kỹ thuật chuyển gen ở thực vật

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen.......................
2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen............................................
3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật................................
3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp......................................
3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens..............
3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus..................................................
3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)................................
3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation)...........................
3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)..................................
3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm...............................................
3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học....................................
3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube).......................

B. NỘI DUNG
1. Các nguyên tắc sinh học của kỹ thuật chuyển gen
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số
vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:
- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency)
- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một
gen ngoại lai
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả
năng thu nhận gen biến nạp vào genome
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Cần
xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái
Thủy Hồng

1

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu
được tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hoàn toàn
không có khả năng biến nạp và tái sinh cây.
- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng
cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai. Vì thế, cho đến nay
chỉ có thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium,
virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương
pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm.
- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu
hiện tạm thời của gen
- Các ADN (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa
đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome
- Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở
nơi mà nó được đưa vào
- Trong khi đó, ADN của virus khi xâm nhập vào genom cây chủ lại không
liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô
phân sinh (meristem).
2. Các bước trong kỹ thuật chuyển gen
Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gen có thể thực hiện
nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa học tin
rằng Agrobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các cây trồng. Nhưng sau đó
kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium không thể thực hiện
được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế mà hàng loạt các kỹ thuật chuyển
gen khác đã được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp như bắn gen
bằng vi đạn (bombardement/ gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện
Thủy Hồng

2


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

(electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic),
chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)... Đến nay, nhờ cải tiến các vector
chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở
cây ngũ cốc đặc biệt là lúa. Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng
đối với cây chuyển gen ở thực vật.
Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm
- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cADN hoặc từ thư viện
genomic ADN)
- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp
- Biến nạp vào E. coli
- Tách chiết ADN plasmid
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp
khác nhau đã kể trên
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc
- Tái sinh cây biến nạp
- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh
giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc các
thử nghiệm in vivo khác...)
Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng rẽ, các mô
hoặc cây hoàn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận ADN ở phần lớn sinh vật là thành tế bào.
Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzym và dưới
những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp
nhận ADN nói chung dễ dàng. Sau khi biến nạp người ta tách những enzym

phân giải và để cho tế bào phát triển, thành tế bào mới được tạo thành. Các tế
Thủy Hồng

3


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

bào biến nạp này được nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo thích hợp cùng
với các chất kích thích sinh trưởng để tạo thành cây hoàn chỉnh. Sau đó bằng
các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern blot, Northern blot
được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen.
3. Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật
Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen
gián tiếp.
3.1. Các phương pháp chuyển gen gián tiếp
3.1.1. Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens
* Nguyên lý chung
Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn Gram âm) để chuyển gen
ở thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng
gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định.
Sự chuyển gen ở thực vật dùng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như hình
sau

Hình1. Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật (tumour inducing
plasmid- Ti plasmid), plasmid này chứa các gen vir và vùng gen cần chuyển (TThủy Hồng

4

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng T-DNA. Các tế bào tổn thương thực
vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở
Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên Ti-plasmid.
Sau đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand và một số protein vir chuyển
vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir
tương tác với T-strand tạo ra phức hệ (T- complex). Phức hệ này vào nhân tế
bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm.

Bộ gen của
vi khuẩn

Ti plasmid

Hình 2. Vi khuẩn A.tumefaciens
Cụ thể như sau:
Phương pháp này sử dụng Ti plasmid của A.tumefaciens hoặc Ti plasmid của
Arhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plamid gồm hai thành phần: TDNA và vùng Vir.
T- DNA có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy
mà có thể gắn gen muốn chuyển vào T- DNA để đưa vào tế bào. T- DNA chứa
gen điều hoà sinh trưởng cục bộ (auxin, cytokinie), gen tổng hợp các chất
Opine và gen gây khối u. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kì đoạn nào

Thủy Hồng

5


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Trong
plasmid vị trí của T- DNA được giới hạn bởi bờ trái và bờ phải.
Vùng Vir phụ trách khả năng lây nhiễm. Chúng gồm 6 nhóm từ VirA đến
VirG và VirE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp.
Để thiết kế vector dùng trong biến nạp: trước hết là cắt bộ gen điều hòa sinh
trưởng cục bộ, sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng
với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng gắn gen cần
biến nạp.
* Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen thực
vật gồm có 2 loại: vector liên hợp và vector nhị thể.
- Vector liên hợp (Cointegrated vector)
Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid. Một vector liên hợp
gồm có: vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí này có nguồn gốc từ
plasmid của vi khuẩn E.coli. Gen chỉ thị kháng sinh giúp cho chọn lọc trong vi
khuẩn E.coli, Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật.
Như vậy vector liên hợp được hình thành từ một plasmid mang trình tự ADN
mong muốn và plasmid kia có chứa vùng vir gen và vùng bờ lặp lại của TADN. Sau tái tổ hợp, một vector liên hợp được tạo ra và dùng cho chuyển gen
vào thực vật.
- Vector nhị thể (Binary vector)
Vector nhị thể là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: một cung cấp T-ADN
đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năng thâm nhập
vào tế bào thực vật (mang các gen vir). Plasmid thứ nhất mang gen chọn lọc ở
thực vật và gen sẽ được ghép vào bộ gen thực vật. Khi plasmid này được đưa
vào chủng Agrobacterium có chứa Ti plasmid, những sản phẩm mang gen vir

Thủy Hồng

6

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

có thể đưa T-AND vào tế bào thực vật, mặc dù T-ADN nằm trên phân tử ADN
khác.
* Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả, đặc biệt
là chuyển gen vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Nhiều giống lúa
chuyển gen có giá trị đặc biệt như giống lúa Golden rice có chứa hàm lượng
vitamin A cao gấp nhiều lần so với lúa thông thường. Nhờ giống lúa này đã giải
quyết được vấn đề hết sức khó khăn về sự thiếu vitamin A ở các nước đang
phát triển, đặc biệt là ở Châu Phi.
* Ưu điểm
- Gen ít bị đào thải
- Số lượng bản sao ít hơn. Do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau và
câm lặng lẫn nhau.
- Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ
thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái tổ hợp
chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay sau đó.
* Nhược điểm
- Có phổ tấn công giới hạn
- Gây khối u cho cả cây khỏa tự và cây hai lá mầm nhưng lại không gây khối
u cho cây một lá mầm (do cây một lá mầm là cây thuộc nhóm tiến hoá nhất, nó
tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn cây hai lá mầm như khi bị thương các tế
bào có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp
chất phenol như cây hai lá mầm...)
3.1.2. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus
Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta còn sử dụng virus làm vector chuyển
gen vào cây trồng. Chuyển gen nhờ virus có thể thuận lợi do virus dễ xâm nhập
và lây lan trong cơ thể thực vật và động vật đồng thời virus có thể mang đoạn
Thủy Hồng

7


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

ADN lớn hơn nhiều so với khả năng của plasmid. Tuy nhiên, virus làm vector
chuyển gen cần phải có các tiêu chuẩn sau:
- Hệ gen của virus phải là ADN
- Virus có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ ở
vách tế bào
- Có khả năng mang được đoạn ADN (gen) mới, sau đó chuyển gen này vào
tế bào thực vật
- Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây)
- Không gây tác hại đáng kể cho thực vật
Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có hai loại virus được sử dụng làm
vector chuyển gen là caulimovirus và geminivirus. Tuy nhiên, việc sử dụng
virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì ADN virus khó ghép nối
với hệ gen của thực vật.
3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
3.2.1. Chuyển gen bằng vi đạn (gene gun)
Là phương pháp dùng các thiết bị bắn các vi đạn mang ADN ngoại lai vào
trong tế bào thực vật. Đạn thường được làm bằng các kim loại nặng: Tungsten,
Vàng, Bạc,..
a. Nguyên lý
Sử dụng các viên đạn có kích thước hiển vi dưới áp lực của xung khí để đẩy
các viên qua các lớp tế bào, mô để đưa lớp ADN bọc ngoài tiếp cận với bộ máy
di truyền của tế bào.
Hiện nay, có 2 loại thiết bị để chuyển gen bằng vi đạn là: Súng bắn gen
(gengune) và hệ thống dội bom

Thủy Hồng

8


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Súng bắn gen

Hệ thống dội bom

b. Các bước tiến hành
Ngâm những viên đạn có kích thước cực nhỏ (vi đạn) bằng vàng
hoặc tungsten với đường kính khoảng 0,5 - 1,5 µm với dung dịch có
chứa đoạn ADN ngoại lai sau khi kết tủa ADN bao quanh viên đạn,
các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích
thước 0,5 - 0,9 cm.
Đĩa kim loại này được gắn vào đầu một viên đạn lớn bằng nhựa,
hoặc vật liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng
súng bắn gen hoặc hệ thống dội bom.
Khi bắn, sự bùng nổ của khí sẽ tạo ra áp suất hơi đẩy viên đạn lớn .
Thủy Hồng

9


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Khi viên đạn lớn ra khỏi đầu nòng súng sẽ bị cản lại bởi một lưới

thép mịn, còn các vi đạn vẫn tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới
1300 m/giây đến đối tượng bắn, xuyên qua thành tế bào và phóng
thích các phân tử ADN ngoại lai giúp ADN ngoại lai hợp nhất vào
nhiễm sắc thể của tế bào thực vật.
Sau khi bắn, tiến hành tách lấy các mô, tế bào và nuôi cấy invitro
để tái sinh cây.
Các gen cần chuyển có thể tái tổ hợp vào hệ gen của cây, từ đó tạo
thành cây chuyển gen. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của tế bào mang gen
chuyển do vậy cần phải chọn lọc. Người ta thường dùng khí nén là
helium áp lực cao để bắn gen.

Sơ đồ nguyên lý hoạt động của hệ thống dội bom
Ưu điểm
- Thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô.
- Các tế bào được chuyển gen có tỉ lệ sống sót cao.
- Cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn....
Thủy Hồng

10


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

- Được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
Nhược điểm
Tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus thì ưu việt của phương
pháp này là nghiên cứu các gen tạm thời
Các ứng dụng của kỹ thuật bắn gen bao gồm
- Tạo thực vật chuyển gen: đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
hiện nay trong lĩnh vực tạo ngũ cốc chuyển gen. Bacillus thuringiensis là loài

vi khuẩn tổng hợp ra protein crystal (crys1Ab và crys1Ac) có khả năng giết
một cách chọn lọc các nhóm côn trùng nhất định. Gen mã hoá protein crystal
được gọi là gen Bt. Gen Bt đã được bắn vào mô sẹo của cây ngũ cốc
(Rassmussen, 1994). Trong khi các tế bào này sửa chữa tổn thương, DNA
ngoại lai xâm nhập vào genome tế bào chủ. Vì vậy cho phép tế bào chủ phiên
mã và giải mã gen Bt. Sau mỗi lần quá trình biến nạp được hoàn thành người
ta cũng tiến hành sàng lọc theo phương pháp truyền thống là dựa trên cơ sở
các marker chọn lọc được xen vào DNA cấu trúc (Brettschneider, 1997). Các
marker chọn lọc mang tính kháng (kháng thuốc kháng sinh hay kháng thuốc
diệt cỏ) như kanamycin là một là một trong những marker phổ biến nhất được
sử dụng.
- Tiêm chủng vaccine di truyền: các gen được đưa vào cơ thể bằng súng bắn
gen với mục đích gây ra phản ứng miễn dịch với protein biểu hiện bởi gen
chuyển. Phương pháp tiêm chủng vaccine này an toàn hơn các phương pháp
khác bởi vì chỉ DNA ngoại lai được đưa vào và không có các protein ngoại lai
(Lin, 2000).
- Liệu pháp gen tự sát (Suicide gene therapy): phương pháp bắn gen đã được
sử dụng trong điều trị bệnh ung thư. Một gen biểu hiện protein gây độc có
promoter đặc hiệu khối u được đưa vào các tế bào khối u. Khi protein này được
biểu hiện thì tế bào khối u chết. Protein này chỉ gây độc đối với các tế bào khối
u bởi vì promoter đặc hiệu cần cho sự biểu hiện chỉ được tạo ra trong các tế
bào khối u (Lin, 2000).
- Sự điều biến miễn dịch (Immunomodulation): phương pháp này còn được sử
dụng để chống lại ung thư. Sử dụng súng bắn gen, một protein chỉ biểu hiện
trong tế bào khối u nhưng làm cho phản ứng miễn dịch tăng lên được đưa vào
Thủy Hồng

11

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

tế bào. Phản ứng miễn dịch tăng lên nhắm vào các tế bào khối u và hiển nhiên
gây ra hiệu quả mong muốn (Lin,2000).
- Dược lý di truyền: súng bắn gen có thể được sử dụng để đưa các gen tổng
hợp protein hữu ích hay protein liệu pháp vào cơ thể. Ví dụ như các yếu tố
đông máu ở các cơ thể rối loạn sự đông máu hoặc tăng sự tổng hợp hồng cầu
trong các cơ thể thiếu máu. Sự biểu hiện kéo dài của các gen đưa vào là một
vấn đề, trong nhiều trường hợp thường đòi hỏi sự phân phối gen phức tạp (Lin,
2000).
- Súng bắn gen là một công cụ nghiên cứu: súng bắn gen có thể được sử dụng
để xen các promoter mà sẽ dẫn đến sự biểu hiện của các gen nhất định. Hiệu
quả khuyếch đại các protein nhất định là một phương pháp có giá trị lớn đối
với các nhà khoa học để nghiên cứu chức năng của các protein này (Lin,
2000).
3.2.2. Chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
 Là phương pháp đưa trực tiếp các phân tư phân cực vào trong tế bào vật
chủ qua màng tế bào.
a. Nguyên lý: Một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn
giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid tạo ra các lỗ
thủng tạm thời cho phép các phân tử ADN ngoại lai từ môi trường xâm nhập
vào bên trong tế bào.
Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử đòi hỏi phải đưa gen hoặc
protein ngoại lai vào trong tế bào vật chủ.
Nhưng do lớp phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía
ngoài và một đầu kỵ nước phía trong, nên bất kỳ phân tử phân cực nào (bao
gồm ADN và protein) đều không thể đi qua màng một cách tự do.

Thủy Hồng

12


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Từ sơ đồ của màng cho thấy thành phần hóa học của màng sinh chất, các đầu
ưa nước phân cực hướng về phía ngoài, các đuôi kỵ nước hướng về phía trong
và tương tác với đuôi kỵ nước khác để cùng bám giữ màng. Các phân tử phân
cực không thể đi qua màng này nếu như không có sự hỗ trợ bên ngoài. Nhiều
phương pháp đã được phát triển để vượt qua rào cản này, cho phép đưa ADN và
các phân tử khác vào trong tế bào đã được nghiên cứu. Một trong những
phương pháp này là kỹ thuật xung điện. Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái
tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập
hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn (Purves, 2001).
Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của
màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua, nhưng
sau đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì
cả.
b. Các bước tiến hành.
 Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho
vào trong một cuvette nhựa có điện cực

Thủy Hồng

13


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

 Dùng thiết bị xung điện tạo điện thế cao (200 – 400 V/cm) trong khoảng

thời gian vài phần nghìn giây.
Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một
thiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser)

Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy này được trình bày bằng sơ đồ sau:

Sơ đồ mạch điện cơ bản cung cấp cho kỹ thuật xung điện.
Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao. Khi
công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung
điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay
đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn
giây.
Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các
lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0V vì vậy,
plasmid mang ADN ngoại lai đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách
thức tương tự như điện di.

Thủy Hồng

14


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Lối ADN đi vào tế bào không thể quan sát thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình
vẽ này cho thấy khái niệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên màng mà ADN
có thể đi qua.
 Khi các ADN ngoại lai đi qua các lỗ gắn vào hệ gên vật chủ thì màng tế
bào phóng điện và các lỗ này đóng lại nhanh chóng và phospolipid kép phục
hồi lại cấu trúc cũ.

 Sau quá trình xung điện, đem protoplast nuôi trong môi trường nuôi cấy
thích hợp, môi trường chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp. Tiếp
theo là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gen.
 Ưu điểm:
Có thể sử dụng ở hầu hết tất cả các loại tế bào của các loài; Hiệu quả biến
nạp cao; Lượng DNA ngoại lai cần thiết là ít các phương pháp khác; Có thể
thực hiện với các mô invivo còn nguyên vẹn; Ðoạn DNA ngoại lai được biến
nạp có kích thước lớn.
 Nhược điểm:
Nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một số lỗ của tế
bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào phóng
điện, làm cho tế bào bị tổn thương hoặc bị thủng; Sự vận chuyển ADN ngoại
lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là tương đối không
đặc hiệu, dẫn đến không cân bằng ion sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và
tế bào chết.
Các ứng dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm:
Thủy Hồng

15


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

- Biến nạp DNA: các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đó
plasmid này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của
gen và protein.
- Chuyển plasmid trực tiếp giữa các tế bào: tế bào vi khuẩn đã chứa plasmid có
thể được ủ với một dòng khác không mang plasmid nhưng lại có đặc tính mong
muốn khác. Ðiện áp của xung điện sẽ tạo ra các lỗ, cho phép một số plasmid đi
ra khỏi tế bào và lại đi vào tế bào khác. Sau đó các tế bào mong muốn sẽ được

chọn lọc bằng tính kháng thuốc kháng sinh hoặc bằng phương pháp tương tự
khác (Withers, 1995). Kiểu chuyển gen này cũng có thể được thực hiện giữa
các loài khác nhau. Vì vậy, một lượng lớn plasmid sinh trưởng trong các khuẩn
lạc vi khuẩn được nhân lên một cách nhanh chóng và sau đó được chuyển vào
các tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện để nghiên cứu (Gunn, 1995).
- Dung hợp tế bào đã kích thích: sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do
xung điện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đã kích thích sự dung hợp tế bào
(Weber và Berrg, 1995).
- Phân phối thuốc qua da: Chỉ khi xung điện gây ra các lỗ tạm thời trên màng
sinh chất, các lỗ tương tự đã tạo ra ở màng lipid kép của lớp da chết ở phía
ngoài cùng. Các lỗ này cho phép thuốc đi qua da đến các mô đích. Các bệnh
nhân thích phương pháp này hơn phương pháp tiêm (không cần kim tiêm) và có
thể tránh được các vấn đề phân hủy hoặc hấp thu không đúng của liệu pháp
uống thuốc (oral medication) trong hệ tiêu hóa (Praustmitz, 1993).
- Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy): các
nhà khoa học đang nghiên cứu tiềm năng của kỹ thuật xung điện để tăng tính
hiệu quả của liệu pháp hóa học. Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp
DNA, xung điện này sẽ phá vỡ màng tế bào ung thư và làm tăng lượng thuốc đi
đến các vị trí. Một số nghiên cứu cho rằng đã làm giảm sự phát triển khối u khi
áp dụng phương pháp này cho các tế bào ung thư ở hệ thống mô hình động vật
(Maeda, 1998).
- Liệu pháp gen: kỹ thuật xung điện cho phép các vector mang các gen quan
tâm được biến nạp qua da đến các mô đích. Khi đã hợp nhất vào các tế bào
của cơ thể, các protein được tổng hợp từ các gen này có thể thay thế gen sai
hỏng và vì vậy đã điều trị các rối loạn di truyền
3.2.3. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)
Thủy Hồng

16

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Là phương pháp sử dụng các thiết bị vi kim tiêm và kính hiển vi và một số
thao tác khác để chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần hoặc tế bào đơn.
a. Nguyên lý
Một lượng nhỏ ADN được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế
bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi.
Quá trình chuyển gen bằng vi tiêm được tiến hành trên hệ thống thiết bị vi
tiêm . Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi thao
tác.
Ðể biến nạp gen vào tế bào bằng phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo
kim tiêm và kim giữ.
• Kim tiêm được tạo ra từ những ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,11,5 mm có sợi bằng volfram mảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị làm kim.
• Kim giữ được chế tạo từ những ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố
định tế bào trong quá trình vi tiêm.
b. Các bước tiến hành
Ðể biến nạp gen vào tế bào bằng phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo
kim tiêm và kim giữ.
• Kim tiêm được tạo ra từ những ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,11,5 mm có sợi bằng volfram mảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị làm kim.
• Kim giữ được chế tạo từ những ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố
định tế bào trong quá trình vi tiêm.
 Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: gen chuyển được xen vào trong một
vector plasmid.
 Nạp gen chuyển vào kim tiêm bằng cách ngâm đầu kim tiêm vào dung
dịch gen khoảng 10-12 giờ hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào.

Thủy Hồng

17

Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

 Lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, đưa protoplast cần tiêm vào
đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ protoplast vào đầu
kim giữ bằng lực hút của syringe.
 Điều chỉnh kính hiển vi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm
vào vị trí của protoplast. Đẩy gen vào bằng cách vặn nhẹ syringe.
 Khi thấy protoplast hơi phồng to và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo
nhanh kim tiêm ra. Protoplast sau khi tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa
petri trước khi tiêm vào protoplast tiếp theo.
 Sau đó đem protoplast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích hợp. Tiếp
theo là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn lọc cây chuyển gen.
 Ưu điểm
- Quyết định được đưa ADN vào loại tế bào nào
- Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào
- Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát
được
- Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc dù hạn chế
về số lượng cũng có thể tiêm chính xác
- Có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi giống cây
 Nhược điểm
- Mỗi lần tiêm chỉ được một phát tiêm và chỉ với một tế bào
- Thao tác trong khi làm đòi hỏi độ chính xác cao
3.2.4. Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm
Là kỹ thuật dùng sóng siêu âm để chuyển gen vào tế bào trần (protoplast)
a. Nguyên lý:
Sóng siêu âm làm cho lớp màng protoplast biến đổi tạo ra các lỗ giúp cho
ADN ngoại lai xâm nhập vào tế bào.

Thủy Hồng

18


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

b. Các bước tiến hành
Sau khi tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang
gen mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù.
Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù sâu
khoảng 3mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20KHz theo từng nhịp ngắn,
mỗi nhịp khoảng 100 mili giây. Số nhịp khoảng từ 6 - 9 nhịp với tổng thời gian
tác động từ 600 - 900 mili giây. Lúc này, sóng siêu âm sẽ làm cho lớp màng
protoplast biến đổi tạo ra các lỗ giúp cho ADN ngoại lai xâm nhập vào tế bào.
Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi trong các môi trường thích hợp, chọn
lọc để tách các protoplast đã được chuyển gen. Nuôi cấy invitro để tái sinh cây.
Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường ngoài
 Ưu điểm:
 Nhược điểm:
3.2.5. Chuyển gen bằng phương pháp hóa học
Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển gen vào tế
bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylen glycol (PEG). Khi có mặt
PEG, màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể thu nhận ADN ngoại
lai vào bên trong tế bào.
Phương pháp chuyển gen bằng hóa chất có thể áp dụng với nhiều loài thực
vật nhưng khả năng chuyển gen với tần số chuyển gen rất thấp. Tuy nhiên, với
khả năng tạo ra số lượng lớn protoplast, do vậy khắc phục được hạn chế của
phương pháp này.
3.2.6. Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube)

(Ray Wu & cộng sự, 1988)
Phương pháp chuyển gen qua ống phấn là phương pháp chuyển gen không
qua nuôi cấy mô invitro.
Thủy Hồng

19


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Nguyên tắc của phương pháp này là ADN ngoại lai chuyển vào cây theo đầu
ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gen vào lúc hạt phấn mọc
qua vòi nhụy và lúc bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh, tốt nhất là sự chuyển gen
xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chưa phân chia.
Như vậy, sự chuyển gen chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái duy nhất và khi tái
sinh cây sẽ không hình thành thể khảm.
- Sau thời gian hoa nở 1- 2 giờ, cắt 2/3 hoặc 3/4 phần trên của hoa lúa
- Sau khi cắt hoa, dùng ống mao quản nhỏ có đường kính 0,2mm đưa dung
dịch ADN tái tổ hợp mang gen mong muốn vào đầu ống nhụy đã bị cắt (nồng
độ ADN tái tổ hợp khoảng 50 µg/ml)
- Bao bông lúa lại, chờ lúa chín thu hái
- Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế hệ sau
4. Lợi ích và nguy cơ của cây trồng chuyển gen
4.1. Lợi ích
Hiện nay, những sản phẩm lương thực- thực phẩm do công nghệ sinh học tạo
ra đã có mặt trên thị trường. Những cây trồng được biến đổi gen vẫn giống
những cây trồng truyền thống nhưng chúng có thêm một số đặc điểm được cải
thiện. Chúng không những có lợi cho nông dân mà còn cho cả người tiêu dùng.
Người nông dân gặt hái được những vụ mùa bội thu, trong khi người tiêu dùng
quanh năm lại có nhiều loại sản phẩm để lựa chọn. Ngoài ra, những giống mới

được tạo ra bằng công nghệ sinh học còn có tiềm năng bảo vệ môi trường. Trên
thị trường hiện nay, đã có một số loại cây trồng công nghệ sinh học được cải
thiện tình trạng và chất lượng như:
- Có khả năng chống chịu bệnh
- Cho phép giảm sử dụng thuốc trừ sâu
- Tăng thành phần dinh dưỡng
Thủy Hồng

20


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

- Tăng thời gian bảo quản
Nhìn chung, việc sử dụng các giống cây trồng chuyển gen có thể đem lại lợi
nhuận đáng kể cho các nước đang phát triển. “Thế hệ đầu tiên” của những
giống cây này đã chứng minh được khả năng tăng năng suất cây trồng, giảm giá
thành sản phẩm, tăng lợi nhuận nông nghiệp và góp phần bảo vệ môi trường.
Hiện nay, các nghiên cứu đang hướng đến các cây trồng biến đổi gen “thế hệ
thứ hai”, tập trung vào việc tăng chất lượng dinh dưỡng và khả năng chế biến.
Các giống cây trồng này sẽ khẳng định được giá trị của chúng ở những quốc gia
có hàng triệu người dân bị thiếu hụt thực phẩm.
Thực vật với khả năng tự bảo vệ chống lại côn trùng và cỏ dại có thể giúp
giảm liều lượng và nồng độ của các thuốc trừ sâu sử dụng. Ví dụ: ở Trung Quốc
bông Bt đã giảm thuốc diệt côn trùng 40 kg/ha.
Giảm sử dụng thuốc trừ sâu cải thiện đáng kể chất lượng nước ở những vùng
sử dụng thuốc. Ví dụ: nước chảy qua các cánh đồng bông Bt ở Mỹ hoàn toàn
không còn nhiễm thuốc trừ sâu trong suốt 4 năm nghiên cứu của Bộ nông
nghiệp Mỹ.
Thực vật kháng thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng biện pháp không cày đất,

một yếu tố quan trọng trong việc bảo tồn đất đai trở nên phổ biến.
Ví dụ: người trồng cải dầu chuyển gen ở Canada đã ít phải cày cấy hơn so với
khi trồng cây cải dầu truyền thống.
Cây chuyển gen có thể tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, do vậy với diện
tích đất canh tác ít hơn vẫn có thể thu được nhiều lương thực hơn. Ví dụ: ở Mỹ,
năm 1999, đã có 66 triệu ruộng ngô tránh được sâu đục thân.
4.2. Nguy cơ tiềm ẩn
* Cây chuyển gen được đánh giá như thế nào đối với an toàn môi trường?

Thủy Hồng

21


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Các cây chuyển gen được đánh giá cẩn thận về ảnh hưởng tới môi trường
trước khi đưa ra thị trường. Chúng được các nhà chức trách đánh giá tuân theo
các quy tắc do các chuyên gia môi trường trên khắp thế giới đưa ra (Hội đồng
nghiên cứu quốc gia Mỹ năm 1989; Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế năm
1992; chính phủ Canada năm 1994). Những người đánh giá ảnh hưởng của cây
chuyển gen gồn những người tạo ra chúng, các cơ quan kiểm soát và các nhà
khoa học.
Hầu hết các quốc gia sử dụng các quy trình đánh giá tương tự để xét xem sự
tương tác giữa cây chuyển gen và môi trường. Bao gồm những thông tin về vau
trò của gen được đưa vào, ảnh hưởng của nó đối với vây nhận gen, đồng thời cả
những cây hỏi cụ thể về ảnh hưởng không mong muốn như: ảnh hưởng lên các
sinh vật không phải là sinh vật cần diệt trong môi trường đó.
Cây chuyển gen có tồn tại trong môi trường lâu hơn bình thường hoặc xâm
chiếm những nơi cư ngụ mới không? Khả năng gen phát tán ngoài ý muốn từ

cây chuyển gen sang loài khác và những hậu quả có thể.
* Cây chuyển gen, những rủi ro có thể
Khả năng xẩy ra lai chéo xa của gen được chuyển vào với các cây cỏ họ
hàng, cũng như khả năng tạo ra những loại cỏ mới.
Lai chéo xa là lai không mong muốn giữa cây trồng với một cây có quan hệ
họ hàng. Lo ngại chính về ảnh hưởng của cây chuyển gen đối với môi trường là
khả năng tạo ra loài cỏ mới thông qua lai chéo xa với các cây họ hàng hoang
dại hoặc đơn giản hơn là tồn tại lâu trong tự nhiên.
Khả năng trên có thể xảy ra, được đánh giá trước quá trình chuyển gen và
được kiểm soát sau khi cây được đưa ra trồng. Một nghiên cứu bắt đầu từ năm
1990 kéo dài 10 năm chứng minh rằng thực vật chuyển gen (như cải dầu, khoai
tây, ngô, củ cải đường) không làm tăng nguy cơ xâm chiếm hay tồn tại lâu dài
Thủy Hồng

22


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

trong môi trường tự nhiên so với các cây không chuyển gen tương ứng. Các
tính trạng như chống chịu thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng đồng thời được điều
tra so với những cây không chuyển gen tương ứng (Crawley và cộng sự, 2001).
Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu phát biểu rằng những kết quả này không có
nghĩa là sự thay đổi di truyền không thể làm gia tăng tính hoang dại hay khả
năng phát tán của cây trồng mà chúng chỉ ra rằng những cây trồng năng suất
khó có thể tồn tại lâu dài mà không được canh tác. Do đó, việc đánh giá cây
chuyển gen theo từng trường hợp như đã quy định là rất quan trọng.
* Ảnh hưởng trực tiếp lên các sinh vật không phải là sinh vật cần diệt
Tháng 5 năm 1999, xuất hiện báo cáo rằng hạt phấn từ cây ngô Bt có ảnh
hưởng bất lợi đối với ấu trùng bướm Monarch. Báo cáo này gây ra những lo

lắng về nguy cơ tiềm tàng đối với bướm Monarch và có thể đối với những sinh
vật không phải là sinh vật cần diệt khác. Một số nhà khoa học lại cho là cần
phải thận trọng trong việc giải thích những kết quả nghiên cứu vì nghiên cứu
phản ánh một tình huống khác với thực trạng môi trường.
Tác giả chỉ ra rằng nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành trong phòng thí
nghiệm và là khởi đầu của những vấn đề quan trọng nhưng chỉ dựa vào nó
không đủ cơ sở để rút ra kết luận về nguy cơ đối với quần thể bướm Monarch
trên cánh đồng.
Một báo cáo của Ủy ban bảo vệ môi trường Mỹ chỉ ra các số liệu đã chứng
minh rằng protein trong cây trồng không có ảnh hưởng bất lợi đối với sinh vật
không phải là sinh vật cần diệt. Thêm vào đó, một nghiên cứu của trường Đại
học Linnois chỉ ra rằng bướm Monarch không bị gây hại bởi hạt phấn Bt trong
điều kiện đồng ruộng thực sự.
* Phát triển tính kháng của côn trùng

Thủy Hồng

23


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Một lo ngại khác về thực vật Bt là sự phát triển tính kháng của côn trùng đối
với Bt. Chính phủ, Bộ ngành và các nhà khoa học đã đưa ra các kế hoạch quản
lý tính kháng của côn trùng để giải quyết vấn đề này.
Những kế hoạch này bao gồm một quy định rằng mọi cánh đồng trồng cây
chuyển gen kháng côn trùng phải có cả cây không chuyển gen để côn trùng phát
triển mà không bị chọn lọc đối với những giống kháng sâu.
Những biện pháp quản lý tính kháng khác cũng đang được các nhà khoa học
trên khắp thế giới xây dựng.

5. Những thành tựu, triển vọng chủ yếu trong tạo giống cây trồng chuyển
gen
Công nghệ chuyển gen vào cây trồng hiện nay không còn là vấn đề phải tranh
cãi mà nó trở thành kỹ thuật thông dụng để tạo ra giống cây trồng mới, phục vụ
trực tiếp cho trồng trọt. Những mốc quan trọng trong sự phát triển kỹ thuật
chuyển gen ở thực vật là:
Năm 1980: Lần đầu tiên thực hiện chuyển ADN ngoại lai vào cây nhờ
Agrobacterium.
Năm 1983: Tạo marker chọn lọc như chỉ thị màu sắc, chỉ thị kháng với kháng
sinh. Thiết kế lại plasmid Ti (loại bỏ gen gây khối u, cài gen mong muốn vào
plasmid Ti).
Năm 1984: Thực hiện chuyển gen trực tiếp và gián tiếp vào tế bào protoplast.
Năm 1985: Tạo các giống cây trồng kháng virus, đưa cây chuyển gen ra đồng
ruộng.
Năm 1987: Chuyển gen kháng sâu bằng súng bắn gen.
Năm 1988: Tạo khoai tây chống nấm, cà chua chín chậm.
Năm 1990: Chuyển gen bất dục đực cho ngô vào phôi nuôi cấy vô tính.
Năm 1992: Chuyển gen cho lúa mì.
Thủy Hồng

24


Kỹ thuật chuyển gen thực vật & ứng dụng

Năm 1994: Thương mại hóa cà chua chuyển gen. Đây là sản phẩm chuyển
gen đầu tiên được thương mại hóa.
Năm 1998: Toàn thế giới có 48 giống cây trồng chuyển gen được thương mại
hóa.
Năm 1999: Chuyển gen tạo giống lúa có giá trị dinh dưỡng và hàm lượng

vitamin A cao.
Từ năm 2000 đến nay, cây trồng chuyển gen không ngừng phát triển. Năm
2000, toàn thế giới có 44,2 triệu ha trồng cây chuyển gen thì đến năm 2003 tăng
lên 67,6 triệu ha. Có 6 nước trồng cây chuyển gen phổ biến là: Mỹ 42,8 triệu
ha; Acgentina 13,9 triệu ha; Canada 4,4 triệu ha; Braxin 3 triệu ha; Trung Quốc
2,8 triệu ha; Nam Phi 0,4 triệu ha.
Các cây chuyển gen chính là đậu tương (chiếm 61%), ngô (23%), bông
(11%), đu đủ (21%). Các gen chính được chuyển là gen kháng thuốc trừ cỏ, gen
kháng sâu.
6. Các hướng chính trong tạo cây trồng chuyển gen
6.1. Chuyển gen kháng sâu
Trong 30 năm gần đây, trong sản xuất nông nghiệp, người ta sử dụng thuốc
trừ sâu vi sinh Bt do vi khuẩn Bacillus thuringiensis tạo ra. Vi khuẩn này sản
xuất ra các protein kết tinh rất độc đối với ấu trùng của côn trùng nhưng không
gây độc đối với động vật có xương sống.
Tinh thể protein độc tố của vi khuẩn này khi vào một côn trùng sẽ bị các
enzym protease phân giải thành các đoạn peptit, trong đó có đoạn khối lượng
khoảng 68.000 dalton chứa khoảng 1200 axit amin làm hỏng ruột côn trùng.
Các gen mã hóa độc tố này nằm trên plasmid của vi khuẩn, được gọi chung là
Cry (crystal).

Thủy Hồng

25