Chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trong hệ thống lúa lai hai dòng - Copy

Báo cáo thực tập giáo trình
A. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây lúa (Oryza Sativa L) là một trong những cây trồng cung cấp nguồn lương
thực quan trọng nhất của loài người, với 40% dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm
thức ăn chính và có ảnh hưởng đến đời sống của ít nhất 65% dân số thế giới.
Ở Việt Nam, việc áp dụng thành tựu về lúa lai đã có kết quả to lớn. Năng suất
lúa lai so với lúa thường tăng từ 20% trở lên và diện tích lúa lai ngày càng tăng.
Trước đây 10 năm, Việt Nam đã xuất khẩu được một lượng lúa gạo lớn đứng thứ
hai trên thế giới (FAO, 2006). Sản xuất lúa lai hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều
công nghệ và giống mới được tạo ra.
Chọn tạo giống lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá”. Bệnh bạc lá lúa(
Xanthomonas oryzae) là một loại bệnh hiện rất đang phổ biến và gây tác hại
nghiêm trọng hầu hết ở các nước, trung bình giảm 6-60% năng suất, tăng tỷ lệ hạt
lép. Ở nước ta bệnh cũng đã gây hại nghiêm trọng và đặc biệt trên các giống lúa
lai. Vì thế một trong những định hướng về phát triển lúa lai ở nước ta là chọn tạo
giống lúa kháng bệnh bạc lá. Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“ Chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trong hệ thống lúa lai hai dòng”
1.2. Mục đích
- Nghiên cứu bệnh bạc lá giúp chúng ta hiểu rõ hơn tác hại của bệnh bạc lá với
cây lúa.
- Nghiên cứu các gen kháng bệnh bạc lá lúa nhằm mục đích chuyển gen kháng
bệnh vào các giống lúa bằng phương pháp truyền thống hoặc có sự hỗ trợ của công
nghệ sinh học.
- Chuyên gen vào các dòng bố, mẹ làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống lúa
trong hệ thống lúa lai hai dòng.
B. NỘI DUNG

1

Báo cáo thực tập giáo trình
I.CƠ SỞ LÝ LUẬN VỀ BỆNH BẠC LÁ LÚA
(Xanthomonas oryzae. Pv.oryzae)
I.1. Giới thiệu về bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá lúa (Bacterial leaf blight of rice) được phát hiện đầu tiên ở
Fukuoka, Nhật Bản vào khoảng năm 1884 – 1885. Sau đó đã có báo cáo xuất hiện
bệnh ở nhiều nước khác nhau, đặc biệt ở Châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc,
Philippin), Bắc Châu Úc, Mỹ Latin; Trung Mỹ và Caribê (1975); Pakistan (1976);
…. Hiện nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới .
Ở nước ta, bệnh này đã gây hại từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, nhưng đặc
biệt từ năm 1965 – 1966 tới nay có năm bệnh phá hại một cách nghiêm trọng ở các
vùng đồng bằng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ xuân và nhất
là trong vụ mùa . Theo số liệu thống kê của cục Bảo vệ thực vật, từ năm 1999-2003
diện tích lúa bị hại do bệnh bạc lá gây ra trong cả nước là 108.691,4 ha (miền Bắc là
86.429,2 ha; miền Nam là 22.262,2 ha), trong đó diện tích bị hại nặng nhất là 156,76
ha và diện tích mất trắng là 80 ha .
I.2. Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa
Năm 1960, Goto đã chỉ ra rằng: vi khuẩn Xanthomonas oryzae. Pv.oryzae
gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa ở nhiệt đới: bạc lá, héo xanh (
Kresek hay Wilt) và vàng nhợt. Những nghiên cứu trong nhà lưới chứng tỏ: hiện
tượng héo và bạc lá khác nhau một cách rõ ràng và độc lập. Héo và bạc lá những
triệu chứng do ảnh hưởng ban đầu của sự nhiễm bệnh, triệu chứng vàng nhợt là
ảnh hưởng sau .
Theo Lê Lương Tề thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hại suốt từ
thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ lúa cây trên ruộng
từ sau đẻ - trỗ, chín sữa.

2

Báo cáo thực tập giáo trình
Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng dễ
nhầm lẫn với các triệu chứng khác. Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở
mút lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc,
lá dễ bị khô .
Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ
theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc
điểm điển hình sau đây:
- Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân
chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá.
- Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái,
vàng lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám.
- Thông thường ranh giới giữa mô bênh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt.,
có giớ hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường
viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng.
Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh. Tuy
nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều hiện
bên ngoài, nhất là ở mạ do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá
sinh lý .

I.3. Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa
I.3.1 Nguồn gốc của bệnh bạc lá lúa

3


Báo cáo thực tập giáo trình
Khi mới xuất hiện ở Nhật Bản, người ta cho rằng bệnh có nguồn gốc sinh lý,
do đất chua gây nên. Đến khi Takaishi (1908) và Boukara (1911) đã tìm thấy vi

khuẩn trong giọt dịch và lây bệnh lại được cho cây thì nguyên nhân gây bệnh đã
được giải đáp .
Vi khuẩn gây bệnh bạc lá đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã từng được
đặt nhiều cái tên khác nhau:
Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama hoặc Phytomanas oryzae Magrou
Xanthomonas campeitris p.v. oryzae
Xanthomonas kresek Schure
Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson
Hiện nay vi khuẩn này được biết đến với cái tên Xanthomonas oryzae.
Pv.oryzae (Ishiyama).
I.3.2. Nguyên nhân gây bệnh
I.3.2.1. Đ ặc điểm vi khuẩn bạc lá
Vi khuẩn hình gậy hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước 12 x 0,5-0,9 µm, sống trên môi trường có khuẩn lạc hình tròn, màu vàng sáp, rìa
nhẵn, vi khuẩn nhuộm gram âm, không có khả năng khử NO3, không có dịch hoá
gelatin, không tạo ra NH3, indol, có khả năng tạo H2S.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng 26 – 30oC, nhiệt độ tối
thiểu 0 – 5oC, tối đa 40oC. Nhiệt độ gây chết là 53oC trong 10 phút, có thể sống
trong phạm vi pH 5,7 – 8,5, thích hợp nhất ở pH 6,8 – 7,2.
Vi khuẩn xâm nhiễm qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá và đặc biệt qua vết
thương xây xát trên lá. Khi đã tiếp xúc với bề mặt có màng nước ướt, vi khuẩn dễ

4


Báo cáo thực tập giáo trình
dàng di động tiến vào bên trong các lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên về
số lượng qua các bó mạch dẫn lan rộng đi.
Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên mặt lá
bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ
mưa gió mà truyền lan tới các lá, các cây khác để tiến hành lây nhiễm lặp lại trong

nhiều đợt sinh trưởng. Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan
hẹp, song nó còn tùy thuộc vào mưa gió, giông bão xảy ra trong vụ mùa mà bệnh
có thể truyền lan với phạn vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn với số lượng
nhiều, đó chính là một nguyên nhân quan trọng làm bệnh sau những đợt mưa gió
vào cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta.
I.3.2.2 Nguyên nhân gây bệnh
Về nguồn bệnh bạc lá, các tác giả Nhật Bản cho rằng nguồn bệnh tồn tại chủ
yếu trên một số cỏ dại họ Hoà thảo, nói cách khác một số cỏ dại là ký chủ phụ của
vi khuẩn X. oryzae.
Ở nước ta phát hiện thấy vi khuẩn hại trên lúa và trên các ký chủ cỏ dại, tàn
dư rơm rạ của cây bệnh, lúa chét, cỏ môi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò,…(Lê Lương
Tề, 1980) .
Mỗi vùng khác nhau thì cũng có sự khác nhau về thành phần và số lượng
chủng X.oryzae: Nhật Bản đã xác định được 5 chủng, Philippine đã xác định được
6 chủng, Indonesia đã xác định được 9 chủng, miền Bắc Việt Nam đã xác định
được 4 chủng với nhiều Isolates .
Về nguyên nhân gây bệnh có thể kể đến một sô nguyên nhân chính sau:
- Một số giống mẫn cảm với bệnh bạc lá như một số giống tạp giao và một số
giống chất lượng.

5


Báo cáo thực tập giáo trình
- Do thời tiết nóng ẩm, mưa to gió lớn xảy ra trong thời kỳ lúa cần quang hợp
cao.
- Do biện pháp canh tác làm đất, cây lúa nhiễm bệnh vàng lá sau lập thu, bón
thêm phân cấp cứu vàng lá, cây lúa ra lớp rễ mới phát triển lá non nên gặp mưa
dông dễ nhiễm bệnh bạc lá.
- Bệnh thường mẫn cảm với lượng đạm dư trong lá, những ruộng bón đạm

nhiều, bón muộn, bón lai rai, bón không cân đối giữ đạm, lân và kaly, những ruộng
trũng hẩu dồn đạm cuối vụ, do biện pháp thâm canh gieo cấy, chăm bón không
đúng kỹ thuật.
I.3.3. Tác hại của bệnh bạc lá:
- Giảm diện tích quang hợp của lá
- Giảm khối lượng 1000 hạt
- Tăng tỷ lệ hạt lép
- Giảm 20- 50% năng suất
I.3.4. Con đường xâm nhập

6


Báo cáo thực tập giáo trình

.
7


Báo cáo thực tập giáo trình
I.4. Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bệnh bạc lá lúa
Theo Viện bảo vệ thực vật thì cải tiến chế độ canh tác như: sử dụng phân
bón hợp lý, đảm bảo thời vụ gieo cấy, chế độ nước tưới hợp lý và sử dụng giống
chống chịu được coi là những biện pháp có hiệu lực phòng chống bệnh này. Trong
đó việc sử dụng giống chống chịu được coi là biện pháp hàng đầu và có hiệu quả
nhất để phòng trừ bệnh bạc lá lúa.
Bạc lá lúa xuất hiện ở tất cả các vùng trồng lúa trên thế giới. Tuy nhiên hình
thức sinh sản đơn giản nhưng vi khuẩn bạc lá vẫn luôn chịu ảnh hưởng của các yếu
tố ngoại cảnh dẫn đến cấu trúc di truyền thay đổi, từ đó tạo ra rất nhiều bệnh cùng
tồn tại trên đồng ruộng. Nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi cấu trúc di truyền của vi

khuẩn là:
- Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật không hợp lý, người nông dân vì thiếu hiểu
biết đã sử dụng một loại thuốc với liều lượng lớn và liên tục trên một ruộng sản
xuất, làm cho vi khuẩn lúc đầu có thể bị tiêu diệt nhưng sau đó chúng trở nên nhờn
thuốc và hình thành nòi mới kháng lại loại thuốc trên.
- Công tác nhập nội giống cây trồng thực hiện hậu kiểm dịch không chặt chẽ
làm cho vi khuẩn tồn tại trên hạt giống di chuyển từ vùng này sang vùng khác, tạo
ra sự đa dạng nòi và gây ra những khó khăn khôn lường.
- Hình thức canh tác đa dạng trồng nhiều giống lúa khác nhau (bao gồm cả
lúa thường và lúa lai) trên một vùng rộng lớn trồng lúa đã tạo ra môi trường ký chủ
phong phú, là điều kiện hình thành nên nhiều nòi vi khuẩn.
Ngoài ra, điều kiện thời tiết thay đổi với những diễn biến phức tạp cũng là
một nguyên nhân gây ra hiện tượng này.
Do vậy, việc chọn giống chống bệnh bạc lá là rất khó.
Những năm 80 của thế kỷ XX, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế đã xác định bản
chất di truyền tính chống bệnh là do gen quy định. Điều này được khẳng định chắc

8


Báo cáo thực tập giáo trình
chắn nhờ vào những nghiên cứu của các nhà khoa học cùng những kỹ thuật hiện
đại.
Tính kháng của cây trồng là khả năng của cây làm giảm sự sinh trưởng và
phát triển của ký sinh sau khi có sự tiếp xúc của ký sinh với ký chủ được khởi phát.
Trong tính kháng của cây trồng có tính kháng dọc (kháng chuyên nòi) do đơn gen
kiểm soát và tính kháng ngang (kháng nhiều nòi) do một hoặc đa gen quyết định.
Giải thích cơ chế kháng, Flor (1956) đã đưa ra thuyết “gen đối gen”: mỗi một gen
quy định tính kháng của ký chủ thì có một gen đặc thù quy định tính gây bệnh của
ký sinh, trước hay sau thì nó cũng thắng gen của ký chủ và cây trồng tiếp tục tiến

hoá. Khi nghiên cứu bệnh bạc lá người ta nhận thấy hiện tượng ban đầu giống biểu
hiện tính kháng rất tốt ở một vùng trồng nhưng sau đó một vài năm thì giống này
lại trở nên nhiễm bệnh - người ta gọi đây là sự phá vỡ tính kháng (breakdown of
resistance) của một giống mà nguyên nhân là sự xuất hiện của chủng vi khuẩn mới
có độc tính cao hơn. Để kiểm soát sự phá vỡ tính kháng, một vài chiến lược chọn
tạo giống đã được đề xuất ví dụ sự đề xuất của Ezuka và Sakaguchi (1978) như
sau:
- Sử dụng giống chứa gen có tính kháng ngang.
- Tổ hợp tính kháng ngang từ tính kháng dọc bằng cách: Sử dụng giống
nhiều dòng (multiline) bao gồm một hỗn hợp các dòng đẳng gen, mỗi dòng có một
gen kháng dọc khác nhau nhưng đồng nhất về thời gian sinh trưởng, hình thái và các
thuộc tính khác; sử dụng luân chuyển các giống có các gen kháng dọc khác nhau. Sự
luân chuyển có thể diễn ra theo không gian hay theo thời gian; tập hợp một lượng đủ
lớn các gen kháng dọc trong một giống đơn . Thực hiện chiến lược này, nhà chọn
giống cần có thông tin chính xác về nguồn bệnh cũng như thông tin về sự di truyền
tính kháng của vật liệu tạo giống.

9


Báo cáo thực tập giáo trình
I.5. Chuyển gen kháng bệnh bạc lá
I.5.1. Nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá
Cho đến tháng 6/2005 các nhà khoa học đã tìm ra 30 gen kháng bệnh bạc lá.
Các gen kháng được ký hiệu Xa1, Xa2, … Tính kháng bệnh có thể được quy định
bởi một gen đơn trội: Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, ...; một gen đơn lặn xa5, xa8, xa13,
xa26, xa28, …; hoặc do hai gen kết hợp với nhau như Xa1/Xa4, Xa4/Xa7, ...
Hiện nay trong nghiên cứu đã sử dụng tới 10 dòng đẳng gen (dòng chỉ thị)
là: IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB10, IRBB11, IRBB14,
IRBB21 chứa lần lượt các gen đơn chống bệnh Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7,

Xa1, Xa11, Xa14, Xa21 [12].Các gen kháng nằm trên các nhiễm sắc thể (NST)
khác nhau: gen Xa1, Xa2, Xa12 nằm trên NST số 4, gen lặn xa5 nằm trên NST số
5, gen Xa7 nằm trên NST số 6, gen Xa15 nằm trên NST số 8, gen Xa9 nằm trên
NST số 10 và các gen Xa10, Xa21,Xa23, Xa3, Xa4 nằm trên NST số 11
R-gene

Donor

Chrom

R-gene

Donor

Chro
m

Xa1

Kogyoku

4

Xa16

Te-tep

-

Xa2

Tetep

4

Xa17

Asominori

-

11

Xa18

IR24, Toynishiki

-

Xa3

Wase
Aikoku

Xa4

TKM6

11

xa19

XM5

-

Xa5

DZ192

5

xa20

XM6

-

Xa7

DV85

6

Xa21

O. longistaminata

11

Xa8

PI231129

7

Xa22(t)

Zhachanglong

-

Xa10

CAS 209

11

Xa23

Oryza rufipogon

-

Xa11

IR8

-

xa24(t)

DV86

-

Xa12

Kogyoku

4

xa25

Nep Bha Bong To

-

Xa13

BJ1

8

Xa26

Arai Raj

-

Xa14

TN1

-

xa27

Lota Sail

-

Xa15

XM41

-

Xa?

Oryza minuta

-

10


Báo cáo thực tập giáo trình
Tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI phát hiện gen kháng bệnh bạc lá
Xa21 ở loài lúa dại Oryzae longistaminata ( Khush et al 1989). Khác với sự nhận

diện của một gen khác, gen trội Xa21 kháng toàn bộ các chủng bạc lá tại Ấn Độ và
Philippin khi thử kiểm tra tính kháng bệnh (Ikeda et al 1990) .
Theo Khush và Kinoshita 1991, Kinoshita 1995, Lin et al 1996 cho rằng có
14 gen trội: Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, Xa7, Xa10, Xa11, Xa12, Xa14, Xa16, Xa17,
Xa18, Xa21, và Xa22 và có 6 gen lặn xa5, xa8, xa15, xa18, xa19, xa20. Gen kháng
bệnh bạc lá được nhận biết tính kháng khác nhau .
Ở Trung Quốc đã chuyển gen kháng Xa21 vào dòng bố có khả năng phối hợp
tốt, trong đó có dòng bố Minghui 63 mang gen kháng bệnh bạc lá .
I.5.2 Đặc điểm di truyền tính kháng bệnh bạc lá
Năm 1961, Nishimura nghiên cứu về gen kháng bệnh, trong nghiên cứu ông
đã tìm ra tính kháng bạc lá do một gen trội kiểm soát. Năm 1968, Hen và cộng sự
đã nhận xét gen kháng bệnh bạc lá được kiểm soát bởi một gen trội không hoàn
toàn. Murty và Khush (1972) đã cho rằng gen kháng bạc lá được kiểm soát bởi một
gen lặn và đối với giống DZ192 gen kháng bệnh được kiểm soát bởi 2 gen lặn .
Sidhu et và cộng sự (1978) đã phân tích 74 giống lúa trồng và tìm ra 3 giống
DV85, DV86 và DZ275 mang một gen lặn là xa5 có tính kháng tốt như các gen
trội
Quy mô rộng lớn và lâu dài của các giống trồng với một gen đơn có thể phát
sinh mầm bệnh gây bệnh trở lại và làm cho tính kháng của đơn gen kháng giảm
dần. Như vậy nhóm gen kháng có thể làm cản trở sự xâm nhiễm của vi khuẩn bằng
nhóm gen kháng đặc hiệu xa5, xa13 và Xa21 trong trồng lúa. Ở quần thể vi khuẩn
có khả năng phát sinh những biến đổi chất độc từ hai hoặc nhiều nhóm nòi mới đã
làm ảnh hưởng đến nhóm gen kháng đặc hiệu. Khi chúng ta sử dụng một gen đơn

11


Báo cáo thực tập giáo trình
trội, nhóm gen kháng đặc hiệu đã được sử dụng trong phương pháp chọn giống từ
sử dụng đơn gen trội đến một nhóm gen kháng đặc hiệu .

Như vậy khi sử dụng nhiều gen kháng trong một giống lúa sẽ tạo nên tính
kháng ngang ổn định, trên qui mô rộng hơn so với khi chúng ta sử dụng một gen
kháng đơn lẻ.
- 1956 Flor đưa ra thuyết “gen đối gen” giữa vật chủ và nguồn bệnh
Đây là cơ sở để giải thích tính kháng bạc lá.

One pair

Pathogen genotypes

of loci
AA
Host

Aa

aa

rr

+

+

+

Rr

-

-

+

RR

-

-

+

genotypes

I.5.3 Chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp chọn lọc truyền thống
Dựa trên nguyên lý của phương pháp lai trở lại (Backcross) là một phương
pháp chọn lọc bởi vì toàn bộ quá trình lai bao hàm chọn lọc những cây theo kiểu
hồi quy (những tính trạng mong muốn của bố mẹ) .
I.5.4 Chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng ứng dụng công nghệ sinh học
Chuyển gen kháng vào một dòng lúa bố, mẹ triển vọng. Xu hướng hiện nay
là tạo ra các dòng đẳng gen ( Near Isogenic Line) có mang gen kháng sau đó lai
quy tụ gen kháng đó vào một nguồn vật liệu
Chọn lọc cá thẻ mang gen kháng bằng chỉ thị phân tử dòng đẳng gen mang
gen kháng và lai quy tụ gen kháng (Pyramid).

12


Báo cáo thực tập giáo trình

I.6 Phương pháp đánh giá tính kháng bạc lá
- Đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá: Sau 18 ngày lây nhiễm bệnh
tiến hành đo chiều dài vết bệnh (cm) (từ vị trí cắt đến hết vết cháy lá), sau đó đánh
giá phản ứng với vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp đo chiều dài vết bệnh của
Satoru.Taura (Nhật Bản) đề xuât mứcđộ kháng của các dòng giống theo bảng sau :
Chiều dài vết bệnh (cm)

Phản ứng

<4

Kháng cao - High resistant (HR)

4 – 7,9

Kháng - Resistant (R)

8 – 11,9

Kháng vừa – Moderately resistant (MR)

12 – 17,9

Nhiễm - Suscepptible (S)

> 18

Nhễm cao - High susceptible (HS)

I.7. Định hướng nghiên cứu chọn tạo giống lúa lai kháng bệnh bạc lá tại Việt

Nam
I.7.1. Những thành tựu trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc tại Việt Nam
- Chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở Miền Bắc của Trường
Đại học nông nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụng
công nghệ sinh học phân lập, nuôi cấy và phân biệt gen kháng bệnh bằng PCR đã
xác định 16 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzea gây bệnh khác nhau. Các dòng
chỉ thị IRBB5 (có gen Xa5), IRBB7 (Xa7), IRBB21 (Xa2) có tính kháng đa số các
chủng vi khuẩn gây bệnh.
- Chọn tạo giống lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá của Trường Đại học
Nông nghiệp Hà Nội với phương pháp lai giữa dòng bất dục 103s và dòng phục
hồi chứa gen kháng bệnh bạc lá tạo ra các tổ hợp lai như Việt lai

13


Báo cáo thực tập giáo trình
24(103s/IRBB21), Việt Lai 24 so với đối chứng là Bồi Tạp Sơn Thanh, thời gian
sinh trưởng ngắn hơn từ 7-10 ngày, năng suất chấp nhận, thuộc nhóm cây bán lùn,
đặc biệt mang gen kháng bệnh bạc lá Xa21.
Như vậy, vấn đề giải quyết hạn chế tối đa sự gây hại của bệnh bạc lá bằng
phương pháp chuyển gen kháng bệnh vào dòng bố, dòng mẹ là hiệu quả nhất.
Chuyển gen trong chọn tạo giống lúa lai sử dụng các gen kháng trội Xa7, Xa21,
Xa3/7 và Xa4/5/13/21, dựa trên cở sở các gen này kháng được nhiều chủng bạc lá
tại vùng núi Trung du phía Bắc, Đồng bằng Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ.
I.7.2 Phương hướng sử dụng gen kháng bệnh bạc lá trong chọn tạo giống lúa
lai hai dòng ở Việt Nam
Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Trọng Thuỷ, các gen đơn trội Xa7, Xa21
và gen lặn xa5 có phản ứng kháng (R), kháng vừa (M) với tất cả 10 chủng vi khuẩn
X. oryzae gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam. Đây là ba gen Xa - gen kháng rất
có ý nghĩa trong việc sử dụng lai tạo, chọn lọc các giống lúa chống bệnh bạc lá.

Gen Xa4 kháng được các chủng Y3, Y4, Y5 và Y7. Gen Xa3 có phản ứng kháng
(R) chủng Y1. Gen Xa10 kháng được chủng Y2 và kháng vừa (M) chủng Y3.
Sự khác biệt lớn của các nhóm gen kháng bao gồm IRBB7, IRBB5, IRBB4
và IRBB21. IRBB7 kháng được các chủng nổi bật, IRBB5 kháng được hầu hết các
chủng đại diện. Kết quả nghiên cứu các dòng đẳng gen thu được các dòng chứa
gen Xa7, xa5 chống được hầu hết các chủng phân lập, tiếp đến Xa21, Xa4. Kết quả
cho thấy vai trò quan trọng của việc sử dụng các gen này trong chương trình chọn
giống lúa chống bệnh bạc lá cho miền Bắc Việt Nam . Như vậy khi chúng ta cần sử

14


Báo cáo thực tập giáo trình
dụng gen trội Xa7, Xa21 có mặt trong dòng bố hoặc mẹ, con lai F 1 sẽ được thừa
hưởng tính kháng bệnh 100%. Trường hợp sử dụng gẹn lặn xa5 sẽ dùng trong chọn
tạo giống lúa thuần.
II. SỬ DỤNG GEN KHÁNG TRONG CHON GIỐNG
II.1. Để chuyển gen kháng vào bố, mẹ
Ta thực hiện lai quy tụ sử dụng dòng đẳng gen
- Dòng đẳng gen được tạo từ phương pháp chuyển gen kháng vào gen nền của
IR24.
- Một gen nền cần đảm bảo các điều kiện:
+ Không mang bất kì gen kháng bạc lá nào
+ Có đầy đủ các tính trạng tốt để cung cấp cho các nơi
+Nằm trong mô hình cấu trúc kiểu cây tương đối lý tưởng
- Kí hiệu dòng đẳng gen của viện nghiên cứu lúa Quốc tế:
IRBB1 = IR24 +Xa1
IRBB21 = IR24 + Xa21
IRBB7 = IR24 +Xa7
+ gen kháng Xa21 phát hiện trong lúa dại O.nivara. Vì vậy dùng O.nivara như

một thể cho và gen nền là IR24
Tổ chức lai:
Mẹ IR24 x Bố O.nivara
F1

F2

Tự thụ
Đánh giá bằng maker phân tử
Nhận biết được mã vạch của
Xa21. Lấy dạng đồng hợp tử
Sau đó lai lại với IR24
15


Báo cáo thực tập giáo trình

BC1F2(có 75% gen của IR24)

MAS +BC

Cứ tiến hành như vậy cho tới đời BC6F2 khi đã có 99% gen của IR24 thì
cho tự thụ để chọn ra những cây có kiểu gen gần tới giống hoàn toàn IR24
Sau đó cho lây nhiễm nhân tạo để đánh giá, chú ý luôn sử dụng IR24 làm đối
chứng .
Sau khi đã tạo ra dòng đẳng gen có thể sử dụng trực tiếp hoặc kết hợp với các
gen khác,
- dòng đẳng gen lai với dòng mong muốn chuyển gen kháng vào( sử dụng trực
tiếp).
ví dụ:chuyển gen Xa21 vào dòng TGMS-103S

103S x IRBB21
Như chúng ta đã biết dòng TGMS có khả năng kết hợp rộng được làm mẹ của
nhiều giống lúa lai sản xuất ở Việt Nam, giống lúa lai quốc gia đầu tiên ở Việt
Nam là việt Lai 20 được lai giữa dòng 103s với giống R20, cho ra con lai có năng
suất cao và thời gian sinh trưởng ngắn, nhưng không kháng được bạc lá do bố mẹ
của nó không mang gen kháng bạc lá.
Mục đích việc nghiên cứu là cải thiện tính kháng bạc lá của dòng mẹ 103s bằng
việc đưa vào gen Xa21.Là 1 gen trội biểu hiện tính kháng với 1 dãy rộng các
chủng bệnh bạc lá nhờ có MAS trong quá trình lai lạ

16


Báo cáo thực tập giáo trình

Sơ đồ tạo dòng 103S mang gen kháng bạc lá
TGMS 103S x

IRBB21

( tms-103s)

(Xa21)

TGMS 103S x

F1

TGMS 103S

x

BC1F1

MAS và lai lại

TGMS 103S

x

BC2F1

MAS và lai lại
MAS và tự thụ

BC3F1
BC3F2

MAS và tự thụ

BC3F3

lây nhiễm thử BB
TGMS-103S có gen Xa21

Nhờ có sơ đồ lai này mà đã tạo ra giống R20 kháng bạc lá tại Việt Nam.
- Kết hợp với các gen khác:
IRBB7 x IRBB21
IRBB 21/7 có tính kháng rộng hơn

17


Báo cáo thực tập giáo trình

II.2. Một số dòng đẳng gen hiện có trên thế giới:

18


Báo cáo thực tập giáo trình

Các dòng đẳng gen đã được ứng dụng ở Việt Nam:
19


Báo cáo thực tập giáo trình
Isolaions
NILs và lai
quy tụ

Xa-gene
HAU02008-1 HAU02009-2 HAU020010-2 HAU01043

IRBB2

Xa1/Xa2

MS

HR

HR

HR

IRBB3

Xa3

S

HR

HR

HR

IRBB4

Xa4

S

HR

HR

HR

IRBB7

Xa7

R

HR

HR

HR

IRBB10

Xa10

S

HR

HR

HR

IRBB11

Xa11

MR

HR

HR

HR

IRBB14

Xa14

R

HR

HR

HR

IRBB21

Xa21

HR

HR

HR

HR

IRBB3/7

Xa3/Xa7

MR

HR

HR

HR

IRBB4/7

Xa4/Xa7

MR

HR

HR

HR

IRBB3/10

Xa3/Xa10

MR

HR

HR

HR

Nguồn: PGS.TS Nguyễn Văn Hoan 2003

II.3.Xu hướng sử dụng các dòng đẳng gen và lai quy tụ

20


Báo cáo thực tập giáo trình
 Kết hợp nhiều gen trong 1 dòng.
 Lai quy tụ các gen Xa4, Xa7, xa5, xa13 và Xa21
Race
NIL/ Pyramid
1

3

9

10

IR24

S

S

S

S

Xa4

R

S

S

R

xa5

R

R

R

Thị R

Xa7

I

R

I

R

Xa 21

R

R

R

R

Xa4/xa5/Xa7

R

R

R

R

Xa4/Xa7/Xa21

R

R

R

R

xa5/Xa7/Xa21

R

R

R

R

Xa4/xa5/Xa7/xa13/Xa21

R

R

R

R

II.4.Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc cá thể

21

Báo cáo thực tập giáo trình
Để chọn lọc cá thể mang gen kháng một cách chính xác và nhanh chóng chúng
ta phải dùng chỉ thị phân tử xác định sự có mặt của gen kháng và kiểm tra hệ gen
trong con lai

- Đối với việc chuyển gen kháng bạc lá vào dòng TGMS (103s) ta cũng sử
dụng Maker phân tử:
Chỉ thị phân tử của Xa21 có các đoạn mồi đặc trưng là M1Xa21, M2Xa21,
M3X21
+ M1X21: 5’- GGTGTTTTCTGCTCTACACTGC-3’ và 5’CGAATCCTGTTTGTGTTCATTG-3’
+ M2Xa21, 5’ TCCAGCCTTTGCATCTATCA 3’ và 5’CCCAACGCCATA-3’
+M3Xa21,5’-TGGAGCAATAAAA-3’ và 5’TACCGATGGTCAATTGCAGA-3’.
M1 Xa21 là chỉ thị đồng trội, sử dụng để chọn lọc cây dị hợp mang gen Xa21.
Các chỉ thị phân tử trội là M2Xa21 và M3Xa 21 đại diện cho các gen tương ứng
của IRBB21 và 103s sử dụng để nhận biết đồng hợp của Xa21 tương ứng trên cây.
Chỉ thị SSR là RM6294 và RM 3294 chúng liên kết với locus tgms (tms103s)và sử dụng cho MAS của tms-103s. WAS( whole genome survey) của
BC3F1 và BC3F2 được sử dụng phổ biến với 74 maker SSr lien tục trong hệ
gen của lúa
22


Báo cáo thực tập giáo trình
II.5.Sử dụng chỉ thị phân tử để xác định trình tự và khoảng cách di truyền:
Distance

Chrom

Linked marker

Xa3

11

RM144

-

Carrillo et al

Xa4

11

Npb181j

1.7

Ma Bo-Jun et al, 1999

Xa5

5

RG556

0-1

McCouch et al, 1991

Xa7

6

P5

0

Porter et al.

xa13

8

RG136

3.8

Zhang et al, 1996

Xa21

11

pTA248, Kinase domain

Gene

References

(cM)

0-1,
0

Ronald et al, 1992

Các gen Xa3, Xa4, Xa21 thuộc NST số 11, Xa 5 ở NST số 5, Xa7 ở NST số 6, Xa
13 ở NST số 8 nhờ chỉ thị phân tử mà xác định được khoảng cách di truyền.

II.6.Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các đột biến trên vi khuẩn
Đột biến đoạn avr Xa7 PXO2684 (Race 9c)

23


Báo cáo thực tập giáo trình

BamHI

BamHI

NLS AD
1 kb

WT PXO1865(r3)
& PXO0314(r9b)
MT PXO2684(r9c)
E

nt GAA TTC GAA GCC CGC TAC GGA
aa
E
F
E
A
R
Y
E
nt GAA
TC GAA GCC CGC
GGA
C
GG
aa
E
E
AT R
L

G

Nhờ sử dụng chỉ thị phân tử mà các chủng đột biến làm mất hiệu lực của gen
kháng dễ dàng được phát hiện. Như vậy bất kì sự biến đổi nào của các chủng gây
bệnh cũng được phân tích rõ rang, chính xác nhờ chỉ thị phân tử để từ đó có các
biện pháp ứng phó kịp thời

*Dùng phản ứng RFLP để xác định bản đồ gen Xa3, Xa4

24

Báo cáo thực tập giáo trình

25