàng cắt bỏ, ngoại trừ khi phát triển trong một không gian giới hạn nhƣ hộp sọ. Tuy
nhiên, nhiều khối u lành tính có tiềm năng ác tính đặc biệt xuất hiện ở trong ruột
già. Do vậy, cần loại bỏ trƣớc khi khối u này phát triển thành khối u ác tính.
Khối u ác tính là các khối u thƣờng có mức độ phát triển nhanh chóng, có khả năng
xâm lấn các mô xung quanh và di cƣ, lây lan đến các cơ quan khác của cơ thể. Các
tế bào khối u ác tính có thể tách ra khỏi khối u nguyên phát theo hệ thống máu và
bạch huyết để hình thành các khối u thứ phát.
I.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới

Theo Globocan (2012), có 14,1 triệu trƣờng hợp mới mắc ung thƣ, 8,2 triệu ca tử
vong do ung thƣ và 32,6 triệu ngƣời đang sống với ung thƣ (trong vòng 5 năm chẩn
đoán) trên toàn thế giới. Có khoảng 57% trong các trƣờng hợp mắc ung thƣ mới,
65% của các trƣờng hợp tử vong do ung thƣ và 48% trong các trƣờng hợp ung thƣ
(phổ biến trong 5 năm) xảy ra ở các khu vực kém phát triển.
Hơn 60% trong tổng số các trƣờng hợp mới mắc ung thƣ hàng năm xảy ra ở Châu
Phi, Châu Á, Trung và Nam Mỹ. Những khu vực này chiếm khoảng 70% các ca tử
vong do ung thƣ trên thế giới[104].
Theo Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thƣ (International Agency for Research
on Cancer, IARC) của WHO đã dự đoán số trƣờng hợp mắc mới ung thƣ ƣớc tính
từ 14 triệu ngƣời vào năm 2012 sẽ lên 22 triệu ngƣời sau 2 thập kỷ nữa (hình 1.2).

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 4


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
Cũng trong giai đoạn này, số trƣờng hợp tử vong do ung thƣ ƣớc tính sẽ tăng từ 8,2
triệu mỗi năm lên 13 triệu ngƣời.

Hình 1.2: Dự đoán về trƣờng hợp ung thƣ trên toàn cầu năm 2012 - 2035
I.1.4 Tình hình ung thư ở Việt Nam
Theo số liệu báo cáo tại một hội nghị khoa học quốc tế về phòng chống và kiểm
soát ung thƣ đƣợc tổ chức tại Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội (2013), Việt Nam có
khoảng 110.000 trƣờng hợp mới mắc ung thƣ ở Việt Nam mỗi năm và hơn 73%
trƣờng hợp mắc ung thƣ đã tử vong. Đây là một trong những tỷ lệ cao nhất trên thế
giới. Theo báo cáo tại hội nghị, 15 dạng ung thƣ phổ biến nhất ở Việt Nam gồm có:
ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ruột già, dạ dày, gan, tuyến tiền liệt, tử cung, cổ tử cung,
thực quản, bàng quang, u lympho không hodgkin, khoang miệng, ung thƣ máu, tụy,

buồng trứng và thận.
Bệnh nhân bị ung thƣ vú ở Hà Nội cao hơn ở TP.HCM 1,5 lần. Ung thƣ gan là rất
phổ biến ở nam giới tại TP.HCM trong khi đó ung thƣ phổi là loại ung thƣ phổ biến
ở Hà Nội. Tại Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội, số lƣợng bệnh nhân ung thƣ có xu
hƣớng tăng và số ngƣời chết hàng năm do ung thƣ trung bình khoảng 82.000 ngƣời,
chiếm 73,5% trong tổng số bệnh nhân tại bệnh viện[97].
SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 5


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
Tại Bệnh viện K (Hà Nội), số lƣợng bệnh nhân ung thƣ tăng 20-30% mỗi năm. Hầu
hết bệnh nhân tìm đến bác sĩ khi họ đang ở vào giai đoạn cuối, do đó tỷ lệ chữa khỏi
bệnh ung thƣ là thấp[97].

I.2 Ung thƣ cổ tử cung
Ung thƣ cổ tử cung (cervical cancer) là dạng ung thƣ ác tính, hình thành từ tầng tế
bào biểu mô trong vùng cổ tử cung[98]. Các tế bào bình thƣờng của cổ tử cung trải
qua quá trình bị biến đổi từ giai đoạn tiền ung thƣ chuyển biến thành ung thƣ cổ tử
cung. Giai đoạn tiền ung thƣ gồm các dạng tổn thƣơng và loạn sản (dysplasia): tân
sản (loạn sản) nội biểu mô (cervical intraepithelial neoplasia, CIN), tổn thƣơng biểu
mô vảy (squamous intraepithelial lesion, SIL)[99] (hình 1.3).

Hình 1.3: Vị trí cổ tử cung và cổ tử cung bị ung thƣ[95]
Các loại ung thƣ cổ tử cung: ung thƣ biểu mô tế bào vảy (squamous cell carcinoma,
SCC) và ung thƣ tuyến (adenocarcinoma). Các loại khác của bệnh ung thƣ cổ tử
cung, chẳng hạn nhƣ u mêlanin và ung thƣ hạch bạch huyết,…[99].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 6


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
I.2.1 Các giai đoạn của ung thư cổ tử cung[95]
Sàng lọc ung thƣ cổ tử cung đƣợc thực hiện bởi thử nghiệm Pap’ Smear nhằm phát
hiện các tế bào tiền ung thƣ, tế bào bất thƣờng. Nếu ung thƣ không đƣợc phát hiện
sớm, nó có thể lây lan từ cổ tử cung vào âm đạo và các khu vực quanh cổ tử cung.
Giai đoạn phát triển tiếp tục của ung thƣ cổ tử cung có thể lây đến hạch bạch huyết
vùng chậu và các cơ quan lân cận vùng chậu. Cuối cùng, các tế bào ung thƣ có thể
di căn đến các cơ quan nội tạng khác nhƣ thận, gan và phổi, thông qua hệ thống
bạch huyết hoặc máu.
Có 4 giai đoạn của ung thƣ cổ tử cung:
 Giai đoạn I: Đây là giai đoạn hình thành u nhú, khối u khu trú hoàn toàn tại
cổ tử cung.
 Giai đoạn II: Ung thƣ đã lan tràn ra các mô cạnh cổ tử cung nhƣng chƣa lan
tràn đến vùng chậu.
 Giai đoạn III: Ung thƣ đã lan rộng xuống 1/3 dƣới âm đạo và/hoặc các vùng
lân cận trong vùng chậu, có thể gây ra các vấn đề vùng thận.
 Giai đoạn IV: Ung thƣ đã lan đến bàng quang, trực tràng và các bộ phận
khác của cơ thể.
I.2.2 Phân loại ung thư cổ tử cung
Dựa vào những thay đổi tổn thƣơng biểu mô tế bào vảy (squamous intraepithelial
lesion, SIL), có thể phân chia thành hai loại:
SIL mức độ thấp (low squamous intraepithelial lesion, LSIL) đề cập tới những thay
đổi sớm về kích thƣớc, hình dáng và số lƣợng tế bào biểu mô cổ tử cung. Thông
thƣờng, một số tổn thƣơng LSIL có thể tự biến mất. Tuy nhiên, theo thời gian, một
số tổn thƣơng khác có thể phát triển rộng hơn hoặc trở nên bất thƣờng hơn, tạo nên
tổn thƣơng mức độ cao (high squamous intraepithelial lesion, HSIL)[93].

Ở mức độ tiền ung thƣ, các dạng LSIL đƣợc phân loại theo hiện tƣợng loạn sản nhẹ
hoặc hiện tƣợng tân tạo trong biểu mô cổ tử cung 1 (CIN 1). Những thay đổi ban

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 7


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
đầu nhƣ vậy thƣờng xảy ra nhất ở những phụ nữ tuổi từ 25-35 nhƣng cũng có thể
xuất hiện ở những nhóm tuổi khác[93].
HSIL diễn ra khi có sự tăng sinh bất thƣờng của các tế bào có dấu hiệu tiền ung thƣ
trên vùng biểu mô cổ tử cung. Do ở giai đoạn sớm, nên khó phân biệt nhóm tế bào
này với tế bào thƣờng (lành). Những tế bào tiền ung thƣ có thể không trở thành tế
bào ung thƣ và không xâm lấn vào những lớp tế bào sâu hơn của cổ tử cung trong
nhiều tháng, có thể trong nhiều năm. Diễn tiến ung thƣ cổ tử cung xuất hiện khi có
HSIL với hiện tƣợng loạn sản mức độ vừa hoặc nặng (CIN 2 hoặc 3) hoặc ung thƣ
biểu mô tại chỗ (carcinomar in situ, CIS). Sự tiến triển ung thƣ thƣờng xuất hiện
nhiều nhất ở những phụ nữ trong độ tuổi từ 30-40 nhƣng cũng có thể xảy ra ở
những độ tuổi khác[93].
I.2.3 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung
I.2.3.1 Nhiễm Human papillomavirus (HPV)
Human papillomavirus là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đến ung thƣ cổ tử cung[81].
Bên cạnh đó, có nhiều bằng chứng cho thấy rằng, HPV là một yếu tố có liên quan
đến ung thƣ đƣờng sinh dục khác (other anogenital cancer) nhƣ hậu môn, âm hộ, âm
đạo, dƣơng vật, ung thƣ đầu và cổ[81].
Các bằng chứng khoa học nhận định các yếu tố nguy cơ có liên quan đến sự phát
triển của ung thƣ cổ tử cung bao gồm: sự biến đổi bất thƣờng cơ chế epigenetics,
mang thai nhiều lần, sử dụng thuốc tránh thai, hút thuốc lá, thuốc ức chế miễn dịch,
nhiễm trùng với các bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục và chế độ dinh dƣỡng[16].

I.2.3.2 Mang thai nhiều lần
Theo báo cáo của Trung tâm nghiên cứu ung thƣ quốc tế (International Agency for
Research on Cancer, IARC), phụ nữ mang thai đủ tháng ba hay bốn lần hoặc phụ nữ
có từ khoảng bảy lần sinh trở lên có nguy cơ mắc ung thƣ cổ tử cung lần lƣợt cao
gấp 2,6 lần và 3,8 lần so với những ngƣời chƣa sinh con[16].
I.2.3.3 Sử dụng thuốc tránh thai

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 8


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
Theo báo cáo của Trung tâm nghiên cứu ung thƣ quốc tế (IARC), việc sử dụng
thuốc tránh thai trong suốt mƣời năm có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thƣ cổ tử
cung lên gấp 4 lần ở phụ nữ bị nhiễm HPV[16]. Ngoài ra, việc sử dụng thuốc ngừa
thai uống trong năm năm hay lâu hơn có thể làm tăng đến 4 lần nguy cơ mắc ung
thƣ cổ tử cung ở phụ nữ nhiễm HPV[56].
I.2.3.4 Hút thuốc lá
Hút thuốc lá đƣợc cho là có liên quan đến ung thƣ cổ tử cung từ cuối những năm
1970[83]. Tổng hợp dữ liệu từ Trung tâm nghiên cứu ung thƣ quốc tế (IARC) cho
thấy rằng, việc hút sáu điếu thuốc mỗi ngày hoặc nhiều hơn có thể làm tăng nguy cơ
bị ung thƣ cổ tử cung ít nhất 2 lần so với ngƣời không hút thuốc[16].
I.2.3.5 Nhiễm trùng với các bệnh lây truyền qua đường tình dục
Phụ nữ có nhiễm HPV và đồng thời bị nhiễm bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục
nhƣ Chlamydia trachomatis và Herpes simplex vius-2 (HSV-2) thì có nhiều khả
năng mắc UTCTC hơn so với phụ nữ không bị đồng nhiễm. IARC ghi nhận phụ nữ
đồng nhiễm HPV và Chlamydia trachomatis hoặc HSV-2 có thể có nguy cơ mắc
ung thƣ cổ tử cung tăng gấp hai lần so với phụ nữ bình thƣờng[16].
I.2.3.6 Chế độ dinh dưỡng

Mặc dù công bố khoa học về mối liên hệ giữa chế độ dinh dƣỡng với ung thƣ cổ tử
cung chƣa đƣợc công bố nhiều, nhƣng một số nghiên cứu đã cho thấy mối liên quan
giữa chế độ ăn các loại trái cây, rau quả với việc giảm nguy cơ UTCTC. Ngoài ra,
có nhiều minh chứng vai trò của vitamin A, các hợp chất carotenoid, vitamin C và
vitamin E có khả năng giảm nguy cơ mắc ung thƣ cổ tử cung[16].
I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới
Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế giới (WHO, 2012), ung thƣ cổ tử cung là loại
ung thƣ phổ biến thứ 4 trong nhóm ung thƣ gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế
giới, với khoảng 528.000 trƣờng hợp mới và 266.000 trƣờng hợp tử vong.

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 9


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
Theo Globocan (2012), ung thƣ cổ tử cung là bệnh ung thƣ phổ biến nhất trên phụ
nữ ở Đông và Trung Phi. Hầu hết các trƣờng hợp tử vong do ung thƣ cổ tử cung xảy
ra ở khu vực các nƣớc kém phát triển.

Hình 1.4: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thƣ tính trên 100.000 ngƣời/ 1
năm trên thế giới (2012)
I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam
Ung thƣ cổ tử cung đứng hàng thứ 2 trong nhóm ung thƣ gây tử vong cao nhất ở
phụ nữ Việt Nam trong độ tuổi 15 – 44. Hàng năm có khoảng 5.146 trƣờng hợp ung
thƣ cổ tử cung mới đƣợc chẩn đoán[81].
Theo số liệu chính thức phát hành tại một hội nghị khoa học quốc tế về phòng
chống và kiểm soát ung thƣ đƣợc tổ chức tại Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội (2013), tỷ
lệ phụ nữ mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung ở TP.HCM là cao hơn so với Hà Nội 6 lần.

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 10


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp

Hình 1.5: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thƣ tính trên 100.000 ngƣời/ 1
năm tại Việt Nam (2012)

I.3 Tổng quan về HPV
I.3.1 Human papillomavirus (HPV)
Human papillomavirus (HPV) là virus thuộc họ Papillomaviridae[77], đƣợc phát
hiện ở nhiều vật chủ khác nhau bao gồm cả động vật và con ngƣời[14].
HPV có hơn 200 type khác nhau về vật liệu di truyền trong đó có khoảng 85 type
đã biết rõ đặc điểm và khoảng 40 type đã đƣợc xác định ở niêm mạc đƣờng sinh
dục ngƣời[14][57].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 11


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
I.3.2 Phân loại type HPV
Dựa vào mối liên quan với ung thƣ cổ tử cung, u nhú và thƣơng tổn da (precursor
lesions), HPV có thể đƣợc chia thành HPV type nguy cơ cao (high-risk HPV types)
và HPV type nguy cơ thấp (low-risk HPV types)[14].
HPV nhóm nguy cơ thấp bao gồm các type: 6, 11, 42, 43 và 44[14]. HPV type nguy
cơ thấp với bộ gen tồn tại độc lập với tế bào chủ, thƣờng chỉ gây ra các u lành biểu

mô (u nhú gai, mụn cóc...)[2]. Tuy nhiên, một số HPV type nguy cơ thấp đƣợc tìm
thấy trong mẫu bệnh phẩm ung thƣ cổ tử cung[14].
HPV nhóm nguy cơ cao bao gồm các type: 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, 66, 68 và 70[14]. HPV type nguy cơ cao đƣợc phát hiện ở những trƣờng hợp
bị tổn thƣơng biểu mô vảy (squamous intraepithelial lesions, SIL). HPV type nguy
cơ cao có khả năng gắn chèn DNA vào bộ gen tế bào chủ, dẫn đến sự rối loạn quá
trình tăng sinh và phân bào, hình thành khối u ác tính và ung thƣ[19]. Đáng lƣu ý,
HPV type 16 và 18 là nguyên nhân gây ra khoảng 70% các trƣờng hợp ung thƣ cổ
tử cung trên toàn thế giới[39][81].
Ngoài ra, một số tác giả còn đề cập đến HPV nhóm nguy cơ trung bình
(intermediate- risk HPV types) bao gồm các type: 9, 10, 15, 38, 42, 65, 66, 67, 68,
69, 70, 71, 72, 76, 79, 80, 82, 90, 91, 105 và 122[14].
I.3.3 Ung thư gây ra bởi HPV
Theo công bố khoa học của Cutts và cộng sự (2007), HPV là nguyên nhân chính
dẫn đến một số bệnh ung thƣ: ung thƣ cổ tử cung (100%), ung thƣ hậu môn (90%),
ung thƣ bộ phận sinh dục ngoài (âm hộ, âm đạo và dƣơng vật) (40%), ung thƣ hầu
họng (>= 12%) và ung thƣ miệng (>=3%) (hình 1.6)[24].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 12


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp

Hình 1.6: Một số bệnh ung thƣ gây ra bởi HPV[24]
I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư của HPV
Số trƣờng hợp dƣơng tính với HPV-16 chiếm khoàng 50% tổng số trƣờng hợp bệnh
nhân ung thƣ cổ tử cung. Thêm vào đó, hơn 50% các trƣờng hợp bệnh nhân có khối
u ác tính dƣơng tính với HPV-18. Điều này cho thấy rằng, sự tích hợp bộ gen HPV

trong một số trƣờng hợp đã góp phần dẫn đến hình thành khối u ác tính.
Trong những thƣơng tổn có episome của HPV, protein E2 trực tiếp ức chế sự biểu
hiện của gen sớm nhƣ là một phần của cơ chế điều hòa quá trình sao chép. Sự chèn
bộ gen virus HPV thƣờng làm mất biểu hiện protein E2, dẫn đến việc giải mã biểu
hiện của 2 oncogenes là E6 và E7[55], đây là hai yếu tố quan trọng dẫn đến rối loạn
sự tăng sinh và sự chết theo chƣơng trình của tế bào chủ[55][68].
Protein E6 ức chế hoạt động của p53 khóa cơ chế chết theo chƣơng trình của tế bào
[68]

. Trong khi đó, protein E7 ức chế pRB kiểm soát chu trình tế bào (cell-cycle)[68].

Do vậy, việc chèn bộ gen virus HPV là một bƣớc cốt yếu trong quá trình dẫn đến
ung thƣ[96].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 13


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
Protein E6 của HPV type nguy cơ cao bao gồm khoảng 150 acid amin và bao gồm 2
motif ngón tay kẽm (zinc finger). Protein E6 định vị ở cả nhân và tế bào chất của tế
bào sừng nhiễm HPV. Một trong những chức năng chính của E6 là khả năng tƣơng
tác gián tiếp với p53 thông qua sự điều hòa chu kỳ tế bào. P53 là một protein ức chế
khối u tham gia vào sự điều khiển điểm dừng ―checkpoints‖ trong chu trình tế bào
của cả pha G1/S và pha G2/M. Để đối phó với sự hỏng DNA và hủy tế bào (cellular
stress), gen ức chế khối u p53 hoạt động phiên mã sự biểu hiện của nhân tố điều hòa
khác nhau, nó bao gồm việc kìm hãm chu trình tế bào hoặc/và gây chết tế bào theo
chƣơng trình (apoptosis). Protein E6 tƣơng tác với p53 bởi sự hình thành phức hợp
với E6AP. Protein p53 bị ubiquitin hóa bởi enzym ubiquitin dẫn đến việc giảm

trạng thái ổn định của p53 qua đó làm giảm khả năng tổng hợp DNA trong tế bào và
cho phép virus sao chép[33].
Protein E7 bao gồm khoảng 98 acid amin và bao gồm 3 vùng bảo tồn gọi là CR1,
CR2 và CR3. Vùng domain CR1 bao gồm motif đầu tận cùng N, CR2 bao gồm
motif LXCXE gián tiếp gắn kết E7 với protein ức chế khối u Rb (retinoblastoma) và
CR3 bao gồm 2 motif ngón tay kẽm (zinc finger). Một trong những chức năng chính
của protein E7 trong chu kỳ sống của HPV là liên kết và làm suy giảm protein
Rb[33]. Protein Rb là yếu tố điều hòa chính của chu trình tế bào. Phosphory hóa Rb
kiểm soát chu trình tại pha G1/S của chu trình tế bào thông qua sự gắn kết với yếu
tố phiên mã E2F, điều này kích hoạt sự phiên mã của nhiều thành phần tham gia
vào sự sao chép trong pha S. Sự liên kết giữa protein E7 và Rb có thể phá vỡ phức
hợp Rb-E2F qua đó giải phóng phức hợp E2F dẫn đến kết quả thúc đẩy sớm pha S
và tổng hợp DNA[33][55]. Các phức hợp E2F đƣợc tìm thấy ở vùng promoter của
nhiều gen, nó có liên quan đến sự điều hòa chu trình tế bào, biệt hóa
(differentiation), phân bào (mitosis) và chết theo chƣơng trình (apoptosis)[55].

I.4 Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG
I.4.1 Epigenetics
Epigenetics lần đầu tiên đƣợc C. H. Waddington định nghĩa là ―sự tƣơng tác nhân
quả giữa gen và sản phẩm của gen, điều đó dẫn đến kiểu hình đƣợc hình thành‖.

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 14


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp
Hiện nay, epigenetics đƣợc nhận định là ―sự biến đổi di truyền trong biểu hiện gen
xảy ra độc lập với sự biến đổi xảy ra trong trình tự DNA ban đầu‖[69].
Cơ chế epigenetics giữ vai trò cho sự phát triển bình thƣờng của tế bào và giữ ổn

định cho biểu hiện gen ở động vật có vú. Sự bất thƣờng của quá trình epigenetics có
thể dẫn đến biến đổi chức năng gen và hình thành tế bào ác tính. Sự biến đổi
epigenetics trong bộ gen đƣợc coi là một dấu hiệu hình thành của ung thƣ.
Epigenetics bao gồm sự methyl hóa DNA, sự biến đổi histone, định vị nucleosome,
các RNA không mã hóa và sự biểu hiện chuyên biệt của microRNA[68].
I.4.2 Sự methyl hóa DNA
Sự methyl hóa DNA là một trong những biến đổi epigenetics đƣợc nghiên cứu
nhiều nhất ở động vật có vú[69]. Nhiều nghiên cứu cho thấy methyl hóa DNA đóng
vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý ở động vật có vú: biểu
hiện gen, phát triển của phôi thai, tăng sinh tế bào, biệt hóa, in dấu bộ gen, bất hoạt
nhiễm sắc thể X và ổn định nhiễm sắc thể[47][54]. Sự methyl hóa DNA thƣờng xảy ra
ở base Cytosine (C) đứng trƣớc base Guanosine (G) ở vùng điều hòa gen thuộc
vùng promoter[4][47].
Sự methyl hóa DNA đƣợc xúc tác bởi nhóm enzym DNA methyltransferase, là phản
ứng hóa học chuyển một nhóm methyl (CH3) từ S-adenosyl-methionine (SAM) đến
vị trí C5 của phân tử Cytosine tạo thành dạng 5-methylcytosine (5mC)[54].
Sự methyl hóa bất thƣờng gồm có methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) và giải
methyl hóa (hypomethylation). Sự methyl hóa vƣợt mức tại vùng đảo CpG thuộc
vùng promoter của gen ức chế khối u dẫn đến sự ―im lặng‖ của các gen này. Ngƣợc
lại, sự giải methyl hóa tại vùng đảo CpG thuộc vùng promoter của các ―oncogene‖
dẫn đến kích hoạt sự biểu hiện của các ―oncogene‖, dập tắt cơ chế chết theo chƣơng
trình của tế bào (hình 1.7)[88].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 15


Báo cáo Thực tập tốt nghiệp

Hình 1.7: Sự methyl hóa bất thƣờng trong ung thƣ[88]
I.4.3 Đảo CpG
CpG là các cặp dinucleotide đƣợc hình thành bởi liên kết phosphodiester giữa
cytosine và guanine. Ở cơ thể ngƣời, các đảo CpG có kích thƣớc trong khoảng 3003000 bp, tập trung ở đầu 5’ của các gen và thuộc 60% các vùng promoter của gen[4].

I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase)
I.5.1 Vị trí, cấu trúc
Gene DAPK (Death-Associated Protein Kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21, có
kích thƣớc 211.407 bp, định vị ở nucleotide 87.497.228 đến 87.708.634 trên nhiễm
sắc thể số 9. Gen DAPK mã hóa protein DAPK, là nhân tố điều hòa dƣơng cho cơ
chế chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis)[67][102].

Hình 1.8: Vị trí gen DAPK trên NST số 9 [100]

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 16