Chiết tách caffein bằng CO2 siêu tới hạn

MỞ ĐẦU
Chất Catechin trong trà xanh đã nhận được sự quan tâm rất lớn từ cả cộng đồng khoa
học và công chúng gần đây do những lợi ích của chúng về sức khỏe và chức năng như chống
oxy hóa, chống ung thư và chống viêm... Trong trà xanh còn có chứa một chất là caffeine có
thể được sử dụng trong y học như một chất kích thích tim, não, hệ hô hấp và cũng là một
thuốc lợi tiểu, nhưng nó còn có một số tác dụng phụ đối với con người bao gồm: thiếu ngủ,
phá thai và sảy thai. Vì thế, Caffeine trong trà xanh được hạn chế đối với một số người.
Chính vì sự hạn chế này đã gia tăng nhu cầu sử dụng các các sản phẩm không chứa caffein
trong trà xanh. Do đó, điều quan trọng là loại bỏ caffeine trong trà xanh mà vẫn giữ được
catechins trong trà xanh.
Các nhà nghiên cứu đã tìm cách loại bỏ caffein từ trà bằng nhiều phương pháp khác
nhau: chiết xuất dung môi, sắc ký cột, xử lý nước nóng, chiết tách bằng CO 2 siêu tới hạn
(SC-CO2)…Nhiều dung môi hữu cơ như chloroform và methylene chloride không được chấp
nhận do độc tính của nó mặc dù nó có hiệu quả để loại bỏ caffein từ lá trà. Sắc ký cột có thể
được sử dụng để khử caffein chiết xuất từ trà nhưng không phù hợp cho khử caffeine trong lá
trà. Xử lý nước nóng là một phương pháp rẻ tiền và an toàn cho trà xanh chứa caffein, nhưng
nó chỉ có thể được sử dụng để xử lý lá chè tươi và nó có thể không chọn lọc loại bỏ cafein từ
chè khô. Khai thác SC-CO2 là một môi trường chọn lọc, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như
cosolvent, áp suất, nhiệt độ, thời gian khai thác và độ ẩm của lá trà. Sản lượng khai thác của
caffeine tăng lên cùng với sự gia tăng nhiệt độ ở áp suất không đổi, và cũng tăng lên với áp
suất gia tăng ở một nhiệt độ cố định, và có kích thước hạt lớn hơn mang lại tỷ lệ khai thác
chậm hơn, khi khai thác SC-CO2 được thực hiện bằng cách sử dụng 95% ethanol như một
dung môi. Sau khi khai thác SC-CO2, loại bỏ được đáng kể của hợp chất Epigallocatechin–3
– gallate, catechin chè chiếm ưu thế.Điều kiện để loại bỏ có chọn lọc của caffeine trà bằng
SC-CO2 được tối ưu hóa hơn nữa. Đó là lý do mà các nhà nghiên cứu sử dụng SC-CO 2 để
tách caffein trong lá trà xanh.

1


CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TRÀ

1.1 Giới thiệu về cây trà
Cây trà hay thường gọi là chè, có tên khoa học là Camellia sinensis có nguồn gốc ở
Đông Nam Á nhưng ngày nay nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, trong các
khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nó là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây
nhỏ, thông thường được xén tỉa để thấp hơn 2m khi được trồng để lấy lá sử dụng để sản xuất
trà. Hoa của nó màu trắng ánh vàng, đường kính từ 2,5–4 cm, với 7-8 cánh hoa. Hạt của nó
có thể ép để lấy dầu. Trà là cây lâu năm, chu kỳ sống rất lâu, có thể đạt đến 60-100 năm hoặc
lâu hơn nữa. tuổi thọ kinh tế tối đa của một cay trà thương mại ào khoảng 50-65 năm tùy
thuộc vào điều kiện môi trường và phương pháp trồng trọt. Trà cho năng suất cao vào mùa
mưa từ tháng 5-11, sau 10-15 ngày thì thu hoạch một lần.
1.2 Phân loại
Cây trà nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau:
- Ngành : song tử diệp ( Angiospermae)
- Lớp: trà ( Dicotyledonae) Luận văn tốt nghiệp 17
- Bộ : trà ( Theales)
- Họ : trà (Theaceae)
- Chi : trà (Camellia)
- Loài: Sinensis
1.3 Thành phần hóa lý tính
Thành phần hóa học của trà biến đổi rất phức tạp, nó phụ thuộc vào giống, điều kiện đất
đai, địa hình, kĩ thuật canh tác,…để khảo sát đặc tính lý, hóa của trà, ta sẽ tìm hiểu thành
phần các chất có trong lá trà, từ đó tìm hiểu vai trò và ý nghĩa của nó.
Hiện nay thành phần lá trà được mô tả khá đầy đủ thành phần lá trà được mô tả trong Bảng 1
sau:

2


Bảng 1: Thành phần hóa học chủ yếu lá trà tươi
1.3.1 Nước

Nước trong nguyên liệu chè là môi trường hoà tan các muối vô cơ, nước tham gia trong
thành phần cấu trúc của các cơ quan khác nhau trong tế bào thực vật, nó có vai trò quan
trọng trong quá trình trao đổi chất. Nước tham gia trực tiếp vào nhiều phản ứng thủy phân,
oxi hóa khử. Hàm lượng nước có quan hệ mật thiết đối với quá trình chế biến trà. Nếu
nguyên liệu trà bị mất nước quá nhanh thì biến đổi sinh hóa diễn ra nhanh và không triệt để,
đôi khi enzyme bị ức chế nếu hàm lượng nước quá thấp (<10%). Trong quá trình chế biến
chè cần khống chế sự bay hơi nước, đặc biệt trong sản xuất trà đen.
1.3.2 Hợp chất polyphenol ( tannin)
1.3.2.1 Hợp chất catechin
Trong lá trà, các hợp chất catechin tồn tại ở trạng thái tự do và dạng ester phức tạp với
acid gallic.
Catechin có công thức cấu tạo chung như sau:

3


R1 và R có thể là nguyên tử hydro.
R1 có thể là gốc galoid.
R có thể là hydroxyl.
1.3.2.2 Tính chất hóa lý của catechin
• Lý tính:
- Các catechin trong lá trà ở dạng tinh khiết là các tinh thể không màu hình kim hoặc
hình lăng trụ, có vị chát.
- Dễ tan trong nước, dễ tan trong dung môi hữu cơ như rượu, ete ethyl, aceton, ethyl
acetate. Phần lớn không tan trong benzen, ete, dầu hỏa, clorofom.
• Hóa tính:
- Tannin có tính khử mạnh, dễ bị oxy hóa, đặc biệt là trong môi trường kiềm.
- Tạo màu với dung dịch FeCl3. Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH có trong phân tử mà
tạo thành chất màu xanh nhạt hay xanh thẫm.
- Khi tác dụng với dung dịch gelatin, protein, alcaloit, và một số hợp chất có tính kiềm,

tannin sẽ tạo tủa tương ứng.
- Tannin bị oxy hóa mạnh khi tác dụng với KMnO 4 trong môi trường acid hoặc dung
dịch iod trong môi trường kiềm.
- Tannin dễ bị oxy hóa và ngưng tụ thành các hợp chất phân tử lớn.
1.3.3 Caffeine

4


Nằm trong nhóm hợp chất Alkanloid. Caffeine (C 8H10N4O2) là tên phổ biến của
trimetilxantin ( tên đầy đủ là 1,3,7- trimethylxanthine hoặc 3,7-dihydro-1,3,7-trimethyl-1Hpurine-2,6-dione). Là dẫn xuất tạo thành từ purine, caffeine chủ yếu được tồng hợp từ lá trà,
chiếm khoảng 3–5% trọng lượng khô trong lá trà, và có hàm lượng ít biến đổi trong quá trình
phát triển của lá trà. Điều đáng chú ý là hàm lượng caffeine trong lá trà cao hơn hàm lượng
caffeine trong hạt cà phê ( chiếm khoảng 1,5% trọng lượng khô). Ngoài caffeine, trong lá trà
còn có các dẫn xuất khác của methylxanthine như theobromine, theophylline với hàm lượng
thấp hơn.
Công thức cấu tạo:

• Tính chất:
- Caffeine là chất kiềm yếu, không có tính acid. Tinh thể màu trắng, vị đắng, không
mùi, có nhiệt độ nóng chảy từ 136 oC đến 225oC, thăng hoa ở 185oC, kết tinh trong nước sôi,
tinh thể dạng hình kim màu trắng.
- Caffeine khi kết tinh nó ngậm một phân tử nước, nhưng khi đun nóng caffeine đến
100 – 150oC thì phân tử nước sẽ mất đi.
- Caffeine rất bền ở nhiệt độ 384o C nó vẫn không bị phá hủy.
- Caffeine tan trong nước ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ 1: 46, ở 12 oC với tỷ lệ 1: 93; tan
trong rượu với tỷ lệ 1: 25 ( ở 20oC); trong ete với tỷ lệ 1: 300 ( 12oC) và đặc biệt rất dễ tan
trong clrofom với tỷ lệ 1: 8 ( ở 25oC).
- Khi caffeine tác dụng với tannin trà sẽ tạo thành váng khi để nguội, gọi là hợp chất
tanat-caffeine.

1.3.4 Protein
5


Protein trong búp chè phân bố không đồng đều, chiếm khoảng 15% tổng lượng chất khô
của lá trà tươi. Protein có thể kết hợp với trực tiếp với Tanin, polyphenol, tạo ra những hợp
chất không tan làm đục nước trà đen. Nhưng trong chế biến trà xanh protein kết hợp với một
phần Tanin làm cho vị đắng và chát giảm đi, vì thế ở chừng mực nào đó Protein có lợi cho
phẩm chất trà xanh.
1.3.5 Hợp chất carbohydrates
Trong thành phần Carbohydrate của trà, đáng quan tâm nhất là là loại đường tan. Dưới
tác dụng của nhiệt và các yếu tố khác, các loại đường sẽ biến đổi tạo nên hương vị đặc trưng
cho thành phẩm. Ngoài ra, các loại đường còn tác dụng với Protein, acid amin tạo nên hương
thơm cho trà.
Lá trà càng già thì lượng đường khử, sacaroza cũng như tổng lượng đường càng lớn.
1.3.6 Enzym
Enzym là nhân tố quan trọng trong quá trình sinh trưởng và chế biến trà, đặc biệt trong
chế biến trà đen. Enzyme có vai trò quyết định chiều hướng biến đổi các phản ứng sinh hóa
trong giai đoạn làm héo, vò, lên men. Trong búp chè có 2 loại enzyme chủ yếu là:
- Nhóm enzyme thủy phân , có tác dụng làm tăng hàm lượng chất hòa tan, hình thành
nên các chất có hương vị và màu sắc đặc trưng cho trà: amilase, protease, glucosidase, …
- Nhóm enzyme oxi hóa – khử , đóng vai trò quan trọng nhất và có tác dụng khác nhau
trong quá trình lên men trà: peroxidase, polyphenoloxidase, ….
1.3.7 Các chất khác
- Acid hữu cơ
- Chất màu
- Vitamin và khoáng
- Các chất dễ bay hơi ( tinh dầu)
- Các chất béo, tinh dầu và chất nhựa
1.4 Hoạt tính sinh học của trà

1.4.1 Dược tính trà
- Tinh thần nâng cao, đầu óc tỉnh táo: khi đầu óc xây xẩm, tinh thần mệt mỏi,người ta
uống một chén chè mới pha, sẽ cảm thấy tinh thần sảng khoái.
6


- Thanh lợi đầu và mắt: uống trà lâu dài có thể thanh lợi đầu và mắt, đạt tác dụng làm
tinh thần sảng khoái, mắt tinh, tai sáng. Trong trà có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng có
quan hệ tới thị lực như là: tiền sinh tố A ( β−caroten ), vitamin B1, B2, và C, đều là những
chất cần thiết duy trì thị lực.
- Tiểu thử giải khát: sau khi uống trà nóng, tinh dầu thơm trong trà và caffeine mau phát
huy tác dụng, làm giãn huyết quản, mở tuyến mồ hôi, thân thể hơi toát mồ hôi, tán phát nhiệt
lượng trong cơ thể, do đó đạt được mục đích tiêu thử giáng thấp thanh nhiệt, sau khi uống trà
nóng gia tăng được lượng nước tiểu, làm cho tiểu tiên bài tiết điều hòa, tự nhiên sẽ có bộ
phận nhiệt lượng thoe đường tiểu tiện tiết ra ngoài, làm cho ra mồ hôi. Ngoài ra, làm co dãn
cơ trơn dạ dày, ruột giãn giải co thắt trường vị, cho nên uống trà điều trị được thử nhiệt, sa
khí, đau bụng.
- Giảm béo: trà xanh chứa nhiều thành phần như chứa chất dẫn phenol, flavonoid,
quereetin cùng nhiều loại sinh tố, nhất là vitamin C với lượng lớn. dẫn chất phenol trong lá
trà giáng giải chất mỡ, flavonoid, quereetin hỗ trợ việc giáng thấp cholesterol. Vitamin C hỗ
trợ lợi tiểu làm cholesterol bài tiết ra ngoài nhanh chóng. Cac vitamin khác cải thiện cơ năng
chuyển hóa của cơ thể, hỗ trợ và để phòng mạch máu bị xơ cưng. Trong lá trà có diệp lục
(chlorophyll ) sau khi vào cơ thể, sẽ loại cholesterol từ thức ăn, ngăn cản tiêu hóa hấp thụ
cholesterol trong cơ thể.
- Ngoài ra còn trà còn rất là nhiều công dụng khác như sử dụng trong mỹ phẩm, vì
chúng có tác dụng làm ẩm da và chống nếp nhăn, có trong thuốc đánh răng có tác dụng diệt
khuẩn.
1.4.2 Tác dụng sinh học của catechin
- Tính chất chống lại oxid hóa (Antioxidants)
- Ngăn ngừa các ung thư (Cancer prevention)

- Làm giảm cholesterol ( Cholesterol reduction)
- Làm giảm huyết áp (Blood pressure reduction)
- Làm giảm lượng đường trong máu cho 2 lại tiểu đường (Blood sugar reduction,
Preventing two types of diabetes)
- Làm thư giản mệt mỏi và căn thẳn (Relieve fatigue and stress)
7


- Giảm bớt rủi ro về đột qụi (Reducing the risk of stroke)
- Ngăn ngừa bịnh xốp xương (Preventing osteoporosis)
- Giảm bớt DNA bị hư hại (Reducing DNA damage)
- Làm chậm lại tuổi già (Delaying the signs of aging)
- Ngăn ngừa sự hiểm nguy do máu đóng cục (Preventing dangerous blood clotting).
-Ngăn ngừa sự suy thóai tim mạch (preventing cardiovascular disease)
- Ngăn ngừa hơi thở hôi (Preventing bad breath)
- Ngăn ngừa sâu răng. Vv....
1.4.3 Tác dụng sinh học của caffeine
Caffeine có tác dụng giảm đau đầu, tăng trí nhớ, giúp con người cảm thấy năng động.
Kích thích hệ thần kinh trung ương, làm tinh thần minh mẫn, tăng hiệu suất làm việc.
1.4.4 Tác dụng của các hợp chất khác
Chlorophyll : Chlorophyll rất hữu ích đối với con người. Nó tăng cường sự tuần hoàn
máu và giúp hệ thống ruột hoạt đông tốt. Chlorophyll có khả năng trung hòa độc tố trong cơ
thể. Phức chlorophyll Cu có tác dụng trung hòa các mutagen, là chất gây đột biến trong cơ
thể.
Tinh dầu trà: kích thích hệ thần kinh, làm tinh thần minh mẫn. Nâng cao hiệu suất làm
việc của các cơ năng trong cơ thể.
Vitamin : đây là hợp chất cần thiết và không thể thiếu trong khẩu phần ăn của người và
động vật. lượng vitamin cung cấp cho cơ thể chiếm tỷ lệ thấp, nhưng nếu thiếu sẽ dẫn tới sự
phá hoại trong việc trao đổi chất và sinh bệnh.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Trà xanh sử dụng được cung cấp bởi Khánh Thành, Khánh Dương, Tứ Xuyên, Trung
Quốc. Các cây trà đã được sấy khô trong máy sấy ở nhiệt độ 103°C trong 4 giờ để loại bỏ
hoàn toàn độ ẩm và sau đó nghiền, sử dụng một máy nghiền EUPA TSK-927S (Cankun Co,
Ltd, Thượng Hải, Trung Quốc) và lọc qua sàng lọc có kích thước khác nhau để lấy mẫu với
ba hạt có kích thước khác nhau (đường kính là 0,2-0,6mm, 0,6-1,2mm và 1,2-2,0mm). Hệ
8


HPLC các hợp chất tham khảo bao gồm:(-)epigallocatechin gallate (EGCG), (-)
Epigallocatechin (EGC), (-) epicatechin gallate (ECG), (+) epicatechin (EC), (+)
gallocatechin gallate (GCG), (-)gallocatechin (GC), (+)catechin gallate (Cg), (-)catechin (C)
và caffeine là các sản phẩm Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mỹ). Các chất phản ứng hóa
học khác được sử dụng là của HPLC cấp (Công ty Cổ phần Công nghệ sinh học Jinmei,
Thiên Tân, Trung Quốc). Nước sử dụng ở trong các thí nghiệm đã được tinh chế, nước được
chuẩn bị bằng một mô hình D7401 EASYPure II UV hệ thống siêu sạch (Barnstead quốc tế,
Iowa, Mỹ).
2.2 Mục tiêu nghiên cứu
Caffeine chứa một lượng đáng kể trong trà, việc chiết tách nhằm đáp ứng nhu cầu uống
trà không caffeine của một số người dùng trà. Vì caffeine tác dụng lên hệ thần kinh trung
ương, có tác dụng khử nước. Do đó nếu trẻ em từ độ tuổi học cấp 1 tiêu thụ quá nhiều sản
phẩm chứa caffeine thì quá trình phát triển cơ thể sẽ gặp nhiều nguy hại. Không chỉ riêng trẻ
em, caffeine cũng gây nguy hại cho người lớn. Nếu cơ thể hấp thụ quá nhiều chất này sẽ
khiến tim đập nhanh hơn, dễ dẫn đến nguy cơ lên cơn đau tim.
Ngoài ra, caffeine dùng làm dược liệu có rất nhiều công dụng. Vì vậy việc trích ly
caffeine cũng được dùng trong y học.
Vì vậy, việc nghiên cứu chiết tách mang ý nghĩa thực tiễn đáng được quan tâm.
2.2 Phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn
Đối với mỗi một chất đang ở trạng thái khí, khi bị nén đẳng nhiệt với một áp suất đủ

cao, chất khí sẽ hóa lỏng và ngược lại. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà tại đó, nếu tăng
nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không hóa hơi trở lại mà trở thành một dạng đặc biệt gọi là
trạng thái siêu tới hạn. Vật chất ở dạng này coa tính chất trung gian, mang nhiều đặc tính của
chất khí và chất lỏng.
Chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn có tỷ trọng tương đương như tỷ trọng của pha lỏng.
nhưng sự linh động của các phần tử lại rất lớn, sức căng bề mặt nhỏ, hệ số khuếch tán cao
giống như đang ở trạng thái khí. Hình 1 biểu thị vùng trạng thái siêu tới hạn của một chất
trong biểu đồ cân bằng pha rắn, lỏng, khí của chất đó theo sự biến thiên nhiệt độ và áp suất.

9


Hình 1 : đồ thị biểu diễn trạng thái vùng siêu tới hạn của môt chất
Giá trị PC phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng của các chất, ví dụ như chất có phân tử
lượng nhỏ như các hydrocacbon có số cacbon từ 1 đến 3 thì giá trị PC của chúng không cao,
mà chỉ xấp xỉ khoảng 45bar. Giá trị TC chỉ tăng ít theo phân tử lượng, nhưng TC lại phụ
thuộc nhiều vào độ phân cực của một chất. độ phân cực càng lớn thì giá trị TT càng lớn.
Điều giải thích là do ở các chất phân cực, tồn tại một lực cảm ứng giữa các chất phân tử, do
đó năng lượng để phá vỡ trật tự giữa các phân tử sẽ lớn hơn nhiều so với các chất không
phân cực.
* Ưu điểm:
- CO2 là chất dễ kiếm, rẻ tiền vì nó là sản phẩm phụ của nhiều ngành công nghiệp hóa
chất khác;
- Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất càn tách chiết. khi được đưa lên
tới trạng thái tới hạn, CO2 không tự kích nổ, không bắt lửa và không duy trì sự cháy;

10


- CO2 không độc với con người và không duy trì sự cháy;

- Điểm tới hạn của CO2 ( PC = 73atm; TC = 30,9 oC) là một điểm có giá trị nhiệt độ và
áp suất không cao lắm so với các chất khác nên sẽ tốn ít năng lượng hơn để đưa CO 2 tới
vùng tới hạn;
- Có khả năng hòa tan các chất hữu cơ ở thể rắn cũng như thể lỏng, đồng thời cũng hòa
tan được cả các chất thơm dễ bay hơi, không hòa tan các kim loại năng và có thể điều chỉnh
các thông số trạng thái như áp suất, nhiệt độ để thay đổi chọn lọc của dung môi;
- Khi sử dung CO2 thương phẩm để chiết tách không có dư lượng chất độc hại trong chế
phẩm chiết;
2.3 Khai thác với cosolvents khác nhau
Sử dụng hệ thống CO2 siêu tới hạn để chiết trong nghiên cứu này. Nó được trang bị bởi
hai máy bơm. Máy bơm đầu tiên là một máy bơm tổng (Model SDC-6, Ningbo Scinentz
Công nghệ sinh học Công ty TNHH, Trung Quốc) luân chuyển chất làm lạnh trong vỏ, và
thứ hai là một máy bơm cosolvent (Model K-501, KNAUER Công ty TNHH, Berlin, Đức )
cho việc cung cấp hơi cosolvent. Ba loại cosolvents đã được thử nghiệm, là : loại AR ethanol
(Công nghệ sinh học Công ty Cổ phần Jinmei, Thiên Tân, Trung Quốc), nước và hỗn hợp
của 50% loại AR ethanol và 50% nước. 15ml cosolvent và 10g mẫu trà (kích thước hạt 0,61,2mm) được dùng trong mỗi lần chiết tách. Áp suất, nhiệt độ và tốc độ dòng chảy của SCCO2 được duy trì không đổi ở 300bar, 60°C và 1,5 L min-1 tương ứng.
2.4 Trực giao mảng thiết kế thử nghiệm
Khai thác thử nghiệm với cosolvents cho thấy rằng nước và 50% dung dịch ethanol đã
không phù hợp với cosolvents vì một tỷ lệ lớn các catechins cảu trà, chất chống oxy hóa
trong trà, đã bị loại bỏ trong quá trình khử caffeine. AR lớp ethanol được bảo vệ như là
cosolvent trong các cuộc thử nghiệm tiếp theo. Để có được điều kiện khử caffeine bằng SCCO2 tối ưu, các trực giao mảng thiết kế (OAD) thiết kế với bốn yếu tố và ba cấp độ, mỗi yếu
tố đã được thực hiện trên các phần mềm của hệ thống SAS của Windows phiên bản 8.0 (SAS
Viện nghiên cứu Inc, Cary, NC , HOA KỲ). Bốn yếu tố kiểm nghiệm là kích thước hạt trà,
nhiệt độ khai thác, thời gian khai thác và thể tích cosolvent. Các chi tiết của thiết kế thử
nghiệm được trình bày trong Bảng 2. 10g mẫu trà được sử dụng trong mỗi chiết tách như
11


trên . Các cuộc nghiệm được thực hiện tại đẳng áp 300 bar và tốc độ dòng chảy SC- CO 2 1,5
Lmin-1

Bảng 2: Thiết kế trực giao với bốn yếu tố và ba cấp độ
2.5 Phân tích HPLC của cafein và catechin
Trà mẫu trước hoặc sau khi phê khử caffeine bằng CO 2 siêu tới hạn đã được sấy khô ở
nhiệt độ 103°C trong 4 giờ và nghiền thành hạt nhỏ hơn có đường kính 0,2mm. 1g mẫu
nghiền đã được tách ra với 100ml 50% dung dịch ethanol ở nhiệt độ phòng trong 45 phút, và
sau đó phần chiết được ly tâm ở 5000 × g và 4°C trong 10 phút. Chất nổi trên bề mặt được sử
dụng cho hiệu suất cao sắc ký lỏng (HPLC, Model LC20A, Shimadzu Co, Kyoto, Nhật Bản)
để xác định caffein và catechin (Kim và Liang et al, 2007). Điều kiện HPLC như sau: bơm
vào một thể tích là 10 µl ; 5 µm TC-C18 cột (4,6 × 250 mm, Agilent Technologies Inc, CA,
USA), tủ sấy ở nhiệt độ 28°C, pha động A là acetonitrile / acetic acid / nước (6/1/193, v / v /
v) và pha động acetonitrile / acetic acid / nước (60/1/139, v / v / v), rửa giải gradient tuyến
tính với pha động B 30-85 (v)% trong thời gian đầu 35 phút và giữ ở 85 % pha động B thêm
5 phút ở tốc độ dòng 1ml min-1, phát hiện ở 280 nm. Caffeine và catechins trong mẫu thử
nghiệm được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu giữ và chiều cao đỉnh điểm với những
tài liệu tham khảo thực tương ứng.
2.6 Thống kê số liệu
Tất cả các thử nghiệm được thực hiện trong ba lần và lấy giá trị trung bình của ba lần
thử nghiệm này. Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm tra Tukey nhóm các dữ liệu được

12


thực hiện trên phần mềm của hệ thống SAS cho Windows phiên bản 8.0 (SAS Institute Inc,
Cary, NC, USA).

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH
3.1 Ảnh hưởng của cosolvents khác nhau về loại bỏ cafein và catechins
Bảng 3 cho thấy cosolvents đã có ảnh hưởng lớn đến việc khử caffeine và loại bỏ các
catechins trong mẫu trà xanh. Khi ethanol đã được sử dụng như cosolvent, 67,39% caffeine

và 7.2% tổng catechin đã được gỡ bỏ từ trà xanh. Trong trường hợp nước như cosolvent,
78,0% caffeine và 67,6% tổng catechin đã được gỡ bỏ. Các mẫu trà chiết xuất bằng cách sử
dụng 50% dung dịch nước ethanol, như cosolvent có nồng độ thấp nhất của caffeine và
catechins. Catechins được biết rất là quan trọng cho sức khỏe, nó được tìm thấy trong các
hợp chất có lợi trong trà. Nó cho thấy nước và ethanol dung dịch cồn là không thích hợp cho
cosolvents để khử caffeine trong trà xanh vì sự mất mát của catechin. Ethanol sẽ được sử
dụng như cosolvent trong các thử nghiệm tiếp theo.

Bảng 3: Ảnh hưởng khác nhau của cosolvents về nồng độ cafein và catechin trong các
mẫu trà khử chất cafein (mg g-1).
3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau về loại bỏ caffein
Kết quả trực giao mảng thiết kế thử nghiệm cho thấy có sự khác biệt về lượng caffeine
giữa các mẫu trà được khử cafein bởi phương pháp xử lý khác nhau (Bảng 4).nồng độ
caffeine trong các mẫu thử dao động 9,99-28,43 mg g-1, với mẫu caffeine là 31,4-89,3%. Xử
lý số 8 (nhiệt độ 80°C, thời gian khai thác 2giờ, kích thước hạt trà 0,2-0,6mm, ethanol
cosolvent 30ml) thì có nồng độ caffeine thấp nhất, với 68,6% caffein (Bảng 3 và 4). Tổng số
nồng độ catechin vẫn ở chín phương pháp xử lý là 5,3 - dưới sự kiểm soát 14,1%, với trị số 3

13


là thấp nhất và xử lý số 6 là cao nhất. Nó cho thấy rằng việc loại bỏ các chất caffeine và khai
thác chọn lọc đã bị ảnh hưởng bởi các SC-CO2 điều kiện.

Bảng 4: Thành phần hóa học của các mẫu thử nghiệm
Phân tích phương sai (ANOVA) cho thấy rằng tất cả các điều kiện thử nghiệm SC-CO 2
bao gồm nhiệt độ khai thác, thời gian khai thác, kích thước hạt và khối lượng cosolvent đã
ảnh hưởng đáng kể đến việc loại bỏ chất caffeine trong trà (Bảng 4). Kích thước hạt ảnh
hưởng đáng kể về nồng độ tổng catechins nhưng không đáng kể trên (-) epigallocatechin
gallate (EGCG). Nồng độ tổng catechin và EGCG không bị ảnh hưởng đáng kể bởi các yếu

tố thử nghiệm khác (Bảng 5).

Bảng 5: Phân tích phương sai cho caffeine, EGCG và catechin tổng
3.3 Tối ưu hóa các điều kiện khử caffeine SC-CO2
Dựa trên kết quả nhóm Tukey (Bảng 6), các điều kiện khử caffeine SC-CO 2 tối ưu đã
được sàng lọc như kích thước hạt trà 0,2-0,6mm, ethanol cosolvent 15ml, nhiệt độ khai thác
14


ở 80°C và thời gian khai thác 2giờ. Để xác nhận hiệu quả khử caffeine, một thử nghiệm đã
được tiến hành theo các điều kiện tối ưu thu được từ trên cao chiếu. 10g kích thước hạt trà từ
0,2-0,6 mm được chiết xuất với 15ml ethanol cosolvent ở 80°C trong 2giờ, với tốc độ dòng
chảy SC-CO2 1,5 L min-1 và áp suất 300 bar và các thử nghiệm đã được thực hiện trong ba
lần. Kết quả cho thấy nồng độ caffeine trong các mẫu trà caffein là 9,48 ± 0,06 g kg -1 và tổng
catechins 157,77 ± 0,38 g kg-1, trong đó EGCG là 89,42 ± 0,03 g kg -1. Hình 2 cho thấy các
cấu hình của HPLC điều khiển và kiểm nghiệm mẫu. Theo kết quả, 70,23% caffeine đã được
loại bỏ, trong khi 93,8% tổng số catechins được giữ lại mẫu không chứa caffein.

Bảng 6: So sánh giữa mức độ khác nhau bằng nhóm Tukey

Hình 2 : Hình chụp HPLC của mẫu đối chứng (A) và mẫu không chứa caffein (B) 1.
GC; 2. EGC; 3.caffeine; 4. C; 5. EC; 6. EGCG; 7. GCG; 8.ECG; 9.CG.
15


KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu các tài liệu về tách chiết caffeine từ trà xanh bằng CO 2 lỏng
siêu tới hạn, ta khảo sát được điều kiện tách chiết thích hợp cho quá trình chiết, xác định
điểm tối ưu trong miền khảo sát, để áp dụng nó vào thực tiễn chúng ta cần phải khảo sát ảnh
hưởng của từng thông số tác động đến hiệu suất chiết và chất lượng chiết. Và chúng ta cũng

cần khảo sát kỹ điểm tối ưu sao cho đạt kinh tế cao để có thể áp dụng vào thực tiễn.
Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không đáng
kể, vì vậy chúng ta nên tách caffeine trong chế phẩm ở dạng tinh khiết để ứng dụng nó trong
một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế.

16


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vũ Thị Thư, Đoàn Tiến Hùng, Đỗ Thị Gấm (2001). Các hợp chất hóa học có trong chè và một số
phương pháp phân tích thông dụng trong sản xuất chè ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp 2001.
2. Decaffeination of green tea by supercritical carbon dioxide - Qing-Lei Sun 1 , Shu Hua 1 , JianHui Ye 1 , Jian-Liang Lu 2 , Xin-Qiang Zheng 1 and Yue-Rong Liang 1 *
3. Bahramifar N, Yamini Y, Shamsipur M (2005). Investigation on the supercritical carbon dioxide
extraction of some polar drugs from spiked matrices and tablets. J. Supercrit. Fluids, 35: 205-211
4. Liang HL, Liang YR, Dong JJ, Lu JL, Xu HR, Wang H (2007). Decaffeination of fresh green tea
leaf (Camellia sinensis) by hot water treatment. Food Chem., 101: 1451-1456.
Kopcak U, Mohamed RS (2005). Caffeine solubility in supercritical carbon dioxide/co-solvent
mixtures. J. Supercrit. Fluids. 34:209-214.

17