Nghiên cứu các điều kiện tinh sạch và đánh giá một số tính chất của protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng serratia marcescens DT3

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------*****-------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ
MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG
NẤM TỪ CHỦNG Serratia marcescens DT3

Giáo viên hướng dẫn
Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Thoan

Lớp

: 1202

Hà Nội – 2016

: TS.Đỗ Thị Tuyên


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ
Thị Tuyên, Phụ trách phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người cô đã quan
tâm, tận tình chỉ bảo, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn, giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi trong quá trình hoàn thành đề tài luận văn
này.

Tôi xin cảm ơn ThS. Lê Thanh Hoàng đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong
quá trình hoàn thành luận văn và cùng tập thể các anh, các chị làm việc tại
phòng Công nghệ sinh học enzyme đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt
luận văn này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học
Mở Hà Nội đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học
tập và hoàn thiện luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè luôn
động viên giúp đỡ tôi trong thời suốt thời gian học tập.

Hà Nội, ngày

tháng
Sinh viên

Trần Thị Thoan

năm 2016


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3
1.1 Đại cương về vi khuẩn Serratia ........................................................... 3
1.2 Bệnh cây trồng do nấm Fusarium và Rhizoctonia gây ra ................. 4
1.2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium và Rhizoctonia hại cây trồng ..4

1.2.2 Tình hình bệnh hại cây trồng do nấm Fusarium và nấm Rhizoctonia
gây ra tại Việt Nam ........................................................................................8
1.2.3 Biện pháp phòng trừ bệnh nấm hại cây trồng.......................................9
1.3 Tình hình nghiên cứu về chủng Serratia marcescens ...................... 14
1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới .....................................................14
1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................15
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................... 17
2.1 Vật liệu và hóa chất ........................................................................ 17
2.1.1 Chủng giống........................................................................................17
2.1.2 Hóa chất ..............................................................................................17
2.1.3 Các loại đệm và dung dịch..................................................................17
2.1.5 Thiết bị thí nghiệm..............................................................................19
2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 20
2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật ....................................................20
2.2.2 Xác định hoạt tính kháng nấm ............................................................20
2.2.3 Phương pháp kết tủa phân đoạn..........................................................21
2.2.4 Sắc kí trao đổi ion ...............................................................................22
2.2.5 Xác định hàm lượng protein ...............................................................24
2.2.6 Điện di protein trên gel polyacrylamide ( SDS-PAGE ) ....................24
2.2.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm..............................25
2.2.8 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng nấm ......................................26


2.2.9 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ...........................................26
2.2.10 Xác định khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm ..................26
2.2.11 Xử lý số liệu ......................................................................................26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 26
3.1 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ngoại bào chủng Serratia
marcescens DT3 ...................................................................................... 27
3.2 Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm...................................... 30

3.2.1 Tủa protein bằng muối amonium sulfate ............................................30
3.2.2 Tinh sạch protein bằng sắc ký trao đổi ion DEAE .............................33
3.2.3 Đánh giá một số hoạt tính kháng nấm của protein tinh sạch ..............35
3.3 Đánh giá tính chất của protein tinh sạch......................................... 36
3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm..............................36
3.3.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng nấm ......................................37
3.3.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch ........39
3.3.4 Xác định khả năng ức chế nẩy mầm của bào tử nấm .........................41
KẾT LUẬN ................................................................................................. 43
KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 44
PHỤ LỤC


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
APS

Ammonium persulphate

DEAE-cellulose

Dimethylaminoethyl-cellulose

ĐC

Đối chứng

F.oxysporum

Fusarium oxysporum

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria and Bertani

PDA

Potato Dextrose Agar

M

Matker

OD

Optical density

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

Pr

Protein

R.solani

Rhizoctonia solani

SDS

Sodium dodecyl sulfate

S. marcescens

Serratia marcescens

TB

Trung bình

TEMED

N,N,N’,N’,- Tetramethyl ethylene diamine

TN

Thí nghiệm

v/v

Volume/volume (thể tích/thể tích)

w/v

Weight/volume (khối lượng/thể tích)

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu............................... 17
Bảng 2.2. Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 18
Bảng 2.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 19
Bảng 2.4. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .......................... 19
Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide 12,5% ........................................ 25
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết ngoại bào S. marcescens DT3 nuôi trong
môi trường LB lên sinh trưởng của nấm F. oxysporum................................. 28
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết ngoại bào S. marcescens DT3 lên sinh
trưởng của nấm R.solani ............................................................................... 29
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ tủa muối amonium sulfate lên sinh trưởng
của nấm F. oxysporum.................................................................................. 31
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ tủa muối amonium sulfate lên sinh trưởng
của nấm R. solani ......................................................................................... 31
Bảng 3.5 Tóm tắt quá trình tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng
S. marcescens DT 3 qua các bước tinh sạch ................................................. 34
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng
S. marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum .......................... 39
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng
S. marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm R. solani ................................. 40


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Hình ảnh chủng S. marcescens DT3 trên môi trường LB đặc .......... 4
Hình 1.2 Hình ảnh nấm F. oxysporum trên đĩa thạch PDA ............................ 5
Hình 1.3 Hình ảnh nấm R. solani trên đĩa thạch PDA ................................... 6
Hình 2.1 Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng S. marcescens DT3
..................................................................................................................... 23

Hình 2.2 Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chuẩn.............................. 24
Hình 3.1 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ngoại bào S. marcescens DT3
đối với nấm F.oxysporum sau 5 ngày ........................................................... 28
Hình 3.2 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ngoại bào S. marcescens DT3
đối với nấm R. solani sau 3 ngày .................................................................. 29
Hình 3.3 Hoạt tính ức chế nấm của nồng độ tủa muối amonium sulfate đối
với nấm F. oxysporum sau 5 ngày ................................................................ 31
Hình 3.4 Hoạt tính ức chế nấm của nồng độ tủa muối amonium sulfate đối
với nấm R. solani sau 3 ngày ........................................................................ 32
Hình 3.5 Hoạt tính kháng nấm của các nồng độ tủa muối amonium sulfate
20 - 80% đối với nấm F. oxysporum (A) và nấm R. solani (B) ................... 32
Hình 3.6 (A) Sắc kí đồ các phân đoạn protein sau khi qua cột trao đổi ion
DEAE – cellulose; (B) Điện di đồ các phân đoạn protein tinh sạch qua cột
trao đổi ion DEAE – cellulose (LC: dịch protein trước khi lên cột; 7-12:
protein từ các phân đoạn 7- 12 sau khi qua cột DEAE- sepharose; M: chỉ thị
phân tử) ........................................................................................................ 34
Hình 3.7Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A)và R. solani (B) của các
phân đoạn protein tinh sạch từ chủng S.marcescens DT3. (Đ/C (-): đệm
potasium phosphate 20 mM pH 6,8;. Đ/C (+): dịch lên cột; 7 - 14: protein tinh
sạch từ các phân đoạn 7 – 14 ........................................................................ 35
Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A)
và nấm R. solani (B) Đ/C (+): mẫu không xử lý nhiệt; Đ/C (-): đệm potasium


phosphate 20 mM pH 6,8; 5-30 mẫu xử lý nhiệt độ 100oC trong các khoảng
thời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút và 30 phút ............................................... 37
B .................................................................................................................. 38
Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) và
nấm R. solani (B) Đ/C (+): Dịch lên cột; Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20
mM pH 6,8; M3: dịch protein tinh sạch ủ trong đệm acetate (pH 3); M7: dịch

protein tinh sạch ủ trong đệm phosphate (pH 7); M9: dịch protein tinh sạch ủ
trong đệm Tris-HCl (pH 9)............................................................................ 38
Hình 3.10Ức chế nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng

S.

marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm của nấm F. oxysporum ................ 40
Hình 3.11Ức chế nồng độ tối thiểu của protein tinh sạch từ chủng
S. marcescens DT3 lên hoạt tính kháng nấm của nấm R. solani ................... 41
Hình 3.12 Khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm F.oxysporum của
protein tinh sạch từ chủng S. marcescens DT3 quan sát trên kính hiển vi
quang học. Bào từ nấm F. oxysporum sau 4 giờ (A, D), 24 giờ ( B, E) và 28
giờ (C, F); bào tử nấm được ủ với protein tinh sạch sau 4 giờ (D), 24 giờ (E)
và 28 giờ (F) ................................................................................................. 42


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, bệnh hại cây trồng gây ra những thiệt hại
nghiêm trọng cho nền nông nghiệp thế giới, làm giảm thu nhập của nhiều
nông dân qua việc làm giảm năng suất và chất lượng nông sản. Đặc biệt, một
số bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium
và Rhizoctonia chiếm tỷ trọng tương đối lớn. Nấm

bệnh Fusarium và

Rhizoctonia gây bệnh trên nhiều loại cây ngũ cốc, cây ăn quả và cây công
nghiệp như lúa, ngô, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, bông. Chúng có khả
năng tồn tại trong đất trong một thời gian dài, phát sinh và gây hại ngay từ
giai đoạn cây non và kéo dài đến cho tới khi thu hoạch nếu không áp dụng các
biện pháp phòng trừ triệt để. Nấm gây ra các triệu chứng thối đen rễ, lở cổ rễ,

thối gốc thân, thối thân, khô vằn, thối lá.
Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng theo xu hướng chủ yếu hiện nay
là chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật gây ra bệnh hại cây. Tuy
nhiên, thuốc phòng trừ các bệnh hại cây trồng có nguồn gốc hóa học vẫn được
dùng phổ biến nhất cho đến nay bởi nó tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng
nhanh nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu
quả càng ngày càng kém và gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, các chế phẩm
sinh học đang được sử dụng rộng rãi nhằm tạo ra một nền nông nghiệp hữu cơ
an toàn và bền vững.
Serratia là một trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, thuộc họ
Enterobacteraceae. Chúng có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính kháng
nấm đã được sử dụng trong kiểm soát nhiều bệnh hại cây trồng khác nhau.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng của Serratia để phòng trừ
nấm và bảo vệ cây trồng nhưng kết quả đạt được trong nghiên cứu và sử
dụng các chế phẩm vẫn còn hạn chế. Bởi chi phí thuốc bảo vệ thực vật trên
thế giới chỉ chiếm 1,9% tổng giá trị của các loại thuốc bảo vệ thực vật. Chính
vì vậy, việc nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt nấm là cần thiết.
1


Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài:‘‘ Nghiên cứu các
điều kiện tinh sạch và đánh giá một số tính chất của protein có hoạt tính
kháng nấm từ chủng Serratia marcescens DT3’’ nhằm thực hiện các nội
dung nghiên cứu:
1. Nghiên cứu các điều kiện tinh sạch

protein từ chủng Serratia

marcescens DT3 có hoạt tính kháng nấm.
2. Đánh giá tính chất của protein tinh sạch từ chủng Serratia marcescens

DT3.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đại cương về vi khuẩn Serratia
Serratia là loài vi khuẩn gram âmthuộc chi Klebsielleae trong họ
Enterobacteriaceae,có thể tìm thấy trong đất, nước, thực vật và cả động
vật.Serratia có khả năng tiết ra một lượng lớn protease ngoại bào vào môi
trường xung quanh. Ngoài ra,Serratia (S. marcescens )còn sản xuất ra một số
enzyme ngoại bào khác như chitinase (Monreal and Reese 1969), nuclease
(Ball et al. 1987), lipase (Akatsuka et al. 1994), hemolysin (Braun and
Schmitz 1980), bacteriocins (Traub 1980). Chi Serratia hiện có mười bốn loài
được công nhận. Điển hình là S.marcescen loài gây bệnh chính của Serratia,
chúng gây bệnh cho con người, động vật, côn trùng.S.marcescensđược phát
hiện vào năm 1819 tại Ý, trước đây nó được biết với nhiều cái tên khác như
Chromobacterium prodigiosum. Năm 1823 đã đặt tên mới cho chủng này là
S.marcescens. Các chủng vi khuẩnS.marcescens phân bố trong đất, nước, thực
vật. Chúng phát triển ở nhiệt độ từ 5-40°C, pH từ 5-9.
Chủng S. marcescens có màng cấu trúc tế bào đặc trưng của vi khuẩn Gram
âm, di động, sinh bào tử. Thành tế bào mỏng làm bằng một lớp duy nhất là
peptidoglycan được bao bọc bởi một lớp màng bên ngoài. Các màng bên
ngoài có lipopolysaccharide, là một loại đặc biệt của phospholipid gồm các
acid béo được gắn vào một dimer phosphate glucosamine. Mộtglucosamine
gắn liền với một polysaccharide cốt lõi mà mở rộng đến các polysaccharide
O. Các màng ngoài cũng là một phương tiện để điều tiết sự hấp thu chất dinh
dưỡng và loại trừ các độc tố.Mặc dù,S.marcescens đã được phân loại như một
tác nhân gây bệnh, nhưngbên cạnh đó thì một số chủng S. marcescens lại
được sử dụng trong các nghiên cứu về y học, quân sự, nông nghiệp…[35]

Chủng S. marcescens DT3 được phân lập từ mẫu đất ở Việt Nam.

3


Ngành : Proteobacteria.
Lớp : Gamma Proteobacteria.
Bộ : Enterobacteriales.
Họ:: Enterobacteriaceae.
Chi: Serratia.
Loài: Serriatia marcescens.
Hình 1.1Hình ảnh chủng
ủng S. marcescens
DT3 trên môi trường
ờng LB đặc
1.2 Bệnh cây trồng
ng do nấm
n
Fusarium và Rhizoctonia gây ra
1.2.1 Đặc điểm
m sinh họ
học của nấm Fusarium và Rhizoctonia hạại cây trồng
ChiFusarium là chi lớn
ớn nhất trong Tuberculariaceae, phổ biến
ến trong tự
t nhiên
và thường được tìm
ìm th
thấy trong đất, chúng sống hoạii sinh hoặc ký sinh tr
trên

nhiều cây trồng,
ng, cây ăn qu
quả và rau. Nấm trong chi này thường
ờng xâm nh
nhập vào
các bộ phận của cây dư
ưới mặt đất và chúng có thể gây ra một
ột lo
loạt các bệnh
trên một phạm vi rộng
ộng đối với cây chủ. Chúng có thể xuất
ất hiệ
hiện trong đất,
trong không khí hay truyền
truy qua đường nước, thậm trí chúng còn
òn tiểm
ti ẩn trong
các hạt giống và có khảả năng hối sinh. Nấm Fusarium là một
ột trong nh
những tác
nhân gây bệnh nghiêm
êm trọng
tr
ở cây trồng trên thế giới.
ới. Đ
Điển hình, F.
oxysporum nó phân tán rrộng nhất của các loài Fusarium được
ợc tìm
t thấy trên
toàn thế giới. F.oxysporum

oxysporum không có giai đoạn sinh học điển
ển hhình,nhưng sản
xuất ba loại bào tử vô tính: bbào tử nhỏ, bào tử đính lớn vàà bào ttử hậu.Bào tử
nhỏ là các bào tử sản
ản xuất
xu nhiều nhất, nó có hình bầu dục,hình
,hình elip hoặc
ho thận
được định hình và sản
ản xu
xuất trên sợi nấm trên bề mặt.Bào tử đính lớn
l có 3 -5 tế
bào và nhọn hai đầuu hoặc
hoặ cạnh cong,được tìm thấy trên khối bào
ào ttử phân trên
bề mặt của cây bịị bệnh
ệnh.Bào tử hậu được hình thành đơn lẻẻ hay theo ccặp
nhưng đôi khi được tìm
ìm thấy
th trong các cụm hoặc chuỗi ngắn.. Nó là bào ttử
tròn có vách dày được
ợc sản
sả xuất trên một sợi nấm hoặc bảo tử
ử đính llớn.Bào tử

4


hậu không giống như các bào tử khác có thể tồn tại trong đất một thời gian dài
[4,22].

Hình 1.2 Hình ảnh nấm F. oxysporum trên đĩa thạch PDA
ChủngF. oxysporum là một mầm bệnh nấm dễ lây nhiễm gây bệnh héo trên
một phạm vi rộng của các loài thực vật. Nó tồn tại trong đất như sợi nấm và
các loại bào tử, nhưng thường tồn tại trong đất ở dạng bào tử hậu. Lây lan
mầm bệnh theo hai cách cơ bản, lây lan khoảng cách ngắn qua bắn nước,
bằng thiết bị trồng trọt còn khoảng cách dài qua cấy ghép và hạt giống bị
nhiễm bệnh F. oxysporum sẽ gây hại cho cây khỏe mạnh bằng cách lây nhiễm
sợi nấm hoặc nảy mầm bào tử xâm nhập qua các mô gốc của cây trồng qua
những vết thương ở gốc rễ. Các sợi nấm sẽ phát triển trong tế bào thông qua
vỏ gốc và xylem. Một khi trong xylem, sợi nấm sẽ phát triển trong mạch
xylem và sản xuất ra bào tử nhỏ. Bào tử nhỏ này có thể nhập vào dòng nhựa
và được vận chuyển lên. Trường hợp dòng chảy nhựa cây dừng, bào tử nhỏ
nảy mầm. Cuối cùng các bào tử nhỏ và sợi nấm làm tắc nghẽn các mạch dẫn
của cây ngăn chặn cây trồng lấy và chuyển hóa các chất dinh dưỡng. Cuối
cùng cây trồng thoát hơi nước nhiều hơn nó có thể vận chuyển,đóng lỗkhí,lá
héo và cây chết.Sau khi cây chết nấm xâm nhập vào tất cả các mô,hình thành
bào tử và tiếp tục lây nhiễm sang các cây lân cận[20].
5


Nấm Rhizoctonia là một nhóm nấm lớn, đa dạng và phức tạp, phân bố khá
rộng và được chia thành nhiều nhóm nấm khác nhau. Rhizoctonia họ nấm
điển hình gây hại cho cây trồng. Đặc biệt, nấmR. solani gây bệnh phổ biến
trên thực vật và phân bố trên toàn thế giới.R. solaniđược phát hiện cách đây
hơn 100 năm, chúng tồn tại ở dạng sợi sinh trưởng trên cây và thường được
tìm thấy trong đất.Nấm R. solani có dạng sợi dài, tạo hạch và không sinh bào
tử. Sợi nấm trong mô tế bào khi còn non không có màu, khi trưởng thành có
màu nâu vàng nhạt. Sợi nấm đa bào, phân nhánh tương đối thẳng góc với sợi
nấm chính. Chỗ phân nhánh hơi thắt nhỏ lại. Sợi nấm trưởng thành có đường

kính từ 8 – 12µm. Nấm tạo hạch trên cây kí chủ, hạch không đều, có hình tròn
dẹt ở phía dưới, khi còn non có màu trắng, khi già có màu nâu đậm. Bề mặt
của hạch thô và có nhiều lổ nhỏ li ti. Hạch nấm có thể ít hay nhiều, nhỏ hay
lớn tùy thuộc vào các dòng nấm khác nhau. Bào tử hậu của nấm rất ít khi gặp,
chỉ phát sinh khi có độ ẩm khá cao. Nấm R. solani sinh sản hữu tính tạo đảm
đơn bào tử. Ở nước ta, nấm R. solani sinh trưởng và phát triển chủ yếu dưới
dạng sợi và hạch nấm, chưa thấy dạng sinh sản hữu tính[39].

Hình 1.3 Hình ảnh nấm R. solani trên đĩa thạch PDA
Nấm R. solani là nấm đa thực bán kí sinh điển hình, có phổ kí chủ rộng.
Nấm này có thể xâm nhiễm và gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau.
Có khoảng 200 loài thực vật bao gồm cây lương thực, cây hoa màu, cây công
nghiệp và các loại cỏ khác nhau bị nấm này gây hại. Nấm R. solani xuất hiện
6


khắp nơi trên thế giới và gây thiệt hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Nó
là nguồn gây bệnh hoại sinh, tồn tại và sinh sống trong đất,tấn công các thực
vật cư trú ở đó.Tác nhân gây bệnh này được biết là gây thiệt hại nghiêm trọng
cho cây trồng bằng cách tấn công chủ yếu là rễ và thân cây của cây trồng.
Mặc dù, nó có một loạt các cây trồng làm ký chủ nhưng mục tiêu chính của
chúng lại là các loại cây thân cỏ. Chủng nấm R.solani sẽ được coi là một loại
nấm đảm nếu giai đoạn sinh sản hữu tính dồi dào [20].
Nấm R. solani sống tốt trên cả 3 loại đất: thịt pha cát, đất thịt mùn và đất sét
pha cát. R. solani có khả năng gây bệnh trên rất nhiều loại cây khác nhau như:
lúa, ngô, các cây họ đậu, lục bình, cà chua, bông…Theo Gangopadyay và
Chaksabarti (1982) thì nấm R.solani là loại đa kí chủ gây hại trên hầu hết các
cây trồng thuộc 32 họ và trên 20 loại cỏ thuộc 11 họ thực vật khác nhau. Nấm
này còn gây bệnh chết rạp cây con và lở cổ rễ trên cà phê, chè, thối cổ rễ ở
cây chuối, đậu phộng, gây cháy lá trên dưa chuột và bầu bí, gây lở cổ rễ bông

vải, héo vàng khoai tây, còn trên cây cà chua, đậu đỗ gây bệnh hại vào thời kỳ
cây con ở rễ, cổ rễ, gây úng nước cây chuyển sang màu nâu đen,cây đổ rạp
gọi là bệnh lở cổ rễ.Trên cây ngô gây bệnh hại trên bẹ, phiến lá,thân và bắp
ngô tạo ra nhiều viết thương lớn loang lổ, đốm vằn da hổ, hình dạng bất kỳ
như đám mây. Vết bệnh lan từ phía dưới gốc lên bắp,cờ, làm cây tàn lụi,bắp
thối gây tổn thất lớn trên các giống ngô mới [8].
Nấm R.solani tồn tại trong đất trong nhiều năm trong các hình thức hạch
nấm. Hạch nấm của Rhizoctonia có lớp bên ngoài dày làm tăng khả năng
sống sót và chúng hoạt động như cấu trúc ngủ đông cho tác nhân gây bệnh.
Nấm được lây nhiễm vào cây trồng bởi các kích thích hóa học được phát ra
bởi sự phát triển cây trồng hoặc dư lượng thực vật phân hủy. Quá trình xâm
nhập của mầm bệnh có thể xảy ra thông qua sự xâm nhập trực tiếp của các lớp
biểu bì bằng các con đường qua các lỗ hở tự nhiên của cây. Sợi nấm sẽ tiếp
xúc với cây và gắn với cây thông qua tăng trưởng, chúng bắt đầu sản xuất một
cấu trúc thâm nhập vào tế bào của cây và sử dụng chất dinh dưỡng từ tế bào
7


của cây, mầm bệnh cũng có thể sản xuất các enzyme phân hủy thành tế bào
thực vật và tiếp tục phát triển bên trong các mô chết. Mầm bệnh mới được sản
xuất trên hoặc trong các mô thực vật và được lặp đi lặp lại một chu kỳ mới
khi các nguồn lây bệnh mới trở nên có sẵn [16,19].
1.2.2 Tình hình bệnh hại cây trồng do nấm Fusarium và nấm Rhizoctonia
gây ra tại Việt Nam
Ở nước ta, điều kiện khí hậu và tập quán canh tác rất tốt nên thích hợp cho
nấm F.oxysporum và R.solanitồn lưu, phát triển và gây bệnh. Bệnh nấm
F.oxysporum và R.solani là một trong những bệnh quan trọng gây hại đồng
thời nhiều loại cây trồng như cà chua, khoai tây,ngô, đậu tương, cây ăn
quả,sầu riêng. Hàng năm sản lượng nông nghiệp thất thu do bệnh này tới hàng
chục tỉ đồng. Ước tính rằng, năm 2010 thiệt hại về bệnh thực vật bao gồm cả

chi phí kiểm soát lên tới 701,2 triệu đô la. Hai trong các cây quan trọng bị hai
nấm trên gây hại mà có ý nghĩa kinh tế và sản lượng nông nghiệp cao là cây
ngô và cây đậu tương. Đây là hai cây lương thực và cây công nghiệp ngắn
ngày quan trọng. Mang lại hiệu quả kinh tế cao trên thế giới và ở Việt Nam
nhưng lại bị bệnh do nấm F.oxysporum và R.solani gây hại nặng ở miền bắc
Việt Nam. Để sản phẩm an toàn cần có các biện pháp sinh học canh tác để
hạn chế bệnh do nấmF.oxysporum vàR.solani gây hại ngoài đồng và truyền
qua hạt đậu tương và ngô. Các bệnh héo trên cây trồng là vấn đề quan trọng
ở Việt Nam, chủ yếu là do nấm F. oxysporum gây ra, nó cũng có thể gây
thối ở dưa hấu và củ khoai tây đã bị sâu hoặc bị dụng cụ gặt hái làm tổn
thương [9].
Bệnh đốm cháy lá do nấm R.solani Kuxhn gây ra xuất hiện từ khi cây
bông mới mọc và bệnh tiếp tục phát triển mạnh mẽ về cuối vụ, gây hại nặng
cho cây bông ở vùng Đồng Nai. Ngoài cây bông nấm R.solani Kuxhn còn
gây hại trên cây đậu xanh, cây ngô,cây cối xay...Nguyễn Kim Vân đã tìm thấy
7 bệnh phổ biến trên cây cải bắp do nấm R.solani gây hại nghiêm trọng với tỉ

8


lệ bệnh từ 26% đến 50% bệnh hại rất nặng ở giai đoạn bắp cuối đến thu hoạch
[5].
Đỗ Tấn Dũng nghiên cứu cho thấy bệnh lở cổ rễ do nấm R.solani gây ra là
bệnh hại phổ biến trên nhiều loại cây trồng thuộc họ cà, họ đậu, họ bầu bí.
Mức độ nhiễm bệnh trên các cây kí chủ cà chua, lạc, đậu tương,...cũng khác
nhau. Phạm vi ký chủ của nấm R. solani vùng Hà Nội năm 2005 -2006 gồm
các cây cà chua, khoai tây, lạc đậu tương, đậu đũa, dưa chuột [2] .
Bệnh lở cổ rễ hại bông ở vùng duyên hải miền Trung chủ yếu là do nấm
R.solani gây ra. Ngoài ra, còn có một số tác nhân khác như F. oxysporum
nhưng ở mức thấp. Bệnh lở cổ rễ do nấm R.solani gây hại từ khi hạt nảy mầm

cho đến giai đoạn 25 ngày tuổi, đặc biệt gây hại khi cây bông được 2-3 lá thật,
cây bông càng lớn thì càng ít bị ảnh hưởng. Nấm gây bệnh chủ yếu tồn tại
trong đất còn đối với nguồn nước tưới và hạt giống thì chưa phát hiện ra [8].
1.2.3 Biện pháp phòng trừ bệnh nấm hại cây trồng
Biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học
Hiện nay, biện pháp phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng phổ biến vẫn là sử
dụng các loại thuốc hóa học với ưu điểm dễ sản xuất ở quy mô lớn, giá thành
rẻ phổ tác dụng rộng với động lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh. Tuy
nhiên, chúng càng ngày càng bộc lộ nhiều nhược điểm như nhanh bị ức chế
bởi côn trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, ảnh hưởng xấu đến
sức khỏe con người. Việc sử dụng tràn lan các loại thuốc bảo vệ thực vật đã
làm loài gây hại biến đổi nhanh chóng dẫn đến hiệu quả của việc sử dụng
thuốc ngày càng thấp và chi phí ngày càng cao. Ước tính có khoảng 520 loài
vi sinh vật gây bệnh cây và 273 loài cỏ dại đã ức chế lại thuốc [43].
Một số loại thuốc bảo vệ thực vật có thời gian phân hủy lâu,sau khi được
sử dụng sẽ thẩm thấu một phần nào đó vào các mạch nước ngầm. Các chất
này khi đã ngấm vào đất thì gây nguy cơ ngộ độc thuốc diệt công trùng rất
cao. Thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp có độc lực mạnh,phổ tác dụng
rộng.Chúng không chỉ tiêu diệt các đối tượng gây hại mà còn tiêu diệt cả
9


những loài có ích như động vật ăn côn trùng. Các loài kí sinh côn trùng hại
cây trồng,tiêu diệt ong mật và côn trùng thụ phấn cho cây làm cho nhiều cây
trồng thụ phấn nhờ côn trùng giảm năng suất và chất lượng [39].
Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật làm cho thực vật bị nhiễm độc, gây ngộ
độc cấp tính hoặc mãn tính cho người sử dụng [49].Trên thế giới hàng năm có
khoảng 26 triệu trường hợp bị ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật,750 nghìn
trường hợp ngộ độc mãn tính,3 triệu trường hợp phải nhập viện và 200 nghìn
trường hợp tử vong [19]. Ở Việt Nam khoảng 15 đến 20 triệu người thường

xuyên phơi nhiễm với thuốc bảo vệ thực vật.Theo báo cáo của cục y tế dự
phòngvà môi trường -Bộ y tế năm 2009 đã có 4515 trường hợp bị nhiễm độc
thuốc bảo vệ thực vật trong đó có 138 trường hợp tử vong.Con số trên chỉ là
kết quả thống kê các trường hợp đã nhập viện [1,49].
Biện pháp phòng trừ bằng thuốc có nguồn gốc sinh học
Ở Việt Nam hiện nay đã và đang hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật
hóa học mà thay vào đó là sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để nhằm phát
triển nền nông nghiệp hữu cơ an toàn và bền vững.Các chế phẩm sinh học tác
dụng có chọn lọc mỗi chế phẩm chỉ tác dụng lên một hay một số đối tượng
nhất định, không hoặc chỉ gây ảnh hưởng đến một số ít loài ăn sâu bọ,các loài
kí sinh sâu bọ và các loài sinh vật có ích khác. Do vậy, hệ sinh thái được phun
các chế phẩm sinh học này không bị xáo trộn,đảm bảo sự ổn định bền vững
của vùng đất trồng trọt.Chế phẩm khi phát tán sang các vùng lân cận cũng
không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cây trồng ở đó.
Các chế phẩm chứa yếu tố tiêu diệt nấm bệnh là vi sinh có khả năng duy trì
hiệu quả kéo dài,chúng không chỉ tiêu diệt nấm đang phá hoại mà còn tồn tại
trong đất từ thế hệ này sang thế hệ khác.Do có tác dụng chọn lọc lên đối
tượng gây hại,các chế phẩm sinh học sẽ không được sử dụng tràn lan, vì vậy
nguy cơ ức chế thuốc của nấm bệnh sẽ được giảm thiểu. Mỗi chế phẩm được
sử dụng trong thời gian lâu hơn làm giảm chi phí nghiên cứu sản xuất các loại
chế phẩm mới thay thế. Các chế phẩm sinh học có thành phần chính là các cơ
10


thể sống hoặc có nguồn gốc từ cơ thể sống,chúng dễ bị phân hủy thành các
chất không độc sau một thời gian sử dụng, không làm ô nhiễm đất, nước và
không khí.Vì các chế phẩm này đã được chọn lọc để tác dụng đến từng loại
côn trùng nhất định,trong trường hợp các cơ thể sống từ các chế phẩm còn
tồn tại được trên các nông sản cũng không gây ảnh hưởng lên sức khỏe con
người,nếu phát tán vào các thủy vực các chế phẩm này ít ảnh hưởng xấu đến

các vi sinh vật đó và do đó không làm giảm giá trị khai thác nguồn lợi thủy
sản cũng như sự cân bằng của hệ sinh thái.Mặc dù, có một số nhược điểm như
giá thành sản xuất cao,hoạt lực không mạnh bằng hóa chất tổng hợp,hiệu lực
tác dụng chậm nhưng với những ưu điểm vượt trội so với hóa chất tổng hợp
về độ thân thiện với môi trường,hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người,các
chế phẩm sinh học ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm trong nghiên cứu
và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp.
Trên thực tế đã có nhiều chế phẩm từ các hoạt chất vi sinh vật đã được thương
mại hóa.Ballad là một chế phẩm từ chủng B. pumilus(strainQST 2808)
AgraQuest www.agraquest.com, sản phẩm mới năm 2005. Có thể sử dụng
cho khoai tây, đậu tương,ngũ cốc B.pumilus sinh tổng hợp một chất đường
amino chống nấm và ngăn chặn sự hình thành của các tế bào mới và làm rối
loạn trao đổi chất tế bào dẫn đến phá hủy tế bào và diệt thể gây bệnh cây
trồng. Ballad cũng tạo ra rào cản vi khuẩn trên bề mặt lá,ngăn thể gây bệnh
như nấm gây rỉ sắt và mốc sương từ khi hình thành trên thực vật.Thuốc này có
phổ sử dụng rộng được ghi vào

danh sách chất kiểm soát gỉ sắt, mốc

sương,mốc lông tơ và bệnh bạc lá.
Chế phẩm antiforhis là sản phẩm lên men xốp thanh trùng trên nền giá thể
dinh dưỡng của một hỗn hợp các chủng vi khuẩn chọn lọc thuộc các nhóm
pseudomonas sinh huỳnh quang Bacillus.Ngoài khả năng đối kháng mạnh và
phân hủy sợi nấm bệnh cây F. oxysporum, R. solani cũng như một số nấm
bệnh cây khác có nguồn gốc từ trong đất gây bệnh thối rễ,lở cổ rễ.Tuy nhiên
sản phẩm này mới dừng lại ở mức độ sử dụng tế bào vi sinh vật sống làm tác
11


nhân ức chế sinh trưởng của nấm bệnh có nguồn gốc từ trong đất.Sản phẩm

này có thời gian hữu hiệu ngắn,không quá 12 tháng và chỉ có tác dụng phòng
trừ những nấm bệnh cây có nguồn gốc từ trong đất.Mặc dù tác dụng phòng trừ
nấm bệnh cây có nguồn gốc từ không khí của các sản phẩm vừa nêu chưa
được đề cập tới,nhưng chắc chắn hiệu quả của chúng sẽ không cao,vì sự tồn
tại trên bề mặt lá,hoa,quả của tế bào sống gặp ít điều kiện thuận lợi hơn so với
điều kiện vùng rễ cây trồng ( tác động trực tiếp của ánh sáng mặt trời, độ
ẩm,gió lớn).
Năm 2010, Nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ sinh học đã nghiên cứu
thành công chế phẩm BCF từ các dịch chiết ngoại bào từ 3 chủng
Bacillus,Burkholderia và Pseudomonas có khả năng ức chế đến 90% Sự sinh
trưởng và phát triển và phát triển của chủng nấm F. oxysporum, R. solani[3].
Biện pháp khác
Việc áp dụng 2 biện pháp trên có thể kết hợp với một số biện pháp trong quá
trình sản xuất như biện pháp canh tác: áp dụng biện pháp luân canh cây
trồng, các kỹ thuật trồng trọt.Hoặc sử dụng các sản phẩm phân bón công nghệ
sinh học cho cây trồng. Sau hơn nửa thế kỉ, chúng ta sử dụng rộng rãi đến
mức lạm dụng phân bón hóa học,hầu hết các nước trên thế giới đã nhận ra
mặt trái của nó.Môi trường bị ô nhiễm trầm trọng, đất bị thoái hóa, trai
cứng,ngộ độc nhất là những cây trồng lâu năm sinh trưởng kém,nông sản
chứa nhiều độc tố.Phân bón hữu cơ sinh học là loại phân bón có nguồn gốc
hữu cơ được sản xuất bằng công nghệ sinh học (như lên men,vi sinh ..) và
phối trộn thêm một số hoạt chất khác làm tăng độ hữu hiệu của phân,khi bón
vào đất sẽ tạo môi trường cho các quá trình sinh học trong đất diễn ra thuận
lợi góp phần làm tăng năng suất chất lượng cây trồng.
Từ lâu phân ủ (compost) đã được nông dân hầu khắp các nước trên thế giới sử
dụng cho sản xuất nông lâm nghiệp nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây
trồng và cải tạo độ phì nhiêu của đất.Từ chỗ Compost chỉ sản xuất bằng
phương pháp thủ công truyền thống tự cung tự cấp chưa thành sản phẩm cung
12

ứng bán trên thị trường. Đến nay nhiều nước như Nhật Bản, Hàn Quốc,Đài
loan, ...compost đã được sản suất theo quy mô công nghiệp và chở thành sản
phẩm hàng hóa trên thị trường.Xu hướng chung hiện nay là tạo ra sản phẩm
hữu cơ giàu dinh dưỡng, có bổ sung các vi sinh vật hữu ích, chức năng phù
hợp với từng loại cây trồng. Như vậy, phân bón hữu cơ vi sinh vật chức năng
(HCVSVCN) là phân bón hữu cơ sinh học có bổ sung tổ hợp các vi khuẩn có
khả năng cố định nitơ và chuyển hóa lân khó tan.
Trong những năm gần đây,việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học
phân bón hữu cơ vi sinh đã phát triển rất nhanh để thay thế cho phân vô cơ
hóa học gây thoái hóa đất trồng.Các nước cũng rất chú trọng đến việc nghiên
cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học phòng trừ dịch hại dạng bón
phối hợp với phân bón để thay thế dần và đi đến loại bỏ hoàn toàn thuốc trừ
dịch hại hóa học độc hại gây ô nhiễm môi trường.Những nghiên cứu này đã
tập chung vào một số các loài vi sinh vật có tính kháng vi sinh vật gây hại
như:
Các chủng P.fluorescens là vi sinh vật có tính đối kháng có khả năng sinh
tổng hợp các chất ức chế,có thể ức chế tới 72% sự phát triển của hệ sợi nấm
Phytophthora capsici gây bệnh thối cổ rễ cây hồ tiêu [38].
Theo Amaret (2002) việc phối hợp sử dụng nấm Metarhizium, chế phẩm
Neem với phân bón hữu cơ vi sinh cho hiệu quả từ rệp sáp hại gốc tới 60%,trừ
tuyến trùng hại rễ đạt hiệu quả 70-80% trên các cây trồng cạn.Việc sử dụng
chế phẩm như vậy không chỉ có hiệu quả cao trong hạn chế dịch hại mà còn
giúp cây trồng phát triển khỏe hơn, sinh trưởng tốt hơn và đề kháng nấm hơn.
Tuy nhiên, các loại thuốc bảo vệ thực vật sinh học dạng bón phối hợp với
phân bón hữu cơ vi sinh chỉ có hiệu quả cao khi không có tác động ức chế lẫn
nhau giữa các tác nhân vi sinh vật có trong các chế phẩm.Vì vậy, cần phải có
sự nghiên cứu nhằm xác định khả năng tương tác giữa các vi sinh vật hữu
hiệu theo tường loại tổ hợp nhất định.

13


Bên cạnh đó, việc kết hợp với biện pháp cơ học và lí học: xử lí đất, phơi
đất,xử lý hạt giống và đất bằng nhiệt,nhổ bỏ cây bệnh,...Áp dụng quản lý dịch
hại tổng hợp nhằm đem lại hiệu quả phòng trừ bệnh hại tốt nhất.
1.3 Tình hình nghiên cứu về chủng Serratia marcescens
1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, mỗi năm thiệt hại hàng trăm triệu dollar bởi bệnh nấm gây
thiệt hại mặc dù đã sử dụng thuốc sát trùng. Vấn đề về môi trường và sự phát
triển ức chế thuốc ở các nấm bệnh đã làm giảm hiệu quả của các loại thuốc
diệt nấm. Vì vậy, các chất ức chế nấm do các vi sinh vật đất sản sinh ra là
một nguồn thuốc sinh học mới, an toàn đầy tiềm năng. Kiểm soát sinh học
(nghĩa là sử dụng các vi sinh vật tự nhiên hoặc các sản phẩm của chúng để
hạn chế sự tấn công và gây hại bởi các mầm bệnh thực vật) hiện đang được
quan tâm rất nhiều [11] .
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy chủng vi khuẩn Serratia đóng vai
trò quan trọng trong việc hạn chế bệnh cây trồng. Các chủng Serratia sinh
tổng hợp nhiều loại chất kháng nấm và protein khác nhau như: chlorinated
macrolide, haterumalide, NA, and NE pyrrolnitrin, chitinase, β-1,3 glucanase.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho rằng các chủng vi khuẩn S.
marcescens đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế các bệnh ở cây trồng.
Năm 1996 Kalbe và các cộng sự đã công bố tìm thấy các hoạt chất kháng nấm
phytopathogenic từ các chủng Serratia được phân lập từ rễ của cây cái dầu
[27]. Năm 2001 Someya và cộng sự đã tách chiết được chitinase và
prodigiosin có khả năng chống lại các bệnh mốc xám và các bệnh héo do nấm
Fusarium gây ra ở các cây Anh thảo từ chủng S. marcescens B2 [42].Năm
2002 Kamensky và các cộng sự đã công bố việc sử dụng S. plymuthica được
phân lập từ đất xung quanh rễ cây dưa để kháng nấm phytopathogenic trong
ống nghiệm [28]. Năm 2004 Givi và cộng sự đã tách chiết được prodigiosin

từ chủng S. marcescens có khả năng kháng một số nấm [21].

14


Năm 2007 Liu và cộng sự đã tách chiết được pyrrolnitrin từ chủng
S.plymuthica có khả năng chống lại các bệnh héo do nấm Verticillium gây ra
[31]. Năm 2010 Liu và cộng sự đã tìm thấy chất có khả năng kháng một số
loại nấm như Botrytis cinerea, Cryphonectria paracitica, R. cerealis và Valsa
sordida từ chủng Serratia sp.G3 [32].Năm 2013 Wang và cộng sự đã công bố
việc sử dụng chủng S. marcescens được phân lập từ vỏ lạc để sản xuất ra các
chất có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của sợi nấm A.paraciticus và aflatoxin
[46]. Cũng năm này, Okay và cộng sự đã nghiên cứu tách chiết được
chitinase từ chủng S.marcescens MO-1 có khả năng ức chế sự sinh trưởng bào
tử của một số loại nấm như A. niger,Rhizopus oryzae, F.oxysporun [36].
Năm 2014 Nalini và cộng sự đã tách chiết được rhamnolipidtừ chủng
S.rubidaea SNAU02 có khả năng kháng một số loại nấm [35].Năm 2015
Gutiserrezvà cộng sự đã tách chiết được chinitase và prodigiosin từ chủng
S.marcescens CFFSUR -B2 có khả năng chống lại nấm Mycosphaerella
fijienis gây bệnh đen ở chuối [24].
1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Việc nghiên cứu các protein có hoạt tính kháng nấm ở cây trồng đã và
đang được quan tâm ở Việt Nam. Một số cơ sở nghiên cứu trong nước như
Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện Hàn lâm khoa học
và công nghệ Việt Nam ), Viện bảo vệ thực vật và Viện Thổ nhưỡng và nông
hóa (Bộ NN& PTNT), Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Đại Học
Cần Thơ. Và các công bố cho thấy một số nhóm vi sinh vật như Trichoderma,
Pseudomoas,Bacillus đã được phân lập, tuyển chọn và đánh giá là những tác
nhân tiềm năng cho phát triển các chế phẩm sinh học đề phòng chống các
nấm bệnh cây [3,6].

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu thành công về ứng dụng của vi
sinh vật đối với ức chế nấm bệnh ở cây trồng. Năm 2005 Lê Thị Hồng Minh
và cộng sự đã công bố: Tách dòng và giải trình tự đoạn gene phLD mã hóa
cho 2,4-diacetylphoroglucinol từ S. marcescens kháng F. oxysporum [6]. Năm
15


2015,Vũ Trọng Lượng và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm của
chủngS.marcescens M6 phân lập ở mẫu đất, trong khi dịch chiết ức chế ngoại
bào chỉ ức chế nấm được 20-30% khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm
F.oxysporum vàR.solani, còn hoạt chất prodigiosin tinh sạch tách ra từ chủng
này đã ức chế lên đến hơn 75% ở nồng độ hoạt chất đạt 40 µg/m [7].Trần Thị
Thùy Linh và cộng sự (2015)bước đầu đã khảo sát tìm được các môi trường
làm tăng sinh tổng hợp các hoạt chất ngoại bào từ chủng S. marcescens DT3
[9].

16


Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1Vật liệu và hóa chất
2.1.1 Chủng giống
Chủng vi khuẩn S.marcescens DT3 do phòng Công nghệ sinh học Enzyme,
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Chủng nấm bệnh F.oxysporum và R. solani từ bộ sưu tập giống của phòng
bệnh cây,Viện bảo vệ thực vật, Từ Liêm, Hà Nội cung cấp.
2.1.2 Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết. Một số hóa chất
chính được liệt kê ở Bảng 2.1
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất và enzyme

Hãng sản xuất

EDTA, temed

Mearck (Đức)

Cao nấm men, pepton

Bio Basic Inc (Canada)

SDS

Sigma (Mỹ)

Thang protein chuẩn

Fermentas

Bột khoai tây

Việt Nam

Agar, một số loại muối NaCl, (NH4)2SO 4…

Trung Quốc

DEAE - cellulose

Merck ( Đức)

2.1.3 Các loại đệm và dung dịch
Các loại dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng dẫn
của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong
bảng 2.2.

17