Bệnh tiểu đường tổng hợp insulin bằng ứng dụng công nghệ sinh học

Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
MỤC LỤC
5.1 Tác đông của insulin đến trao đổi carbohydrate..............................................................9
5.2Tác động của insulin lên lipid........................................................................................13
5.3Tác động của insulin lên protit.......................................................................................13
37
11.2Thuốc tiêm....................................................................................................................37
*Insulin (dùng cho dạng typ1).............................................................................................37
* Thuốc dùng cho dạng typ2...............................................................................................38

I. MỞ ĐẦU
CNSH – ngành nâng cao chất lượng cuộc sống thế kỷ 21. Cùng với
sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật khác như: vật lý, hóa học,
điện hạt nhân, công nghệ thông tin... CN9SH cũng được chú ý phát triển ở
các nước công nghiệp từ những năm đầu thập niên 80, ở các nước có nền
công nghiệp mới thì từ những năm 85 và các nước đang phát triển trong
khu vực thì chủ yếu từ những năm 90 trở lại đây. Đến nay, hầu hết ở các
nước CNSH đều được coi là một hướng khoa học công nghệ ưu tiên, đầu tư
và phát triển trở thành một trong những ngành mũi nhọn của thế kỷ 21.
Chính nhờ đó và được thừa hưởng một cách tổng hợp những thành quả của
các ngành khoa học cơ bản như: VSV học, di truyền học, sinh hóa học, sinh
lý học, sinh học phân tử, miễn dịch, VSV học ứng dụng, công nghệ sinh
hóa học... đồng thời xu hướng hội nhập, quốc tế hóa, toàn cầu hóa CNSH
đã phát triển và được ứng dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực của cuộc
sống: nông - lâm – ngư nghiệp, lĩnh vực y – dược, khoa học thực phẩm, bảo
vệ môi trường... nhằm phục vụ cho mọi nhu cầu của cuộc sống: dinh dưỡng,
giải trí, chăm sóc sức khỏe... và mang lại lợi ích kinh tế to lớn cho các quốc
gia.
CNSH được chia làm 3 giai đoạn căn cứ vào sự phát triển của nó:

1

Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
+ CNSH truyền thống: chế biến các thực phẩm như tương, chao,
nước mắm... theo phương pháp truyền thống, xử lý đất đai, phân bón để
phục vụ nông nghiệp.
+ CNSH cận đại: sử dụng công nghệ trong quá trình chế biến sản
phẩm như việc sử dụng các nồi lên men công nghệ để sản xuất ở quy mô
lớn các sản phẩm: mì chính, acid amin, acid hữu cơ, chất kháng sinh...
+ CNSH hiện đại: công nghệ di truyền, công nghệ tế bào, công nghệ
Enzym và Protein, công nghệ VSV, công nghệ lên men, công nghệ môi
trường... Nhờ đó, loài người đã và đang có thể sửa chữa, trao đổi, cải tạo,
tạo mới vật chất di truyền ở cấp độ phân tử. Thực tế, phát triển và ứng dụng
CNSH hiện đại trên cơ sở kế thừa và phát huy CNSH cổ truyền và cận đại.
Những năm gần đây loài người đã có thể tuyển chọn và dần tạo thêm được
giống cây trồng, vật nuôi mới có năng suất, chất lượng cao, sức chống chịu
tốt... tạo ra được các chủng, loài VSV mới hoặc chỉ định các VSV này tạo
ra các Enzym, Protein có hoạt tính cao hơn các sản phẩm khác mà trước đây
chúng ta không làm được. Đặc biệt là nhân loại đã và đang có thể chuẩn
đoán, phòng ngừa hay cứu chữa các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền: ung
thư, thiếu máu, các bệnh nhiễm sắc thể thường và nhiễm sắc thể giới tính...
bằng kỹ thuật gen và ứng dụng các loại VSV trong việc tổng hợp các loại
thuốc cũng như những chất dinh dưỡng cho con người. Và bệnh tiểu đường
cũng là một trong những bệnh đã ứng dụng thành tựu của ngành CNSH qua
việc tổng hợp insulin làm giảm chi phí cho những bệnh nhân. Điều này rất
quan trọng vì số bệnh nhân tiểu đường đang có xu hướng tăng trong tương
lai. Chính vì những điêu đã phân tích ở trên mà nhóm chúng em đã chọn đề
tài này. Và cũng qua đó chúng em cùng các bạn có được cách nhìn vừa khái
quát vừa cụ thể về bệnh tiểu đường, cách phòng chữa bệnh. Đặc biệt là quá
trình sinh tổng hợp insulin – thuốc dành cho người mắc bệnh tiểu đường,

bằng những con đường khác nhau. Không chỉ có vậy, qua bài viết này
chúng em muốn cùng mọi người cùng đi sâu tìm hiểu thêm nhiều vấn đề
mang tính xã hội liên quan đến những khía cạnh của cuộc sống.

2


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

II. NỘI DUNG
1. Giới thiệu về insulin
Insulin là một loại hormone có bản chất protein được tiết ra từ tuyến
tụy trong cơ thể. Đây là hormone quan trọng nhất cho quá trình lưu trữ, sử
dụng đường, acid amin, acid béo và kiểm soát lượng đường trong máu.

3


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H1: Tuyến tụy nằm bên cạnh tá tràng.

2.

Quá trình tìm ra insulin
Bệnh tiểu đường từng được biết đến từ thời cổ đại. Những tài liệu cổ
của người Ai Cập từ 1.500 năm trước Công nguyên đã mô tả một bệnh suy
mòn với tình trạng nước tiểu của người bệnh có vị ngọt. Từ những năm
1850 trở đi, các cuộc khám nghiệm tử thi trên bệnh nhân bị bệnh tiểu đường
đã gợi ý, bệnh xuất hiện là do tuyến tụy không bảo đảm được chức năng

bình thường. Nhiều bác sĩ cho rằng các tế bào biệt hóa, được gọi là tiểu đảo
Langerhan, sản sinh ra một hóa chất giúp cơ thể điều hòa nồng độ đường
trong máu. Bệnh tiểu đường xuất hiện khi hóa chất này không được sản
sinh.

4


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
Năm 1922, Fred Banting và Charles Best thuộc Đại học Tổng hợp
Toronto (Canada) thông báo họ đã tìm ra insulin và ứng dụng thành công
chất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người. Vào thời điểm đó, người bị
bệnh tiểu đường phải vật lộn với căn bệnh để tồn tại và chưa có biện pháp
điều trị hiệu quả nào. Bệnh nhân nhanh chóng trở thành những bộ xương di
động và thường chết sớm do bị sút cân nghiêm trọng.
Banting và Best đã cắt bỏ tuyến tụy của những chú chó, và hậu quả là
chúng bị tiểu đường (thử nghiệm này nghe có vẻ tàn nhẫn, nhưng đã giúp
cứu sống hàng triệu con người). Họ đã cố gắng tinh chế ra một hoóc môn
hóa học từ tụy và chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan. Sau
đó, những chất này được tiêm vào chó bị bệnh tiểu đường để thử nghiệm và
họ nhận thấy bệnh tiểu đường đã bị đẩy lùi.
Ban đầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất và thường gây những tai biến
nguy hiểm. Một đội ngũ các nhà khoa học đã phối hợp nghiên cứu và tạo ra
được tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết
để thử nghiệm trên người bệnh. Vào tháng 5 năm 1922, Leonard
Thompson, 14 tuổi, đã được điều trị thành công ở Bệnh viện Toronto bằng
tinh chất này (được gọi là insulin). Năm 1928, Oskar Wintersteiner đã
chứng minh rằng insulin là một protein. Tin tức về sự thành công của
Banting và Best đã nhanh chóng lan rộng và ngay sau đó phòng thí nghiệm
của họ đã không thể đáp ứng đủ nhu cầu về loại thần dược mới này.

Quy trình sản xuất thương mại insulin bắt đầu bằng việc chiết suất
chất này từ tụy của bò và lợn thịt (hiện vẫn là nguồn insulin quan trọng đối
với y học). Quá trình biến đổi hóa học đã làm cho insulin này giống với
hoóc môn của người và cũng tạo cho nó những đặc tính thuận tiện hơn cho
việc sử dụng. Ban đầu, insulin được tiêm 3-4 lần/ngày trước bữa ăn. Sau đó,
loại insulin có tác dụng kéo dài được ra đời, vì vậy số lần tiêm đã giảm
xuống.
3.

Phân loại insulin
Theo nguồn gốc :

5


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
+Từ nguồn gốc động vật : tuỵ của bò, lợn : có khác biệt một chút về
cấu trúc so với insulin của người. Ngày nay, đã được tinh chế bằng phương
pháp sắc ký, có độ tinh khiết cao. Phổ biến là 2 loại : Actrapid beef và Lent
beef.
+Insulin "người" : bằng các phương pháp
-Bán tổng hợp từ insulin lợn
-Tái tổ hợp gen : từ loại insulin trung tính đơn thành phần, được sản
xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp AND, sử dụng nấm men làm cơ thể sinh sản
đạt đến độ tinh khiết, chất lượng cao, có cấu trúc giống hệt như insulin tự
nhiên của người. Do vậy, ít tạo kháng thể và thời gian tác dụng ngắn hơn.
+Theo kỹ thuật : tinh chế cao độ và tinh chế theo sắc ký.
+Theo tác dụng : 3 loại : nhanh, trung bình, chậm.
4.

Cấu tạo của insulin

Phân tử insulin được sử dụng làm mô hình cho các nghiên cứu về cấu
trúc và tính chất cơ bản của protein. Nó cũng là protein đầu tiên được giải
mã trình tư sắp xếp chuỗi acid amin vào năm 1955 nhờ công trình nghiên
cứu của Fred Sanger(nghiên cứu đã mang về cho ông giải thưởng Nobel
năm 1958). Phân tử protein insulin có khối lượng khoảng 6000 Dalton, cấu
tạo bởi hai chuỗi polypeptide A và B được liên kết với nhau bởi các cầu
disulfur. Chuỗi A với 21 acid amin và chuỗi B với 30 acid amin, có một cầu
nối disulfur trong chuỗi A(A6 – A11) và 2 cầu nối disufur nối giữa hai
chuỗi A và B(A7 – B7 và A20 – B19).

6


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H2: Insulin nối bằng nối disulfide (S-S)

Vị trí của các cầu nối disulfur này không thay đổi theo loại insulin
của các loài đông vật có vú. Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng
“preproinsulin” (tiền insulin) trên ribosome trong tế bào beta trong vùng
Langerhans của tuyến tụy. Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng bao
gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với
31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A. Khi vận
chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (BC-A). Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành
cấu trúc bậc ba. Proinsulin bị phân cắt bởi enzyme PC1/3 tại liên kết giữa
chuỗi B và peptide C và sau đó bị phân cắt bởi enzyme PC2 ngay vị trí liên
kết giữa chuỗi A và peptide C. Hai acid amin đầu N của peptide nối với đầu
C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi B

bởi enzyme carboxypeptidase H. Kết quả cuối cùng của quá trình phân cắt
tạo thành insulin.

7


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H3: Cấu trúc phân tử insulin người.

Người ta cũng đã xác định được cấu trúc không gian ba chiều của
insulin và thấy rằng cấu trúc phân tử insulin được giử vững bởi nhiều liên
kết: liên kết hydro và liên kết cầu disulfua giữa chuỗi A và chuỗi B.

H4: cấu trúc không gian của insulin

8


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
Vấn đề đặt ra là cấu trúc insulin của những loài động vật có vú
(mammalian species) khác với cấu trúc insulin của loài người ở chổ nào?
Điều đó cũng giải thích là ta ít dùng insulin của các động vật có vú dùng
thay cho người đươc (W.F Ganong, 2004). Sự khác nhau, nếu so sánh với
insulin của con người, được nhìn thấy sau theo bản dưới đây. Nói chung thì
40% giống nhau, còn khác nhau ở các vị trí 8,9,10 và 30 và tên của các
amino acids (Katzung, 2000)
Sự thay đổi chuổi cấu trúc amino acid của con người.
Chủng loại

Chuỗi A các vị trí

Chuỗi B các vị trí

8 - 9 - 10

30

Heo, chó, tinh dịch cá voi

Thr-Ser-Lie

Ala

Thỏ

Thr-Ser-Lie

Ser

Gia súc(trâu, bò ngựa, dê

Ala-Ser- Val

Ala

Trừu

Ala-Gly- Val

Ala

Ngựa

Thr-Gly-Lie

Ala

Sei whale

Ala-Ser-Thr

Ala
(Source W.F ganong, 2004

5. Vai trò sinh học của insulin
5.1

Tác đông của insulin đến trao đổi carbohydrate.
Tác động của insulin đến chức năng dữ trữ đường tại gan:

+Sau một bữa ăn nhiều tinh bột và đường, hàm lượng glocose trong
máu tăng sẽ kích thích tế bào beta của đảo tuỵ tiết insulin. Insulin sẽ tác
động đến các quá trình giữ, dự trữ và sử dụng glucose bởi các loại mô trong
cơ thể đặc biệt là tại gan, cơ và mô mỡ.

9


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H5: insulin vận chuyển glucose trong máu

Khi nồng độ glucose trong máu tăng cao (sau khi ăn, uống đồ uống
có nhiều đừớng, truyền glucose v.v.), glucose sẽ được dự trữ trong gan dưới
dạng glycogen. Khi hàm lượng đường trong máu giảm (khi đói, giữa hai
bữa ăn...) glycogen sẽ biến đổi trở lại thành glucose để đi vào máu giữ cho
lượng đường trong máu (gọi tắt là đường huyết) không hạ quá thấp.
Insulin tác động đến quá trình này như sau:
- Insulin ức chế phosphorylase, một enzyme biến đổi glycogen thành
glucose
- Insulin làm tăng cường hấp thu glucose của các tế bào gan thông
qua tác động của enzyme glucokinase (enzyme này tăng cường phosphoryl
hoá giữ glucose không qua được màng tế bào để đi ra ngoài).
- Tăng cường hoạt tính của enzyme tổng hợp glycogen bao gồm
phosphofructokinase dẫn đến giai đoạn hai của quá trình phosphoryl hoá
phân tử glucose và glucose synthetase có tác dụng tạo chuỗi từ các
monosaccharide để hình thành phân tử glycogen.

10


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
Các tác động này làm tăng lượng glycogen dự trữ trong gan (có thể
chiếm 5-6% khối lượng của gan hay khoảng 100gram glycogen).
Khi đường huyết giảm:
- Tế bào beta giảm tiết insulin
- Thiếu insulin sẽ dẫn đến diễn tiến ngược của quá trình trên bao gồm
giảm thu nhận glucose và giảm tổng hợp glycogen tại gan.
- Thiếu insulin (song song với tăng glucagon) hoạt hoá

phosphorylase có tác dụng chuyển glycogen thành glucose phosphate.
- Enzyme glucose phosphatase xúc tác giải phóng gốc tự do
phosphate khỏi glucose cho phép glucose quay trở lại hệ tuần hoàn (vào
máu).
Như vậy, dưới tác động của insulin, gan "lấy " glucose từ máu và dự
trữ dưới dạng glycogen. Khi cần thiết (hạ đường huyết), sẽ giải phóng
glucose trở lại.

11


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H6: insulin điều hoà glucoz trong máu

Tác động khác của insulin tại gan:
Insulin còn có khả năng biến đổi glucose thành các acid béo tại
gan. Acid béo sau đó sẽ đến các mô mỡ. Insulin còn ức chế
gluconeogenesis bằng cách giảm số lượng và hoạt tính các enzyme cần thiết
cho quá trình này hoặc thông qua tác động làm giảm quá trình giải phóng

12


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
amino acid từ các tế bào cơ và các mô khác ngoài gan dẫn đến giảm lượng
tiền chất cho gluconeogenesis.
5.2 Tác động của insulin lên lipid
Với quá trình chuyển hoá lipid: tăng tổng hợp và dự trữ lipid ở gan,
ngăn cản phân giải mỡ và ức chế tạo các chất cetonic nhờ ức chế hoạt tính

của lipase nhạy cảm với hoomon,làm giảm nồng độ axit béo và glyxerol
trong huyết tương.
5.3 Tác động của insulin lên protit
Không nằm ngoài sự tác động của insulin đối với chuyển hoá protit:
nó thúc đẩy đồng hoá protit bằng cách làm các acid amin dễ xâm nhập vào
tế bào để tổng hợp protein. Đặc biệt ở thành mạch, insuline tham gia vào
tạo glycoprotein cấu trúc,do đó nếu thiếu insuline thành mạch dễ bị tổn
thương.
Ngoài ra, insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat
vô cơ tạo điều kiện cho quá trình photphoryl hoá và sử dụng glucoz.

13


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H7: Insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat vô cơ
Và gần đây có rất nhiều nghiên cứu mới có liên quan đến insulin về
những tác dụng mới của nó cũng như mối liên hệ của nó với một số bệnh.
Chẳng hạn như insulin có thể bảo vệ trí nhớ. Các nhà nghiên cứu thuộc Đại
học Northwestern đã điều trị các tế bào thần kinh vùng hải mã, trung tâm
điều khiển trí nhớ của não, bằng insulin và thuốc Avandia, thuốc dùng trong
điều trị đái tháo đường type 2. Họ đã phát hiện ra rằng insulin bảo vệ các tế
bào chống các khối protein độc được gọi là ADDLs (amyloid beta-derived
diffusible ligands), các khối protein này liên kết với các khớp thần kinh ở
não.Khám phá cho thấy insulin có thể làm chậm hoặc ngăn ngừa bệnh
Alzheimer – căn bệnh liên quan đến việc mất các dữ liệu ghi nhớ, có giả
thuyết cho rằng căn bệnh này có thể có nguyên nhân là bệnh đái tháo đường
type 3.
6. Quá trình tổng hợp insulin

14


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
6.1 Tổng hợp insulin trong cơ thể
Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy. Insulin được tạo
ra từ một phần của một protein lớn hơn để đảm bảo sự gấp nếp đúng.
mARN dịch mã protein preproinsulin. Preproinsulin gồm một trình
tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội chất tham gia vào quá trình sau
dịch mã.
Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thủy phân tạo thành dạng
proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua một số peptitdaza cắt
proinsulin thành insulin hoàn chỉnh và hoạt động. insulin được đóng gói và
chứa trong các hạt tiết tích tụ trong tế bào chất đến khi đươc kích hoạt để
giải phóng

15


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
H8: Tổng hợp isulin trong cơ thể

H9: Các bước cải biến sau dịch mã của phân tử insulin
6.2 Tổng hợp insulin từ vi sinh vật
Cơ sở lý luận của phương pháp
Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại
đều dựa trên các chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn
(E. coli) kết hợp với các kỹ thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp.
Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sử
dụng rất đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật. Trong số

đó, tế bào vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa
vào áp dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp, nhiều nhất là E.coli và nấm
men pichia. Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống biểu hiện khác cho các
loại protein tái tổ hợp - đó là Bacillus brevis.
Mục đích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn phát
triển một hệ thống biểu hiện và 1 phương pháp sản xuất insulin có năng

16


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
suất cao và hiệu quả sản xuất phải ngang bằng hay vuợt trội hơn so với
những hệ thống sản xuất insulin đã từ trước tới nay. Hay nói cách khác, các
nghiên cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiến phương pháp cổ điển chuyển
các tiền chất của insulin thành insulin; nghiên cứu tìm ra môi trường tối ưu
cho việc hình thành các cầu nối cần thiết cho việc biểu hiện hoạt tính của
insulin; tìm ra một hệ thống biểu hiện insulin cho năng suất, sản luợng cao.
Có nhiều phương pháp để tổng hợp insulin. Chúng em sẽ điểm qua
một vài phương pháp đang được áp dụng trên thế giới:
Phương pháp 1
Tạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặc tạo một tiền chất
chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành insulin hoàn
chỉnh.
Bước 1: Trước hết, bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học
phân tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể số 11.
Sau đó, tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tụy của
người.

17

Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H10:Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người
Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen. Do hầu
hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để
bắt cặp với đuôi polyA đó. Trong quá trình đó người ta sử dụng sử dụng sắc
kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch mã; còn lại
loại bỏ ADN và các ARN khác rồi cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN.
Bước 2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.
+Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn.
Nối bằng ADN ligase của phageT4.
+Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận
chuyển insulin ra ngoài tế bào chất.
+Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược và
nhờ các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)

18


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
+Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau
một promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli.
Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn
với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến nạp, cần
chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.

H11: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli
Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên men.
Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên

tục, các chất dinh dưỡng được bổ xung thường xuyên để đảm bảo sự tăng
trưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ. Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn
được nhân lên qua nguyên phân. Chỉ sau một thời gian ngắn, sinh khối tăng
lên rất nhanh và gen insulin được tổng hợp.

19


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H12: Đưa các vi khuẩn chuyển gen vào nồi lên men.
Bước 5: Tiền tinh sạch
Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng nhiệt.
Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau đó dùng hỗn hợp chất
tẩy rửa để tách lớp màng lipit.
Bằng phương pháp ly tâm và lọc tách được proinsulin.

20


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H13: Proinsulin được lọc tách
Bước 6: Hoạt hoá
Do hệ thống E.coli có khả năng biểu hiện gen insulin nhưng không
có khả năng hoạt hoá insulin. Nên người ta phải hoạt hoá proinsulin invitro
bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùng
enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm thu được
mới có hoạt tính cần thiết.

21


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H14: Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh
Bước 7: bằng phương pháp sắc ký, tách và phương pháp miễn dịch
gắn enzyme người ta đã thu được hỗn hợp tinh sạch chỉ có insulin. Độ tinh
sạch của insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian của quá trình
sản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá. Cuối cùng insulin được tinh thể
hoá.

22


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H15: Tinh thể insulin
Phương pháp 2: tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B
+Để thực hiện quá trình này người ta phải xác định được trình tự
ADN của từng chuỗi để tiến hành sản xuất chuỗi A và B. Qua đó tổng hợp
và tách 2 dòng gen này.
+Mỗi ADN được chèn vào plasmit. Sau đó sản xuất tương tự như sản
xuất proinsulin.
+Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình thành cầu
nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một chất oxi hoá nhất định.
23


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm

H16:Sản xuất insulin bằng cách tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và
B
Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp. Do đó, Eli Lilly phát
triển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện proinsulin
thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối
disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng
trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin.
6.3 Tổng hợp insulin từ tế bào gốc
Từ nhiều thế kỷ nay các nhà khoa học đã biết rằng một số loài vật có
thể tái tạo các bộ phận đã mất trên cơ thể chúng. Con người chúng ta cũng
có chung đặc điểm này, giống như loài sao biển. Mặc dù cơ thể chúng ta
không thể tái tạo cả một cẳng chân hay ngón tay bị mất, nhưng tế bào máu,
tế bào da hay các tế bào khác(tế bào tụy tạng) vẫn thường xuyên được tái
sinh trong cơ thể của chúng ta. Những tế bào “toàn năng” giúp chúng ta tái
tạo mô, lần đầu tiên được phát hiện trong quá trình tiến hành thí nghiệm với
tủy xương, vào những năm 1950 đã dẫn đến phát hiện về sự tồn tại của TẾ
24


Tiểu luận vi sinh học thực phẩm
BÀO GỐC trong cơ thể; từ đó phát triển kỹ thuật cấy ghép tủy xương hiện
đang được ứng dụng rộng rãi trong y học. Khám phá về tế bào gốc đã thắp
sáng hy vọng về tiềm năng y học của kỹ thuật tái sinh. Trên nền tảng cơ sở
đó insulin cũng được sản xuất từ các tế bào gốc từ rất lâu. Các tế bào gốc
được chiết tách từ nhiều nguồn khác nhau, ban đầu nó được nghiên cứu từ
phôi người.

H17: Tổng hợp insulin từ tế bào gốc
Phôi ( trứng đã được thụ tinh hoặc nhân bản vô tính để tạo phôi) bắt

đầu phân chia, sau 5-7 ngày tạo thành khoảng 150 tế bào – được gọi là tế
bào gốc phôi, mỗi tế bào có khả năng phát triển thành bất kỳ loại tế bào nào
trong cơ thể. Sau đó người ta tiến hành tách các tế bào gốc này và đem nuôi
cấy trong điều kiện thích hợp để phát triển thành tế bào chuyên biệt: tế bào
tụy tạng, sau đó được đưa vào cơ thể người.
Dựa trên cơ sở của phương pháp này đã có rất nhiều nghiên cứu. Tuy
nhiên, nghiên cứu về tế bào gốc làm nảy sinh những câu hỏi về cả mặt khoa
học lẫn mặt đạo đức ngay khi nó đạt được những thành tựu đầu tiên. Nhưng
do những đóng gop to lớn không thể phủ nhận được của nó đối với y học
nên nó vẫn được các nhà khoa học không ngưng khám pha nghiên cứu. Và
đến bây giờ họ đã tìm ra những nguồn khác nhau để tạo ra tế bào gôc,
chẳng hạn như: tế bào phôi chuột,các tế bào gốc trưởng thành, dây rốn, dịch
25