Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TR

Đ I H C QU C GIA HÀ N I
NGăĐ I H C KHOA H C T NHIÊN

=======

VǛăANHăPH

NGHIÊNăC UăĐ NHăL
TRONGăM UăHUY TăT
PH

NG

NGăPARAQUAT
NG NG

I B NG

NGăPHÁPăS CăKụăL NGăHI UăNĔNGăCAO
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã s : 60440118
LU NăVĔNăTH CăSƾăKHOAăH C

Ng iăh ng d n khoa h c:
1. PGS.TS. T TH TH O
2. TS. HÀ TR NăH NG

HÀ N I - 2015

L I C Mă N
L i đầu tiên cho tôi gửi l i c m ơn sâu sắc tới PGS.TS T Thị Th o và
TS. Hà Trần H ng đư tận tình h ớng dẫn và t o mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong su t
quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin đ ợc gửi l i c m ơn chân thành tới ban lưnh đ o và toàn thể nhân
viên Trung tâm Ch ng Độc – Bệnh viện B ch Mai đư t o điều kiện thuận lợi cho tôi
đ ợc học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày t lòng biết ơn tới các thầy cô giáo gi ng d y t i khoa Hoá, đặc
biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đư cho tôi những kiến thức quý giá
trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin gửi l i c m ơn các anh chị, b n bè của tập thể lớp cao học hoá
K24, đặc biệt là những ng

i b n trong nhóm hoá phân tích K24 đư giúp đỡ, chia sẻ

những khó khăn trong su t quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này.
Cu i cùng tôi xin gửi l i c m ơn tới gia đình và b n bè đư luôn động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015
H c viên

VǜăAnhăPh

Vũ Anh Phương

ng

Trường ĐảKả Tự nhiên

M CăL C
ĐẶT V NăĐ ............................................................................................................1
CH

NGă1:ăT NG QUAN.....................................................................................3

1.1. T̉ng quan về paraquat......................................................................................3
1.1.1. Công thức paraquat.....................................................................................3
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat .............................................................3
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat ......................................................................4
1.1.4. D ợc động học paraquat ............................................................................6
1.1.4.1. Hấp thu .................................................................................................6
1.1.4.2. Phân b .................................................................................................6
1.1.4.3. Chuyển hoá, th i trừ .............................................................................7
1.1.5. Tiên l ợng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết t ơng. .......7
1.2. Các ph ơng pháp xác định paraquat trong huyết t ơng ...................................9
1.2.1. Ph ơng pháp quang ph̉ .............................................................................9
1.2.2. Ph ơng pháp sắc ký khí kh i ph̉ ............................................................10
1.2.3. Ph ơng pháp sắc ký l ng kh i ph̉ ..........................................................11
1.2.4. Ph ơng pháp sắc ký l ng hiệu năng cao ..................................................13
1.3. Các ph ơng pháp xử lý mẫu huyết t ơng phân tích Paraquat ........................15
CH

NGă2:ăĐ IăT

NG VÀ PH

NGăPHÁPăNGHIÊN C U ...................19

2.1. Đ i t ợng nghiên cứu .....................................................................................19
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị..........................................................................19
2.2.1 Chất chuẩn .................................................................................................19
2.2.2 Hoá chất .....................................................................................................19
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................20
2.3. Ph ơng pháp nghiên cứu ................................................................................21
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định l ợng paraquat. .............................21
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn...........................................................................21
2.3.1.2. Ph ơng pháp tách PQ từ huyết t ơng ................................................21

Vũ Anh Phương

Trường ĐảKả Tự nhiên


2.3.1.3. Ph ơng pháp kh o sát điều kiện sắc ký để định l ợng PQ trong huyết t ơng ...21
2.3.2 Đánh giá ph ơng pháp phân tích PQ trong huyết t ơng...........................22
2.3.2.1. Tính chọn lọc .....................................................................................22
2.3.2.2. Kho ng nồng độ tuyến tính ................................................................23
2.3.2.3. Giới h n phát hiện và giới h n định l ợng ........................................23
2.3.2.4. Đánh giá độ đúng và độ chụm ...........................................................23
2.3.2.5. Độ ̉n định..........................................................................................23
2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết t ơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên
l ợng bệnh nhân và đánh giá hiệu qu lọc máu hấp phụ.........................24
2.3.3.1. Đ i t ợng nghiên cứu ........................................................................24
2.3.3.2. Tiêu chuẩn lo i trừ bệnh nhân ...........................................................24
CH

NGă3:ăK T QU VÀ TH O LU N .........................................................26

3.1. T i u hóa các điều kiện ch y sắc lý l ng hiệu năng cao ..............................26
3.1.1. Xác định b ớc sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD.............26
3.1.2. Kh o sát nh h

ng của thể tích mẫu tiêm vào cột..................................26

3.1.3. Kh o sát lựa chọn lo i pha động ..............................................................28
3.1.4. Kh o sát thành phần pha động .................................................................29
3.1.5. Kh o sát nh h

ng pH của pha động......................................................31

3.1.6. Kh o sát thành phần dung dịch đệm ........................................................33
3.1.6.1. Kh o sát nh h
3.1.6.2. nh h

ng của nồng độ KCl .............................................................35

3.1.6.3. Kh o sát nh h
3.1.7. Kh o sát nh h
3.1.8. Đ

ng của nồng độ natriheptanesulfonate ...................33
ng của nồng độ PEG ..............................................36

ng của t c độ d̀ng .......................................................37

ng chuẩn, giới h n phát hiện và giới h n định l ợng. .......................39

3.1.8.1. Xây dựng đ

ng chuẩn ......................................................................39

3.1.8.2. Giới h n phát hiện và giới h n định l ợng ........................................41
3.1.8.3. Đánh giá ph ơng trình đ

ng chuẩn ................................................42

3.2. Kh o sát ph ơng pháp xử lý mẫu ...................................................................45
3.2.1. Kh o sát nồng độ dung dịch TCA ............................................................45

Vũ Anh Phương

Trường ĐảKả Tự nhiên


3.2.2. Kh o sát th i gian lắc xoáy ......................................................................46
3.2.3. Kh o sát độ ̉n định mẫu phân tích ..........................................................48
3.3. Xác nhận giá trị sử dụng của ph ơng pháp ....................................................49
3.3.1. Đánh giá độ chọn lọc ................................................................................49
3.3.2. Đánh giá độ đúng của ph ơng pháp .........................................................49
3.3.2.1. Đánh giá độ thu hồi của ph ơng pháp ...............................................49
3.3.2.2. Đánh giá độ đúng của ph ơng pháp phân tích ..................................50
3.3.3. Đánh giá độ lặp l i và tái lặp l i ...............................................................51
3.3.3.1. Đánh giá độ lặp l i của thiết bị ..........................................................51
3.3.3.2. Đánh giá độ chụm của ph ơng pháp phân tích ..............................53
3.3.4. Độ ̉n định ................................................................................................56
Độ ̉n định trong th i gian phân tích ..............................................................56
3.4. Phân tích mẫu PQ trong huyết t ơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên l ợng
bệnh nhân và đánh giá hiệu qu lọc máu hấp phụ..........................................56

3.4.1. Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: ...................................................56
3.4.2. Nồng độ Paraquat huyết t ơng trong tiên l ợng bệnh nhân và đánh giá
hiệu qu lọc máu hấp phụ ........................................................................58
K TăLU N ..............................................................................................................65
TÀI LI U THAM KH O ......................................................................................66

Vũ Anh Phương

Trường ĐảKả Tự nhiên


DANHăSÁCHăB NGăBỈU
B ng 3.1:
B ng 3.2:
B ng 3.3:
B ng 3.4:
B ng 3.5:
B ng 3.6:

nh h

ng của thể tích bơm mẫu .......................................................27

nh h ng của t̉ lệ pha động tới độ phân cực, th i gian l u, hệ s đ i
xứng pic ...............................................................................................31
nh h ng của pH tới th i gian l u, hệ s đ i xứng pic ....................32
nh h ng nồng độ natriheptanesulfonate đến th i gian l u, hệ s đ i
xứng pic ...............................................................................................34
nh h
nh h

ng của nồng độ KCl đến th i gian l u và hệ s đ i xứng pic. ....36
ng của nồng độ PEG đến th i gian l u và hệ s đ i xứng pic. ...37

ng 3.7:
ng 3.8:
ng 3.9:
ng 3.10:

nh h ng của t c độ d̀ng đến th i gian l u và hệ s đ i xứng pic 38
Nồng độ và diện tích pic trung bình của PQ .......................................40
Giới h n phát hiện và giới h n định l ơng của PQ .............................42
Kết qu so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của ph ơng trình đ ng
chuẩn PQ. ............................................................................................43

B ng 3.11:
B ng 3.12:
B ng 3.13:

Kết qu so sánh giữa b và b′ trong ph ơng trình đ ng chuẩn của PQ ....44
nh h ng của nồng độ TCA đến hiệu qu chiết PQ ra kh i huyết t ơng ..46
nh h ng của th i gian lắc xoay đến quá trình chiết .......................46

B ng 3.14:
B ng 3.15:

Kết qu xác định độ ̉n định khác ngày ..............................................48
Kết qu đánh giá hiệu suất thu hồi đ i với ph ơng pháp phân tích PQ ....50

B

B
B
B

Kết qu phân tích lặp l i các mẫu huyết t ơng thêm chuẩn ...............51
Các đ i l ợng th ng kê .......................................................................51
Độ lặp l i th i gian l u và diện tích pic của các chất .........................52
Kết qu hàm l ợng PQ tìm l i đ ợc bằng ph ơng pháp thêm chuẩn
của 3 kỹ thuật viên khác nhau .............................................................53
Các dữ kiện th ng kê đánh giá độ lặp l i của ph ơng pháp phân tích
tiến hành b i ba KTV khác nhau.........................................................54

B
B
B
B

ng 3.16:
ng 3.17:
ng 3.18:
ng 3.19:

B ng 3.20:
B ng 3.21:
B ng 3.22:

Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp của ph ơng pháp phân tích...............55
Kết qu xác định độ ̉n định trong ngày .............................................56

B ng 3.23:

Th i gian từ lúc u ng đến khi lấy mẫu xét nghiệm ............................59

B ng 3.24:
B ng 3.25:

Kết qu định l ợng PQ trên 31 bệnh nhân ..........................................60
Thay đ̉i nồng độ Paraquat huyết t ơng sau lọc máu hấp phụ ...........63

Vũ Anh Phương

Trường ĐảKả Tự nhiên


DANHăSÁCHăHỊNH
Ch

ngă1.

Hình 1.1:

Công thức hóa học của paraquat .............................................................3

Hình 1.2.

Cơ chế gây độc của paraquat ...................................................................4

Hình 1.3:

Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết t ơng, th i gian sau

u ng, và kh năng s ng. ..........................................................................8

Ch

ngă3.

Hình 3.1:

Ph̉ hấp thụ UV của PQ.........................................................................26

Hình 3.2:

Sắc đồ kh o sát thể tích bơm mẫu .........................................................27

Hình 3.3:

Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi A ...............................................28

Hình 3.4:

Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi B ...............................................29

Hình 3.5:

Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C ...............................................29

Hình 3.6:

Sắc ký đồ kh o sát t̉ lệ pha động ACN μ Đệm %v/v ............................30

Hình 3.7:

Sắc đồ kh o sát nh h

Hình 3.8:

Sắc đồ kh o sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong đệm pH 2,5 .34

Hình 3.9:

Sắc đồ của PQ khi thay đ̉i nồng độ của KCl trong pha động. .............35

ng của pH........................................................32

Hình 3.10: Sắc đồ của PQ khi thay đ̉i nồng độ của PEG trong pha động. ............37
Hình 3.11: Sắc đồ kh o sát t c độ d̀ng ..................................................................38
Hình 3.12: Sắc ký đồ các nồng độ PQ khác nhau từ 0,02 – 10,00 µg/ml ...............39
Hình 3.13: Đ

ng chuẩn PQ theo diện tích pic ......................................................40

Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ trong mẫu huyết t ơng .................................47
Hình 3.15: Sắc ký đồ PQ trong huyết t ơng chuẩn áp dụng quy trình xử lý mẫu
hình 3.14 ...............................................................................................48
Hình 3.16: Độ chọn lọc PQ của ph ơng pháp .........................................................49
Hình 3.17: Phân b bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tủi ....................................57
Hình 3.18: Phân b bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp .................................57
Hình 3.19: Kết qu bệnh nhân ngộ độc Paraquat ....................................................58
Hình 3.20: Kết qu định l ợng nồng độ PQ khi vào viện bệnh nhân s ng và tử vong.....61
Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP

bệnh nhân s ng và tử vong. ..................................62

Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên l ợng tử vong ....................................................63

Vũ Anh Phương

Trường ĐảKả Tự nhiên


DANH M C CÁC CH
Tênăvi tăt t

VI T T T

Tênăti ngăanh

TênăTi ngăvi t

% Relative standard deviation

% Độ lệch chuẩn t ơng đ i

% Reproducibility standard

% Độ lệch chuẩn tái lặp

deviation

t ơng đ i

Acetonitrile

Acetonitril

Asymmetry factor

Hệ s đ i xứng pic

ATP

Adenosin Triphophate

Adenosin Triphophat

BN

Patient

Bệnh nhân

diode-array detector

detector m ng diode

DQ

Diquat

Diquat

EPQ

Ethylparaquat

Ethylparaquat

% RSD
% RSDR
ACN
AS

DAD

GC - MS
HP
HPLC

LC - MS

Gas chromatography - Mass
spectroscopy
Hemoperfusion
High performance liquid
Chromatography
Liquid Chromatography - Mass
Spectroscopy

Sắc ký khí kh i ph̉
Lọc máu hấp phụ

Sắc ký l ng hiệu năng cao
Sắc ký l ng kh i ph̉

LOD

Limit of Detection

Giới h n phát hiện

LOQ

Limit of Quantification

Giới h n định l ợng

Methanol

Methanol

ppm

Parts per million

Phần triệu

PQ

Paraquat

Paraquat

Relative coefficient

Hệ s t ơng quan

Receiver operating characteristics

Đ

Reverse phase-HPLC

Sắc ký l ng pha đ o

MeOH

R
ROC
RP-HPLC

Vũ Anh Phương

ng cong ROC

Trường ĐảKả Tự nhiên


Tênăvi tăt t
SD
SIPP
TCA

tR
UV-VIS

Vũ Anh Phương

Tênăti ngăanh

TênăTi ngăvi t

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

Severity Index of Paraquat

Ch̉ s độ nặng của ngộ độc

Poisoning

Paraquat

Trichloroacetic acid

Acid Tricloacetic

Retention time

Th i gian l u

Ultraviolet-Visible

Tử ngo i và kh kiến

Trường ĐảKả Tự nhiên


ĐẶTăV NăĐ
Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thu c diệt c giá
thành rẻ, hiệu qu diệt c d i nhanh chóng, ít nh h
đang đ ợc sử dụng rộng rãi

ng tới môi tr

ng do đó hiện

Việt Nam với nhiều tên th ơng m i khác nhau. Tuy

nhiên, paraquat (PQ) l i là một chất hóa học vô cùng độc với ng

i. Liều tử vong của

PQ ớc tính là kho ng 10 ml dung dịch 20%. T i nhiều n ớc phát triển, PQ đư bị cấm
sử dụng nh ng

Việt Nam việc thiếu các chính sách và biện pháp qu n lý sử dụng hóa

chất này nên trong những năm vừa qua có rất nhiều tr

ng hợp ngộ độc PQ đến cấp

cứu [1]. Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đư đ ợc báo cáo [10][1λ][27].
T i Trung tâm Ch ng độc bệnh viện B ch Mai, trong những năm gần đây, s l ợng
bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và tr thành một vấn n n vô cùng nghiêm
trọng, v ợt ng ỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 3λ1 ca. T̉ lệ tử vong
do ngộ độc PQ rất cao, th

ng kho ng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của các tác gi

n ớc ngoài [2λ][32]. T i Trung tâm ch ng độc (TTCĐ) bệnh viện B ch Mai, t̉ lệ tử
vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,λ% [2], nghiên cứu t i bệnh viện Chợ
Rẫy thành ph Hồ Chí Minh là 85%.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định l ợng PQ
trong huyết t ơng đóng vai tr̀ đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của
ngộ độc, tiên l ợng bệnh nhân cũng nh đánh giá hiệu qu của các biện pháp điều
trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu
các biện pháp điều trị hiệu qu . Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác gi n ớc
ngoài và một s tác gi Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc
máu hấp phụ bằng cột than ho t hoặc cột resin nhằm tăng c

ng đào th i PQ cho

kết qu kh quan, cứu s ng một s không nh bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét
nghiệm định l ợng nồng độ PQ huyết t ơng cung cấp công cụ quan trọng để đánh
giá hiệu qu của các biện pháp điều trị tăng th i trừ này.
Tuy nhiên, cho đến nay t i Việt Nam việc xét nghiệm PQ ch̉ dừng

mức độ

định tính trong n ớc tiểu bằng ph ơng pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc

Vũ Anh Phương

1

Trường ĐảKả Tự nhiên


PQ mà ch a có cơ s xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định l ợng nồng độ PQ
máu với kết qu đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một kho ng tr ng lớn trong chẩn
đoán, tiên l ợng cũng nh đánh giá hiệu qu của các biện pháp lọc máu làm cho
việc điều trị ngộ độc PQ t i Trung tâm Ch ng độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên
c n ớc gặp rất nhiều khó khăn.
Để định l ợng PQ trong huyết t ơng trên thế giới đư áp dụng các ph ơng
pháp sắc ký khí kh i ph̉ (GC-MS), điện di mao qu n (CE), sắc ký l ng kh i ph̉
(LC-MS)... T i Trung tâm ch ng độc bệnh viện B ch Mai hiện đang sử dụng máy
sắc ký l ng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nh ng cũng ch a có quy trình
chuẩn định l ợng PQ huyết t ơng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
ắNghiênăc uăđ nhăl

ng Paraquat trong m u huy tăt

ngăng

i b ngăph

ngă

pháp s c ký l ng hi uănĕngăcaoẰ với hai mục tiêu:
1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người
và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat.

2. Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat
trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc
bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

Vũ Anh Phương

2

Trường ĐảKả Tự nhiên


CH

NGă1:ăT NGăQUAN

1.1.ăT̉ngăquanăv̀ăparaquată
1.1.1. Công thức paraquat
Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium là thu c diệt c ph̉ biến nhất hiện nay do đặc tính
diệt c nhanh và triệt để. PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium,
đ ợc t̉ng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thu c
trừ c từ những năm 1λ50 [42].
PQ có kh i l ợng phân tử t ơng đ i 186,2 có công thức hóa học nh hình 1.1μ

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat
PQ th

ng có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng

20oC là 1,240 -

1,260, điểm ch y 175 - 180oC, điểm sôi kho ng 300oC và pH của dung dịch PQ
trong n ớc 6,5 - 7,5.
PQ th

ng

d ng dimethylsulphate hoặc dichloride. D ng dichloride tinh

thể trắng, d ng dimethylsulphate ch y rữa. PQ ̉n định trong dung dịch môi tr
acid hoặc trung tính và không ̉n định trong môi tr
PQ tan t t trong n ớc (độ tan 700 g/l

ng

ng kiềm.

20oC), ít tan trong cồn và hầu nh

không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
PQ bị phân hủy d ới ánh sáng UV, bị bất ho t b i các tác nhân ho t động bề
mặt anionic và b i đất sét, bị mất ho t tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ không
bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn m̀n thép, tấm thiếc, sắt m kẽm và nhôm [43].

Vũ Anh Phương

3

Trường ĐảKả Tự nhiên

PQ đ ợc s n xuất b i nhiều công ty khác nhau với các tên th ơng m i và
hàm l ợng khác nhau, nói chung th
tên gọi th

ng đều

d ng dung dịch màu xanh. Một s

ng gặp của PQ nh μ Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone,

Owen... [42].
Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các n ớc phát triển đều đư cấm
sử dụng PQ nh là một lo i hóa chất b o vệ thực vật (Mỹ và các n ớc Châu Âu).
Một s n ớc nh Nhật B n ch̉ cho phép l u hành PQ d ng dung dịch với hàm
l ợng thấp 4,5% sẽ giúp gi m thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên
thế giới vẫn có gần 130 n ớc cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42].
Hiện

Việt Nam thu c từ c PQ đ ợc l u hành d ng dung dịch 20% do đó nguy cơ

ngộ độc cấp tính rất lớn.
Một điều đáng nói là công ty s n xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là
Syngenta hay c̀n gọi là Zeneca đặt nhà máy t i Trung Qu c và Anh. Trên đất n ớc
họ đư cấm hoàn toàn PQ, ho t động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các n ớc
thứ ba [39].
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat
Cơ chế gấy độc của PQ đ ợc mô t theo sơ đồ sau [37]μ

Hình 1.2. Cơ chế gây độc của paraquat [15]

Vũ Anh Phương

4

Trường ĐảKả Tự nhiên


Trong giai đo n đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH tr i qua
một ph n ứng t o ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+. PQ+ ph n ứng hầu nh
ngay lập tức với oxy tái t o l i PQ2+ và g c superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu
trình oxy hoá - khử của PQ x y ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và
không ngừng t o ra g c superoxid. G c tự do superoxid sau đó ph n ứng với b n
thân nó để t o ra peroxid hydro (H2O2), và với H2O2 cùng Fe để t o thành g c tự do
hydroxyl [18] [31]. C n kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá - khử
t o thành g c tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm t̉n th ơng tế bào: ph n ứng
với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein t i cần thiết cho
tế bào s ng sót cũng bị các g c tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40].
Hậu qu lên tế bào do việc hình thành các g c tự do (superoxid và các g c tự
do khác) là đ i t ợng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào
việc thay đ̉i các g c tự do bằng các chất nh desferioxamin, superoxid dismutase,
α-tocopherol và vitamin C cùng với bài niệu c ỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện
nay không có chất nào trong s này đ ợc khuyến cáo dùng.
Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các g c tự do do PQ sinh ra vẫn
ch a đ ợc biết nh ng những gì ng

i ta đư biết về cơ s để ngộ độc là sự t ơng tác

giữa PQ, NADPH và oxy. Sau đó,

mức độ tế bào, oxy là yếu t t i cần thiết cho

việc hình thành bệnh lý do PQ. Đây là cơ s cho việc h n chế cung cấp oxy trong
việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ.
PQ có tính ăn m̀n và gây t̉n th ơng gi ng nh kiềm khi tiếp xúc với da,
mắt và các niêm m c. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là
đ

ng tiêu hoá, thận và ph̉i. D dày, ruột bị t̉n th ơng nặng nề do tác dụng ăn

mòn trực tiếp khi bệnh nhân u ng PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan
đào th i PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng
ph̉i, PQ vào các phế bào týp I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo
cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP.
Do vậy PQ gây t̉n th ơng hầu hết tất c các cơ quan trong cơ thể vì đều có
liên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên t i các vị trí hấp phụ nhiều PQ

Vũ Anh Phương

5

Trường ĐảKả Tự nhiên


hoặc liên quan đến th i trừ PQ thì t̉n th ơng đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là
nguyên nhân hàng đầu gây tử vong nh t̉n th ơng ph̉i gây suy hô hấp, suy thận,
viêm gan, loét niêm m c đ

ng tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37].

Việc tiếp xúc với l ợng PQ ít hơn sẽ làm chậm nguy cơ tử vong do xơ ph̉i tiến
triển và suy thận [33]. Một s nghiên cứu gần đây c̀n cho thấy phơi nhiễm PQ có
liên quan với hội chứng Parkinson [21][23].
Trong ngộ độc cấp PQ, có thể tiên l ợng bệnh dựa trên nồng độ PQ trong
huyết t ơng. Một s báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết t ơng v ợt qua 2 µg/ml thì
hầu hết tử vong, tuy nhiên một vài tr

ng hợp bệnh nhân vẫn hồi phục khi nồng độ

trong máu cao hơn 2 µg/ml [7][10][22].
1.1.4. Dược động học paraquat
1.1.4.1. ảấp thu
đ
yếu

ng tiêu hoá PQ đ ợc hấp thu rất nhanh nh ng ít (5-10%). Hấp thu chủ

ruột non. Khi d dày ruột bị t̉n th ơng lan rộng, s l ợng chất độc đ ợc hấp

thu sẽ tăng lên. PQ không gắn với protein huyết t ơng. Nồng độ đ̉nh của PQ trong
huyết t ơng đ t đ ợc trong vòng 2 gi sau u ng [6] [37]. Tiếp xúc qua da, hấp thu
vào cơ thể nói chung ch̉ x y ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị t̉n th ơng. Tiếp xúc
với PQ qua đ

ng hô hấp không làm cho l ợng PQ đ ợc hấp thu đến mức đủ để

gây nhiễm độc. B i vì kích th ớc các h t chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 m) làm
cho PQ không đi sâu đ ợc xu ng đ

ng hô hấp để hấp thu [11]. Mắt tiếp xúc với

PQ sẽ bị t̉n th ơng, nh ng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân.
1.1.4.2. Phân bố
Sau khi u ng, PQ phân b nhanh chóng nhất tới tất c các cơ quan chính nh
ph̉i, thận, gan và cơ, đặc biệt là ph̉i, PQ sẽ bị khử thành d ng g c tự do ho t tính
cao [8][22]. Thể tích phân b của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg.
PQ đ t đ ợc nồng độ cao và tồn t i lâu hơn trong ph̉i, nồng độ trong ph̉i
có thể cao hơn so với nồng độ huyết t ơng gấp 50 lần. Sau u ng 5-7 gi , nồng độ
PQ trong t̉ chức ph̉i đ t cao nhất. Tuy nhiên, l ợng PQ huyết t ơng cũng cần đ t
đến một ng ỡng tới h n để cho quá trình hấp thu

Vũ Anh Phương

6

ph̉i diễn ra [11].

Trường ĐảKả Tự nhiên


PQ qua đ ợc nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch i và
máu dây r n, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [11]. Không có bào thai
nào s ng sót. Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn s ng thì đến lần có thai sau không
nguy hiểm đến bào thai.
1.1.4.3. Chuyển hoá, th i trừ
PQ đ ợc đào th i hầu nh hoàn toàn qua thận nh c quá trình lọc của cầu
thận và quá trình bài tiết tích cực của ng thận. Trong vòng 12-24 gi sau u ng, trên
90% PQ đ ợc đào th i d ới d ng không đ̉i qua thận, nếu chức năng thận bình
th

ng [11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong n ớc tiểu vài ngày sau do

có sự tái phân b PQ từ các cơ quan. Th i gian bán th i của PQ có thể kéo dài 12120 gi hoặc lâu hơn khi có suy thận. Ngoài ra PQ c̀n đào th i qua phân d ới d ng
không đ̉i [8][22].
1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.
Tiên l ợng bệnh nhân u ng PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết t ơng theo
th i gian. Nồng độ PQ ph i đo tr ớc khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm
gi m nồng độ PQ (dùng than ho t, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29]
lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên l ợng kh năng s ng từ kết qu định l ợng nồng
độ PQ huyết t ơng t i nhiều th i điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN
s ng có nồng độ d ới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l t ơng ứng
gi sau u ng PQ. Schermann và cộng sự [35] m rộng đ

4, 6, 10, 16, và 24

ng cong tiên l ợng BN

này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc, và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng
độ PQ huyết t ơng trên 10 mg/l (định l ợng trong vòng 8 gi ), th

ng chết vì s c

tim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nh ng vẫn trên đ

ng tiên

l ợng), chết vì xơ ph̉i và suy hô hấp muộn hơn 24 gi sau u ng. Suzuki và cộng sự
(1991) [36] đư kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann
(1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận rằng đồ thị tiên l ợng
chính xác 101 trong 102 tr

ng hợp tử vong và 61 trong 63 BN s ng đ ợc đánh giá

trong vòng 24 h sau u ng PQ. Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác định mức độ
nặng và tiên l ợng tử vong nếu định l ợng đ ợc PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng

Vũ Anh Phương

7

Trường ĐảKả Tự nhiên


đôi khi tiên đoán sai. Nguyên nhân do ớc tính th i gian từ khi u ng PQ dễ sai, đặc
biệt trong vài gi đầu tiên nồng độ PQ huyết t ơng gi m nhanh sai s về th i gian
thậm chí 0,5 đến 1h có thể thay đ̉i hoàn toàn m i quan hệ nồng độ và tiên l ợng.
Ngoài ra, nồng độ PQ trong huyết t ơng có thể không hoàn toàn chính xác vì đ ợc
phân tích bằng một s ph ơng pháp khác nhau và các nghiên cứu th

ng không

trình bày rõ nồng độ của ion hay là mu i PQ, và thực tế có thể có khác biệt giữa
các bệnh nhân về mức độ nh y c m với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt này
ch a đ ợc nghiên cứu.

Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết t ơng (µg/ml), th i gian
sau u ng, và kh năng s ng.
Năm 1988 Sawada và cộng sự [34] báo cáo ch̉ s tiên l ợng ngộ độc PQ
dựa trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh

30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN

s ng. Ch̉ s độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính
bằng th i gian từ khi u ng (gi ) cho đến khi bắt đầu điều trị nhân với nồng độ PQ
huyết thanh (µg/ml) khi vào viện.
SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)] × [th i gian từ u ng đến bắt đầu điều trị (h)]
Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể s ng sót; điểm 50 phân biệt tử
vong muộn do suy hô hấp (10 < SIPP <50) với tử vong sớm do suy tuần hoàn

Vũ Anh Phương

8

Trường ĐảKả Tự nhiên


(SIPP > 50). Mặc dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định
l ợng dùng huyết thanh không ph i huyết t ơng. Suzuki và cộng sự (1λλ1) đư so
sánh SIPP với đồ thị tiên l ợng s ng trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau
u ng PQ. Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đư sai

1

tr

ng hợp tử vong và 2 BN s ng; trong khi đó, SIPP sai

tr

ng hợp tử vong. Những khác biệt này có ý nghĩa th ng kê, và tác gi kết luận

1 BN s ng và 10

rằng dựa trên nồng độ PQ trong 24 h đầu sau u ng, đồ thị của Proudfoot tiên
l ợng chính xác hơn SIPP [36].
1.2. Các ph

ngăphápăxácăđ nhăparaquatătrongăhuy tăt

ng

1.2.1. Phương pháp quang ph̉
Rai M.K và cộng sự [30] định l ợng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong
môi tr

ng kiềm t o ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đ i

b ớc sóng 600nm

trong khi Kato K. và cộng sự [20] l i dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester
(TBPE) ph n ứng với PQ để t o ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da tr i,
có thể chiết đ ợc bằng dichloromethane. Chang-bin Li và cộng sự [24] đư định
l ợng PQ trong huyết t ơng dựa bằng đo quang ph̉ của dẫn xuất khi ph n ứng với
Na2S2O4 10% và NaOH 5M.
u điểm của ph ơng pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ nh y cao, với các điều
kiện khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ̉n định lên đến 12h và
không cần đệm để ̉n định màu, kho ng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định
luật Lambert – Beer, trong khi giới h n phát hiện là 0,03 µg/ml. Trong khi đó,
ph ơng pháp sử dụng TBPE thì mẫu đ ợc phép để t i đa trong 20 phút. C 2
ph ơng pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] lo i b DQ thì Kato

K. [20] l i định l ợng đồng th i c PQ và DQ.
Ph ơng pháp định l ợng PQ bằng NaBH4 đư lo i đ ợc sự nh h
thu c trừ sâu thông th
sẽ gây nh h

ng của các

ng và các ion kim lo i khác. DQ, có cấu trúc gần gi ng PQ,

ng khi định l ợng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị lo i khi thêm

NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi. Các ion kim lo i nh Fe3+ và Al3+, có
thể nh h

ng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị lo i đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5%

Vũ Anh Phương

9

Trường ĐảKả Tự nhiên


tr ớc khi thêm dung dịch NaOH [30]. Còn theo Kato K [20], DQ cũng có thể chiết
đ ợc với TBPE trong dichloromethane cũng gi ng nh PQ nh ng PQ-TBPE có
quang ph̉ hấp thụ hơi khác với DQ-TBPE. Đo độ hấp phụ của PQ
nm & DQ

b ớc sóng 603

b ớc sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 - 45,0)×10-7 M. Giới h n phát

hiện 4,77.10-7 M.
Ph ơng pháp định l ợng PQ bằng NaBH4 đư đ ợc ứng dụng để định l ợng
PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nh máu, n ớc tiểu, sữa mẹ cũng nh các mẫu
thực phẩm và các mẫu trong môi tr

ng.

Với ph ơng pháp đo quang ph̉ thông th

ng, không phát hiện đ ợc PQ t i

b ớc sóng 257 nm. Nên Chang-bin Li và cộng sự [24] đư định l ợng nồng độ PQ
trong huyết t ơng dựa trên việc đo quang ph̉ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật
Lambert Beer với r = 0,996). Dung dịch n ớc chuẩn PQ 10 g/ml đ ợc quét b ớc
sóng từ 200 đến 300 nm, với mẫu trắng là n ớc cất. Huyết t ơng s ch và các dung
dịch huyết t ơng chuẩn PQ 50 và 10 g/ml đ ợc thêm TCA 20% (t̉ lệ 6:1, v/v).
Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét
b ớc sóng từ 200 đến 300 nm. Sau khi xử lý mẫu nh trên, dịch trong phần trên
đ ợc chuyển vào ng Eppendorf mới, b o qu n tránh ánh sáng. Tr ớc khi đo, 400
l mẫu đ ợc lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 l hỗn hợp đồng thể tích
Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm t ơng tự với mẫu huyết t ơng trắng đ i chiếu và
đo độ hấp thụ quang trong kho ng b ớc sóng từ 300 đến 500 nm (kho ng b ớc
sóng Δ = 0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể đ ợc tính toán theo công thức
Δ2Abs/(Δ )2 (kho ng b ớc sóng dẫn xuất Δ =4 nm) [24].
1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối ph̉
Ph ơng pháp GC-MS là ph ơng pháp đơn gi n có độ nh y và độ tin cậy cao,
từ lâu đư đ ợc sử dụng để định l ợng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và
Almeida R. M. [5] cùng sử dụng ph ơng pháp GC-MS để định l ợng PQ. Trong c

hai nghiên cứu, các tác gi đư sử dụng hệ th ng chọn lọc ion (selected ion
monitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng th i cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn,
khí He đ ợc dùng nh là khí mang để đ a chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu

Vũ Anh Phương

10

Trường ĐảKả Tự nhiên


phân tích đều đ ợc khử bằng NaBH4 tr ớc khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí.
Tuy nhiên mỗi tác gi l i nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.
Tác gi L. Gao và cộng sự [16] l i sử dụng cột mao qu n (10 m × 0,18 mm,

độ dày màng 0,25 µm). Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần l ợt là

280, 280, 200oC. Khí mang đ ợc bơm đẳng dòng với t c độ là 1,01 ml/phút. Mẫu
đ ợc đ a vào bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ gi i hấp phụ lúc đầu là
70oC trong 1 phút và tăng đến 295oC với t c độ 25oC/phút. Nhiệt độ 295oC đ ợc
duy trì trong 10 phút. Trong đó các m nh ion 1λ6 và 224 đ ợc dùng để định l ợng
PQ & EPQ. Độ thu hồi của mẫu máu và n ớc tiểu lần l ợt là 94,00 - 99,85% và
95,00 - 100,34%, kho ng tuyến tính 0,1 - 50 µg/ml. Giới h n phát hiện (S/N = 3) là
0,01 µg/ml đ i với c máu và n ớc tiểu. Ph ơng pháp này đư đ ợc áp dụng để phân
tích các mẫu sinh học thu đ ợc từ các n n nhân chết do u ng PQ.
Trong khi đó, Almeida R. M. và cộng sự [5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GCMS (Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972)
với cột mao qu n fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1
µm) và chế độ đẳng dòng với t c độ 0,6 ml/phút. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ
phận ghép n i giữa GC và MS) là 270oC. Bơm ho t động

chế độ chia dòng. Nhiệt

độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến
270oC và duy trì 270oC trong 4 phút. S kh i của các m nh ion đ ợc chọn cho các
hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220
(EPQ), trong đó các m nh ion 1λ2 và 162 đ ợc dùng để định l ợng PQ & EPQ.
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối ph̉
Hai tác gi ZhaohongWang và Proenca P. đều định l ợng PQ trong mẫu sinh
học bằng sắc ký l ng - ion hóa tia điện - kh i ph̉ [28] [41].
ZhaohongWang sử dụng hệ th ng Waters UPLC với. Tiêm mẫu 5 l với cột
ACQUITY BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 m)

30oC. Còn Proenca P. sử

dùng hệ th ng sắc ký LC Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 ×
2,1 mm × 5 µm). Nhiệt độ cột duy trì 35oC. Bơm mẫu 10 µl. Detector m ng

Vũ Anh Phương

11

Trường ĐảKả Tự nhiên


photodiode Water 996 ho t động từ b ớc sóng 210-400 nm với độ phân gi i 1,2 nm.
Độ hấp thụ UV đ ợc đo

258 nm.

C hai tác gi đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile.

Trong khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều ch̉nh đến pH
3,7 bằng acid formic) và acetonitrile. Và ch y pha động theo chế độ gradient với t c
độ dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile gi m từ 60% đến 20%
trong 0,5 phút, sau đó tăng tới 60%

1,5 phút và duy trì 60%

1,5 phút tiếp. T̉ng

th i gian ch y là 3 phút. Thì tác gi Proenca P. dùng pha động gồm acetonitrile và
đệm ammonium formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và t c
độ 300 µl/phút.
Các tác gi trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện d ơng để ion hóa PQ và
chuẩn nội nh ng có khác nhau về điều kiện kh i ph̉.
Tác gi

ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích ph̉ kh i ACQUITY

BSM_SM_Quattro Premier XE MS. T i u hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêm
dòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250
mM (40:60, v/v) với t c độ khí cone là 50 l/h và t c độ dòng khí làm khô là 651 l/h
350oC. Điện áp mao qu n là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là
4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định l ợng bằng kỹ thuật quét ion (multireaction monitoring, MRM), bắt các m nh ion ban đầu có m/z 186 và các ion s n
phẩm có m/z 155 và 171 đ i với PQ; m nh ion ban đầu có m/z 214 và các ion s n
phẩm có m/z 158 và 185 đ i với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác gi Proenca P [28] phát hiện ph̉ (MS) đ ợc thực hiện trên máy
kh i ph̉ tứ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120oC; nhiệt
độ làm khô 400oC; t c độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và t c độ dòng khí làm khô (N2)
600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng l ợng
ion 0,5 V; Quét ph̉ từ m/z 130-500, th i gian quét 0,5 s và th i gian trễ (interscan)

0,1s. Đ

ng chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu

(y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tính từ 0,025-10,0 µg/ml trong n ớc
tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994). Giới h n phát hiện của PQ trong máu và

Vũ Anh Phương

12

Trường ĐảKả Tự nhiên


n ớc tiểu lần l ợt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD, S/N = 3) và giới h n định
l ợng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong n ớc tiểu.
Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng th i gian l u
với PQ và chất chuẩn nội
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Có rất nhều tác gi đư sử dụng ph ơng pháp HPLC để định l ợng PQ trong
dịch sinh học [7][17][26].
Arys K. và cộng sự [7] sử dụng hệ th ng HPLC. Gồm bơm model 126 và
tiêm mẫu type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl. B ớc sóng ho t động là 230 nm.
Cột phân tích Aluspher 100 RP-select B (125 mm × 4,0 mm, kích th ớc h t 5
µm) với cột b o vệ 100 RP-select B (4 mm × 4,0 mm, kích th ớc h t 5 µm). Pha
động là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125 M trong n ớc (dung dịch A) và dung
dịch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung dịch B), t c độ dòng 1 ml/phút.
Ch y pha động chế độ gradient, dung dịch A từ λ0% đến 10% trong th i gian 15
phút. Sau khi ch y xong, ch y l i điều kiện ban đầu trong 5 phút tr ớc khi
chuyển sang ch y mẫu mới. Giới h n phát hiện PQ của ph ơng pháp trong máu

và n ớc tiểu lần l ợt là 63 và 32 µg/l.
Paixão P. [26] định l ợng PQ trong huyết thanh và huyết t ơng ng

i đ ợc

làm đơn gi n và nhanh bằng ph ơng pháp HPLC sử dụng 1,19-diethyl-4,49bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn. Hệ th ng HPLC gồm bơm mẫu
model 1100, ̉n định nhiệt, detector UV-VIS. V̀ng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar
C18 (150×4,6 mm, 5µm). Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm). PQ và chất nội chuẩn
đ ợc rửa gi i

25oC với t c độ dòng 0,8 ml/phút và b ớc sóng hấp thụ 258 nm.

Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong
900 ml n ớc khử khoáng điều ch̉nh pH đến 3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile
nồng độ 10% (v/v). Kết qu : Th i gian l u của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút.
Giới h n phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới h n định l ợng (LOQ) 0,4 µg/ml trong
huyết t ơng và huyết thanh. Độ đúng trong ngày không v ợt quá 3,5%; 3,2% đ i

Vũ Anh Phương

13

Trường ĐảKả Tự nhiên


với huyết t ơng, huyết thanh. Độ đúng trong khác ngày không v ợt quá 4,7%; 3,1%
đ i với huyết t ơng, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết t ơng và huyết thanh lần
l ợt là 98,9% và 98,7%.
Shuuji Hara [17] định l ợng đồng th i PQ và DQ trong huyết t ơng bằng
ph ơng pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm

mẫu (20 µl) Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS đ ợc tách trên cột pha đ o Capcell PaK
C18 UG120 (150-4,6 mm, cỡ h t 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung
dịch rửa gi i của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và
sodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). T c độ dòng của pha động 0,5
ml/phút và nhiệt độ cột trong kho ng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC đ ợc trộn
với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. T c độ dòng 0,4
ml/phút. Hỗn hợp đ ợc dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và đ ợc làm ấm trong bể
n ớc SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật)

nhiệt độ 20oC và đo

b ớc sóng 391 nm bằng

detector UV Hitachi L- 7405. Độ cao của pic đ ợc dùng để định l ợng bằng máy CR6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới h n phát hiện của PQ và DQ là
50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết t ơng.
Định l ợng PQ trong huyết t ơng sử dụng sắc ký l ng hiệu năng cao pha đ o
cặp ion đư đ ợc Brunetto M.R. thực hiện trên hệ th ng sắc ký đ ợc sử dụng có 2
bơm, 1 bơm 2 ǹng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model
64 để chuyển pha động vào cột chiết. Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100
hoặc 200 µl để đ a mẫu vào cột chiết. Sử dụng các cột 25 - 4 mm đ ợc lấp đầy các
h t LiChrospher RP-18 ADS (kích th ớc h t 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18
(25 cm × 4,6 mm, h t 5 µm) lần l ợt là cột chiết và cột phân tích. Cột chiết và cột
phân tích đ ợc gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne đ ợc điều khiển bằng bơm 2
nòng. Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer LC 235

b ớc sóng 258 nm với

flowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu.

Vũ Anh Phương

14

Trường ĐảKả Tự nhiên


Các pha động:
-

Pha động để chiết (Pha động 1)μ chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM
và acid orthophosphoric 0,05 M đ ợc pha bằng n ớc cất 2 lần, và lọc
màng 0,45 µm. Điều ch̉nh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2-propanol
nồng độ 3% (v/v).

-

Pha động để phân tích (Pha động 2)μ methanol 40 % và SOS 10 mM
trong acid orthophosphoric 0,05 M. Điều ch̉nh đến pH 2,8 bằng TEA.

Các dung dịch và pha động đ ợc lọc màng 0,45 µm và lo i khí trong bể siêu
âm tr ớc khi sử dụng. Giới h n phát hiện, t̉ lệ tín hiệu (Signal) / Nhiễu đ

ng nền

(Noise) với S/N > 3, là 0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg [9].
Chen Lu và cộng sự [25] đư sử dụng ph ơng pháp sắc ký l ng hiệu năng cao
để xác định PQ trong huyết thanh ng

i. Trong thí nghiệm này, các mẫu huyết

thanh đư đ ợc kết tủa protein lần l ợt 30% acid perchloric, acetonitrile và
dichlormethane, thu đ ợc 50 ml dung dịch. Pha động acetonitrile-đệm (10:90), dung
dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều ch̉nh
pH đến 2,0 bằng triethylamine. T c độ d̀ng 1,2 ml/phút, b ớc sóng phát hiện 256
nm, nhiệt độ cột 40oC. Đ

ng chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 -

40 mg/l (r = 0,9999). Giới h n phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3). Độ lệch chuẩn (RSD)
của các mẫu chứng nồng độ thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% - 6,149%,
độ lệch chuẩn giữa các lô 0,705% - 2,7λ6%, và độ thu hồi của ph ơng pháp xử lý
mẫu λ6,7λ % - 100,07%, và độ thu hồi ph ơng pháp là λ1,66% - 108,4λ%. Ph ơng
pháp này là đơn gi n, nh y c m, chính xác, nhanh chóng và cũng ch̉ ra rằng có thể
đ ợc sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng.
* Ngoài ra, một vài ph ơng pháp khác cũng đư đ ợc nghiên cứu để định
l ợng PQ trong máu nh μ miễn dịch phóng x [14], điện di mao qu n [38]…
1.3.ăCácăph

ngăphápăx ălýăm uăhuy tăt

ngăphơnătíchăParaquat

Một trong những yếu t quyết định đến hiệu qu của ph ơng pháp định
l ợng đó là ph ơng pháp xử lý mẫu.

Vũ Anh Phương

15

Trường ĐảKả Tự nhiên

Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh
học trong phân tích PQ [5][16][20][28][41]. Một s tác gi dùng đệm phosphate để
thêm vào mẫu thử tr ớc khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41].
Cột chiết pha rắn C18 th

ng đ ợc dùng để chiết PQ & DQ trong mẫu thử

[20]. Dung dịch mẫu đư lo i protein đ ợc ch̉nh pH đến 11 bằng NaOH. Cột đ ợc
ho t hóa bằng 5 ml n ớc, 5 ml methanol và 20 ml n ớc tr ớc khi bơm mẫu vào cột.
3 ml n ớc cất đ ợc bơm qua cột để lo i b hoàn toàn các hợp chất khác trong máu.
Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 n ớc khử khoáng đ ợc cho qua
cột để rửa gi i PQ & DQ. Với dịch thu đ ợc thêm 3 ml dung dịch NaOH 0.2 M.
Mẫu này đ ợc mang đi đo quang [20].
Chang-bin Li [5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột đ ợc rửa với 2 ml
methanol và 2 ml đệm phosphate (pH 8,0). Dung dịch mẫu đ ợc đ a qua cột rồi rửa
với 2 ml n ớc khử khoáng. Cu i cùng, rửa gi i với 2 ml methanol và dịch rửa gi i
đ ợc bay hơi

nhiệt độ ph̀ng d ới dòng khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 100 µl

methanol và bơm 1 µl vào hệ th ng GC-MS.
Zhaohong Wang [41] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3 ml đệm phosphate 0,1M (pH
7) và dung dịch chuẩn nội 100 ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các cột
Waters Oasis WCX 3 ml đ ợc cho ch y qua lần l ợt 3 ml methanol, 3 ml n ớc khử
khoáng và 1 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7). Sau khi cho mẫu ch y qua cột, rửa cột
với 3 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7), 3 ml n ớc khử khoáng và 3 ml methanol.
Sấy khô chân không cột trong 10 phút. Chất phân tích đ ợc rửa gi i bằng 2 ml dung
dịch acid formic 2% trong acetonitrile 80%. Bay hơi dịch rửa gi i bằng dòng khí

nitrogen

45oC. Hòa tan cắn bằng 50

l pha động (dung dịch acetonitrile và

ammonium formate 250 mM t̉ lệ 1:1).
Proenca P [28] xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml máu hoặc 1 ml n ớc tiểu thêm
50 µl chuẩn nội (10 µg/ml) và 2 ml acetonitrile. Lắc, ly tâm 2500 vòng/phút trong
10 phút. Cột chiết pha rắn (Oasis, 3 cc) đ ợc rửa với lần l ợt 1 ml methanol và 1 ml
n ớc khử khoáng. Đ a mẫu qua cột chiết pha rắn. Rửa cột với 1 ml đệm phosphate
pH 7,1 ml n ớc khử khoáng và 1 ml methanol. Sau khi làm khô 10 phút trong chân

Vũ Anh Phương

16

Trường ĐảKả Tự nhiên