Luận văn một số đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV

Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

MỞ ĐẦU
Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân
chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy hiểm nhất hiện nay. Theo các tài liệu đã công bố,
có ít nhất hai type HIV gây nên AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là
nguyên nhân chính gây ra AIDS trên toàn thế giới.
Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3 triệu người
đang sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người đã chết vì AIDS và có thêm 2,6 triệu trường
hợp mới bị nhiễm virus này. Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục phòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính
đến 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện người nhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phường, gần 97,9%
quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố. Tổng số trường hợp nhiễm HIV là 235.535 người, số bệnh
nhân AIDS là 94.613 người, số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo là 49.912 người.
Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu. Enzyme này cắt các
chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và
chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Vì thế protease được xem là một trong các đích tác
động quan trọng nhất cho liệu pháp tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS. Tuy nhiên, do HIV sao chép
nhanh, enzyme phiên mã ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo ra sự biến đổi liên tục trong cấu trúc hệ
gen của các nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Mặc dù ngày càng nhiều chất ức chế
protease chống HIV được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm các chất ức chế mới của
protease vẫn luôn được quan tâm.
Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc riêng biệt, do
đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn thành
công (Hoffmann và tập thể, 2007)§. Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thường theo hướng phát hiện
đột biến trong gen mã hóa protease HIV có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ
điều trị HIV/AIDS.
Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc là vấn đề còn ít được
nghiên cứu. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người

Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào về
biểu hiện gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc phân lập từ các bệnh nhân người
Việt Nam.
Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được đặt ra là nhằm phát hiện một số đột biến kháng
thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV, đồng thời bước đầu biểu hiện gen này trong vi

Lớp Cao học K18
2011

1

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

khuẩn E. coli để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

Các nghiên cứu của luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội.

Lớp Cao học K18
2011

2

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về HIV
1.1.1. HIV/AIDS
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS, do virus HIV gây ra
sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đến nay đã
trở thành “căn bệnh thế kỷ” trên toàn thế giới.
Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ
Retroviridae với hai type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2),
trong đó HIV-1 gây ra 98% sự lan truyền còn HIV-2 chỉ chiếm ưu thế ở vùng tây
châu Phi, ít lan truyền trên thế giới [1, 15]. Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyên
nhân chính gây nên AIDS.
HIV-1 được chia thành 3 nhóm là M (main), O (outlier), nhóm N (new) trong
đó hơn 90% sự lây nhiễm của HIV thuộc nhóm M. Trong nhóm M gồm các phân
nhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating
recombinant form-CRF). Các phân nhóm khác nhau chủ yếu ở cấu trúc của các
protein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm theo khu vực địa lý. Đây là một đặc
điểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị cho các bệnh nhân
HIV/AIDS theo từng khu vực [14].
Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô
tả ở hình 1. Lớp vỏ ngoài cùng của virus HIV bao gồm một lớp màng lipid kép có
nguồn gốc từ tế bào chủ, trên lớp vỏ này có chứa khoảng 72 bản sao protein env của
virus, mỗi protein env lại chứa một mũ được tạo thành từ 3 phân tử gp120 còn thân

được tạo thành từ 3 phân tử gp41 có chức năng neo giữ lõi virus với vỏ bao ngoài.
Lõi virus có dạng như hạt đậu tạo thành từ 2.000 bản sao của protein p24. Trong lõi
bao gồm hệ gen của HIV là hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có kích thước khoảng 10
kb gồm 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau. Cuối mỗi chuỗi RNA là các trình
tự được gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài (LTRs) đóng vai trò trong việc kiểm soát
sự nhân lên cũng như điều hòa quá trình tổng hợp protein của virus. Giống như các
retrovirus khác, HIV có 3 gen chính gag, pol và env mã hóa cho các protein tham

Lớp Cao học K18
2011

3

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

gia vào quá trình sao chép và trưởng thành của virus. Sản phẩm ban đầu của gen
gag là một protein 56 kDa, sau đó được chế biến thành ít nhất 3 sản phẩm p17, p24
và p15 là các protein cấu trúc của virus. Gen pol mã hóa cho các enzyme reverse
transcriptase (RT), intergrase và protease trong đó enzyme RT có chức năng phiên
mã ngược RNA của virus thành cDNA; enzyme intergrase chèn cDNA vào nhiễm
sắc thể của tế bào chủ còn protease tham gia vào quá trình cắt các phân tử protein
tiền thân dưới dạng polypeptide thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự
hình thành của thể virus. Gen env mã hóa cho các glycoprotein capsid của virus; sản
phẩm của gen env (gp160) được cắt bởi protease của tế bào chủ thành gp120 và

gp41 sau đó lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân trong lớp vỏ virus. Ngoài 3 gen
chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa
cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm khác nhau
hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [5, 17, 22].

Hình 1: Cấu tạo của HIV [40]

Lớp Cao học K18
2011

4

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

HIV truyền nhiễm theo 4 con đường, bao gồm con đường tiêm truyền do
dùng chung kim tiêm, lây nhiễm do truyền máu và các sản phẩm của máu, từ mẹ bị
nhiễm bệnh sang thai nhi và qua quan hệ tình dục không an toàn [1, 15].
Quá trình tiến triển của bệnh được chia thành 3 thời kì. Sự lây nhiễm HIV
ban đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thường kéo dài từ 3-6 tuần, sau đó virus đi
khắp cơ thể, nhân bản mạnh trong khi không có bất cứ đáp ứng miễn dịch thích hợp
nào được phát hiện [1, 7, 15]. Người bệnh sốt nhẹ, có triệu chứng như cảm cúm,
hạch lympho sưng to, cũng có khi không thấy triệu chứng gì. Tiếp theo là giai đoạn
tiềm ẩn kéo dài từ 1 đến 12 năm (tùy theo từng người nhiễm). Trong giai đoạn này,
quá trình sao chép của virus giảm và số lượng tế bào lympho T CD4+ tăng lên, virus

HIV có thể được phát hiện bằng PCR hoặc RT-PCR trong các lympho của máu và
trong các mô bạch huyết [1]. Khoảng vài năm sau, mật độ các virus trong máu tăng
nhanh và giữ ở mức đó cho tới lúc chết, các kháng thể kháng virus giảm dần. Giai đoạn
này gọi là giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối. Lúc này hội chứng lâm sàng của bệnh
suy giảm miễn dịch xuất hiện, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công, người bệnh
chết dần [7, 16, 28].
Chính những đặc trưng phân tử trong cách tấn công hệ thống miễn dịch
của HIV mà AIDS trở thành một trong những bệnh nguy hiểm nhất trong lịch
sử loài người.
1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS
Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình
phát triển xã hội. Sau gần 3 thập kỷ phát hiện, bắt đầu ở các nước phát triển, HIV/
AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt phát triển ở khu vực châu Phi và các nước
châu Á. Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV và thuốc chữa trị đặc hiệu.
Theo thông báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) và Chương trình phối hợp
phòng chống AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS) đến cuối năm 2009 ước tính
khoảng 33,3 triệu người đang mang căn bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng mới
là 2,6 triệu người và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS. Tại khu vực
châu Á, có khoảng 4,87 triệu người đang sống cùng với HIV/AIDS ở các khu vực

Lớp Cao học K18
2011

5

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Đông Nam và Nam Á; tình hình phát triển của bệnh này ngày càng tăng với những
diễn biến phức tạp. Theo dự đoán, khu vực này sẽ trở thành trung tâm của đại dịch
HIV/AIDS trong vài thập kỉ tới [37].
Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nước có
180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng
số người chết vì AIDS được báo cáo là 48.368. Cho đến nay, đã có trên 74% xã,
phường và 97,8% quận, huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS.
Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất
với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước. Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy,
trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có
49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và
10% không rõ đường lây. Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chiếm 70,8% và nữ giới chiếm
29,2%. Phần lớn người nhiễm HIV được phát hiện trong 9 tháng qua ở tuổi từ 20-39
(chiếm 82%), trẻ em dưới 15 tuổi chiếm gần 3%. Theo đánh giá chung, tình hình
nhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm nhưng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn
tập trung – xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt trong
nhóm tiêm chích ma túy và nhóm người mại dâm.
Do những hậu quả to lớn của đại dịch HIV/AIDS đối với sự phát triển xã hội
trên phạm vi toàn cầu, việc tìm ra vaccine phòng ngừa hiệu quả và thuốc đặc trị cho
căn bệnh này là vấn đề cấp thiết đối với các nhà khoa học y học và sinh học phân tử.
1.1.3. Phương pháp điều trị HIV/AIDS
Cách điều trị HIV/AIDS phổ biến nhất là dùng thuốc chống virus, đây là
thuốc có tác dụng ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khác
nhau trong vòng đời của virus. Hiện tại có một số nhóm chất chống HIV đang được
sử dụng dựa trên cơ chế tương đồng về cấu trúc dẫn đến cạnh tranh hoạt động.
Chúng được chia thành 5 nhóm chính gồm: các chất có bản chất nucleoside (NRTI)
ức chế enzyme phiên mã ngược RT, các chất ức chế protease (PI), các chất ức chế

enzyme phiên mã ngược không phải loại nucleoside (NNRTI), các chất ức chế

Lớp Cao học K18
2011

6

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

enzyme phiên mã ngược dạng nucleotide (NTRTI) và các chất ức chế hòa nhập
không cho virus nhân bản. HIV/AIDS còn có thể được điều trị bằng các thuốc điều
hòa miễn dịch như alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine với tác dụng tăng
cường khả năng bảo vệ hệ miễn dịch. Ngoài ra, bệnh nhân HIV/AIDS còn có thể
được điều trị với một số thuốc phòng ngừa các bệnh cơ hội [15].
Tuy nhiên, do HIV có tỷ lệ đột biến cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc và
việc sử dụng thuốc điều trị trong thời gian dài dẫn đến các tác dụng phụ. Chính vì
vậy, hướng nghiên cứu tìm ra các loại thuốc chống HIV/AIDS mới cũng như liệu
pháp điều trị bằng cách kết hợp các loại thuốc khác nhau đã và đang là vấn đề cấp
bách hiện nay.
1.2. Protease của HIV-1 (gọi tắt là protease HIV-1)
Protease HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của
virus. Protease cần thiết để phân cắt các tiền chất polyprotein virus gag và gag-pol
thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của virus
[39]. Các nghiên cứu cho thấy, khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến

trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không có khả
năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19]. Với vai trò đặc biệt quan trọng như trên,
protease HIV-1 là một trong các đích nghiên cứu nhằm tìm ra loại thuốc ngăn chặn
sự nhân lên của HIV.
1.2.1. Gen mã hóa protease HIV- 1
Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+)
đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau.
Trên mỗi sợi RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩa “groupantigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là “envelope” (vỏ). Các
gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã
hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có
6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007)§.
Do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được tạo ra mỗi

Lớp Cao học K18
2011

7

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình trạng
kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chưa dùng thuốc. Nghiên

cứu trên các bệnh nhân nhiễm chủng CRF01_AE thất bại trong điều trị HAART ở

Nonthaburi, Thailand được đăng ký trên GenBank với số hiệu từ FJ463512FJ463596, phát hiện các đột biến phụ (minor) kháng thuốc PI là M36I và H69K ở
hầu hết các bệnh nhân, I13V, E35D và L89M ở hơn 84% các bệnh nhân được điều
trị ATV, ATV/r, IDV/r, NFV, TPV/r.
Các nghiên cứu về gen mã hóa protease HIV-1 ở Việt Nam chủ yếu tập trung
vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến
liên quan đến tính kháng thuốc. Năm 2003, Nguyễn Hoàng Lan và tập thể [21] đã tiến
hành đọc trình tự các gen mã hóa RT, protease và env trên các bệnh nhân nhiễm HIV-1
ở miền Nam, chủ yếu là ở thành phố Hồ Chí Minh. 198 trong số 200 bệnh nhân nghiên
cứu thuộc phân nhóm CRF01_AE. Nghiên cứu cũng xác định được 6,5% đột biến
kháng thuốc chính khi sử dụng HAART đối với 200 bệnh nhân này. Ishizaki và tập thể
[15] cũng tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease và RT trên đối tượng các bệnh
nhân nhiễm HIV-1 ở Hải Phòng. Phân tích hình thái di truyền của hơn 1.000 bệnh nhân
cũng cho thấy phân nhóm HIV-1 gây bệnh của yếu là CRF01_AE (chiếm 98,3%).
Phân tích đột biến kháng thuốc trên 294 bệnh nhân đã chỉ ra có 0,3% đột biến liên quan
đến kháng thuốc ức chế protease tại vị trí M46I.
Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến kháng PI rất rộng có thể
do sự đa hình xảy ra ở 49 gốc axit amin trong tổng số 99 axit amin của protease.
Mặc dù có sự kháng chéo từ mức độ vừa đến mức độ cao giữa các PI, các đột biến
chính là tương đối đặc hiệu cho từng thuốc riêng biệt. Phần lớn các dữ liệu về đột
biến chính phát sinh từ các bệnh nhân điều trị PI không tăng cường (PI thế hệ thứ
nhất). Đột biến chính rất hiếm gặp ở các phác đồ điều trị bằng PI tăng cường
(Hoffmann và tập thể, 2007)§. Khi điều trị saquinavir không tăng cường chủ yếu xảy ra đột biến

G48V và làm giảm độ nhạy với saquinavir 10 lần; nếu kèm thêm đột biến L90M,
mức độ nhạy cảm với saquinavir giảm rõ hơn trên 100 lần (Jacobsen và tập thể,
1995). Trong khi đó, phải cần ít nhất 4 trong số các đột biến L10I/R/V, G48V,
I54V/L, A71V/T, V77A, V82A, I84V và L90M mới có thể làm giảm hiệu lực của

Lớp Cao học K18
2011

8

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

saquinavir tăng cường (Valer và tập thể, 2002).
1.2.2. Cấu trúc của protease HIV-1
Có nhiều cách phân loại protease, dựa vào vị trí cắt trên chuỗi polypeptide,
protease được chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase.
Exopeptidase cắt liên kết peptide ở gần đầu N hoặc đầu C của cơ chất, trong khi đó
endopeptidase cắt liên kết peptide nội chuỗi. Dựa vào cấu trúc của “nhóm chức” có
mặt trong trung tâm hoạt động, protease lại được chia thành bốn nhóm chính:
protease serine, protease aspartyl, protease cysteine/thiol và protease chứa kim loại
(metallo protease), tiếp đó protease lại tiếp tục được phân chia thành nhiều họ khác
nhau dựa vào trình tự axit amin [34]. Theo cách phân loại này, protease HIV-1 là
một protease aspartyl hay protease axit.
Navia và tập thể tại phòng thí nghiệm Mecrk [27] là nhóm đầu tiên tạo được
cấu trúc tinh thể của protease HIV-1 vào năm 1989, kể từ đó cấu trúc của protease
đã được nghiên cứu rộng rãi cả về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất cũng như sự liên
kết với các chất ức chế. Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt
nhau được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lượng khoảng
11 kDa gồm 99 axit amin (Hình 2). Sự tương tác giữa chúng tạo thành cấu trúc
không gian với 3 miền (domain) chính quyết định chức năng và các tính chất khác
của protease HIV-1 [39]. Đầu tiên là miền kết thúc (terminal domain) gồm phiến

gấp nếp β được tạo thành từ 4 đầu cuối của cả 2 tiểu phần (axit amin 1-4 và 90-95
của mỗi tiểu phần), vòng quay tạo thành từ các axit amin 4-9 và vòng xoắn α (các
axit amin 86-94 của mỗi tiểu phần). Miền này khá quan trọng trong việc hình thành
và ổn định dạng dimer của một protease có hoạt tính. Tiếp theo là 2 miền lõi (core
domain) với sự tham gia của các axit amin từ 10-32 và 63-85 của mỗi tiểu phần.
Trung tâm hoạt động của enzyme với một trình tự bảo thủ cao Asp25-Thr26-Gly27
được tạo thành ở mặt phân giới của các miền lõi từ cả 2 tiểu phần. Miền lõi có tính
quyết định đối với sự ổn định của dimer cũng như hoạt tính xúc tác của protease.
Miền cuối cùng còn được gọi là “mũ” (flap domain) gồm một vòng được tiếp xúc

Lớp Cao học K18
2011

9

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

phần lớn với dung môi (gốc 33-43) trước một cấu trúc cặp tóc có chứa mũ (các axit
amin 44-63). Các chất ức chế hoặc cơ chất liên kết giữa hai tiểu phần bằng liên kết
hydro và tương tác Van der Waals với vị trí hoạt động gồm hai bộ ba đặc trưng và
hai mũ linh hoạt. Các mũ gấp xuống cơ chất hoặc các chất ức chế và hoạt động
trong suốt quá trình xúc tác cùng với việc liên kết cơ chất cũng như loại trừ phân tử
nước từ vị trí hoạt động. Có một phân tử nước được giữ lại hình thành nên cầu nối
giữa chất ức chế và nhóm –NH- của Ile 50/50’ –NH- ở các mũ. Phân tử nước này

rất thiết yếu cho sự thủy phân của protease và có thể bị thay thế bởi một nhóm
cacbonyl có trong một chất ức chế thích hợp nào đó. Các nghiên cứu cũng đã chứng
minh rằng các mũ của protease thực sự mềm dẻo và tính chất mềm dẻo này có thể
quan trọng đối với hoạt tính của enzyme. Nếu đột biến xuất hiện ở vị trí mũ có thể
làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme [11, 39].

Lớp Cao học K18
2011

10

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Hình 2: Cấu trúc không gian của protease HIV-1 [39]

1.2.3. Chức năng của protease HIV-1
Protease là enzyme không thể thiếu có vai trò quan trọng trong quá trình tái
bản của HIV-1. Nó cắt phân tử polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cấu
trúc, có chức năng cần thiết cho virus trưởng thành. Cụ thể, protease HIV-1 nhận
biết 9 trình tự peptide khác nhau trên polypeptide gag để tạo ra các protein cấu trúc:
matrix, capsid, nucleocapsid cùng với các protein có khối lượng phân tử bé p2, p1
và p6 có vai trò trong quá trình lắp ráp và xác định hình thái của lớp vỏ trưởng
thành; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành 3 enzyme: protease, RT và
intergrase cần thiết cho quá trình sao chép của virus HIV và thủy phân polypeptide

env thành các protein vỏ gp120 và gp41 của HIV-1 [4, 39] (Hình 3).

Lớp Cao học K18
2011

11

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Mặc dù, các tế bào ở động vật có vú cũng có protease aspartyl và các
protease khác nhưng chúng không có khả năng phân cắt các polyprotein gag, gagpol như protease của HIV-1. Ngoài ra, protease HIV-1 không những cắt các
polyprotein của chính nó mà còn thủy phân rất nhiều protein của vật chủ như actin,
Bcl2, procaspase 8 [29]. Đây chính là cơ sở để tạo ra các cơ chất đặc hiệu của
protease HIV-1 [4].

Hình 3: Sơ đồ phân cắt polyprotein gag và gag-pol của HIV-1 để hình thành
các protein chức năng [39]

Hoạt tính của protease HIV-1 bị ức chế bởi pepstatin A [21] giống như các
protease aspartyl khác. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen
mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không đóng gói phù hợp
để tạo thành thể virus trưởng thành, nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào
tế bào vật chủ. Ngoài ra, protease HIV-1 còn đóng vai trò trong quá trình phát sinh
bệnh. Khi chuyển vào tế bào người hoặc virus, protease HIV-1 gây độc và cắt nhiều

protein của vật chủ như actin, Bcl2 và procaspase 8. Các nghiên cứu cũng khẳng
định, sử dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tượng chết theo

Lớp Cao học K18
2011

12

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

chương trình do protease HIV-1 gây nên [34].
1.2.4. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp
Do vai trò quan trọng của protease HIV-1, việc sản xuất và tinh sạch với
lượng đủ lớn enzyme này là cần thiết cho các nghiên cứu nhằm phát triển các loại
thuốc ức chế protease trong điều trị bệnh HIV/AIDS. Chính vì vậy từ khi HIV được
phát hiện cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV1 bằng cách biểu hiện trên vi khuẩn E. coli hoặc trên nấm men Saccharomyces
cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp hóa học monomer 99 axit amin. Tuy nhiên, quá
trình sản xuất protease HIV-1 gặp nhiều trở ngại trong việc biểu hiện và tinh sạch.
Năm 1989, Darke và tập thể [8] đã sử dụng promoter trp của vector pPRT để
biểu hiện protease HIV-1. Protease sau khi được tinh sạch qua hệ thống cột DEAEsephadex A-25 và phosphocellulose có khối lượng khoảng 11 kDa, bao gồm 99 axit
amin, có hoạt tính phân cắt protein gag p55 thành p24 và p17 cũng như phân cắt cơ
chất tổng hợp. Kết quả nghiên cứu tính chất cũng cho thấy, hoạt tính của protease
tinh sạch bị ức chế bởi pepstatin A và khi gây đột biến thay Asp-25 thành Asn-25,
protease chỉ còn 1% hoạt tính so với dạng protease nguyên bản ban đầu.

Năm 1990, Cheng và tập thể [6] đã sử dụng tế bào E. coli JM105 đồng nhiễm
với phage αCE6 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 với số lượng lớn. Protease
HIV-1 thu được chủ yếu ở dạng thể vùi, sau đó được hòa tan bằng ure 8 M, tinh sạch
qua cột lọc gel ACA54 rồi được hồi tính để thu được dạng hoạt động và thử hoạt tính
với cơ chất tổng hợp. Kết quả, protease HIV-1 được tinh sạch với hiệu suất 20 mg từ
1 lít môi trường nuôi cấy, có khả năng phân giải peptide với hoạt độ 450
nmol/phút/mg protein, một bước tinh sạch qua cột tiếp theo làm tăng hoạt độ lên 800
nmol/phút/mg. Khi so sánh với protease HIV-1 thu được từ các điều kiện không biến
tính cho thấy protease ở dạng biến tính sau đó sẽ được hồi tính hiệu quả.
Năm 1992, Rangwala và tập thể [32] đã biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn
E. coli và thu được protease tái tổ hợp chiếm từ 8 đến 10% protein tổng số của tế
bào bằng cách thay đổi một số thông số như: promoter; sử dụng các codon ưa thích
đối với E. coli; thêm trình tự giàu A+T ở vùng 5’ mã hoá; gen được biểu hiện dưới

Lớp Cao học K18
2011

13

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

dạng protein dung hợp với hai trình tự tự cắt trong tế bào.
Leuthardt và Roesel [23] đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E. coli. Bằng hệ thống biểu hiện
này, protease được gắn thêm 3 gốc Histidine (His) ở đầu cùng N và đầu cuối C để

thuận tiện cho quá trình tinh sạch. Nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 sau
biểu hiện thu được ở phân đoạn kết tủa (pellet) của tế bào vi khuẩn và được hòa tan
hiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6 M. Sau khi tinh sạch bằng hệ thống cột
trao đổi anion và sắc ký ái lực Ni-agarose, protease tái tổ hợp được hồi tính và có
hoạt tính cắt cơ chất gag p55 của HIV-1 và cơ chất tổng hợp đặc hiệu giống như
protease tự nhiên.
Năm 2007, Chen và tập thể [5] đã sử dụng hệ thống biểu hiện bên ngoài tế
bào (E. coli cell-free system) của hãng Roche, Grenzacherstrasse (Thụy Sỹ) để biểu
hiện trực tiếp protease HIV-1 trong điều kiện in vitro. Để nhân bản DNA cho biểu
hiện protein in vitro, hai phản ứng PCR đã được tiến hành. Phản ứng PCR thứ nhất
nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đặc hiệu. Trong phản ứng PCR thứ hai,
C-terminal His-tag và các nhân tố điều hòa cần thiết cho biểu hiện protein ở hệ
thống tế bào nhân sơ dựa trên T7 polymerase (T7 promoter, vị trí liên kết ribosome
của vi khuẩn, T7 terminator, mã mở đầu, mã kết thúc) được bổ sung vào. Sản phẩm
PCR cuối cùng có thể biểu hiện trực tiếp protein không cần bất kỳ bước tinh sạch
nào. Phân tích phân đoạn hòa tan và không tan của hệ thống biểu hiện bằng điện di
protein cho thấy thu nhận được protease mong muốn chủ yếu ở phân đoạn hòa tan.
Khi được biểu hiện ở E. coli, protease HIV-1 có khả năng gây độc giết chết tế
bào [34]. Để hạn chế tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu
hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện và quy trình biểu hiện
khác nhau như sử dụng các promoter trp, λPL, T7, araBAD và tac [8, 18, 35]. Nghiên
cứu biểu hiện protease dưới dạng dung hợp với nhiều protein khác nhau để tăng tính
tan của protease như β-galactosidase, dihydrofolate reductase, β-lactamase, maltose
hoặc gắn với phân tử IgG [10, 24, 35]. Protease được liên kết với IgG bởi liên kết
peptide Asp-Pro, liên kết này không bị cắt bởi protease của virus. Protein dung hợp

Lớp Cao học K18
2011

14

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

có khối lượng phân tử 25,4 kDa vẫn có hoạt tính xúc tác, cắt cơ chất peptide tại đúng
vị trí liên kết Tyr-Pro. Protease nguyên bản có thể được thu lại bằng cách ủ protease
dung hợp với axit formic, cắt liên kết Asp-Pro [10]. Komai và tập thể [18] đã biểu
hiện protease HIV-1 trên hệ thống vector có sử dụng T7 promoter trong tế bào E.
coli chủng BL21 (DE3) với chế phẩm protease có hoạt tính cao gấp mười lần so với
khi sử dụng các vector tương tự. Nghiên cứu của nhóm tác giả cho thấy hệ thống
biểu hiện này cũng phù hợp với việc biểu hiện các protein độc khác trong E. coli.
Nhìn chung, các nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy quá trình
sản xuất enzyme này gặp nhiều khó khăn do: protease gây độc với tế bào chủ;
protein đích được biểu hiện chủ yếu ở dạng không hòa tan (90% ở dạng thể vùi);
hàm lượng thu được rất thấp chỉ có thể phát hiện bằng phương pháp thẩm tách miễn
dịch [19, 23]. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy, bằng việc đồng biểu hiện
với plasmid pLysS, pLysE có thể hạn chế được tính độc và protease HIV-1 khi
được biểu hiện cùng với các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng
tính tan và thuận tiện cho tinh sạch nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính [10, 23-24, 35].
Ở Việt Nam, protease HIV-1 là một trong số những enzyme được nghiên cứu
nhiều nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết
và nghiên cứu một số tính chất trên đối tượng vi sinh vật. Tuy nhiên, protease HIV1 từ các bệnh nhân Việt Nam là vấn đề chưa được nghiên cứu nhiều.
Năm 2010, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2] đã thành công trong biểu
hiện và tinh sạch protease HIV-1 trên hệ thống vector pET32a, ở tế bào E. coli.
Protease HIV-1 biểu hiện có hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp giống trong tế bào chủ.

Xuất phát từ thực tế, ở tế bào E. coli, protease HIV-1 thường chỉ có hoạt tính
khi được biểu hiện ở dạng tự cắt tại liên kết Phe (Tyr)-Pro để giải phóng chuỗi
polypeptide với axit amin mở đầu chuỗi là Pro [8]. Các nghiên cứu cũng cho thấy,
protease HIV-1 khi được biểu hiện cùng các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suất
biểu hiện, tăng độ hòa tan và thuận tiện cho quá trình tinh sạch mà vẫn đảm bảo
được hoạt tính tự cắt [25, 32, 35, 37].

Lớp Cao học K18
2011

15

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh đã bất hoạt virut lấy từ các bệnh nhân đang điều trị
kháng virut tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương.
2.1.2.Các hệ vector và chủng vi sinh vật
Đoạn gen mã hóa protease của HIV được đưa vào vector nhân dòng
pCR2.1 là kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2].
Vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega. Các vector: pET28a,
pET32a và pET43a của hãng Novagen (Mỹ).

Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3) pLysS; E. coli BL21
(DE3) RIL được mua từ hãng Novagen.
2.1.3. Hóa chất
Thang chuẩn protein nhuộm sẵn, hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và
dTTP) của hãng Fermentas. Các oligonucleotide được thiết kế và đặt mua từ hãng
Invitrogen. Kit tinh sạch DNA trên gel điện di của hãng Bioneer và Fermentas. Các
hoá chất giải trình tự do hãng Beckman Coulter cung cấp. Kháng thể đơn dòng
kháng protease HIV-1 được mua từ hãng Gene-Tex. Gel sắc ký ái lực His-bind của
hãng Novagen. Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh
học phân tử.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA
RNA của HIV-1 được tách và tinh sạch từ các mẫu huyết thanh bệnh nhân
nhiễm HIV-1 theo kit QIAamp Ultrasen virus của Qiagen với các dung dịch (đệm) kèm theo với
các ký hiệu là AR, AB, AW1, AW2, AVE. Quy trình thực hiện như sau:

Huyết thanh (400 µl) đã được tách sẵn từ máu tổng số được chuyển sang ống
eppendorf, 400 µl dung dịch đệm phosphate chứa muối (PBS) và 640 µl đệm AC,
0,56 µl dung dịch chất mang RNA (RNA carrier) được bổ sung nhằm tăng khả năng
gắn RNA virus, hỗn hợp được trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Mẫu sau đó

Lớp Cao học K18
2011

16

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Dũng

Nguyễn Văn

được ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi.
Kết tủa được hoà tan trở lại trong 240 µl đệm AR đã được làm nóng tới 60 oC, 16 µl
proteinase K được bổ sung, hỗn hợp được trộn đều trên máy vortex 3-5 lần, mỗi lần
5-10 giây. Tiếp theo, hỗn hợp được ủ tiếp ở 40 oC trong 10 phút và lắc đều cứ sau 5
phút 1 lần. 240 µl đệm AB được bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều bằng máy vortex.
Sau đó, hỗn hợp được đưa vào cột QIAamp Spin và được ly tâm ở 7.000 vòng/phút
trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Có thể lặp lại bước này nhiều hơn 1 lần để RNA gắn
với cột được nhiều nhất. Cột sau đó được chuyển sang ống eppendorf mới và được
rửa 2 lần bằng đệm AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
Cuối cùng, cột được chuyển sang một ống eppendorf mới. 60 µl đệm AVE được bổ
sung, hỗn hợp được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi lại RNA.
Mẫu được bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
2.2.2. Tổng hợp cDNA từ RNA virus
RNA của HIV-1 được chuyển thành cDNA bằng enzyme M-MLV reverse
transcriptase của Hãng Enzynomics.
cDNA được tổng hợp theo quy trình: 10 µl RNA của HIV-1 và 1 µl mồi
ngẫu nhiên (0,2 µg) được biến tính ở 70oC trong 5 phút, làm lạnh trên đá. Hỗn hợp
phản ứng sau đó được bổ sung 2 µl đệm M-MLV reverse transcriptase 10x, 2,5 µl
hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) 2 mM, 3,5 µl H2O, 0,5 µl chất ức
chế ribonuclease và 0,5 µl M-MLV reverse transcriptase, hỗn hợp phản ứng được ủ
ở 37oC trong 90 phút, phản ứng được kết thúc bằng xử lý nhiệt ở 70 oC trong 10 phút
và làm lạnh trên đá. Các mẫu cDNA sau đó được bảo quản ở -20 oC để dùng cho các
thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Tách chiết và định lượng DNA
DNA plassmid được tách chiết theo kit của Hãng Fermentas.
Nguyên lý: Màng tế bào bị dung giải bằng SDS để giải phóng plasmid. Trong

môi trường kiềm, trong khi DNA nhân sẽ bị biến tính và kết tủa khi hỗn hợp được
trung hòa bằng axit thì plasmid do có cấu trúc siêu xoắn nên quá trình biến tính xảy
ra ở mức độ vừa phải và sẽ nhanh chong được hồi tính khi trung hòa, do vậy,

Lớp Cao học K18
2011

17

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

plasmid được tách riêng khỏi DNA nhân. Mặc khác, sự phá vỡ màng tế bào được
điều khiển bằng thời gian tiếp xúc với SDS sao cho màng nhân không bị phá hủy,
sự giải phóng DNA nhân là tối thiểu.
Quy trình: Một khuẩn lạc trên đĩa thạch được cấy vào 1,5 ml môi trường LB
lỏng có chứa kháng sinh phù hợp, được nuôi cấy lắc ở 37 0C, 180 vòng/phút trong 1416 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 2 phút ở 25 0C để thu tế
bào. Sau đó, tủa tế bào được hòa trong 250 µl dung dịch I đã được bổ sung RNase và
ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút, tiếp tục bổ sung 250 µl dung dịch II, lắc đều rồi ủ ở nhiệt
độ phòng trong 5 phút và trung hòa bằng 350 µl dung dịch III, ủ trên đá từ 3-5 phút.
Sau các bước phá màng, giải phóng DNA, hỗn hợp được ly tâm 13.000 vòng/phút
trong 20 phút, thu dịch trong. Dịch này được nạp lên cột (kèm theo kit) và để tĩnh
một phút ở nhiệt độ phòng. Trong giai đoạn này, DNA plasmid có ái lực với gel sẽ
được giữ lại trên cột. Cột được rửa với 500 µl đệm PE 2 lần, ly tâm 13.000 vòng/phút
trong 1 phút để loại dịch rửa. Cột được ly tâm thêm một lần nữa nhằm loại hết EtOH

còn sót lại sau bước rửa. DNA plasmid được đẩy ra khỏi gel bằng 30-50 µl đệm EB.
Độ tinh sạch của DNA plasmid sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.
DNA plasmid sau khi tinh sạch được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ánh
sáng tử ngoại của các axit nucleic ở bước sóng 260 nm (A 260). A260 = 1 tương đương
với hàm lượng DNA là 50 μg/ml và tương đương với hàm lượng RNA là 40 μg/ml.
DNA plasmid được cho là sạch khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên tắc: Các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường trung
tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức
độ di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích
thước của chúng và nồng độ gel.
Quy trình tiến hành: Gel agarose được chuẩn bị trong đệm TAE với
nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Mẫu DNA
được trộn với đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene
cyanol và Ethidium bromide 50 µg/ml sau đó tra vào Đường chạy. Điện di được

Lớp Cao học K18
2011

18

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

tiến hành với điện thế ổn định khoảng 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 25-30

phút. Sau khi kết thúc điện di bản gel được lấy ra soi và chụp ảnh dưới ánh
sáng tử ngoại của máy soi gel Doc (Bio-Rad).
2.2.4. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cặp mồi HIV Fw/Rv được thiết kế để nhân bản đặc hiệu đoạn gen
mã hóa cho protease HIV-1 từ nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể
[2]. Để thuận tiện cho quá trình biểu hiện sau này, có vị trí cắt giới hạn của enzyme
BamHI trên mồi xuôi và enzyme XhoI trên mồi ngược. Ngoài ra, trên mồi xuôi còn
có thêm 21 nucleotide mã cho trình tự tự cắt gồm 7 axit amin, Gly-Thr-Val-SerPhe-Asn-Phe, tương ứng với vị trí cắt đặc hiệu giữa p17 và p24 trên gen gag của
HIV-1. Trình tự cặp mồi như sau (vị trí cắt enzyme giới hạn được thể hiện bằng chữ
có gạch chân; trình tự tự cắt được thể hiện bằng chữ in nghiêng):
•

HIV-Fw: 5’-GGGCGGATCCACTAGT
(BamHI)

GGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGC-3’

• HIV-Rv: 5’ GAGTCCTCGAGAAAATTTAAAGTGCAGCCAATCTG-3’
(XhoI)
PCR được tiến hành với khuôn là vector pCR2.1 mang đoạn gen mã hoá protease HIV-1
(pCR2.1-Prot) [2]. Thành phần của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 1.

Bảng 1. Thành phần của phản ứng PCR

Thành phần

Thể tích (μl)

dd H2O
Đệm Taq DNA polymerase 10X

17
2,5

Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl)

0,5

dNTPs 2 mM

2,5

HIV-Fw 10 pmol

1

HIV-Rw 10 pmol

1

pCR2.1-Prot

Lớp Cao học K18
2011

0,5

19

Khóa 2009-

Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Tổng thể tích

25

94oC-40 giây

Với chu trình nhiệt như sau: 40 chu kỳ

53oC-30 giây
72oC-30 giây

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.
2.2.5. Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1
Sản phẩm PCR được tổng hợp với sự xúc tác của enzyme Taq DNA
polymerase sẽ có đầu adenosine monophosphate (A) do hoạt tính gắn thêm đầu
tận cùng không phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn của enzyme Taq DNA
polymerase. Trong khi đó, vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega được
thiết kế có chứa một gốc thymidine monophosphate (T) ở đầu 3’.
Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T được thể
hiện ở bảng 2.
Bảng 2. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T

STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1
2

Sản phẩm PCR
Đệm T4 DNA ligase 2X

2
5

3

T4 DNA ligase

1

4

Vector pGEM-T

1

5

ddH2O

1

Tổng thể tích

10

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 3 tiếng, sau đó sử dụng cho biến nạp vào
tế bào khả biến E. coli chủng DH5α
Tế bào khả biến E. coli DH5α được lấy ra từ tủ lạnh sâu -80 oC để trên đá 10
phút cho tan dần, sau đó được bổ sung hỗn hợp phản ứng gắn ở trên, trộn nhẹ và để

Lớp Cao học K18
2011

20

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào. Hỗn hợp biến nạp
được làm sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, làm lạnh trên đá 2 phút rồi bổ sung 500 µl
môi trường LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp. Các tế bào sau biến nạp được giữ trong tủ
ấm 37oC trong 10 phút và tiếp đến nuôi lắc ở tốc độ 180 vòng/phút ở 37 oC trong 60
phút. 50-100 µl hỗn hợp biến nạp được cấy trải trên đĩa LB đặc có chứa ampicillin µg
/ml, cơ chất X-gal 20 mg/ml và chất cảm ứng IPTG 0,1 mM và nuôi trong tủ ấm 37oC

qua đêm. Các thể biến nạp được sơ bộ nhân ra bằng màu sắc của khuẩn lạc và được
kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng PCR và xác định trình tự gen.
2.2.6. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phương pháp
Sanger
Plasmid từ các thể biến nạp được tách và tinh sạch bằng kit của Hãng
Fermentas như được mô tả ở mục 2.2.2 và được sử dụng để xác định trình tự đoạn gen
đích.
Nguyên tắc: Xác định trình tự dựa trên phương pháp kết thúc kéo dài chuỗi
nhờ dideoxyribonucleotide của Sanger và tập thể [31]. Các ddNTP do không chứa
nhóm –OH tại vị trí 2’ của gốc đường nên khi được enzyme DNA polymerase gắn
vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể tham gia hình thành liên kết
phosphodiester với nucleotide mới và khiến cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng
lại. Như vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới được đánh dấu ở một
đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các sợi này có độ dài khác biệt nhau
một nucleotide. Các sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện di
acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để
đưa ra trình tự đoạn DNA gốc.
Quy trình tiến hành: Khuôn cho phản ứng PCR được chuẩn bị để xác định
trình tự, sản phẩm PCR đoạn gen mã hoá cho protease HIV-1 được pha loãng ở
nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol).
Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm: 6 µl hỗn hợp DTCS
(Dye terminator cycle sequencing) Master mix, 1 µl khuôn, 1 µl mồi (mồi xuôi
hoặc mồi ngược), H2O vô trùng vừa đủ 20 µl.

Lớp Cao học K18
2011

21

Khóa 2009-

Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ gồm 3 bước: 96 oC trong 30 giây,
56oC trong 30 giây, 60oC trong 4 phút. Sản phẩm của phản ứng PCR này được xử lý
trước khi đưa vào máy đọc trình tự. Quá trình xử lý mẫu gồm các bước sau:
- Dung dịch dừng phản ứng gồm: 20 µl CH3COOK 3 M pH 5,2, 20 µl EDTA
100 mM pH 8, 10 µl glycogen và trộn đều. 5 µl dung dịch dừng phản ứng được bổ
sung vào 1 phản ứng PCR 20 µl và trộn đều.
- Bổ sung vào hỗn hợp 60 µl ethanol 95% giữ ở -20oC. Sau đó, hỗn hợp phản
ứng được ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 0C. Dịch nổi được hút
bỏ và thu kết tủa. Kết tủa được rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 µl ethanol 70% giữ ở
-20oC và được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được hút bỏ cẩn
thận bằng pipet, kết tủa được để khô ở nhiệt độ phòng sau đó được hoà tan trở lại
bằng 40 µl dung dịch SLS (sample loading solution). Mẫu sau khi xử lý được giải
trình tự bằng hệ thống đọc trình tự CEQ-8000 của hãng Beckman Coulter .
2.2.7. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli
Để gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện pET32a, cả
plamid tái tổ hợp pGEM-Prot và vector pET32a đều được cắt bằng hai enzyme
BamHI và XhoI để tạo các đầu dính, thành phần phản ứng cắt được nêu ở bảng 3,
thời gian phản ứng là 3h giờ, ở 37oC.
Bảng 3. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn

Thành phần phản ứng
Khuôn

Vector pET32a
40 µl

Plasmid pGEM-Prot
40 µl

Đệm II 10x

10 µl

10 µl

BSA 10x

10 µl

10 µl

dd H2O

37 µl

37 µl

BamHI (20 đơn vị/µl)

3 µl

3 µl

XhoI (20 đơn vị/µl)

5 µl

5 µl

Sản phẩm cắt enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. Sau khi các
băng DNA đã phân tách, phần gel chứa DNA quan tâm được cắt riêng, chuyển sang
ống eppendorf sạch. Quy trình tinh sạch DNA từ gel agarsore bằng kit thôi gel của

Lớp Cao học K18
2011

22

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Bioneer được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trước tiên, đệm gắn mẫu
(gel binding buffer–GB) chứa NaI được bổ sung vào mẫu, hỗn hợp được ủ ở 60oC
cho tới khi gel tan hoàn toàn (5-10 phút). Trong trường hợp kích thước đoạn DNA
cần tinh sạch nhỏ hơn 200 bp hay lớn hơn 3 kb, hỗn hợp được bổ sung isopropanol
để tăng khả năng thu hồi DNA. Sau khi được trộn đều, hỗn hợp được nạp lên cột
kèm theo kit. Cột được ly tâm trong 1 phút để loại bỏ đệm gắn mẫu, sau đó rửa hai
lần bằng 500 µl đệm rửa (washing buffer-WB) có chứa EtOH, ly tâm trong 1 phút

để loại bỏ dịch rửa. Sau đó, cột được tiếp tục ly tâm trong 1 phút để loại bỏ hoàn
toàn EtOH. DNA gắn trên cột được thu lại bằng cách bổ sung 30 µl dung dịch đệm
rửa chiết (elution buffer–EL) vào cột gel và ly tâm trong 1 phút.
Sau khi thu đã thu được hai sản phẩm gen mã hóa protease HIV-1 và vector
pET32a đã được tinh sạch, phản ứng gắn được thực hiện ở 22 oC trong 3 giờ với
thành phần phản ứng gồm: 7 µl vector pET32a (đã xử lý bằng enzyme giới hạn), 10
µl gen mã hóa protease HIV-1 (đã xử lý bằng enzyme giới hạn), 2 µl đệm T4 DNA
ligase 10x, 1µl T4 DNA ligase. Tổng thể tích phản ứng là 20 µl, hỗn hợp phản ứng
được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3) có RIL và sự có mặt của gen đích
trong các thể biến nạp được xác định bằng PCR.
Tế bào E. coli BL21 (DE3) có RIL mang plasmid pET32a-Prot chứa gen mã
hoá proteasae HIV-1 được nuôi qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút trong môi trường
LB có chứa 50 μg/ml ampicilin và 34 μg/ml chloramphenicol, dịch khởi đầu sau đó
được trẻ hoá trong 150 ml LB lỏng theo tỷ lệ 1:30-1:50. Môi trường chứa tế bào tiếp
tục được nuôi cấy cho tới khi A 600 đạt tới giá trị từ 0,7 đến 0,8; IPTG được bổ sung
đạt nồng độ cuối cùng 0,1 mM để cảm ứng quá trình biểu hiện protein. Sau 3 đến 4
giờ cảm ứng, tế bào được thu bằng ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC và
hoà trở lại trong đệm có bổ sung PMSF 1 mM. Dịch tế bào được làm lạnh trên đá,
siêu âm để phá màng tế bào, giải phóng protein, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20
phút ở 4oC để thu dịch chiết.
2.2.8. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen)
Nguyên tắc: các protein chứa trình tự Histidine (His-tag) có ái lực cao với ion
Ni2+. Do vậy, những protein này có thể được tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên gel His-

Lớp Cao học K18
2011

23

Khóa 2009-

Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

bind (có giá thể được gắn thêm gốc Ni 2+), sau đó protein đích gắn trên cột được thu lại
bằng cách rửa chiết protein ra khỏi gel với Imidazol, là chất có cấu tạo tương tự His.
Tiến hành: Gel His-bind ở dạng trương nở sẵn được nhồi vào cột (kích thước
1x2 cm) để có thể tích cột gel 2 ml. Cột gel được xử lý Ni2+ nồng độ 50 mM để tạo
phức hệ gắn; sau đó được cân bằng với đệm A (Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa
NaCl 100 mM, ure 8 M, và Imidazol 5 mM). Phân đoạn kết tủa tế bào chứa protease
HIV-1 được cho lên cột với tốc độ 10 ml/giờ. Các protein không gắn với gel được
loại bỏ dần bằng cách rửa cột với đệm A có Imidazol 20 mM đến khi OD280 ‹ 0,1.
2.2.9. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phương
pháp của Laemmli [20]
Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 4% và gel tách là 15% với tỷ
lệ thành phần được ghi ở bảng 4.
Bảng 4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide

Thành phần

Gel tách 15%

Gel cô 4%

Dung dịch acrylamide 30%

1,97 ml

0,16 ml

4x Tris HCl/SDS pH 8,8

0,94 ml

4x Tris HCl/SDS pH 6,8

0,31 ml

Nước cất

0,94 ml

0,76 ml

APS 10%

30 µl

20 µl

TEMED

7 µl

5 µl

Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp được trộn đều đúc vào

khuôn kính đã được gắn sẵn trên giá đỡ. Gel tách được đúc trước, bề mặt gel được
phủ một lớp butanol tuyệt đối để mặt gel phẳng. Sau khi phần gel tách được trùng
hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và cài lược để tạo các Đường chạy, để gel
trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di.
Mẫu protein được trộn vào đệm mẫu (nồng độ 4X gồm Tris-HCl, glycerol,

Lớp Cao học K18
2011

24

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

SDS, β-mercaptoethanol, bromophenol blue) theo tỷ lệ thể tích 3:1, xử lý nhiệt ở
950C trong 5 phút, làm lạnh nhanh trên đá và dùng để tra Đường chạy chạy điện di.
Đệm chạy điện di là Tris-Glycine pH 8,8 có chứa SDS 1%, quá trình điện di
được thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu chỉ
thị (bromophenol xanh) chạm mép bản gel thì dừng lại.
Gel được nhuộm bằng dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn hợp methanol:
axit axetic: H2O với tỷ lệ thể tích là 3: 6: 1 trong khoảng 20 phút, màu thuốc nhuộm
được tẩy bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.
2.2.10. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western
blotting)
Nguyên tắc: Dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa protease HIV-1 (kháng nguyên)

và kháng thể đơn dòng kháng protease. Phức hợp protease-kháng thể tiếp tục được nhận
biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phosphatase kiềm, cuối cùng phức hợp
proteasse- kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp được phát hiện bằng cách cho ủ trong
dung dịch cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển
từ không màu thành sản phẩm có màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường.
Các bước tiến hành:


Protein sau khi được tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, được chuyển lên màng
PVDF bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có chứa 10%
methanol. Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng protein được giữ nguyên.



Màng được cố định bằng dung dịch BSA 1% trong đệm Tris-HCl 10 mM, pH
7,4 qua đêm ở 4oC hoặc bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.



Màng được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%
để loại bỏ BSA thừa.



Màng sau đó được ủ với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (kháng
thể sơ cấp), lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC.



Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng được loại bỏ bằng cách

tráng rửa màng 3 lần trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%.
Sau đó màng được ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn phosphatase

Lớp Cao học K18
2011

25

Khóa 2009-