BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

Họ và tên: Nguyễn Thị Thùy Linh
MSSV: 1318191
Ca: 2A
Nhóm: 14

BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM
VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
I.

II.

Mẫu thực phẩm:
1. Tên mẫu: Thịt heo
2. Ngày thu: 22/12/2015
3. Nơi thu mẫu: Chợ nhỏ gần nhà
Chuẩn bị môi trường:
Trong quá trình học, nhóm em có chuẩn bị 2 môi trường là BPW (Buffered Pepton
Water) và Urea Broth.
Đối với môi trường BPW, sẽ chứa cả trong chai và trong ống nghiệm với thể tích như
sau:
Chứa trong chai: 250ml/nhóm x 19 nhóm = 4750ml
Chứa trong ống nghiệm (1 ống/nhóm): 19 ống x 10ml/ống = 190ml
 Tổng = 4940ml. Nhóm pha 5000ml.
Môi trường BPW là môi trường từng thành phần nên ta sẽ cân riêng từng thành phần theo
tỉ lệ khối lượng:
Trong: 1000ml H2O có: pepton 10g, NaCl 5g, Na2HPO4.12H2O 9g, KH2PO4 1.5g
 5000ml H2O: pepton 50g, NaCl 25g, Na2HPO4.12H2O 45g, KH2PO4 7.5g

Sau khi đã cân đủ các thành phần với khối lượng như trên thì ta mới thêm nước vào
(nhưng chưa đủ 5000ml, khoảng 2500ml) rồi khoáy đều lên cho các thành phần tan hết.
Sau khi các thành phần trong đó tan hết ta đổ môi trường qua ống đong rồi mới thêm

nước vào cho tới khi đủ 5000ml. Môi trường này không cần vô trùng nên ta chỉ cần lấy
ống đong để đong vào chai. Còn ống nghiệm thì chúng ta đo 5ml trước, kẻ vạch, sau đó
them vào cho tới vạch là được.
Đối với môi trường Urea broth, đây là môi trường tổng hợp nên ta sẽ dựa vào
khối lượng mà nhà sản xuất ghi trên chai đựng. Cần pha: (2 ống/nhóm) 19 nhóm x 2 ống
x 5ml/nhóm = 190ml. Pha thành 200ml. Trên chai ghi 38.5g/l => cần cân 7.7g. Sauk hi
cân được 7.7g (trong điều kiện vô trùng, đốt đèn cồn xung quanh), bỏ vào becher rồi cho
them nước vào (không đủ 200ml) khoáy tan. Sau khi đã khoáy tan, ta đổ môi trường vào
ống đong rồi cho them nước vào đến khi đủ 200ml. Khi cho môi trường vào trong ống
nghiệm ta cũng thực hiện trong điều kiện vô trùng (đèn cồn). Sử dụng xi lanh với đầu tip
5ml có màng lọc (vô trùng) để hút môi trường cho vào ống nghiệm.


Kết quả thí nghiệm:
1. Chỉ tiêu định lượng Coliforms:

III.

Quy trình:
Cấy 1ml mẫu Lật
đã pha
ngược
loãng
và ủ ở 37oC
Đổ vào 10-15ml VRB đã đun tan và làm
-3
-4
10 và 10 vào đĩatrong
petri,24
2 giờ nguội 45oC, chờ đông đặc (khoảng 15’),

đĩa/nồng độ
đổ them 5ml, chờ đông đặc
Chọn và đếm các
Cấy 5 khuẩn lạc đã
Ủ ở 37oC trong 24 giờ
Kết quả: Trên đĩa VRB:
khuẩn lạc đặc trưng
chọn sang môi
trường BGBL
Hệ số pha
Số khuẩn lạc đếm được

loãng

Đĩa petri 1

Đĩa petri 2

Đĩa đối chứng

10-3

451 (>300)

Không đếm được

23

10-4

165

150

Kết quả trong ống BGBL: Có 2 ống trong 5 ống mẫu không sinh hơi. Ống đối chứng không sinh
hơi.
 Tỷ lệ xác nhận R: R = Số khuẩn lạc sinh hơi/số khuẩn lạc đã cấy = 2/5 = 0.4
 Tổng số Coliforms (cfu/g): C = NxR/nVf = (165 + 150)x0.4/(2x1x10-4) = 6.3x105 (cfu/g)

Đối với Coliforms, vì Coliforms là vi khuẩn gram âm (-), có khả năng lên men lactose sinh
acid và có khả năng sinh hơi ở 37oC. Nên đầu tiên ta dùng môi trường VRB (môi trường đỏ
hồng) để chọn lọc Coliforms. Lựa chọn môi trường VRB vì trong VRB có chứa Crystal Violet và
muối mật số 3 có khả năng ức chế vi khuẩn gram (-) giúp loại bỏ các vi khuẩn gram (-), ngoài ra
muối mật số 3 còn tạo vòng tủa muối mật, lactose là nguồn Carbohydrat, Coliforms sẽ sử dụng
và lên men lactose sinh ra acid, acid sẽ được phát hiện bằng Neutral red có trong môi trường
VRB => pH giảm => khuẩn lạc đặc trưng có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, kích
thước >= 0.5mm. Sau khi chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng, ta cấy vào ống nghiệm môi trường BGBL
(có chuông Durham ngược). BGBL là môi trường tổng hợp không chọn lọc, giúp các vi khuẩn
trong môi trường khỏe mạnh trở lại. Ngoài ra, trong BGBL cũng có lactose giúp phát hiện
Coliforms (nếu có Coliforms thì sẽ có các bọt khí trong chuông Durham). Ống đối chứng không
sinh hơi có thể là do thao tác thực hiện có sai sót (que cấy còn nóng làm chết, khi lấy sinh khối
không lấy được), khi chọn khuẩn lạc trên đĩa đối chứng đã chọn sai khuẩn lạc.
Kết luận: Tổng số Coliforms/g trong mẫu là 6.3x105 (cfu/g)
2. Chỉ tiêu định tính E. coli giả định

Quy trình:
o
Ủ ở 44
trong
Cấy 1g (10ml

củaC10
1
giờ
) vào 10ml24
môi
trường LSB đôi

Chọn ống sinh
hơi cấy sang canh
trypton

Ủ ở 37oC trong
24 giờ
Ủ ở 44oC trong
24 giờ

Chọn ống sinh hơi cấy
sang ống EC broth (10ml)
Thử phản ứng indol, E.
coli giả định cho phản
ứng indol (+)


Kết quả:
Môi trường

Đối chứng

Mẫu

LSB

Sinh hơi trong chuông Durham,
môi trường đục

Sinh hơi trong chuông Durham, môi
trường đục

EC Broth

Sinh hơi trong chuông Durham,
môi trường đục

Sinh hơi trong chuông Durham, môi
trường đục

Canh trypton

Dương tính

Dương tính

E. coli giả định là Coliforms có khả năng chịu nhiệt (44oC) và có khả năng cho phản ứng indol
(+). Đầu tiên, ta sẽ cấy mẫu vào trong môi trường LSB đôi (Lauryl sulphate broth nồng độ đôi)
và đem ủ ở 37oC để chọn lọc Coliforms. Vì trong LSB có chứa lauryl sulphate có khả năng ức
chế các vi sinh vật không phải là Coliforms, giúp tăng sinh Coiliforms trong mẫu. Lactose là
nguồn Carbohydrat, giúp phát hiện sự có mặt của Coliforms. Coliforms sẽ sử dụng nguồn đường
lactose này, lên men và sẽ sinh ra acid. Quan sát thấy có sự sinh hơi trong chuông Durham có
nghĩa là có sự lên men lactose bởi Coliforms. Sau đó, cấy các ống có sinh hơi (có Coliforms)
sang môi trường EC broth và ủ ở nhiệt độ 44oC để chọn lọc ra E. coli giả định. Trong EC broth

có muối mật số 3 có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+), còn sót lại sau khi đã chọn lọc ở
bước tăng sinh E. coli giả định trong môi trường LSB đôi trên. Lactose được lên men bởi E. coli
giả định sinh ra khí trong chuông Durham. Đem ủ ở 44oC để chọn lọc ra E. coli giả định vì E.
coli giả định có thể chịu được nhiệt còn Coliforms thì không chịu được nhiệt. Cuối cùng chọn
các ống sinh hơi cấy vào canh trypton và đem ủ ở 44oC trong 24 giờ rồi đem đi thử phản ứng
indol để khẳng định chắc chắn là có E. coli giả định. Trong canh trypton – môi trường giàu
tryptophan, tryptophanase của E. coli giả định sẽ thủy phân tryptophan thành indol vì vậy ta cần
ủ 24 giờ để có xuất hiện indol. Để phát hiện indol, dùng thuốc thử Kovac có chứa pdimethylaminobenzaldehyde. Chất này sẽ kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối dimethyl
ammonium có màu đỏ. Vì vậy khi cho thuốc thử Kovac vào ta sẽ thấy có vòng màu đỏ trên bề
mặt môi trường. Để quan sát ta không được lắc ống nghiệm vì nếu ta lắc thì vòng màu đỏ này sẽ
tan đi không còn quan sát được nữa.
Kết luận: Phát hiện E. coli giả định trong 1g mẫu thịt tươi.
3. Chỉ tiêu định lượng S. aureus
Quy trình:
Cấy 0.1ml dd mẫu ở 10-3 lên bề
mặt 2 đĩa môi trường BPA, trải
đều bằng que tam giác

Ủ ngược đĩa ở 37oC
trong 48 giờ => đếm số
khuẩn lạc đặc trưng

Chuyển 5 khuẩn lạc
đã đếm sang môi
trường TSA


Ủ ở 37oC qua
đêm

Ủ ở 37oC và theo dõi sau 2,4,6,8
giờ. Nếu không có biểu hiện ngưng
kết sẽ ủ đến 24 giờ.

Cấy vào ống chứa
0.3ml huyết tương

Kết quả: Trong môi trường BPA:
Hệ số pha loãng

10-3

Số khuẩn lạc đếm được
Đĩa petri 1

Đĩa petri 2

Đĩa đối chứng

98

42

126

Trong môi trường TSA: Có 3 trong 5 ống mẫu đông tụ và ống đối chứng đông tụ. Cả 4 ống đều
đông tụ sau 4 giờ ủ và đều bị tan sau đó. Sau khi ủ được 24 giờ thì vẫn không có ông nào đông tụ
trở lại.
 Tỷ lệ xác nhận R: R = số ống huyết tương đông tụ/số khuẩn lạc đã cấy = 3/5 = 0.6
 Tổng số S. aureus (cfu/g): C = (N/nVf)xR = (42+98)x0.6/(2x1x10-3) = 4.2x104 (cfu/g)

Staphylococcus Aureus là vi khuẩn gram (+), sống hiếu khí tùy nghi, cho phản ứng catalase,
coagulase dương tính, có khả năng lên men tạo acid từ mannitol và có khả năng tạo độc tố
enterotoxin bền nhiệt. Đầu tiên, ta cấy mẫu lên môi trường BPA. BPA là môi trường chọn lọc để
phát hiện và đếm số S. aureus. Khuẩn lạc đặc trưng là khuẩn lạc tròn, lồi, đen bóng, có quầng
sáng và quầng trong bao quanh, đôi khi chỉ có 1 trong 2 quầng trên. Màu đen của khuẩn lạc là do
tellurite (egg yolk tellurite) tạo nên. Trong BPA có LiCl giúp ức chế các quần thể vi khuẩn
thường hiện diện cùng với S. aureus. Natri pyruvate và L-lysine kích thích sự tăng trưởng của S.
aureus. Nấm men cung cấp phức hệ vitamin B kích thích tăng trưởng. Vì vậy sẽ giúp cho tỉ lệ S.
aureus trong mẫu tăng lên. Sau đó, chọn ra 5 khuẩn lạc đặc trưng rồi đem cấy vào môi trường
TSA (trypton soya agar). TSA là môi trường giàu dinh dưỡng, giúp tăng sinh không chọn lọc.
Trong TSA có trypton và soya pepton là nguồn cung cấp đạm, vitamin và cacbon giúp cho vi
sinh vật tăng sinh trở lại một cách tối ưu. Sau khi đã chọn lọc trong môi trường BPA, S. aureus
cần được tăng sinh, phát triển trở lại để có thể thể hiện đầy đủ đặc tính khi ta cho cấy chuyển vào
huyết tương. S. aureus có cho hiện tượng đông tụ huyết tương nên ta cấy chuyển mẫu vào ống
huyết tương để kiểm tra mẫu. Trong S. aureus có enzyme Coagulase sẽ tác động vào làm hoạt
hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen. Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm và một
enzyme vách vi khuẩn giúp S. aureus tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó. Làm hình thành nên


các cục đông tụ huyết tương. Nhưng trong S. aureus có enzyme protease, nên khối fibrin có thể
bị cắt bởi protease làm tan cục huyết tương. Vì vậy, chúng ta cần quan sát thường xuyên (2,4,6,
…,24 giờ) để quan sát kĩ nhất sự đông tụ huyết tương.
Kết luận: Tổng số S. aureus/g trong mẫu là 4.2x104 (cfu/g)
4. Chỉ tiêu định tính Salmonella
Quy trình:
Cân 25g mẫu +
225g BPW, đồng
nhất
Cấy phân lập

sang môi
trường XLD

Ủ ở 37oC trong
16-24 giờ

Ủ ở 37oC
trong 24 giờ

Cấy vào các môi trường thử nghiệm
sinh hóa: KIA, Manitol Phenol Red
broth, Urea broth, LDC, canh trypton

Kết quả:

Chuyển 0.1ml canh khuẩn
sang ống nghiệm chứa 10ml
môi trường RV
Chọn khuẩn lạc đặc trưng
cấy sang ống nghiệm chứa
5ml môi trường BHI

Ủ ở 37oC trong 24 giờ

Ủ ở 42oC trong 24
giờ

Ủ ở 37oC trong khoảng
4-6 giờ

Giai đoạn

Môi trường

Mẫu

Đối chứng

1. Tiền tăng sinh

BPW

Đục

Đục

2. Tăng sinh chọn lọc

RV

Đục

Đục

3. Phân lập

XLD

Khuẩn lạc trong suốt, có

tâm đen/không tâm

Khuẩn lạc trong suốt, có
tâm đen/không tâm

4. Hồi phục tổn thương BHI

Không thấy rõ sự đục

Không thấy rõ sự đục

5. Khẳng định

Nghiêng: hơi đỏ

Nghiêng: Đỏ

KIA

Sâu: hơi vàng, có tủa đen Sâu: Vàng, có tủa đen và
và có sinh khí (nứt thạch) có sinh khí (nứt thạch)
Manitol Phenol
Red Broth

(+), có màu vàng

(+), có màu vàng

Urea Broth

(-), không đổi màu

(-), không đổi màu

Lysine
Decarboxylase
Broth

(+), có vòng tím trên bề
mặt, đục

(+), tím, đục

Canh Trypton

(-)

(-)

-

Đầu tiên, cân mẫu và đem đi đồng nhất mẫu với BPW vì đây là môi trường tăng sinh
không chọn lọc. Trong BPW có pepton là nguồn nitơ, cacbon, vitamin và khoáng vật,….
Giúp cho vi sinh vật tăng trưởng trở lại một cách mạnh mẽ cũng như phục hồi các tế bào
bị tổn thương trong quá trình bảo quản. Cần có giai đoạn tiền tăng sinh như vậy vì sang
giai đoạn tăng sinh, ta sẽ chuyển canh khuẩn vào môi trường RV (Rapparport Vasiliadis
broth). Đây là môi trường chọn lọc cực mạnh, giúp ức chế các vi sinh vật khác, chọn lọc
Salmonella. Nhưng vì đây là môi trường chọn lọc cực mạnh nên nếu chúng ta không có
giai đoạn tiền tăng sinh để chúng khỏe mạnh thì có thể ngay cả Salmonella cũng bị ức
chế (các tế bào Salmonella yếu, bị tổn thương…). Trong môi trường RV có Malachite

green oxalate (chất ức chế mạnh) giúp ức chế các vi sinh khác không phải Salmonella.
MgCl2 tăng áp lực thẩm thấu trong môi trường. Độ pH thấp của môi trường RV kết hợp
với MgCl2 và Malachite green oxalate cũng làm tăng tính đề kháng của Salmonella.
Ngoài ra, Trong RV còn có Trypton là nguồn dinh dưỡng kết hợp của nhiều dưỡng chất,
giúp tăng sinh Salmonella. Vì vậy, sau giai đoạn tăng sinh này thì mật độ Salmonella
trong mẫu sẽ cao hơn so với các vi sinh vật khác. Cấy lập sang môi trường XLD để phân


lập và biệt hóa Salmonella, tách biệt Salmonella ra khỏi các vi sinh vật khác. Khuẩn lạc
đặc trưng có dạng: khuẩn lạc trong suốt, có tâm đen hoặc không có tâm đen. Khuẩn lạc
có tâm đen là vì trong XLD có Ferric ammonium citrate và sodium thiosulfate. H 2S kết
hợp với Fe2+ tạo ra tủa FeS có màu đen. Trong XLD có 3 nguồn đường là xylose, lactose
và sucrose, nhưng Salmonella chỉ sử dụng đường xylose (đường đơn) mà không sử dụng
đường lactose và sucrose (2 đường đôi). Chính vì Salmonella không sử dụng 2 loại
đường này nên đã tạo ra khuẩn lạc trong suốt. Ngoài ra, lượng đường xylose trong XLD
là rất ít nên khi Salmonella sử dụng hết thì nó sẽ chuyển sang sử dụng L-lysine có trong
XLD. Môi trường XLD ban đầu có màu cam vàng, Salmonella chỉ sử dụng đường xylose
làm sinh acid nên môi trường có màu vàng. Nhưng sau khi hết xylose nó chuyển sang sử
dụng L-lysine làm kiềm hóa môi trường, nên môi trường sẽ có màu hồng. Vì vậy, khi
quan sát khuẩn lạc ta sẽ thấy khuẩn lạc trong suốt, có tâm đen và xung quanh khu vực
khuẩn lạc, môi trường sẽ có màu hồng. Môi trường BHI là môi trường tăng sinh không
chọn lọc, giúp cho vi khuẩn khỏe lại để thể hiện đầy đủ đặc tính của Salmonella, để tiến
hành các thử nghiệm sinh hóa giúp khẳng định xem có Salmonella trong mẫu hay không.
Môi trường KIA là môi trường thạch nghiêng để thử nghiệm khả năng lên men glucose,
khả năng sinh khí và sinh H2S của Salmonella. Phần nghiêng là bề mặt hiếu khí, vi khuẩn
sử dụng glucose để hô hấp và sinh CO 2, trong quá trình đó sẽ sinh ra acid làm cho môi
trường có màu vàng, nhưng khi glucose hết thì vi khuẩn dùng nguồn lactose, sau đó là
peptone làm sinh NH3, làm kiềm hóa môi trường, nên môi trường chuyển sang màu đỏ.
Phần thạch sâu có màu đen là do tủa FeS , H 2S do Salmonella sinh ra từ Soldium
thiosulfate phản ứng với Ammonium ferrous (II) citrate. Màu và là do vi khuẩn sử dụng

glucose làm lên men sinh acid tạo ra màu vàng. Môi trường Mannitol phenol red broth để
thử nghiệm khả năng lên man đường mannitol của Salmonella. Salmonella sử dụng
nguồn carbohydrat này làm sinh ra acid nên môi trường có màu vàng. Môi trường LDC là
môi trường dùng để thử khả năng sinh enzyme Lysine Decarboxylase của Salmonella.
Khi vi khuẩn sử dụng dextrose (có trong môi trường) làm sinh acid, pH giảm, màu từ tím
chuyển sang vàng. Nhưng sau đó, khi hết dextrose, sẽ sử dụng pepton, sinh ra NH 3, kiềm
hóa môi trường, nên môi trường lại chuyển sang màu tím. Vì vậy, vòng màu tím trên bề
mặt ống nghiệm cho thấy đang bắt đầu bước vào giai đoạn kiềm hóa. Còn ống nghiệm có
màu tím thì đã kiềm hóa hoàn toàn. Salmonella không có khả năng sinh indol, cũng
không có khả năng thủy phân urea sinh NH 3 nên cho phản ứng với Urea broth và phản
ứng indol âm (-) tính.
Kết luận: Có phát hiện Salmonella trên 25g thịt tươi.
IV.
Kết luận chung:
Mẫu thịt tươi nhiễm cả 4 chủng vi sinh vật: Coliforms, E. coli giả định, Staphylococcus
Aureus và Salmonella.