Tỷ giá hối đoái thực và cán cân thương mại của Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN HỮU QUÂN
NGUYỄN HỮU QUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH
TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi
Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học
Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI-2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

HÀ NỘI-2009



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 2

sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng

1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2

nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện

1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2

về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.

1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và

1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3

tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học

1.3. CẤU TRÚC ............................................................................................. 5

đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên

1.3.1. Cấu trúc bậc nhất .................................................................................. 5

môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện

1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6

trong suốt quá trình thực tập.

1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng

1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10

ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi

1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11

trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.

1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ...................................... 11

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời

1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 12

thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết

1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 13

quả nhƣ ngày hôm nay.

1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quí báu đó !

1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14
1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009

1.7.1. Nguồn carbon ..................................................................................... 16

Học Viên

1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17
1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18
1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................................... 18
1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19

Nguyễn Hữu Quân

1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19
1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ......................................................... 20

3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ............................................................. 41

1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21

3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22

3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44

2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22

3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45

2.1.1. Chủng giống ....................................................................................... 22

3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46

2.1.2. Thiết bị ............................................................................................... 22

3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47

2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22

3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48

2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23

3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50

2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24

3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50

2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................... 25

3.5.2. pH phản ứng tối ƣu............................................................................. 51

2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25

3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52

2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25

3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54

2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25

3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55

2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh

3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56

tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27

3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57

2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59

2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30

KẾT LUẬN .................................................................................................. 59

2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30

KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 59

2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36

TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61

3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-

TIẾNG ANH ................................................................................................ 64

glucanase cao ............................................................................................... 36

PHỤ LỤC .................................................................................................... 69

3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S
rRNA............................................................................................................ 37
3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39
3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ........................................... 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22
Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23
Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42
Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A.
oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 49
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 57
Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69
Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae
VTCC-F-045 ................................................................................................ 69

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73
Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73
Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74
Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75
Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76
Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77
Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77
Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78

Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của
Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7
Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea.. 8
Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của
cellulase ......................................................................................................... 9
Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase .............. 10
Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose ................................................................... 26
Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae
VTCC-F-045 ................................................................................................ 29
Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae........ 36

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A);
Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI
(C). ............................................................................................................... 38
Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39
Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A.
oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 40

β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 47
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 48
Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) ................................................................ 49
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A.
oryzae VTCC-F-045 ..................................................................................... 54
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase
của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 56

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endoβ-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 44
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................. 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

g

Microgram

l

Microliter

nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một

APS
Cel

Ammonium persulphate
Cellulose

cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và

CMC

Carboxyl methyl cellulase

cs
EDTA
kb

Cộng sự
Ethylene diamine tetraacetic acid
Kilobase

kDa
M

Kilo Dalton
Marker (thang protein chuẩn)

MTK
MW

Môi trƣờng khoáng
Molecular Weight

OD
PCR
SDS-PAGE

Optical density
Polymerase chain reaction

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine

Tris
U
v/v
w/v

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane
Unit
Volume/volume
Weight/volume

Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc

một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân
giải mạnh mẽ cellulose vô định hình.
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau
nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các hạt
ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy nhiên,
nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme hết sức
đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus, Trichoderma
viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus).
Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác
nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực
phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung
môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh.

Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi
sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ
phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài:
Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó
Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4glucanase.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



1


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hƣơng and Hoàng Đình Hòa, 2003). Ngoài ra còn có các loài ƣa kiềm nhƣ
Cephalosporium sp. RYM-202 (Kang and Rhee, 1995).

1.1. ĐỊNH NGHĨA
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase.

Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lƣợng

Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân

and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và

tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác để

Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme.

giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện

Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus nhƣ A.niger (Coral et al., 2002,

hoạt tính mạnh mẽ trên cellulose vô định hình.

Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A. candidus

1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI

(Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A. flavus (Ojumu et al., 2003),
A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng

1.2.1. Nguồn gốc

Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cƣờng and

Endo-β-1,4-glucanase đƣợc thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau

Nguyễn Đức Lƣợng, 2003) đều có khả năng sinh enzyme. Các nhóm thuộc

nhƣ động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc

chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá,

nảy mầm là đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi,

2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp enzyme cao.

nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme
chủ yếu vì thời gian sống ngắn nên thu đƣợc nhiều lần trong năm và chủ động
sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng nhƣ dễ dàng điều khiển có

1.2.2. Phân loại enzyme
1.2.2.1. Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế

định hƣớng nguồn enzyme hoặc gia tăng lƣợng enzyme. Ngày nay, cùng với

Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng

sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phƣơng

enzyme của hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside

pháp sinh học phân tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi

bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng

bật mà các đối tƣợng động vật, thực vật ít áp dụng nhƣ gây đột biến nhân tạo.

tự khác để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose (Chellapandi et

Trong vi sinh vật, rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một

số loài nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.

al., 2008).
Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase đƣợc gọi là

Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng sinh endo-β-1,4-

endoglucanase hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC

glucanase nhƣ Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et

3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng

al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999, Nguyễn Lan

2 là exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống nhƣ cello
dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



3

hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là -glucosidase hoặc -glucoside

peptide. Sự phiên mã của gene CbhA và CbhB đƣợc cảm ứng bởi D-xylose. Ở

glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong

chủng A. kawachi, (Hara et al., 2003) đã phát hiện ba gene mã hóa

phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau.

endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A. Trong đó, cel5A và cel61A có liên

Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi

kết CBD1; còn cel5A và cel5B thuộc glycosyl hydrolase nhóm 5 (GH5),

cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose

cel5B có cấu trúc rất giống cel5A, nhƣng thiếu CBD1 và sự liên kết. Cel5A

(cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002).

gồm 4 đoạn intron, cel5B gồm 5 đoạn intron, còn cel61A thuộc nhóm GH61

1.2.2.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử

không có intron.

Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ

Dựa vào cấu trúc bậc một cơ bản, phức cellulase đƣợc chia làm 6 họ là
A, B, C, D, E và F (Henrissat et al., 1989). Dựa vào trung tâm xúc tác phức

khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể.
Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm

cellulase đƣợc chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes et al.,

enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm 3 nhóm là Cel-1, Cel-2 và Cel-3.

1991). Hiện nay, cellulase đƣợc xếp thành 12 họ khác nhau là 5, 6, 7, 8, 9,

Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng

(10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Trong đó, họ 9 chứa cellulases của vi khuẩn

là 62 kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự

(hiếu khí và kỵ khí), nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm

do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1

hydrolase nấm và họ 8 gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002).

giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có

1.3. CẤU TRÚC

độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình

Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần

tự amino acid của Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase

cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A. oryzae có

CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối lƣợng phân tử của Cel-1 và

khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa và 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng

Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối

A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng

lƣợng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của

Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A. terreus

Cel-2 chƣa đƣợc xác định (Yamane et al., 2002).

M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008).

Khi nghiên cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase
(CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, cả hai enzyme này đều
thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7); trong đó CbhB bao gồm cấu
trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi các amino acid
giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên kết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4

1.3.1. Cấu trúc bậc nhất
Nghiên cứu của Nozaki và cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase
thuộc họ 5 (GH 5) chứa CBM ở đầu nitơ, có trọng lƣợng phân tử khoảng
44 kDa và đƣợc gọi là ThEG. ThEG từ chủng Trametes hirsuta là một chuỗi
polypeptide có chứa 384 amino acid và có độ tƣơng đồng cao với En-1 từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



5


chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) và EglB từ

trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác đƣợc tăng lên

chủng A. niger (49%).

(Hình 1.1).

Ở chủng A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân

Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở

tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là

bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn α. Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến

CelA và CelB. Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron. Protein do CelA mã

β, liên kết với 6 amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực

hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H. Gene CelB chứa

vanderval. Liên kết giữa các amino acid có kích thƣớc từ 3,5 đến 4,1 Å

1248 bp không chứa đoạn intron. Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino

(Hình 1.2A). Gốc cysteine 206 nằm gần trung tâm xúc tác Glu 205 trên chuỗi

acid và đƣợc xếp vào họ cellulase C. Sau khi tinh sạch, protein của CelA và

B4. Đầu của chuỗi bên ở lõi phiến β, nơi có hệ thống tƣơng tác chặt chẽ với

CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa và 53 kDa.

các chuỗi bên của 8 gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và T204; cùng

Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) đã có
những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A, enzyme này thuộc họ 12
(GH 12) endoglucanase là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo
nên các chuỗi α, β và các vùng nối.

với sự tách rời giữa các nguyên tử trong chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.2B).
Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề
mặt xúc tác của enzyme. Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên

dƣới điểm hoạt động, nơi tƣơng tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89,
F214 và F219 có kích thƣớc từ 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.2C).

1.3.2. Cấu trúc không gian
Phân tử Cel12A đƣợc cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β
là A và B. Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β
(B1-B9). Hai phiến này xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp. Bề mặt lõm
của phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề
mặt của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme là hai gốc glutamyl 120 và
205 ở chủng H. grisea. Sáu gốc phía ngoài phân bố phía trên phân tử giống
nhƣ gài các amino acid tự do. Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu nitơ. Các dải
xoắn β đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ
29-32, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tƣơng ứng với chuỗi β:
B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7. Ba gốc cysteine là C175,

Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A)
và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. Grisea (Sang et al., 2003)

C206 và C216 đƣợc định vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4. Các chuỗi bên tập

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7


này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải
phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3).

Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea

1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC

Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A)

Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose

và phức hệ cellulose (B) của cellulase (Lee et al., 2002)

tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy

Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ exo-β-1,4-

phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme

glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu

trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy

endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose

phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau.

và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn

Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan

cellobiose. Kết quả tạo ra các cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và

của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi

glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



8



9


lipase, phytase và pectinase. Ở Việt Nam A. oryzae đƣợc sử dụng chủ yếu
trong quá trình làm tƣơng.
Năm 2001, bộ gene di truyền của A. oryzae đã đƣợc phân tích và giải mã.
Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base (Galagan
et al., 2005, Machida et al., 2005) (Hình 1.5).

Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase

Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. Oryzae (Machida et al., 2005)

1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae
A. oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp
Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002).
Bào tử của A. oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin.
A. oryzae tiết ra môi trƣờng các enzyme thủy phân nhƣ cellulase, pectinase,
xylanase và hemicellulase khi sống trên môi trƣờng có nguồn cơ chất tƣơng
ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose. Nên A. oryzae đã đƣợc ứng
dụng rất rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công
nghiệp sản xuất các enzyme. Ở Nhật Bản A. oryzae đƣợc sử dụng trong quá

1.6. Ứng dụng
Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase đƣợc
ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau nhƣ công nghiệp
sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản
xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công
nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh.
1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

trình sản xuất thức ăn nhƣ xì dầu, rƣợu sakê và trong công nghiệp sản xuất

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme

enzyme nhƣ amylase, protease, hemicellulose, cellulase, oxidoreductase,

trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên
liệu ban đầu chứa hàm lƣợng cao các chất khó tan là lignin và một phần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



11


hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột

giảm lƣợng diacetyl đƣợc tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia.

mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung

Trong dịch lên men có chứa một lƣợng β-glucan, chất này ảnh hƣởng tới khả

endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng

năng lọc và gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004).

nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học.

Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu đƣợc sản

Trƣớc khi nghiền hóa học, gỗ đƣợc xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các

xuất bằng phƣơng pháp khô, phƣơng pháp này cho chất lƣợng cà phê không

enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất

cao. Để tiến hành nâng cao chất lƣợng cà phê, phƣơng pháp lên men đã đƣợc

vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.

áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử

Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần đƣợc tẩy mực trƣớc khi

lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ,

sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã đƣợc

cellulose gây hiện tƣợng thẫm mầu, làm giảm chất lƣợng sau khi sấy, đồng

dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn

thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm A. niger có tên thƣơng

trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004).

mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lƣợng cà phê

1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm

đƣợc bóc vỏ tăng, hạt cà phê đƣợc bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt nhƣ

Trong quá trình sản xuất các loại nƣớc quả và nƣớc uống không cồn dựa
trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt
đƣợc nghiền, thu đƣợc thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả
nghiền đã ép bã thu đƣợc dịch quả. Dịch này thƣờng chứa các thành phần tế
bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ

hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá
trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan
trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích
ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% (Nguyễn Đức Lƣợng, 2003).
1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm

Nguồn thức ăn cung cấp năng lƣợng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là

quan nƣớc quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất

ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dƣỡng cung

quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết

cấp năng lƣợng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó,

hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá

các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4

trình sản xuất, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase,

glucoside. Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột

hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của

hấp thụ các chất dinh dƣỡng. Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn

nƣớc quả có thịt sẽ tốt hơn.

trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dƣỡng nhƣ protein, tinh bột

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease

và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh

và glucanase đã đƣợc sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



13


dƣỡng này. Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả

phân giải cellulose mạnh. Đặng Minh Hằng (1999) cũng phân lập đƣợc 2

năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.

chủng nấm có khả năng phân giải cellulose mạnh và đã tối ƣu đƣợc các điều

Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu

kiện nuôi cấy 2 chủng nấm đó nhằm nâng cao khả năng tổng hợp cellulase. Hai

cellulose nhƣ rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang đƣợc triển khai ở

mƣơi chủng xạ khuẩn, 40 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose đã

nhiều nƣớc, trong mọi lĩnh vực nhƣ sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho

đƣợc phân lập và khi bổ sung các chủng đó vào bể ủ sẽ rút ngắn thời gian ủ 5-7

gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thƣờng đƣợc sử dụng lên men các nguồn

ngày (Nguyễn Lan Hƣơng et al., 1999). 192 chủng xạ khuẩn có khả năng phân

phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lƣợng các amino acid

giải cellulose đã đƣợc phân lập và thuần khiết từ các mẫu đất rác, rơm mục, gỗ

cân đối, các vitamin và tạo hƣơng thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi (Đặng

mục; trong đó số chủng có khả năng phân giải cellulose rất mạnh chiếm 42%

Thị Thu et al., 2004, Vũ Duy Giảng, 2009).

(Phạm Thị Ngọc Lan et al., 1999). Nguyễn Lan Hƣơng và Hoàng Đình Hòa
(2003) cũng đã phân lập đƣợc 15 chủng Bacillus có hoạt tính CMCase từ các

1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

mẫu rác sinh hoạt chứa cacboxymetyl cellulose.

Trong giai đoạn đƣờng hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là
thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một
số enzyme phá hủy thành tế bào nhƣ cellulase, hemicellulase có vai trò quan
trọng, giúp tăng lƣợng đƣờng tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột
với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rƣợu tăng lên 1,5% (Đặng Thị Thu et
al., 2004).

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc
tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã đƣợc
nghiên cứu và sản xuất. Chế phẩm Micromix 3 đƣợc tạo ra bằng cách tuyển
chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao đã đƣợc bổ sung
vào bể ủ rác thải có thổi khí sẽ rút ngắn đƣợc thời gian ủ 15 ngày, giảm một
nửa thời gian lên men, đồng thời lƣợng mùn tạo thành cũng cao hơn 29% và

1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trƣờng dẫn tới mất cân

các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng (Lý Kim Bảng et al.,
1999).

bằng sinh thái và phá hủy môi trƣờng sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống

Phức hệ cellulase đƣợc sử dụng để xử lý nguồn nƣớc thải do các nhà máy

con ngƣời. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử

giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh

dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trƣờng rất có hiệu

khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan

quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do

trọng quyết định tới chất lƣợng, số lƣợng giấy là cellulose. Vì vậy, nƣớc thải

các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải.

của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xƣởng mộc khi bổ sung các

Sau khi nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa
nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải (Lý Kim Bảng et al., 1999) đã tuyển chọn đƣợc

chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao (Trần Đình Toại and
Trần Thị Hồng, 2007).

3 chủng xạ khuẩn, 4 chủng vi khuẩn ƣa nhiệt trong bể rác thải có khả năng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



15


1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG

sinh tổng hợp cellulase rất kém (Henning et al., 2005). Lê Thị Thanh Xuân và

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE

cs (2005) khi nghiên cứu chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces cho thấy

Nấm sợi A. oryzae chủ yếu sống hoại sinh phân giải nguồn cơ chất trong

chúng sinh trƣởng mạnh nhất trên nguồn carbon là glucose và tinh bột, nhƣng

môi trƣờng nơi chúng sống dựa vào hệ enzyme ngoại bào do chúng tiết ra để

nguồn carbon thích hợp để chủng sinh tổng hợp cellulase là cellulose và

sinh trƣởng và phát triển. Tốc độ tiết enzyme phụ thuộc rất nhiều vào điều

CMC. Trịnh Đình Khá (2006), khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DQT-

kiện môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, nguồn carbon và nguồn nitrogen.

HK1 cho thấy, chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trên nguồn carbon là
rơm với nồng độ 0,6%.

1.7.1. Nguồn carbon
Tùy loài vi sinh vật mà nguồn carbon đƣợc sử dụng để sinh endo-β-1,4-

1.7.2. Nguồn nitrogen

glucanase là khác nhau, có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn

Nguồn nitrogen ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ tiết enzyme của các loài vi

carbon, có loài lại thích hợp với nhiều nguồn carbon. Nguồn carbon có thể là

sinh vật. Nguồn nitrogen tồn tại ở dạng vô cơ nhƣ urea, ammonium sulfate,

các loại carbohydrate đơn giản nhƣ đƣờng đơn, đƣờng đôi hoặc phức tạp nhƣ

natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử nhƣ cao thịt, cao thịt

tinh bột, cellulose, xylan. Nguồn carbon phức tạp này thƣờng tồn tại ở hầu hết

bò, bột đậu tƣơng, bột cá hay peptone. Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitrogen

các sản phẩm, phế phẩm nhƣ trấu cám, vỏ quýt, sơ dừa, lõi ngô, bã mía, vỏ cà

đƣợc sử dụng là khác nhau. Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn

phê, mùn cƣa. Những chất này thƣờng đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích

nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitrogen để

hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.

sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài. Tang và cs (2004) khi tối ƣu điều

Kawamori và cs (1987) khi nghiên cứu trên chủng Thermoascus
aurantiacus A-131 và Thermoascus reese QM 9414 cho thấy Avicel là nguồn
carbon thích hợp nhất để chủng T. reese QM 9414 sinh tổng hợp CMCase,
tiếp đến là bã mía, cellulose, lactose, CMC và xylan. Trong khi lõi ngô và
xylan lại là nguồn carbon thích hợp cho chủng T. aurantiacus A-131 sinh
tổng hợp CMCase (Kawamori et al., 1987). Nguồn phế phẩm từ quả cam ngọt
(vỏ, cùi) đã đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh
cellulase ở chủng A. niger, T. longi và Saccharomyces cerevisae (Omojasola
and Jilani, 2008). Các loài Penicillium pinophilum, P. persicium, P.
brasilianum sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự
nhiên, còn đối với nguồn carbon là xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



16

kiện nuôi cấy chủng B. subtilis nhận thấy nguồn nitrogen vô cơ không thích
hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase; còn nguồn
nitrogen là cao nấm men và bột đậu tƣơng rất thích hợp cho khả năng sinh
enzyme (Tang et al., 2004). Nguồn nitrogen là urea và bột đậu tƣơng ảnh
hƣởng mạnh mẽ tới quá trình tổng hợp cellulase của chủng A. niger

NRRL-363 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003); Acharya và cs (2008) khi
nghiên cứu trên chủng A. niger cho thấy peptone, ammonium sulfate và urea
là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase. Ở
một số chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt nguồn nitrogen vô cơ là KNO 3 thích hợp cho
tổng hợp cellulase mạnh nhất (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Bột đậu
tƣơng là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh
tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



17


cellulase mạnh trong môi trƣờng có pH ban đầu là 8,0 (Tăng Thị Chính et al.,

1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ ảnh hƣởng sâu sắc tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung

1999). Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus lại thích hợp ở pH trung tính

và của nấm mốc nói riêng. Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt

(Nguyễn Đức Lƣợng and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999). Các chủng nấm

độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật đƣợc chia

Aspergillus lại thích hợp trong khoảng pH từ 4,5-6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999,

làm 3 nhóm là nhóm vi sinh vật ƣa lạnh và chịu lạnh; nhóm vi sinh vật ƣa ấm

Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani,

và nhóm vi sinh vật chịu nhiệt. Các loài ƣa lạnh sinh trƣởng đƣợc trong điều

2008).

kiện nhiệt độ dƣới 15°C; các loài ƣa ấm sinh trƣởng và phát triển tốt ở khoảng

1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME

nhiệt độ 20-37°C. Các loài chịu nhiệt sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ

Mỗi loại enzyme đƣợc tổng hợp từ các loài khác nhau có cấu trúc và hoạt

cao trên 50°C. Khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endo-β-

tính sinh học khác nhau. Nhiệt độ, pH, các dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa hay

1,4-glucanase cho thấy, ở chủng vi khuẩn B. subtilis nhiệt độ thích hợp cho

các ion kim loại có ảnh hƣởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme.

sinh tổng hợp enzyme là 37°C (Tang et al., 2004). Đối với các chủng vi
khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt thì nhiệt độ thích hợp để các chủng này sinh
enzyme cao từ 45-55°C (Nguyễn Lan Hƣơng et al., 1999, Tăng Thị Chính et
al., 1999). Ở các chủng nấm mốc nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase nằm trong khoảng từ 28-50°C (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003,
Ojumu et al., 2003, Narasimha et al., 2006, Omojasola and Jilani, 2008).
Chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase tối đa ở nhiệt độ
30°C (Trịnh Đình Khá, 2006).

1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong
một giới hạn nhất định, chƣa ảnh hƣởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính
enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp và khoảng nhiệt độ thích hợp của
nhiều enzyme vào khoảng 40-50°C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm
hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dƣới 0°C hoạt độ
của enzyme giảm nhiều nhƣng lại có thể phục hồi khi đƣa về nhiệt độ thích
hợp. Endo-β-1,4-glucanase gồm Cel 1 và Cel 3 từ chủng A. oryzae hoạt động

1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng

mạnh nhất ở nhiệt độ lần lƣợt là 50C và 60C (Fukuda et al., 2002). Endo-β-

pH môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp enzyme của
vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho việc
sinh tổng hợp enzyme. pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, trung tính hay
kiềm. pH thích hợp đối với các chủng vi khuẩn ƣa ấm sinh tổng hợp cellulase
là 6,5-7,0 và pH tối ƣu là 7,0; còn các chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt là 7,0-7,5 và pH
tối ƣu là 7,5 (Trần Đình Toại et al., 2008). Chủng Bacillus sinh tổng hợp mạnh
nhất ở pH 7,5. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



18

1,4-glucanase gồm Cel A và Cel B từ chủng A. oryzae KBN616 có hoạt tính
mạnh nhất ở nhiệt độ lần lƣợt là 55C và 45C (Kitamoto et al., 1996).
Endoglucanse III từ Trichoderma reesei có hoạt tính tối đa đạt 55C (Macarron

et al., 1993), nhiệt độ tối ƣu của -glucosidase từ chủng Trichoderma reesei
QM 9414 và chủng Trametes hirsuta là 50C (de la Mata et al., 1992, Nozaki
et al., 2007).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



19


đối chứng (đạt 37%) (Sang et al., 1995). Chinedu và cs (2008) nghiên cứu

1.8.2. Ảnh hƣởng của pH
Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trƣờng, những biến đổi dù

trên chủng Penicillium chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và

nhỏ trong nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hƣởng rõ rệt đến tốc độ

Fe2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt

phản ứng của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các enzyme mà pH thích

320% và 162%); trong khi Mg2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+ và EDTA ức chế mạnh

hợp có thể là trung tính, kiềm hoặc là acid. Endo-β-1,4-glucanase do các loài

hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và 43% với Hg2+) (Chinedu et al.,

khác nhau có pH tối ƣu khác nhau. Theo những nghiên cứu trƣớc đây, pH

2008).

thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng A. niger NRRL-363 hoạt động

1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa

mạnh nhất là 5,5 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). Endo-β-1,4-glucanase của
Chủng Trametes hirsuta là 5,0 và chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt
là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002). CMCase của A. niger Z10 hoạt động ở dải
pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002).
1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại

Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hƣởng rất mạnh tới hoạt tính
của enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ
và chất tẩy rửa là khác nhau. Trịnh Đình Khá (2006) khi nghiên cứu trên
chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy các chất tẩy rửa Tween 20, Tween
80, Trixton X-100, SDS đều làm giảm hoạt tính của cellulase và SDS làm

Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có

giảm mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%. Các dung môi hữu cơ

thể kích thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme. Một số ion kim loại có khả

(methanol, ethanol, isopropanol và aceton) đều ức chế hoạt tính cellulase,

năng liên kết phối trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm

riêng n-butanol ức chế mạnh mẽ hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Đỗ Thị

cacboxyl, amine hoặc peptide của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động

Tuyên và cs (2008) các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol

của enzyme có độ bền rất lớn; đồng thời các ion kim loại này tạo ra một dạng

không ảnh hƣởng mạnh tới hoạt tính xylanase từ chủng A. ozyzae DSM1863,

thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn đƣợc với cơ chất. Do đó

riêng n-butanol làm tăng và aceton làm giảm nhẹ hoạt tính xylanase. Tween

tốc độ thủy phân của enzyme đƣợc tăng lên. Các ion kim loại nặng ở nồng độ

20 và Triton X-100 không ảnh hƣởng mạnh ở nồng độ thấp (0,2-1%) nhƣng

gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của enzyme. Theo

làm giảm hoạt tính xylanase ở nồng độ cao 2%, trong khi đó SDS làm giảm

2+

2+

những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, các ion kim loại nhƣ Cu ; Hg , Ag

+

hoạt tính enzyme mạnh ở tất cả các nồng độ.

ức chế mạnh hoạt tính của các enzyme nhƣ xylanase, endoglucanase,
mannanase, protease, cellulase (Nguyễn Thị Thảo, 2005, Trịnh Đình Khá,
2006, Đỗ Thị Tuyên et al., 2008, Gao et al., 2008). Trong khi đó ion Ca2+ làm
tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40% so với đối chứng, Mg2+
làm giảm nhẹ hoạt tính (chỉ đạt 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính so với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



21


Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Hóa chất

2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

Hãng sản xuất (nƣớc)

Cao nấm men

Difco (Mỹ)

CMC

Sigma (Mỹ)

Kit tinh sạch plasmide QIA prep Spin Miniprep

Qiagen (Mỹ)

sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn

Peptone

Merck (Mỹ)

chủng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất.

Sephadex G100

Pharmacia

Sodium dodecylsulfate

Sigma (Mỹ)

Triton X-100

Merck (Đức)

Tween-20

BioBasic Inc (Mỹ)

2.1.1. Chủng giống
Ba mƣơi lăm chủng nấm A. oryzae do Viện vi sinh vật và Công nghệ

2.1.2. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị

Hãng sản xuất

Bể ổn nhiệt

Trung Quốc

2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

Việt Nam

Dung dịch

Thành phần, nồng độ

Box cấy vi sinh vật clean bench (TTCG công nghệ)

Việt Nam

Dung dịch A

Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

Cân phân tích AB 240

Sartorius (Thụy Sỹ)

Dung dịch Amp gốc

100 mg/ml ampicillin

Cân phân tích BL 150S

Sartorius (Đức)

Dung dịch APS

10% ammonium persulfate

Hệ thống chụp ảnh gel-doc

Pharmacia (Thụy Điển)

Dung dịch arsenomolypdate

5% (w/v) ammonium molybdate; 5% (v/v) H2SO4 đặc;

Hệ thống điện di ngang

Mupid α (Nhật Bản)

Hệ thống điện di SDS-PAGE

Biometra (Đức)

Dung dịch B

Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

Lò vi sóng

SamSung (Hàn Quốc)

Dung dịch Bradford gốc

100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml 88%

Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino

Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy lắc nuôi cấy

Certomat HK (Đức)

Máy li tâm lạnh Mikro 22R

Hettich (Đức)

Máy PCR Mastercycler personal

Eppendorf (Đức)

Dung dịch C

30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide

Máy quang phổ UV-2500

LaboMed Inc (Mỹ)

Dung dịch D

10% SDS; 25mM EDTA

Nồi khử trùng ES-315

Tomy (Nhật Bản)

Dung dịch muối A

20% (w/v) Na2SO4; 2,5% (w/v) Na2CO3; 2,5% (w/v) muối

Tủ lạnh 4C, -20C, -80C

Toshiba, Sanyo (Nhật bản)

Box cấy LB-1234

2.1.3. Hóa chất
Các hóa chất dùng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết (bảng 2.2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



22

0,6% (w/v) Na2HAsO4.7H2O

phosphoric acid
Dung dịch Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric
acid; 30 ml dung dịch Bradford gốc

Seignett; 2% (w/v) NaHCO3
Dung dịch muối B

15% CuSO4.5H2O; thêm vài giọt H2SO4 đặc

Dung dịch nhuộm

0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue; 30% (v/v)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



23

Chủng E. coli DH5α đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB (Luria-Bertani):

methanol; 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch nhuộm gel

0,1 μg/ml ethidium bromide

1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 6,5 khử

Dung dịch phá tế bào

100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0

Dung dịch protease K

20 μg/ml protease K

trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng

Dung dịch RNase

10 μg/ml Rnase

Dung dịch rửa PAGE

30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acid acetic

Dung dịch Sol I

50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8,0

Dung dịch Sol II

0,2 N NaOH; 1% SDS

Dung dịch Sol III

mang plasmid tái tổ hợp, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 μg/ml ampicillin.
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme

60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic

Chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đƣợc nuôi cấy

Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4

trong môi trƣờng khoáng MTK chứa 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng

Đệm TBE 10x

ở nhiệt độ 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ.

108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH
8,0

2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase

Đệm TE

100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0

Đệm tra mẫu

0,05% Brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10%

Hoạt tính enzyme đƣợc định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa

protein 5X (biến tính)

SDS; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M

thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong nƣớc cất dày khoảng 0,5 cm,

Tris-HCl, pH 6,8

đƣợc đục lỗ đƣờng kính 0,5 cm. Năm mƣơi μl dịch enzyme đƣợc cho vào lỗ

Đệm tra mẫu DNA 5x

0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene
xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol

Hỗn hợp muối AB

Dung dịch muối A: dung dịch muối B = 25:1

rồi ủ 12 giờ trong 4C cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch đƣợc ủ 4-6

giờ ở 37C lấy ra và nhuộm bằng lugol 1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo =
R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng

2.1.5. Môi trƣờng

thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tƣơng đối của enzyme.

Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi cấy trong 3 ml môi trƣờng khoáng
(MTK): 0,1% (w/v) peptone; 0,2% (w/v) KH2PO4; 0,03% (w/v) CaCl2.2H2O;
0,14% (w/v) (NH4)2SO4; 0,03% MgSO4.7H2O; 0,1% (w/v) cao nấm men; 1
ml dung dịch muối (18 mM FeSO4; 6,6 mM MnSO4; 4,8 mM ZnSO4.7H2O;
15 mM CoCl2); pH 6,5 khử trùng (Hong et al., 2001).

2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp định lƣợng đƣờng
khử của Nelson/Samogi (Nelson N, 1944). Đơn vị hoạt độ là lƣợng enzyme
phân giải cơ chất CMC thành đƣờng khử tƣơng đƣơng 1 l glucose trong một
phút ở điều kiện thí nghiệm.

Cazpek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4;
0,05% (w/v) KCl; 2% sucrose; pH 6,5 khử trùng. Môi trƣờng đặc bổ sung 2%
(w/v) agar.

Xây dựng đường chuẩn: Glucose đƣợc pha trong 100 mM đệm natri
acetate pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 20-100 µg/ml. Một ml dung
dịch glucose chuẩn đƣợc đo ở bƣớc sóng 660 nm. Độ hấp phụ và nồng độ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



25


glucose đƣợc vẽ theo chƣơng trình Excel. Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ

cơ chất còn dƣ và so màu ở bƣớc sóng 660 nm. Mẫu đối chứng thay dung

chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 20-90 µg/ml. Đƣờng chuẩn có phƣơng

dịch cần định lƣợng đƣờng khử bằng nƣớc cất. Đối chiếu với đồ thị chuẩn suy

trình y = 0,0064x - 0,0024. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bƣớc sóng

ra hàm lƣợng đƣờng khử.

660 nm, x là nồng độ glucose (µg/ml) (Hình 2.1).

2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng
sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

OD (660nm)

0.6

2.2.4.1. Khảo sát thời gian sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
y = 0.0064x - 0.0024
R2 = 0.9943

Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK

0.4

pH 6,5 ở 30C, có 0,5% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Dịch enzyme
đƣợc thu ở những khoảng thời gian khác nhau từ 24-56 giờ (cách nhau 12

0.2

giờ) để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase.
2.2.4.2. Tối ƣu nồng độ cơ chất cảm ứng

0
0

20

40

60

80

100

Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK

Nồng độ glucose (µg/ml)

pH 6,5 ở 30C và bổ sung cơ chất CMC ở các nồng độ khác nhau 0,5; 0,7;

Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose

1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 2,7. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt
Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,5 ml dung dịch 0,5% CMC pha trong
100 mM đệm natri acetate pH 5,0 đƣợc cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml

tính.
2.2.4.3. Tối ƣu nguồn carbon

dịch enzyme. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ 5 phút ở 50C sau đó bổ sung ngay
các hóa chất định lƣợng đƣờng khử tạo thành.

Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK
pH 6,5 ở 30C và bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng. Trong đó,

Ống kiểm tra: Hút 0,5 ml cơ chất CMC, thêm các hóa chất định lƣợng

nguồn cao nấm men đƣợc thay bằng các nguồn carbon khác là lactose,

đƣờng khử, sau đó bổ sung 0,5 ml dịch enzyme và tiến hành định lƣợng đƣờng

glucose, lõi ngô, bã mía, vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cám, CMC, vỏ quýt ở cùng

khử ngay.

nồng độ ban đầu (0,1%). Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt

Một ml dung dịch cần định lƣợng đƣờng khử đƣợc cho vào ống nghiệm,

tính.

thêm 1 ml hỗn hợp muối AB. Hỗn hợp đƣợc đun sôi cách thủy đúng 20 phút,

Sau khi xác định đƣợc nguồn carbon tốt nhất, để tối ƣu nồng độ

làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 1 ml dung dịch asenomolybdate lắc đều

carbon, chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MTK

đến khi hết bọt khí. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút loại bỏ tủa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



27


pH 6,5 ở 30C có nồng độ carbon khác nhau: 0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau

2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase

0,2%). Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme đƣợc xác định.
Dịch enzyme thô

2.2.4.4. Tối ƣu nguồn nitrogen

↓
Ly tâm 10 phút ở12500 vòng/phút

Trong môi trƣờng MTK nuôi cấy chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 ban
đầu, nguồn nitrogen sử dụng là peptone nhƣng không phù hợp để sản xuất chế

↓
Dịch trong
↓
Tủa muối ammonium sulfate 65%
↓

phẩm enzyme do giá thành chi phí sản xuất rất cao. Với mục tiêu là sử dụng
nguyên liệu sẵn có, peptone đƣợc thay thế bằng các nguồn nitrogen khác nhƣ
NaNO3, (NH4)2SO4, bột cá, bột đậu tƣơng, urea với cùng nồng độ ban đầu
(0,1%), bổ sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng và nguồn carbon đã

Thẩm tích loại muối
↓
Qua cột Sephadex G100
↓

đƣợc tối ƣu ở 30C, pH 6,5. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định
hoạt tính.
Sau khi xác định đƣợc nguồn nitrogen tốt nhất, để tối ƣu nồng độ nitrogen
chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi trong môi trƣờng có nồng độ nitrogen

Enzyme tinh sạch

khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 1,5; 1,8 và 2%. Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính enzyme

Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045

đƣợc xác định.
Bốn mƣơi ml dịch enzyme sau khi ly tâm 10 phút ở 12500 vòng/phút

2.2.4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy
Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK bổ
sung 1% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng cùng nguồn carbon và nitrogen đã
đƣợc tối ƣu, nuôi lắc 200 vòng/phút ở pH 6,5 và các nhiệt độ khác nhau: 28,
30 và 37C. Dịch enzyme đƣợc thu ở 120 giờ để xác định hoạt tính.
2.2.4.6. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng

đƣợc tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và để ở 4C qua đêm. Sau khi
ly tâm thu tủa ở 12500 vòng/phút, tủa đƣợc hòa vào đệm 100 mM acetate
pH 5,5 và thẩm tích loại muối (Hong et al., 2001). Để thấm tích loại muối,
15 ml mẫu đƣợc hút vào trong túi thẩm tích đã hoạt hóa và kẹp chặt hai đầu.
Cho túi vào cốc chứa 200 ml nƣớc cất có khuấy từ liên tục và đặt cốc vào
trong đá. Sau 3 giờ mẫu đƣợc thay nƣớc một lần để loại muối. Dịch tủa sau

Chủng nấm A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy 120 giờ trong môi

khi loại muối đƣa qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100. Cột có kích thƣớc

trƣờng MTK có pH thay đổi từ 3,5-8,5 ở 28C, lắc 200 vòng/phút để xác định

2,6 x 60 cm. Cột đƣợc cân bằng với đệm phosphate 50 mM, pH 7,5. Tốc độ

pH môi trƣờng tối ƣu.

chảy là 25 ml/h. Thể tích mỗi phân đoạn đƣợc thu 2 ml (thu 20 phân đoạn).
Hàm lƣợng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc xác định trong mỗi
phân đoạn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



29


2.2.6. Điện di SDS-PAGE

2.2.7.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH

Khối lƣợng tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch của enzyme

Để xác định độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae

đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide theo

VTCC-F-045, dịch enzyme đã tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ ở các

Laemmli (1970).

nhiệt độ khác nhau từ 30-60C trong các khoảng thời gian là 1; 2; 4; 6 và 8
giờ. Dịch enzyme sau khi ủ đƣợc xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase với

Thành phần

Gel tách (l)

Gel co (l)

H2O

1940

1180

Dung dịch A

1500

0

Dung dịch B

0

500

0,1 M ở các pH khác nhau từ 4,5-7,5 (đệm natri acetate pH từ 4,5-5,5; đệm

Dung dịch C

2500

300

phosphate pH từ 6,0-7,5). Sau khi ủ 1; 2; 4 và 6 giờ ở nhiệt độ phòng, hoạt

Dung dịch D

60

20

tính enzyme còn lại đƣợc xác định trong thời gian phản ứng là 5 phút.

APS 10%

24

10

TEMED

7

5

6031

2015

Tổng

thời gian phản ứng là 5 phút và nhiệt độ tối ƣu là 55C.
Để xác định độ bền pH, dịch enzyme đƣợc ủ ở các đệm có nồng độ

2.2.7.3. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ
Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính của endo-β1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với các

Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 18-20 mA cho gel co và

dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol, acetone và n-butanol nồng

25-30 mA cho gel tách.

độ 80% ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55C

2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase

trong thời gian phản ứng là 5 phút.

2.2.7.1. Xác định nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu

2.2.7.4. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa

Để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch (0,028 mg/ml

Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính của endo-β-1,4-

protein) đƣợc ủ với cơ chất 0,5% CMC trong đệm 0,1 M natri acetate pH 5,0

glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mg/ml protein) đƣợc ủ với các chất

ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-80C trong 5 phút.

tẩy rửa Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS với các nồng độ 0,4-2,0%

Để tìm pH tối ƣu, dịch enzyme đã tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5%

ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55C trong

CMC trong đệm ở các pH khác nhau từ 3,5-7,5 ở nhiệt độ tối ƣu là 55C

thời gian 5 phút để đánh giá ảnh hƣởng của chúng lên hoạt tính endo-β-1,4-

trong 5 phút.

glucanase.
2.2.7.5. Ảnh hƣởng của ion kim loại
Để đánh giá mức độ ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính của
endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch (0,028 mgml protein) đƣợc ủ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



31


với các ion kim loại Ag+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Zn2+, Ni+, Mn2+, K+ và EDTA

Phản ứng đƣợc thực hiện ở điều kiện: 95°C/5 phút, 35 chu kỳ (95°C/1

với các nồng độ 4 mM, 8 mM và 12 mM ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính còn lại

phút; 52°C/1 phút; 72°C/1 phút); 72°C/10 phút.

đƣợc xác định sau 4 giờ ủ, thời gian phản ứng 5 phút ở nhiệt độ phản ứng là

2.2.8.3. Gắn dính sản phẩm PCR vào pJET1.2

55C.

Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET1.2 đƣợc

2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử

thực hiện theo bài thí nghiệm (Fermentas). Hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl

2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số

sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O và hỗn hợp đƣợc ủ ở

Tế bào nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Czapek ở 30C, lắc 200
vòng/phút, sau 96 giờ dịch nuôi đƣợc ly tâm 10 phút với 10000 vòng/phút.
Tủa tế bào đƣợc nghiền nhẹ trong nitơ lỏng, sau đó bổ sung 600 µl đệm phá tế

70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ
qua đêm ở nhiệt độ 22°C tạo plasmid tái tổ hợp.
2.2.8.4. Biến nạp plasmid hóa học

bào lắc nhẹ và 65 µl lysozyme, ủ 45 phút ở 37°C. Sau đó hỗn hợp đƣợc bổ

Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo phƣơng

sung 5 µl protease K ủ 2-3 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol

pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli đƣợc cấy chuyển vào 3 ml

(24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl

môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Một trăm ml môi trƣờng

dịch nổi phía trên đƣợc thu sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol tỷ

LB đƣợc tiếp giống với 1 ml dịch tế bào qua đêm, nuôi lắc ở 37°C với

lệ 1:1 để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa sau khi ly tâm 15 phút ở 4°C với 12000

200 vòng/phút. Khi OD600nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi

vòng/phút đƣợc làm khô dƣới ánh sáng đèn và bổ sung 500 µl ethanol 70% để

cấy đƣợc đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4°C với 6000 vòng/phút.

rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10

Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô

phút, tủa đƣợc làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở -20°C

trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên. Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong

(Sandgren et al., 2003).

40 ml CaCl2 100 mM lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 10 phút với
4000 vòng/phút. Tủa tế bào lại đƣợc hòa vào 500 μl dung dịch 100 mM CaCl2

2.2.8.2. Khuếch đại gene bằng PCR
Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng nấm A. oryzae VTCC-F045 cặp mồi NL1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và
NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') đƣợc sử dụng.
Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR
gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 2,5 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl đệm PCR
10x; 0,35 µl Taq; 1 µl khuôn DNA và bổ sung H2O cất tiêm lên tổng thể tích

lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol đƣợc chia
nhỏ vào các ống eppendorf, dùng để biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -84°C.
Năm μl plasmid tái tổ hợp đƣợc trộn với 40 μl dịch tế bào làm khả biến,
ủ 20-30 phút ở 4°C. Hỗn hợp đƣợc sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó đặt ngay
vào đá lạnh 5 phút rồi bổ sung 250 μl môi trƣờng LB đã khử trùng. Sau khi
nuôi lắc hỗn hợp khoảng 60 phút ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-200 μl dịch tế

25 µl.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



33


bào đã biến nạp đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh

đầu 3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi

ampinillin ủ qua đêm ở 37°C.

gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH. Kết quả

2.2.8.5. Tách chiết DNA plasmid

là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc

Một khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp trên đĩa thạch đƣợc cấy vào 3 ml môi
trƣờng LB chứa ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200 vòng/phút. Dịch tủa
tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm 5 phút với 6000 vòng/phút đƣợc lắc rung 30
giây trong 150 µl Sol I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng.
Sau đó 150 µl Sol II đƣợc bổ sung vào hỗn hợp và đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung
150 µl Sol III vào hỗn hợp đảo nhẹ. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 450 µl

hơn kém nhau một nucleotide và đƣợc phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang
trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.
Vector pJET1.2 đƣợc gắn hai trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc M13 (-20) để
đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai.
Kết quả đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so
sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại.

chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 10 phút với 12500
vòng/phút trong. 450 µl pha trên đƣợc hút sang ống mới, bổ sung 320 µl
isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa DNA plasmid. Tủa DNA
plasmid sau khi ly tâm 12500 vòng/phút trong 5 phút đƣợc rửa với 500 µl
70% ethanol ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở
nhiệt độ phòng. Tủa plasmid đƣợc hòa trong đệm TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử
ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C.
2.2.8.6. Cắt DNA tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn XhoI và
XbaI qua đêm ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng gồm
3,5 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm
Tango Y+ và bổ sung H2O cất tiêm đến 10 µl. Sau phản ứng, sản phẩm cắt
đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra.

2.2.8.7. Giải trình tự nucleotide
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA chèn vào plasmid đƣợc
giải trình tự nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa
trên các dideoxy. DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



35


Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-

Chủng

Hoạt tính
U/ml

%

A. oryzae VTCC-F-022

0,78

81

Các chủng A. oryzae đƣợc nuôi ở cùng môi trƣờng MTK bổ sung 0,5%

A. oryzae VTCC-F-037

0,88

CMC ở 30C, pH 6,5 lắc 200 vòng/phút; sau 72 giờ dịch nổi nuôi cấy đƣợc

A. oryzae VTCC-F-040

Hoạt tính

Chủng

U/ml

%

A. oryzae VTCC-F-174

0,54

56

91

A. oryzae VTCC-F-176

0,44

45

0,45

46

A. oryzae VTCC-F-178

0,52

53

A. oryzae VTCC-F-041

0,89

92

A. oryzae VTCC-F-183

0,47

48

A. oryzae VTCC-F-042

0,73

76

A. oryzae VTCC-F-185

0,45

46

A. oryzae VTCC-F-043

0,84

87

A. oryzae VTCC-F-187

0,62

64

kính vòng phân giải rất khác nhau. Nhƣ vậy, các chủng A. oryzae đƣợc khảo

A. oryzae VTCC-F-044

0,76

79

A. oryzae VTCC-F-189

0,74

76

sát đều sinh ra endo-β-1,4-glucanase ngoại bào. Tuy nhiên, chỉ một số chủng

A. oryzae VTCC-F-045

0,97

100

A. oryzae VTCC-F-201

0,45

47

A. oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhƣ VTCC-F-037, 043,

A. oryzae VTCC-F-046

0,56

58

A. oryzae VTCC-F-206

0,47

49

045, 050, 187 và 189 mới đƣợc chọn ra (Hình 3.1).

A. oryzae VTCC-F-047

0,59

61

A. oryzae VTCC-F-210

0,55

57

A. oryzae VTCC-F-049

0,76

79

A. oryzae VTCC-F-233

0,35

36

A. oryzae VTCC-F-050

0,64

66

A. oryzae VTCC-F-243

0,27

28

A. oryzae VTCC-F-051

0,70

72

A. oryzae VTCC-F-254

0,30

31

A. oryzae VTCC-F-053

0,52

54

A. oryzae VTCC-F-310

0,39

41

A. oryzae VTCC-F-056

0,50

52

A. oryzae VTCC-F-314

0,31

32

A. oryzae VTCC-F-111

0,50

52

A. oryzae VTCC-F-351

0,32

33

A. oryzae VTCC-F-122

0,62

64

A. oryzae VTCC-F-357

0,37

38

A. oryzae VTCC-F-173

0,47

49

glucanase cao

xác định hoạt tính trên đĩa thạch. Kết quả khảo sát trên 35 chủng A. oryzae
cho thấy, trên đĩa thạch đều xuất hiện vòng phân giải cơ chất CMC với đƣờng

Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae

3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene
28S rRNA

Song song với định tính, khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

DNA của A. oryzae VTCC-F-045 sau khi tách chiết, đƣợc điện di trên gel

từ 35 chủng A. oryzae trên môi trƣờng khoáng MTK cũng đƣợc định lƣợng.

agarose 0,8 % cho thấy DNA tinh sạch và đủ để tiến hành nhân dòng và đọc

Sau 72 giờ nuôi cấy chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh endo-β-

trình tự. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi NL1 và NL4. Sau khi điện

1,4-glucanase cao nhất với hoạt tính đạt 0,97 U/ml (Bảng 3.1). Chủng

di, một vạch có kích thƣớc khoảng 614 bp xuất hiện (Hình 3.2A).

A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase tốt nhất
đƣợc chọn để tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy và đánh giá tính chất lý hóa của chúng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



36

Sản phẩm PCR đƣợc gắn trực tiếp vào vector pJET1.2 sau đó đƣợc biến
nạp vào tế bào E. coli DH5. Các dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc chọn lọc và cắt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



37

kiểm tra bằng enzyme hạn chế XhoI và XbaI. Sản phẩm cắt kiểm tra trên gel

(AF459735), A. parasiticus NRRL 6433 (EF661568), A. oryzae MN

0,8% agarose (Hình 3.2C) có 2 băng DNA kích thƣớc khoảng 2974 bp tƣơng

(GQ38275), A. flavus UWFP 570 (AY216669) và A. parasiticus NRRL 424

ứng với vector pJET1.2 và băng còn lại có kích thƣớc khoảng 600 bp tƣơng ứng

(EF661557) (Hình 3.2). Trình tự 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-

với đoạn DNA ngoại lai.

045 đã đƣợc đăng kí trong GenBank với mã số là GQ382276.

A

B

ĐC P1

Ap68
Ap57
Ao35
Af69
Ao75
Ao72

Af45
Ao76

M 1 2
3000

3000

614 bp

C

1500
1000
750

1500
1000

500

750

250

500

614 bp

0.2

250

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm
Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C).
P1: plasmid mang gene 28S rRNA; ĐC: plasmid không mang gene 28S rRNA

Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene mong muốn đã đƣợc tách và tinh
sạch bằng kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide. Đoạn gene 28S rRNA của
chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải

0
Nucleotide Subs titutions (x100)
Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045
Ao68: A. parasiticus NRRL 6433, Ap57: A. parasiticus NRRL 424, Ao75: A. oryzae MN;
Af69: A. flavus UWFP570; Af45: A. flavus IFM 5436; Ao35: A. oryzae NRRL 506; Ao76:
A. oryzae VTCC-F-045, Ao72: A. oryzae RIB40

3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase
3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian

trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau khi phân tích

Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase theo thời gian,

và xử lý số liệu, nhận đƣợc đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae

chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng khoáng MTK

VTCC-F-045 dài 614 bp (Bảng 4.2).

ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Dịch enzyme đƣợc thu ở các thời gian khác nhau

Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc

để xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. Kết quả cho thấy, ở 24 giờ hoạt

so sánh với trình tự gene 28S rRNA của các chủng nấm sợi đã công bố trên

tính đạt 1,96 U/ml. Hoạt tính enzyme đạt tối đa ở 120 giờ (2,34 U/ml). Sau

GenBank bằng phần mềm DNAstar. Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng

120 giờ hoạt tính giảm dần và trở về mức ổn định, hoạt tính đạt 1,75 U/ml sau

A. oryzae VTCC-F-045 có quan hệ họ hàng gần gũi với một số đại diện thuộc

156 giờ nuôi cấy (Hình 3.4 và Bảng 4.3). Nhƣ vậy, thời gian thích hợp nhất cho

chi Aspergillus. Trong đó, có độ tƣơng đồng 99,7% với các chủng A. oryzae

chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase là 120 giờ.

RIB40 (AP007172), A. flavus IFM (AB363745), A. oryzae NRRL 506
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



39