Nghiên cứu chế tạo bộ panel ứng dụng trong đánh giá độ nhạy của kỹ thuật realtime RT PCR chẩn đoán virus ebola

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ PANEL ỨNG DỤNG
TRONG ĐÁNH GIÁ ĐỘ NHẠY CỦA KỸ THUẬT REALTIME
RT-PCR CHẨN ĐOÁN VIRUS EBOLA

Người hướng dẫn:TS. Hoàng Xuân Sử
Sinh viên thực tập: Nguyễn Thùy Linh
Lớp: 12-01 - Khoa công nghệ sinh học

HÀ NỘI - 2016
i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được khóa luận này, đầu tiên, em xin trân trọng gửi lời
cảm ơn đến Tiến sĩ Hoàng Xuân Sử đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn
em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại Trung tâm nghiên cứu Y Dược
học Quân sự - Học viện Quân y.
Em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Hồ Hữu Thọ, Thạc sĩ Đinh Thị Thu
Hằng, cử nhân Phạm Văn Quyền cùng các thầy cô và nhân viênphòng Vi sinh
vật và các mầm bệnh sinh học, phòng Công nghệ gen và di truyền tế bào Trung tâm nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y đã nhiệt tình
giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo tại khoa Công nghệ sinh học
- Viện Đại học Mở Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức cho em trong quá
trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn tới bố mẹ đã sinh thành, nuôi nấng,
giúp đỡ và động viên giúp em tập trung thực hiện và hoàn thành được khóa
luận này.

Trong quá trình thực tập cũng như hoàn thành khóa luận, do kiến thức và
kinh nghiệm còn hạn chế nên em khó tránh khỏi sai sót, rất mong nhận được ý
kiến đóng góp của các thầy, cô để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thùy Linh

ii


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1

DANH MỤC BẢNG

3

DANH MỤC HÌNH ẢNH

4

MỞ ĐẦU

5

PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

7

1.1. Tình hình về dịch bệnh Ebola

7

1.1.1. Tình hình dịch bệnh Ebola trên thế giới
1.1.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
1.2. Giới thiệu virus Ebola

7
15
16

1.2.1. Phân loại

16

1.2.2. Đặc điểm hình dạng, cấu trúc hệ gen

17

1.3. Các triệu chứng, con đường lây truyền và biện pháp phòng bệnh 18
1.3.1. Các triệu chứng

18

1.3.2. Con đường lây truyền

19

1.3.3. Biện pháp phòng bệnh

21

1.4. Các phương pháp chẩn đoán xét nghiệm virus Ebola

23

1.4.1. Phương pháp huyết thanh học

23

1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử

24

1.5. Hiểu biết về panel

26

1.5.1. Khái niệm

26

1.5.2. Các loại panel

26

1.6. Kỹ thuật PCR

27
iii


1.6.1. Nguyên lý

27

1.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

27

1.6.3. Các giai đoạn của phản ứng PCR

29

PHẦN 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

30

2.1. Vật liệu, hóa chất và trang thiết bị

30

2.1.1. Vật liệu, sinh phẩm, hóa chất

30

2.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị

31

2.2. Phương pháp nghiên cứu

32

2.2.1. Kỹ thuật phản ứng PCR

32

2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp chứa gen NP của virus Ebola

33

2.2.3. Kỹ thuật tách và tinh sạch plasmid

34

2.2.4. Kỹ thuật cắt enzyme giới hạn

36

2.2.5. Kỹ thuật giải trình tự gen

37

2.2.6. Kỹ thuật phản ứng realtime RT-PCR

38

2.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

42

2.3.1. Thời gian nghiên cứu

42

2.3.2. Địa điểm nghiên cứu

42

PHẦN 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nhân dòng gen NP của virus Ebola chủng Zaire

43
43

3.1.1. Kiểm tra plasmid chứa gen NP bằng PCR

43

3.1.2. Thiết lập hệ vector tách dòng mang gen NP

43

3.1.3. Kiểm tra plasmid mang gen mã hóa cho NP

44

3.2. Tổng hợp ARN in-vitro
3.2.1. Tổng hợp mẫu đối chứng ARN

46
46
iv


3.2.2. Tổng hợp ARN của virus Ebola
3.3. Xây dựng bộ panel độ nhạy
3.3.1. Xây dựng bộ panel độ nhạy

47
48
48

3.3.2. Đánh giá ngưỡng phát hiện kỹ thuật realtime RT-PCR chẩn đoán
virus Ebola trên bộ panel độ nhạy

51

PHẦN 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

52

4.1. Kết luận

52

4.2. Kiến nghị

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

53

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

acid deoxyribonucleic

ARN

acid ribonucleic

bp

Base pair

BEBOV

Bundibugyo

cADN

complementary acid deoxyribonucleic

CDC

Center for Disease Control and Prevention

CIEBOV

Côte d’Ivore

dNTP

3’-deoxyribonucleotide-5’-triphosphate

dATP

deoxyadenosine triphosphate

dGTP

deoxyguanosine triphosphate

dCTP

deoxycytidine triphosphate

dTTP

deoxythymidine triphosphate

ddNTP

dideoxynucleotide

E.Coli

Escherichia Coli

ELISA

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

GP

Glycoprotein

kb

kilobase

L

Polymerase ARN

NAT

Nucleic acid amplification

NIBSC

National Institute for Biological Standards and Control

NP

nucleoprotein

PCR

Polymerase Chain Reaction

REBOV

Reston ebolavirus

RT-PCR

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

sGP

Solute Glycoprotein

SEBOV

Sudan ebolavirus

VP24

virion protein 24
1

VP40

virion protein 40

VP30

virion protein 30

VP35

virion protein 35

WHO

World Health Organization

ZEBOV

Zaire ebolavirus

µl

Micro lít

2


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Các vụ dịch do virus Zaire

12

Bảng 2. Các vụ dịch do virus Sudan

14

Bảng 3. Các vụ dịch do virus Côte d’Ivore

14

Bảng 4. Các vụ dịch do virus Reston

15

Bảng 5. Các vụ dịch do virus Bundibugyo (BEBOV)

15

Bảng 6. Trang, thiết bị sử dụng trong đề tài

32

Bảng 7. Chu kỳ luân nhiệt

33

Bảng 8. Chu trình realtime

42

Bảng 9. Số lượng bản copies/phản ứng

50

3


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Dịch bệnh Ebola ở châu Phi

7

Hình 2. Dịch bệnh Ebola giữa biên giới Gabon và Cộng hòa Công-gô

10

Hình 3. Hệ gen của virus Ebola

17

Hình 4. Cấu trúc plasmid pIDTBlue chứa trình tự gen chủng virus EBOV 30
Hình 5. Quy trình tách và tinh sạch plasmid

35

Hình 6. Cơ chế mở vòng của plasmid

39

Hình 7. Sản phẩm PCR chứa gen NP của virus Ebola

43

Hình 8. Các khuẩn lạc màu trắng chứa plasmid ngoại lai

44

Hình 9. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR

44

Hình 10. Kết quả cắt bằng enzyme giới hạn

45

Hình 11. Nồng độ mẫu đối chứng ARN

46

Hình 12. Kết quá kiểm tra kích thước sản phẩm

47

Hình 13. Nồng độ ARN của virus Ebola

47

Hình 14. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp ARN

48

Hình 15. Pha loãng nồng độ

49

Hình 16. Tính toán số lượng bản copies/phản ứng

49

Hình 17. Đường chuẩn đánh giá panel

50

Hình 18. Đánh giá ngưỡng phát tín hiệu của panel

51

4


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Dịch bệnh Ebola bùng phát ở Tây Phi gần đây là vụ dịch Ebola lớn nhất với
28.637 ca được chẩn đoán, 11.315 ca tử vong tính đến ngày 5 tháng 8 năm
2015[1]. Tâm dịch Ebolavirus là Guinea (bắt đầu từ tháng 2/2014), lan sang
Liberia (tháng 3), Sierra Leone (tháng 5), cùng các nước khác ở Tây Phi như
Nigeria (cuối tháng 7) và Senegal[2]. Châu Âu và Mỹ cũng đã được báo cáo
như là những vùng bị ảnh hưởng không thường xuyên[3]. Chính vì vậy, WHO

tuyên bố dịch Ebola ở Tây Phi là “sự kiện y tế khẩn cấp được ưu tiên hàng
đầu” theo quy định y tế quốc tế (năm 2005) và ước tính sẽ có khoảng 20000
người bị nhiễm các tháng sau đó. Đến tháng tháng 9, 2014 chính phủ Mỹ đã
đồng ý cung cấp khoản kinh phí 500 triệu USD và triển khai 3000 lính Mỹ
đến vùng dịch để hỗ trợ kiểm soát dịch[4]. Nghiên cứu virus học đã xác định
virus ebola chủng Zaire (ZEBOV) là tác nhân gây dịch bệnh hiện tại và
nghiên cứu phân tích trình tự đầy đủ genome và cây phân loại đã chỉ ra rằng
ZEBOV được phân lập từ Guinea này là một nhánh tách biệt với chủng đã
được biết trước đây từ Cộng hòa Dân chủ Congo và Gabon[5].
Do tiềm năng ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng, tiến triển bệnh nhanh
và tỷ lệ tử vong cao, ZEBOV được phân loại vào nhóm A các tác nhân sinh
học có nguy cơ sử dụng khủng bố sinh học, cần được xác định chính xác và
kịp thời. Con đường lây lan chính của ebola là tiếp xúc với các dịch cơ thể
như qua con đường bơm kim tiêm không đảm bảo, tiếp xúc trực tiếp với mẫu
dịch hay mô người bệnh hay tiếp xúc gần với bệnh nhân.Trong nhiều trường
hợp, phân loại thích hợp bệnh nhân phụ thuộc chính vào việc chẩn đoán
nhanh và chính xác[6].
Chẩn đoán nhiễm virus Ebola giai đoạn sớm thường gặp nhiều khó khăn do
các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu và thường phải dựa vào khai thác
yếu tố dịch tễ học như bệnh nhân vừa quay trở về từ vùng dịch đang lưu hành
5


hoặc có tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân bị nhiễm virus Ebola. Chính vì vậy
chẩn đoán xét nghiệm đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán sớm và xác
định nhiễm virus Ebola bao gồm xét nghiệm phát hiện sự xuất hiện của virus
trong máu bằng kỹ thuật realtime RT-PCR và chẩn đoán huyết thanh học xác
định IgG và IgM bằng kỹ thuật ELISA, trong khi đó phân lập virus chỉ được
phép thực hiện ở phòng an toàn sinh học cấp 4.
Các xét nghiệm chẩn đoán dựa trên khuếch đại acid nucleic với độ nhạy và độ

đặc hiệu cao đã được công nhận là công cụ hữu hiệu trong điều trị lâm sàng
và kiểm soát dịch bệnh này[1]. Những xét nghiệm này được ứng dụng cả
trong chẩn đoán và phân biệt bệnh do virus Ebola với các bệnh nhiệt đới khác
cũng như quản lý những bệnh nhân nhiễm virus Ebola không triệu chứng
trước khi xuất viện. Trên thế giới, một số xét nghiệm NAT in-house được
phát triển cho chẩn đoán virus Ebola và một số đã trở thành thương mại
(tháng 10/2015)[7], NIBSC và WHO đã xây dựng mẫu chuẩn tạm thời phục
vụ cho công tác kiểm định, kiểm soát và đánh giá cho những xét nghiệm
này[1]. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa có công bố chính thức nào
về nghiên cứu chế tạo bộ panel và kit chẩn đoán nhiễm virus Ebola do đó để
chuẩn bị sẵn sàng các biện pháp ứng phó với trường hợp người nhiễm virus
Ebola xuất hiện ở Việt Nam.

2. Mục tiêu
Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu chế tạo bộ panel ứng dụng trong đánh giá
độ nhạy của kỹ thuật realtime RT-PCR chẩn đoán virus Ebola chủng
Zaire” nhằm các mục tiêu:
- Chế tạo được bộ panel độ nhạy ứng dụng trong chẩn đoán virus Ebola chủng
Zaire bằng kỹ thuật realtime RT-PCR.
- Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật realtime RT-PCR chẩn đoán virus Ebola
chủng Zaire trên bộ panel độ nhạy.
6


PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình về dịch bệnh Ebola
1.1.1. Tình hình dịch bệnh Ebola trên thế giới
Đại dịch Ebola hay còn được biết đến là bệnh sốt xuất huyết được gây
ra bởi virus Ebola, là một căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với tỷ lệ gây tử
vong rất cao lên tới 90%[8].

Hình 1. Dịch bệnh Ebola ở châu Phi[8]
RC: Cộng hòa Công-gô; DRC: Cộng hòa dân chủ Công-gô
1.1.1.1. Giai đoạn 1976 - 1979
Virus Ebola xuất hiện lần đầu trong hai đại dịch bùng phát đồng thời
vào năm 1976. Đại dịch ở Cộng hòa dân chủ Công-gô là do hai chủng virus
khác biệt về mặt kháng nguyên và sinh học có tên là Zaire ebolavirus
(ZEBOV) và Sudan ebolavirus (SEBOV). Ở Sudan, đại dịch bùng phát ở các
thị trấn Nzara và Maridi từ giữa tháng 06 và tháng 11 năm 1976. Người đầu
tiên bị nhiễm virus từng làm việc tại nhà máy sản xuất bông tại Nzara. Tỷ lệ
tử vong là 53% trong số 284 trường hợp được báo cáo (WHO 1978)[9].

7


Đại dịch thứ hai do ZEBOV xảy ra ở Cộng hòa dân chủ Công-gô từ
tháng 8 đến tháng 11/1976. Nạn nhân là một giảng viên nam 44 tuổi tại
trường truyền giáo Yambuku bị ngã bệnh sau chuyến du lịch ở phía bắc tỉnh
Equateur. Nguyên nhân do mua thịt linh dương và thịt khỉ tươi trên đường trở
lại Yambuku. Trong 318 trường hợp được ghi nhận thì tỷ lệ tử vong lên tới
88% (WHO 1978)[9].
Ebola xuất hiện lần thứ 3 vào tháng 06 năm 1977. Một bé gái 9 tuổi
sống tại Tandala - một thị trấn của Cộng hòa dân chủ Công-gô đã có những
biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh sốt xuất huyết do ZEBOV.
Năm 1979, hai thị trấn Nzara và Maridi một lần nữa bị tấn công bởi
virus Ebola, tuy nhiên lần này dịch bệnh không lan rộng như lần đầu tiên với
34 người mắc bệnh trong đó có 22 người tử vong[8].
1.1.1.2. Giai đoạn 1994 - 1997
Trong thời kỳ 1994-1997, có khoảng 5 khu vực được xác định bị nhiễm
virus Ebola, đó là: Côte d’Ivore năm 1994[10], Cộng hòa dân chủ Công-gô

năm 1995 [11], và Gabon năm 1994,1995 và 1996 [12], [13]. Năm 1994, sự
bùng phát lớn virus Ebola xảy ra khiến cho những con tinh tinh trong Công
viên Quốc gia Tai ở Côte d’Ivoire bị nhiễm. Trong khi khám nghiệm một con
tinh tinh đã chết, một người trong đoàn nghiên cứu đã bị nhiễm. Cô ấy nhanh
chóng được chuyển tới Basel, Thụy Sĩ để cách ly và điều trị nhằm tránh lây
nhiễm cho người khác. Đây là trường hợp đầu tiên trong giai đoạn này được
xác nhận là nhiễm virus Ebola Côte d’Ivore (CIEBOV) ở Tây Phi.
Dịch bệnh tiếp tục xảy ra lần thứ 4 vào giữa tháng 01 và tháng 07 năm
1995 tại một thị trấn ở Kikwit, cách 500km về phía nam trung tâm Cộng hòa
dân chủ Công-gô. Nguyên nhân là do ZEBOV đã giết chết 256 người trong số
315 nạn nhân. So với năm 1976, mặc dù tại đây được đầu tư các nguồn lực
khoa học và y tế tiên tiến và hiện đại hơn, tuy nhiên tỷ lệ tử vong vẫn không
suy giảm.
8


Tại Gabon có ít nhất ba vụ dịch xảy ra cả ở người và linh trưởng trong
thời kỳ này. Vụ dịch đầu tiên xảy ra vào giữa tháng 12/1994 và tháng 02/1995
ở vùng Đông Bắc Gabon, gần biên giới Cameroon. Nó được chia làm hai đợt
liên tiếp bắt nguồn từ những người thợ đào vàng ở trong rừng đã làm bùng
phát dịch bệnh khi họ di chuyển tới bệnh viện gần đó để chữa trị. Trong số 49
trường hợp nhiễm bệnh thì có 29 người chết[8]. Vụ dịch thứ hai xảy ra vào
tháng 02/1996 tại hai ngôi làng Mayibout I và II, cách 40 km về phía Nam
của Mekouka dọc theo sông Ivindo. Những nạn nhân đầu tiên là 18 đứa trẻ ở
làng Mayibout II, chúng cố gắng mang về xác một con tinh tinh được tìm thấy
ở trong rừng. Sau đó, những đứa trẻ này lây bệnh cho gia đình và bạn bè, từ
đó căn bệnh đã lan rộng ra khắp làng. Tỷ lệ tử vong là 67,7 % [8]. Vụ dịch
thứ ba xảy ra tại Booué bắt đầu từ ngày 05 tháng 10 năm 1996 đến tháng
3/1997, khi một bệnh nhân được kiểm tra là dương tính với kháng nguyên của
virus Ebola. Cụ thể là một thợ săn bị chết với những biểu hiện của bệnh sốt

xuất huyết, trong cùng thời điểm người ta cũng tìm thấy một số xác tinh tinh
quanh rừng. CDC (Center for Disease Control and Prevention) ở Atlanta phát
hiện được kháng nguyên của virus Ebola từ những mẫu mô lấy từ họ. Cùng
trong tháng đó, người thợ săn thứ hai cũng tử vong với những biểu hiện tương
tự, một trong số những người bạn của anh ta cũng bị ốm 12 ngày sau đó và
được đưa tới bệnh viện Booué. Tuy nhiên bệnh nhân này lại rời bệnh viện tới
một ngôi làng gần Booué, nơi ông ta được chữa bệnh bằng phương pháp
truyền thống và sau đó những người dân đến chữa bệnh lần lượt bị lây truyền
ra các thị trấn ở Gabon. Trong thời gian sáu tháng đã có 45 người tử vong
trong số 60 người bị nhiễm bệnh[8].
Năm 1996, Reston ebolavirus (REBOV) được phát hiện lần đầu trong
những con khỉ được xuất khẩu từ Philippines. Không có người nào bị nhiễm
bệnh.

9


1.1.1.3. Giai đoạn 2001 - 2004
Đây là thời kỳ bùng nổ dịch bệnh do ZEBOV tại một khu vực (biên
giới Gabon và Cộng hòa Công-gô) và sự trở lại của SEBOV tại Sudan và
Uganda.

Hình 2. Dịch bệnh Ebola giữa biên giới Gabon và Cộng hòa Công-gô[8]

- Các đại dịch gây ra bởi ZEBOV
Đại dịch đầu tiên trong thời kỳ này xảy ra tại Mekambo vào tháng
10/2001 và tháng 05/2002, thực tế đây là một chuỗi các dịch liên tiếp. Vụ đầu
tiên xảy ra tại làng Mendemba, đây là lần nghiêm trọng nhất dẫn theo những ổ
dịch thứ phát [14]. Hai vụ dịch tiếp theo xảy ra gần như đồng thời tại hai làng
Ekata và Olloba nằm về phía biên giới Cộng hòa Công-gô, bắt nguồn từ một

vài thợ săn tìm thấy và mổ thịt xác một con linh dương (Ekata) và khỉ đột
(Olloba). Thêm hai vụ dịch nữa diễn ra sau ba tuần tại làng Ekata và
Ekatangaye (12/2001).Vụ cuối cùng xảy ra vào tháng 03/2002 cũng liên quan
đến việc thợ săn mổ thịt xác khỉ đột tìm được trong rừng. Các vụ dịch xảy ra
trên trục Mekambo-Olloba sau đó lan rộng sang phía bên kia biên giới[8].
Những ngôi làng Entsiami, Abolo và Ambomi gần biên giới Gabon là
nơi xảy ra đại dịch lần thứ hai nhưng vẫn chưa xác định được nguồn gốc [8].
10


Vào đại dịch lần thứ ba, virus Ebola tái xuất hiện và gây bệnh cho 143
người ở Mbomo (17 người) và Kellé (126 người), trong đó có 128 người tử
vong [15].
Và trong cùng năm đó một vụ dịch khác nhỏ hơn xảy ra tại Mbomo từ
tháng 10 đến tháng 12/2003 làm cho 29 người chết [16]. Không xác định
được rõ ràng nguồn gốc động vật.
Virus Ebola không những làm bùng phát dịch ở người mà còn ảnh
hưởng đến các loài động vật như khỉ đột, tinh tinh, linh dương khiến cho mật
độ dân số ở khu vực này giảm một cách nhanh chóng.
- Các đại dịch gây ra bởi SEBOV
Có hai vụ dịch do SEBOV gây ra trong thời kỳ này. Đầu tiên là ở
Uganda giữa tháng 10/2000 và tháng 01/2001 khiến 173 người tử vong trong
tổng cộng 425 nạn nhân [17]. Đây được cho là đại dịch có số người tử vong
cao nhất trong tất cả các dịch được ghi lại. Tuy nhiên, vụ dịch thứ hai lại là vụ
nhỏ nhất từng có, với 17 trường hợp mắc bệnh và 7 người tử vong trong tháng
05 và tháng 06/2004 tại một thị trấn ở Yambio, gần với hai khu vực nhiễm
Ebola lúc trước (Nzara và Maridi) [18].
1.1.1.4. Giai đoạn 2007 - 2008
Theo báo cáo của CDC, vào ngày 28/08/2007, CDC được thông báo về
một trường hợp chưa xác định được bệnh tại một vùng hẻo lánh của tỉnh

Kasai ở Cộng hòa dân chủ Công-gô. Các mẫu bệnh phẩm được gửi tới phòng
xét nghiệm của CDC, kết quả thu được xác định là dương tính với virus
Ebola. Đến ngày 01/10/2007, tổng số trường hợp nghi ngờ là 249 với 183
trường hợp tử vong [19].
Đại dịch Ebola lại một lần nữa tấn công Kaluamba vào năm 2008 với
32 trường hợp trong đó có 14 người chết. Nạn nhân là một cô gái bị xuất
huyết sau khi phá thai, tuy nhiên vẫn chưa phát hiện được nguồn gốc tiếp xúc
của cô ấy [9].
11


1.1.1.5. Giai đoạn 2011-2014
Vào ngày 14/05/2011, Bộ Y tế Uganda thông báo rằng có một bệnh
nhân bị nghi ngờ sốt xuất huyết Ebola đã tử vong vào ngày 06/05/2011 tại
quận Luwero, Uganda.CDC của Uganda đã xác nhận một kết quả kiểm tra
dương tính với virus Ebola từ mẫu máu của bệnh nhân.
Tháng 06 đến tháng 10/2012, một vụ dịch xảy ra tại quận Kibaale ở
Uganda làm 4 người tử vong trong 11 nạn nhân[19].
Ngày 26/10/2012, Bộ Y tế Cộng hòa dân chủ Công-gô thông báo chấm
dứt dịch Ebola gần nhất tại tỉnh Orientale. Tổng cộng có 77 trường hợp, bao
gồm 36 trường hợp được xác nhận bởi kết quả xét nghiệm, 41 trường hợp
nghi ngờ, 36 trường hợp tử vong[20].
Tính đến ngày 02/12/2012, Bộ Y tế Uganda thông báo có 7 trường hợp
nhiễm virus Ebola tại quận Luwero trong đó có 4 trường hợp tử vong.
Đại dịch Ebola năm 2014 là đại dịch lớn nhất trong lịch sử, ảnh hưởng
tới nhiều quốc gia ở Tây Phi.Bắt đầu từ tháng 02/2014, hai khu vực bùng phát
đầu tiên tại khu vực này là Guinea và Liberia. Đến ngày 07/04/2014, Bộ Y tế
Guinea báo cáo có 151 trường hợp tương thích về mặt lâm sàng với virus
Ebola, trong đó có 95 người tử vong. Liberia báo cáo có 21 trường hợp với 10
trường hợp tử vong. CDC báo cáo tính tới tháng 03/2016 trên thế giới đã có

trên 28.639 trường hợp nhiễm virus Ebola, trong đó có 11.316 người tử vong
theo thống kê của WHO [21].
Tháng 8 đến tháng 12/2014, dịch bệnh Ebola xảy ra ở nhiều làng của
Cộng hòa dân chủ Công-gô với 49 người tử vong trong số 66 người bị nhiễm.
Và vụ dịch này không có liên quan tới vụ dịch ở Tây Phi.
1.1.1.6. Tổng kết
Theo CDC và WHO, dưới đây là bảng tổng hợp số vụ dịch bệnh được
gây ra bởi virus Ebola.
Bảng 1. Các vụ dịch do virus Zaire
12


Trường
TT

Thời gian

Địa điểm

Số người

Tỷ lệ tử

chết

vong

318

280

88%

hợp mắc
bệnh

Zaire
1

1976

(Cộng hòa dân
chủ Công-gô)

2

1977

Zaire

1

1

100%

3

1994

Gabon

52

31

60%

4

1995

315

250

81%

Gabon

37

21

57%

5

1996
(tháng 01 - 04)

Cộng hòa dân
chủ Công-gô

6

07/1996 - 01/1997

Gabon

60

45

74%

7

1996

Nam Phi

2

1

50%

8

1996

Nga

1

1

100%

9

10/2001 - 03/2002

Gabon

65

53

82%

10

10/2001 - 03/2002

57

43

75%

11

12/2002 - 04/2003

35

29

83%

143

128

89%

1

1

100%

264

187

71%

32

15

47%

66

49

74

Cộng hòa
Công-gô
Cộng hòa
Công-gô

2003

Cộng hòa

(tháng 11 - 12)

Công-gô

13

2004

Nga

14

2007

15

08/2008 - 02/2009

16

2014

12

Cộng hòa dân
chủ Công-gô
Cộng hòa dân
chủ Công-gô
Cộng hòa dân

13


17

(tháng 08 - 12)

chủ Công-gô

03/2014 - nay

Nhiều quốc gia

28.639

11.316

39,5%

Số người

Tỷ lệ tử

chết

vong

284

151

53%

1

0

0%

34

22

65%

425

224

53%

17

7

41%

Uganda

1

1

100%

Uganda

11

4

36,4%

Uganda

6

3

50%

* Nguồn: [10]

Bảng 2. Các vụ dịch do virus Sudan
Trường
TT

Thời gian

Địa điểm

hợp mắc
bệnh

Sudan

1

1976

2

1976

3

1979

4

2000 - 2001

5

2004

6

05/2011

7
8

(Nam Sudan)
Anh
Sudan
(Nam Sudan)
Uganda
Sudan

(Nam Sudan)

2012
(tháng 06 - 10)
11/2012 - 01/2013

* Nguồn: [10]

Bảng 3. Các vụ dịch do virus Côte d’Ivore
Thời gian
1994

Địa điểm
Côte d’Ivoire
(Ivory Coast)

Trường hợp

Số người

Tỷ lệ tử

mắc bệnh

chết

vong

1

0

0

* Nguồn: [10]
14


Bảng 4. Các vụ dịch do virus Reston

TT

Thời gian

Địa điểm

Trường

Số

hợp mắc

người

bệnh

chết

Tỷ lệ tử
vong

1

1989

Mỹ

0

0

0

2

1990

Mỹ

4

0

0

3

1989 - 1990

Philiippine

3

0

0

4

1992

Ý

0

0

0

5

1996

Mỹ

0

0

0

6

1996

Philippine

0

0

0

7

11/2008

Philippine

6

0

0

* Nguồn: [10]

Bảng 5. Các vụ dịch do virus Bundibugyo (BEBOV)

TT

1
2

Thời gian
12/2007 01/2008

Địa điểm

Trường

Số

hợp mắc

người

bệnh

chết

149

37

25%

36

13

36,1%

Uganda

2012

Cộng hòa dân

(tháng 06 - 11)

chủ Công-gô

Tỷ lệ tử
vong

* Nguồn: [10]
1.1.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
Tính từ ngày 11 đến ngày 26/08/2014, theobáo cáo của Cục Y tế Dự
phòng Việt Nam đã ghi nhận 128 người từ các quốc gia có dịch nhập cảnh
vào Việt Nam. Qua kiểm tra chưa phát hiện được trường hợp nào có biểu hiện
15


của bệnh do virus Ebola. Tuy nhiên, theo nhận định, khả năng dịch bệnh
Ebola xâm nhập vào Việt Nam rất cao do sân bay Tân Sơn Nhất tiếp nhận
một số chuyến bay quá cảnh qua châu Phi. Do đó, khả năng sẽ có bệnh nhân
nghi nhiễm Ebola nhập cảnh Việt Nam cao hơn [22].
Ngày 01/11/2014, Sở Y tế Đà Nẵng thông báo khẩn gửi Bộ Y tế, Cục Y
tế dự phòng, viện Pasteur Nha Trang và một số ban ngành địa phương về một

trường hợp bị nghi ngờ nhiễm virus Ebola. Bệnh nhân đã sống và làm việc tại
Guinea hai năm. Trước khi về Việt Nam, anh ta đã quá cảnh qua Marocco và
Qatar trước khi về sân bay Tân Sơn Nhất, sau đó đến Đà Nẵng. Bệnh nhân
được chẩn đoán là sốt được hai ngày và chưa rõ nguyên nhân. Do trở về từ
vùng dịch Ebola nên bệnh nhân ngay lập tức được đưa tới bệnh viện Đà Nẵng
để cách ly và điều trị. Tuy nhiên, đến ngày 02/11, mẫu bệnh phẩm của bệnh
nhân được chẩn đoán là âm tính 99% với virus Ebola [23].
Tuy “tâm” đại dịch Ebola là ở châu Phi nhưng không có nghĩa là Bộ Y
tế và người dân các nước khác, trong đó có Việt Nam có thể chủ quan trước
tình trạng nạn dịch khủng khiếp này. Thực tế cho thấy, dịch Ebola không chỉ
là vấn đề của châu Phi mà có nguy cơ rất lớn xâm nhập vào Việt Nam và các
nước thông qua đường du lịch và giao thương toàn cầu. Do đó, để ngăn chặn
dịch lây lan vào Việt Nam, Bộ Y tế đề nghị Sở Y tế các tỉnh, thành phối hợp
với cơ quan chức năng tại cửa khẩu giám sát chặt chẽ người nhập cảnh, đặc
biệt đến từ quốc gia có dịch bệnh. Đồng thời thực hiện tốt việc giám sát tại
cộng đồng và các cơ sở y tế. Việt Nam cũng như các nước lân cận đã xây
dựng kế hoạch sẵn sàng ứng phó khi dịch bệnh thâm nhập và xuất hiện ở Việt
Nam[24].
1.2. Giới thiệu virus Ebola
1.2.1. Phân loại
EBOV được phân thành 5 chủng bao gồm: virus Zaire (Zaire
ebolavirus - ZEBOV), virus Sudan (Sudan ebolavirus - SEBOV), virus Côte
16


d’Ivoire (Côte d’Ivoire ebolavirus - TAFV), virus Bundibugyo (Bundibugyo
ebolavirus - BEBOV) và virus Reston(Reston ebolavirus - REBOV). Những
chủng hay gặp ở người nhất trong những chủng virus khác nhau là virus
Zaire, virus Sudan và virus Bundibugyo. Giữa năm chủng này chỉ có virus
Reston là không lây nhiễm lên người. Các chủng virus Ebola được liệt kê trên

đây có thể không phải là những chủng duy nhất. Khi chúng đột biến, các sợi
mới có thể kết hợp với nhau và từ đó tạo thành một chủng mới [25].

1.2.2. Đặc điểm hình dạng, cấu trúc hệ gen

Hình 3. Hệ gen của virus Ebola
Virus Ebola thuộc họ Filoviridae là virus dạng sợi, có vỏ, không phân
đoạn, là nucleocapsid có dạng xoắn, được bao bọc bởi vỏ ngoài chứa lipid.
Lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ tế bào chủ, phía ngoài có thể chứa một số
protein của người và một số thụ thể bề mặt. Virus Ebola có vật liệu di truyền
là ARN (Acid Ribonucleic), 1 sợi đơn mang điện tích âm. Hệ gen của virus
Ebola dài khoảng 19kb và mã hóa cho 7 protein của virus lần lượt là
nucleoprotein (NP), polymerase cofactor (VP35), protein ma trận (VP40),
glycoprotein (GP), protein phiên mã sao chép (VP30), protein ma trận
(VP24), và polymerase ARN phụ thuộc ARN (L), và một glycoprotein hòa
tan thêm (sGP). Trong đó, NP của virus Ebola là nucleoprotein lớn nhất (739
amino acid) của virus [25].
17


Các gen được sắp xếp theo trình tự 3’-NP-VP35-VP40-GP-VP30VP24-L-5’ (Hình 3). Trên bề mặt virus Ebola có chứa các gai GP dài khoảng
7-10nm, mỗi gai cách nhau 10 nm. Các GP là protein duy nhất được phát hiện
trên bề mặt virus, chịu trách nhiệm gắn, nhập vào tế bào chủ mới, che chắn bề
mặt virus khỏi sự giám sát của hệ miễn dịch và duy trì sự ổn định của virus
khi ở ngoài tế bào vật chủ. Bên trong lớp vỏ là không gian ma trận được tạo
bởi các protein ma trận VP24 và VP40. VP40 giúp ổn định cấu trúc virus và
hình thành chồi ở thành tế bào chủ khi virus thoát ra ngoài. VP24 có tác dụng
cản trở hệ miễn dịch hoạt động bằng cách ngăn cản các nhân tố tạo nên
interferon. Lớp vỏ capsid bao gồm các NP và VP30. NP là thành phần chính
của lớp vỏ capsid, nhờ nó mà cấu trúc dạng cuộn xoắn được tạo ra, qua đó

cuộn lấy và bao bọc ARN một cách chắc chắn. Lớp vỏ này bao bọc lấy hệ gen
của virus Ebola là đoạn ARN đơn âm. Đoạn ARN này cùng với vỏ capsid và
các protein VP35, L cuộn lại với nhau tạo thành cấu trúc xoắn, cấu trúc này
được gọi là nucleocapsid. VP35 kết hợp với L để khởi động quá trình tái bản,
ngoài ra nó cũng có tác dụng cản trở sự hình thành của interferon. VP30 cần
thiết cho sự khởi động phiên mã tạo mARN. L cần thiết cho cả phiên mãvà
quá trình tái bản của virus [25].

1.3. Các triệu chứng, con đường lây truyền và biện pháp phòng bệnh
1.3.1. Các triệu chứng
Bệnh bắt đầu sau 2 đến 21 ngày ủ bệnh. Các đặc điểm lâm sàng có thể
được chia làm bốn giai đoạn chính sau:
- Giai đoạn 1: Có những triệu chứng tương tự bệnh cúm như: sốt cao,
đau đầu, đau khớp, buồn nôn, đau họng và đau cơ.
- Giai đoạn 2: Cấp tính (ngày 1 - 6): sốt kéo dài không phản ứng với
thuốc hay kháng sinh, đau đầu, mệt mỏi, tiếp theo đó là tiêu chảy, đau bụng
và buồn nôn.
18


- Giai đoạn 3: Bệnh thuyên giảm (ngày 7 - 8): trong giai đoạn này, bệnh
nhân sẽ cảm thấy khỏe và thèm ăn hơn. Sức khỏe của bệnh nhân đi theo chiều
hướng tốt hơn. Một số bệnh nhân có khả năng phục hồi và sống sót khỏi căn
bệnh này.
- Giai đoạn 4: Bệnh nghiêm trọng hơn (ngày 9): tình trạng sức khỏe sẽ
trở nên tồi tệ hơn bằng việc quan sát các triệu chứng sau:
+ Rối loạn hô hấp: khó thở, đau ngực, ho và nấc cục.
+ Triệu chứng của xuất huyết tạng: tiêu chảy ra máu, nôn ra máu,
viêm màng kết, chảy máu nướu, chảy máu cam, chảy máu ở
những nơi truyền vào tĩnh mạch và các màng nhày.

+ Biểu hiện trên da: chấm xuất huyết (không rõ ràng trên da
đen), ban xuất huyết (da bị phát ban như bệnh sởi)
+ Biểu hiện về rối loạn thần kinh và tâm thần như: kiệt sức, mê
sảng, hôn mê.
+ Đau tim và sốc Hypovolaemic (dẫn đến tử vong).
Từ những biểu hiện lâm sàng, bệnh Ebola có thể có những triệu chứng
khởi đầu tương tự như bệnh sốt rét, thương hàn hay sốt vàng da. Trong hầu
hết các vụ dịch, các bác sĩ thường không phát hiện được các triệu chứng đặc
trưng nên việc chẩn đoán được bệnh thường bị trì hoãn. Do vậy, bệnh được
phát hiện khi bệnh nhân có những triệu chứng nghiêm trọng hơn[9].

1.3.2. Con đường lây truyền
Ebola không phải là virus truyền qua không khí. Không như một số
virus khác, virus Ebola chỉ có thể lây truyền trực tiếp qua máu, dịch tiết, mô,
cơ quan, hoặc dịch cơ thể từ những người đã chết hay người bị bệnh. Ngoài
ra, virus Ebola cũng có thể lây truyền thông qua các vật đã qua sử dụng mà có
19


dính dịch cơ thể của bệnh nhân. Do bản chất nguy hiểm của nó, virus này
được coi như một mối nguy hại cấp độ 4. Sự lây nhiễm của virus thường dẫn
đến hoại tử gan, lá lách, thận, hạch bạch huyết, tinh hoàn và buồng trứng do
sự sao chép của virus trong các tế bào nhu mô. Nhiều tác động đáng kể hơn
như là sự phá hủy các tiểu động mạch và sự thay đổi tính thấm của thành
mạch. Sự phá hủy các tiểu cầu và các tế bào nội mô dẫn tới phá hủy sự cân
bằng dịch. Hơn nữa, virus Ebola được cho rằng là mối nguy hiểm tiềm tàng
gây ức chế khả năng miễn dịch của cơ thể[26].
Các vật chủ tự nhiên của virus Ebola chưa được xác định, và cách mà
virus xuất hiện trên cơ thể người làm bùng nổ đại dịch cũng chưa được biết.
Tuy nhiên, các nhà khoa học lại tin rằng bệnh nhân đầu tiên bị nhiễm bệnh có

tiếp xúc với động vật cũng bị nhiễm virus như dơi hay linh trưởng (tinh tinh
hay khỉ). Sự lây truyền từ người sang người có thể dẫn tới số lượng lớn người
bị nhiễm bệnh. Trong các đại dịch trước, các động vật linh trưởng cũng bị ảnh
hưởng bởi virus Ebola và căn bệnh lan rộng khi con người chạm hay ăn thịt
động vật linh trưởng. Một khi đã xâm nhập vào cơ thể người, virus Ebola sẽ
lan rộng ra thông qua nhiều con đường như:
- Máu hoặc dịch cơ thể (nước tiểu, nước bọt, mồ hôi, phân, chất nôn,
sữa mẹ hoặc tinh dịch) của bệnh nhân Ebola.
- Các vật dụng (kim, bơm tiêm) có thể nhiễm virus.
- Dơi ăn quả hay động vật linh trưởng bị nhiễm (tinh tinh hay khỉ).
Virus Ebola không lây truyền qua không khí, nước, hay thông thường
qua thức ăn. Tuy nhiên, ở châu Phi, virus Ebola có thể lan truyền thông qua
việc xử lý thịt thú rừng (động vật hoang dã được dùng làm thực phẩm) và tiếp
xúc với dơi đã bị nhiễm virus. Chưa có bằng chứng nào chứng minh là muỗi
hay các loài côn trùng khác có thể truyền virus Ebola. Chỉ có một số loài động

20