Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
----------------------------------------

BÙI THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO
GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH KHẢM VÀNG

Chuyênngành : Di truyền và chọn giống cây trồ ng
Mãsố

: 62.62.01.11

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2016


Công trình được hoàn thành tại:
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Hà Viết Cường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
2. TS. Trần Danh Sửu, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Phản biện 1: ………………………………………………
Phản biện 2 ………………………………………………
Phản biện 3: ………………………………………………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm 2016

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư Viện Quốc gia
2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Đậu xanh là một trong những cây thực phẩm họ đậu quan trọng trên thế giới và
Việt Nam. Bệnh khảm vàng là bệnh phổ biến trên cây đậu xanh ở một số nước và có
phổ ký chủ rộng. Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều virus thuộc chi
Begomovirus gây ra và được lan truyền bởi bọ phấn theo cơ chế không bền vững. Chỉ
thị phân tử liên kế t với tính kháng bê ̣nh đã đươ ̣c báo cáo đều liên kết xa với tính
trạng. Tại Việt Nam, bệnh đã được quan sát từ những năm 1980 nhưng chưa có
nghiên cứu nào xác định virus gây bệnh cũng như xác định gen kháng. Vì thế, công
tác đánh giá tập đoàn đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, nghiên cứu xác định

cơ sở di truyền tính kháng, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần thúc đẩy công
tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu cho chương trình
chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở nước ta. Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất
đậu xanh, nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học và vật liệu cho công tác chọn tạo
giống đậu xanh kháng bệnh, đề tài: "Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo
giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng" đã được tiến hành..
2. Mục tiêu của đề tài
Tìm hiểu, xác định bản chất di truyền tính kháng bệnh khảm vàng trên cây đậu
xanh ở mức phân tử, giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh
kháng bệnh.
Mục tiêu cụ thể của đề tài:
- Xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh tại Việt Nam.
- Xác định được di truyền tính kháng bệnh khảm vàng ở cây đậu xanh.
- Xác định được các QTL kháng bệnh khảm vàng.
- Giới thiệu được một số nguồn gen đậu xanh triển vọng làm vật liệu khởi đầu
cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng và năng suất cao tại
Việt Nam.
3. Ý nghiã khoa ho ̣c và thư ̣c tiễn của đề tài
Việc xác định được nguyên nhân gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh tại Việt
Nam là MYMV, xác định nguồn gen kháng bệnh, đánh giá đa dạng di truyền, thiết


2

lập bản đồ gen kháng ở giống đậu xanh làm cơ sở khoa ho ̣c cho công tác chọn tạo
giống đậu xanh kháng bệnh.
Xác định di truyền tính kháng bệnh và các chỉ thị SNP liên kết với gen kháng
bệnh khảm vàng ở giống đậu xanh nhập nội NM94 không chỉ nhằm xác định nguồn
gen kháng mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc khai thác hiệu quả các nguồ n
gen kháng bênh

̣ phục vụ công tác cho ̣n ta ̣o giố ng đâ ̣u xanh kháng bênh.
̣
4. Những đóng góp mới của luận án
Đây là đề tài đầu tiên ở Việt Nam đã xác định được virus gây bệnh khảm vàng
trên cây đậu xanh là MYMV.
Đã thiết lập được bản đồ di truyền gồm 11 liên kết tương ứng với 11 nhiễm sắc
thể trên bộ gen của cây đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP bằng phương pháp GBS.
Đã xác định được vị trí các QTL kháng bệnh khảm vàng trên bản đồ di truyền và
bản đồ vật lý ở nguồ n gen đâ ̣u xanh nhâ ̣p nô ̣i NM94.
5. Bố cục của luận án
Luận án được trình bày trong 121 trang (không kể phần Tài liệu tham khảo và
Phụ lục): Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan và cơ sở khoa học của Đề tài (39
trang), Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (14 trang), Chương
3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (62 trang), Kết luận và đề nghị (2 trang). Tài liệu
tham khảo được sử dụng 158, trong đó có 20 tài liệu tiếng Việt và 138 tài liệu tiếng
Anh. Luận án có 31 bảng, 40 hình, 13 phụ lục, 4 công trình đã công bố.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀ I LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
Luận án đã tham khảo và tổng quan 20 tài liệu tiếng Việt và 138 tài liệu tiếng
Anh, với các nội dung liên quan bao gồm: 1. Giới thiệu chung về cây đậu xanh; 2.
Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh; 3. Những nghiên cứu về bệnh khảm
vàng đậu xanh; 4. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền và tiềm năng ứng dụng trong cải
tiến giống ở cây đậu xanh; 5. Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử và lập bản đồ phân
tử ở Việt Nam.
Với các tài liệu thu thập được đã khẳng định cây đậu xanh (Vigna radiata (L.)
Wilczek.) có nguồn gốc Ấn Độ và được thuần hóa từ 1500 năm trước công nguyên


3

(Mogotsi, 2006). Đậu xanh rất giàu và cân đối protein, thời gian sinh trưởng ngắn, có
khả năng chịu hạn, thích ứng rộng với môi trường (Phạm Văn Thiều, 2009). Diện tích
trồng đậu xanh trên toàn thế giới đạt trên 6 triệu ha nhưng năng suất đậu xanh hiện
nay còn thấp (Nair et al., 2012).
Đậu xanh là cây trồng tự thụ, bộ nhiễm sắc thể 2n=2x=22, kích thước bộ gen
khoảng 579 Mbp (Somta và Srinives, 2007) và có nền di truyền rất hẹp (Nair et al.,
2012).
Bệnh khảm vàng (Mungbean yellow mosaic virus – MYMV) là bệnh hại nghiêm
trọng đến canh tác đậu xanh. Bệnh được quan sát thấy lần đầu tiên vào năm 1955 tại
Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ (IARI) (Nariani, 1960), sau đó được phát hiện
tại một số quốc gia khác thuộc khu vực Nam Á và Đông Nam Á như Philippines
(Benigno và Favali-Hedayat, 1977), Thái Lan (Thongmeearkom et al., 1981), Papua
New Guinea (Pearson, 1981), SriLanka (Shivanathan, 1983), Bangladesh (Akanda et
al., 1992), Pakistan (Saleem et al., 1998), Myammar (Han et al., 2001) cho thấy đây
là bệnh quan trọng gây hại trên đậu xanh.
Bệnh có phổ ký chủ rộng, không chỉ gây hại trên đậu xanh mà còn gây hại trên
một số loài cây họ đậu khác như đậu xanh đen, đậu tương, đậu cowpea … (Varma,
1992). Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều virus thuộc chi Begomovirus (họ
Geminivirus) gây ra và được lan truyền bởi vectơ truyền bệnh là bọ phấn (Bemisia
tabaci Genn.) theo cơ chế không bền vững (Nariani, 1960). Bệnh đã từng gây hại rất
nghiêm trọng, làm mất 100% năng suất tại Thái Lan và Ấn Độ (Thogmeearkhom et
al., 1981; Manjunath et al., 2013), gây thiệt hại kinh tế trên 300 triệu USD (Varma,
1992).
Tại Việt Nam, đậu xanh là cây đậu đỗ đứng thứ ba sau lạc và đậu tương. Đậu
xanh được trồng từ Bắc vào Nam. Diện tích trồng đậu xanh của Việt Nam năm 2015
là 90.950 ha trong đó các tỉnh Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên là vùng
trồng chính với 67,8% diện tích trồng cả nước (2015). Bệnh khảm vàng trên cây đậu
xanh đã được quan sát ở Việt Nam với các triệu chứng điển hình từ những năm 1980
(Phan Hữu Trinh và cs., 1986) và mặc dù chưa có một nghiên cứu chính thức nào về
thiệt hại do MYMV gây ra đối với đậu xanh nhưng đã có những ước đoán về thiệt hại

của bệnh gây mất năng suất từ 20-70% (Phạm Văn Thiều, 2009).
Sử dụng các giống kháng bệnh được đánh giá là mang lại hiệu quả tối ưu, là


4

cách ổn định và an toàn để quản lý dịch bệnh. Nghiên cứu xác định nguồn gen kháng
đã và đang được tiến hành tại nhiều quốc gia khác thế giới và Việt Nam. Một số
nguồn gen kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh đã được phát hiê ̣n (Shad et al., 2006;
Habib et al., 2007). Một số công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng di truyền tính kháng
của MYMV được kiểm soát bằng đa gen. Tính kháng được quy định bằng đơn gen
lặn (Singh và Patel, 1977; Reddy, 2009; Sudha et al., 2013a), một gen trội (Gupta et
al., 2005), hai gen lặn (Ammavasai et al., 2004; Singh et al., 2013) và các gen lặn bổ
sung (Dhole và Reddy, 2012).
Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ chỉ thị phân tử, nhiều locut gen
kháng sâu bệnh chính đã được định vị trên bản đồ bộ gen của cây đậu xanh (Chen et
al., 2007; Zang et al., 2008). Chỉ thị phân tử liên kế t với gen kháng bênh
̣ khảm vàng
trên đâ ̣u xanh cũng đã đươ ̣c báo cáo nhưng các chỉ thị này đều liên kết xa với tính
trạng (Somta và Srinives, 2007; Dhole và Reddy, 2013).
Trong số các chỉ thị phân tử, SNP là chỉ thị thế hệ mới, có số lượng cao trong bộ
gen do vậy được ứng dụng tốt cho tăng mật độ chỉ thị, lập bản đồ QTL và chọn lọc
nhờ chỉ thị phân tử với nhiều thông tin (Choudhary et al., 2012). Sự phát triển nhanh
chóng của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã giúp dễ dàng phát hiện các SNP
trên toàn bộ hệ gen. Công tác đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của tập đoàn
đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần
thúc đẩy công tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu cho
chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở Việt Nam.
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. 1. Vật liệu nghiên cứu
- Giống đậu xanh:
+ Thí nghiệm sàng lọc nguồn gen đậu xanh kháng bệnh khảm vàng: gồm 96 nguồn
gen đậu xanh địa phương và nhập nội đang được lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng
Quốc bao gồm giống đối chứng nhiễm bệnh chuẩn là KPS2 (Akatar et al., 2011) có
nguồn gốc từ AVRDC (Bảng 2.1 và Phụ lục 1)
+ Thí nghiệm đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh: gồm 94 nguồn gen trong đó có
nguồn gốc từ Việt Nam (50 nguồn gen), AVRDC (13 nguồn gen) và Úc (31 nguồn


5

gen) (chi tiết ở Phụ lục 2)
+ Quần thể lập bản đồ: 200 dòng quần thể đậu xanh F3 do AVRDC khu vực Nam Á
đóng tại ICRISAT, Hyderabad, Ấn Độ tạo ra từ tổ hợp lai NM94 (kháng MYMV) và
KPS2 (nhiễm MYMV).
- Nguồn bệnh: là những cây đậu xanh bị bệnh khảm vàng thu thập tại Phú Yên với
triệu chứng điển hình.
- Các vật liệu hóa chất dùng trong sinh học phân tử
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng ở Việt Nam
Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng kháng bệnh khảm vàng và đặc điểm nông sinh học
của các mẫu giống trong tập đoàn đậu xanh
Nội dung 3: Nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đậu xanh
Nội dung 4: Nghiên cứu lập bản đồ gen của cây đậu xanh
2.3.1. Thời gian nghiên cứu: từ năm 2011 đến năm 2015.
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu
- Các nghiên cứu đánh giá tính kháng bệnh trên đồng ruộng được thực hiện tại Nam
An Nghiệp, Tuy An, Phú Yên
- Các thí nghiệm đánh giá bệnh trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo được thực hiện tại

hệ thống nhà lưới chống côn trùng của Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông
nghiệp Việt Nam và Trung tâm Tài nguyên Thực vật.
- Các thí nghiệm nghiên cứu về sinh học phân tử được thực hiện tại Bộ môn Đa dạng
Sinh học Nông nghiệp - Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm Bệnh cây nhiệt
đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng virus học và Phòng chỉ thị phân tử Trung tâm Rau thế giới (AVRDC, Đài Loan).
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp xác định virus gây bệnh khảm vàng đậu xanh
Phương pháp thu mẫu bệnh:
Thu thập và bảo quản mẫu bệnh được tiến hành theo AVRDC như sau:
Thu mẫu bệnh là lá và quả non ngẫu nhiên trên đồng ruộng và ghi chép các
thông tin liên quan tại các vùng trồng đậu xanh chính và các cây họ đậu khác theo
biểu mẫu của DSMZ. Mẫu được làm khô bằng silicagen tự chỉ thị và được bảo quản


6

trong lọ hoặc ống falcon kín chứa silicagen và bảo quản ở điề u kiêṇ thường.
Tách chiết ADN tổng số
Tách chiết ADN tổng số bằng dung dịch đệm CTAB (Doyle và Doyle, 1987).
Kiểm tra chất lượng ADN trên gel agarose 0,8%. Tinh sạch ADN bằng Kit ZR-96 DNA
clean and concentratorTM-5 (Zymo Research). Nồng độ chính xác được đo trên máy
quang phổ nanodrop.
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2 % trong TBE 0,5X.
Phương pháp tách dòng và giải trình tự ADN của begomovirus
Dựa vào việc căn trình tự của các sản phẩm PCR 1,5kb và trình tự nucleotide
thu được trên GenBank, thiết kế mồi khuếch đại các đoạn ADN-A và ADN-B hoàn
chỉnh của các chủng MYMV từ Việt Nam. Các đoạn ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh
này sau đó được tách dòng và giải trình tự.
Nhân dòng bằng vectơ pGEM-T Easy theo chỉ dẫn của nhà sản xuất (Promega,
WI, USA). Sản phẩm nhân dòng được nhuộm bằng BigDye® Terminator v3.1 Cycle

Sequencing Kit và giải trình tự bằng thiết bị ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems, San Francisco, CA, USA) tại công ty Yourgene (Đài Loan).
Phân tích trình tự của các ADN begomovirus
Sử dụng BLASTn trên NCBI để tìm kiếm các trình tự của geminivirus trên cơ
sở dữ liệu của GenBank tương đồng nhất với trình tự ADN hoàn chỉnh thu được
(Altschul et al., 1990). Phần mềm ClustalX2 2.0 (Larkin et al., 2007) được sử dụng
để căn trình tự và so sánh trình tự. Cây đa dạng di truyền (Phylogenetic tree) của các
ADN-A và ADN-B của virus được tạo ra bằng phần mềm MEGA6 (Tamura et al.,
2013).
Kỹ thuật ELISA
Kỹ thuật ELISA là TAS-ELISA (Triple antibody sandwich –ELISA) được sử
dụng để chẩn đoán một virus rất phổ biến trên cây đậu đỗ tại Việt Nam là Bean
common mosaic virus. Kit ELISA do Viện DSMZ (Đức) cung cấp và qui trình được
thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.


7

2.4.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền sử dụng DArT
Tách chiết ADN
Các nguồn gen nghiên cứu được gieo trồng, thu lá non từ 5 cây/nguồn gen để
tách chiết ADN tại Phòng chỉ thị phân tử, AVRDC - Đài Loan. Tách chiết ADN theo
phương pháp chiết ADN tổng số bằng dung dịch đệm CTAB (Doyle và Doyle, 1987).
Sau khi tách chiết ADN của đậu xanh, các mẫu ADN này được gửi đến công ty
Diversity Arrays Technology, Bldg 3, Lv D, University of Canberra, Kirinari st.,
Bruce, ACT 2617, Australia để thực hiện các bước tiếp theo của quy trình DArT và
nhận lại số liệu thô cho phân tích đa dạng di truyền.
Phân tích số liệu DarT
Các dòng DArT đa hình với P lớn hơn hoặc bằng 80 được lựa chọn để phân tích
đa dạng di truyền của đậu xanh sử dụng phần mềm DARwin 6. Sơ đồ hình cây được

xây dựng dựa trên khoảng cách di truyền của Nei (1978) theo phương pháp UPGMA
bằng phần mềm DARwin 6.
2.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của đậu xanh
2.4.3.1. Đánh giá trong điều kiện áp lực bệnh tự nhiên
Địa điểm thí nghiệm: Nam An Nghiệp, Tuy An, Phú Yên ở vụ Hè (là vùng xuất
hiện bệnh trong nhiều năm liên tục).
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm sàng lọc nguồn gen kháng bệnh của tập đoàn đậu xanh: được bố trí
theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần lặp, khoảng cách hàng x hàng:
40cm, cây x cây: 10cm, 15 cây/hàng/lần lặp.
Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của các dòng trong quần
thể F2:3: được bố trí tuần tự không nhắc lại, khoảng cách hàng x hàng: 40 cm, cây x
cây: 10 cm, 30 cây/dòng. Các cây này được đeo thẻ từ 35 ngày sau trồng để phục vụ
cho quá trình đánh giá.
Quy trình kỹ thuật chăm sóc chung đối với cây đậu xanh được áp dụng cho thí
nghiệm, nhưng không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để không ảnh hưởng đến quần
thể bọ phấn - vector truyền bệnh.
Cấp bệnh được đánh giá trên từng cây theo thang điểm 6 cấp (được cung cấp bởi
AVRDC) tại thời điểm cây được 35 và 55 ngày trồng.


8

2.4.3.2. Đánh giá trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo nhờ bọ phấn
Chuẩn bị cây nguồn nhiễm bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo nhờ vi khuẩn
(Agroinoculation). Lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp ủ hạt qua đêm (Mandal
et al., 1997).
Lây nhiễm nhân tạo sử dụng bọ phấn
Các dòng đánh giá được gieo trong khay xốp, mỗi dòng trồng 30 cây, gieo 1
hạt/hốc, đặt trong nhà lưới. Khi cây mọc và được 10 ngày sau gieo tiến hành cho lây

nhiễm nhờ bọ phấn.
Chuyển cây bị bệnh (cây nguồn) vào lồng kín, thả bọ phấn khỏe với mật độ 4-6
con/cây. Sau thời gian 2 ngày, tiếp tục chuyển cây không bị bệnh vào lồng chứa bọ
phấn đã mang bệnh ngay sau khi mang cây bị bệnh ra ngoài. Chăm sóc hàng ngày và
theo dõi kết quả sau 2 tuần lây nhiễm khi 100% cây của giống mẫn cảm KPS2 đã
biểu hiện triệu chứng điển hình của bệnh và có kết quả dương tính với MYMV (PRC
test). Mỗi cây được đeo thẻ đánh số để đánh giá bệnh theo thang điểm của AVRDC ở
giai đoạn 35 ngày và 55 ngày sau trồng.
2.4.3.3. Phân tích thống kê:
Tính tỷ lệ bệnh (TLB) theo phương pháp của Vũ Đình Ninh (1972) và chỉ số cấp
bệnh trung bình (CBTB) tính theo Fang (2010)
2.4.4. Phương pháp đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự (GBS)
2.4.4.1. Thiết lập thư viện cho GBS theo mô tả chi tiết trong công bố của Elshire et
al., 2011.
2.4.4.2. Xử lý số liệu bằng các phần mềm tin sinh học
Sử dụng bộ công cụ STACKS 1.21 (Catchen et al., 2013) và Bộ công cụ GATK
( chạy trên hệ điều hành Linux 32G-RAM để
gọi ra các chỉ thị SNP
2.4.5. Phân tích QTLs (Quantitative Trait Loci)
Sử dụng các phần mềm QTL Icimapping 4.0 (Li et al., 2007) và Qgene 4.3 (Li et
al., 2007) để phân tích QTLs.


9

CHƯƠNG 3
KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh
3.1.1. Kết quả thu mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh, các cây họ đậu khác
tại Việt Nam

Mẫu bệnh khảm vàng đã được thu thập tại 17 tỉnh, thành trong cả nước. Tổng
cộng đã thu được 68 mẫu bệnh, 57 mẫu bệnh trên đậu xanh, 11 mẫu bệnh trên các cây
họ đậu khác. Trong đó 16 mẫu bệnh thu tại Phú Yên trên cây đậu xanh, 10 mẫu bệnh
thu tại Hà Nội (9 mẫu bệnh trên đậu xanh, 1 mẫu bệnh trên đậu đen), 7 mẫu bệnh thu
tại Thái Bình trên đậu xanh, còn lại các mẫu bệnh khác được thu rải rác trên các tỉnh
thành khác (Bảng 3.1, Hình 3.2). Triệu chứng của cây bị bệnh khảm vàng thu mẫu
bệnh được thể hiện trong Hình 3.1.
Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả điều tra, thu thập mẫu bệnh Begomovirus theo vùng địa lý
Tính đến ngày 15 tháng 12 năm 2013

TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Vùng, địa
phương
Bắc Giang
Bắc Ninh
Yên Bái
Bắc Cạn
Sơn La
Lào Cai
Q.Ninh

Hà Nội
Hưng Yên
Tổng số

Đậu
xanh
1
1
2
4
1
9
2
57

Cây
khác
2
1
3
4
1
11

Hình 3.1: Các triệu chứng
khảm vàng ở đậu xanh tại
Phú Yên

TT
10

11
12
13
14
15
16
17

Vùng, địa
phương
Thái Bình
Thanh Hóa
Nghệ An
Quảng Trị
Đà Nẵng
Bình Định
Phú Yên
Cần Thơ

Đậu
xanh
7
2
2
1
4
3
16
2

Hình 3.2: Định vị các
vùng thu thập mẫu
bệnh khảm vàng chính
tại Việt Nam, năm
2011-2013

Cây
khác
-


10

3.1.2. Thiết kế mồi phát hiện các virus gây hại trên cây đậu xanh và các cây
họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR
Vì các begomovirus trên cây họ đậu chủ yếu là các begomovirus có bộ gen kép nên
2 loại mồi sẽ được thiết kế là các mồi đặc hiệu MYMV và các mồi chung đặc hiệu cho
tất cả các begomovirrus gây hại trên cây họ đậu (còn được gọi là các legumovirus) từ
cựu thế giới.
Kết quả đã thiết kế được 7 mồi có thể phát hiện các begomovirus có bộ gen kép
gây hại trên cây họ đậu và mồi đặc hiệu phát hiện MYNV (Bảng 3.2).
Bảng 3.2: Kết quả thiết kế mồi cho ADN-A của begomovirus
TT

Tên mồi

1

LegA-repF1

2

LegA-repR1

3

LegA-repR2

4

LegA-cpF1

5

LegA-cpR1

6

MYA-For1

7

MYA-Rev1

Trình tự mồi

Số Nu

(5’-3’) (*)
ATAATGBGGATC

RACGTCATC
TCAYCTVCATGT
TCTGCTTC
CAYATTWCCAT
CCGAACATTCAG
GGTCAAGTKTTY
AACATGTATGA
GCATGAGTACAT
GCCATATAC
CAATTTGAGTGC
TGTGTTATCAG
CTCAATAGTGGA
TCCAAGTTAC

Tm

Vị trí

21

49-53 1846-1866

20

43-48 2461-2480

23

51

2372-2394

23

46-48

770-820

Kích thước
(bp)

F1/R1 = 634
F1/R2 = 548

280
21

49

1000-1050

23

52

1773 – 1795
566

22

49

2316-2339

*: Y: C/T, R: G/A, H: A/C/T, M: A/C, B: C/G/T, D: A/G/T, K: G/T; i=inosine.
3.1.3. Kết quả chuẩn đoán bệnh virus trên đậu xanh và các cây họ đậu khác
bằng kỹ thuật PCR
Kết quả chuẩn đoán bằng PCR 68 mẫu bệnh thu được (Bảng 3.3), tất cả 11 mẫu
bệnh của cây họ đậu khác đều biểu hiện dương tính với begomovirus, legumovirus,
MYMV. 25 trên tổng số 57 mẫu bệnh đậu xanh dương tính với begomovirus,


11

legumovirus, MYMV. Có 4 địa phương phát hiện mẫu đậu xanh nhiễm MYMV, 5 địa
phương phát hiện MYMV trên các cây họ đậu khác (Bảng 3.3). Trong đó 100% mẫu
bệnh thu được trên đậu xanh tại Bình Định và Phú Yên dương tính với MYMV.
Kết quả chuẩn đoán bằng ELISA để phát hiện BCMV với 68 mẫu bệnh thu được
cho thấy: cả 11 mẫu bệnh của cây họ đậu khác đều không nhiễm BCMV, 14 trên 57
mẫu bệnh đậu xanh thu được dương tính với BCMV, các mẫu này đều âm tính với
begomovirus.
Bảng 3.3: Tổng hợp kết quả thu thập theo nhóm cây trồng
Loại
STT

cây
trồng

1

Đậu
xanh

Số mẫu dương tính với

Số

lượng Begomo Legumo
mẫu

virus

virus

Địa phương phát

MYMV BCMV

hiện mẫu bệnh
Bình Định (3), Phú

57

25

25

25

14

Yên (16), Sơn La (3),
Thái Bình (3),
Yên Bái (2), Quảng

2

Đậu
khác

11

11

11

11

0

Ninh (4), Sơn La
(3), Bắc Cạn (1), Hà
Nội (1)

Tổng

68

36

36

36

14

3.1.4. Kết quả giải và phân tích trình tự ADN-A của begomovirus
Kết quả đã xác định được chủng begomovirus gây bệnh khảm vàng trên đậu
xanh từ Nam Trung Bộ đều là MYMV và có tương đồng cao nhất về trình tự ADN-A
với isolate phân lập tại Campuchia (SĐK GenBank: AY271892) và 2 isolate phân lập
tại Thái Lan (SĐK GenBank: AB017341 và D14703), có độ tương đồng cao nhất về
trình tự ADN-B với isolate phân lập được ở Thái Lan (SĐK GenBank: D14704)
3.1.5. Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài của MYMV từ các trình tự
ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh của Việt Nam
Từ kết quả phân tích cây phát sinh loài và so sánh tương đồng trình tự với nhóm


12

ADN-A và ADN-B đã xác định được MYMV trên thế giới chia làm 3 nhóm, trong đó
nhóm I từ Việt Nam, Thái Lan, Campuchia, nhóm II từ Ấn Độ, nhóm III từ Ấn Độ và
Pakistan. Ba nhóm này thuộc 2 chủng virus MYMV khác nhau dựa vào sự tương
đồng trình tự ADN-A nucleotide, chủng A là các isolate thuộc nhóm I và II, chủng B
là các isolate thuộc nhóm III.
3.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng và đặc điểm nông
sinh học của các mẫu giống đậu xanh
3.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của các nguồn gen đậu xanh
Đánh giá 96 nguồn gen đậu xanh qua 2 năm có 65 nguồn gen (chiếm 67,7%)
biểu hiện nhiễm đến nhiễm nặng bệnh khảm vàng, 24 nguồn gen (chiếm 25%) nhiễm
bệnh ở mức trung bình.

Bảng 3.6: Thống kê mức độ nhiễm bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh tại
Phú Yên vụ Hè 2012 và 2013
Chỉ số bệnh trung bình
<=2,0

Mức độ nhiễm bệnh

Số nguồn gen

Tỉ lệ %

Kháng cao

HR

3

3,1

>2,0 - <3,0

Kháng

R

0

0

3.0 - <4,0

Kháng trung bình

MR

4

4,2

4,0 - <5,0

Nhiễm trung bình

MS

24

25,0

Nhiễm đến nhiễm nặng S, HS

65

67,7

Tổng

96

100

>=5,0

Xác định được bốn nguồn gen kháng hiệu quả với virus gây bệnh khảm vàng tại
Phú Yên dưới điều kiện áp lực bệnh tự nhiên và có độ ổn định tính kháng là các
nguồn gen: SĐK 3198 (V. Glabrescens), NM92, NM94 và CV3960-88 có nguồn gốc
từ AVRDC. Đây là những nguồn gen kháng hữu hiệu cho vùng sản xuất đậu xanh tại
Phú Yên và vùng Duyên Hải nước ta. Bên cạnh đó đã chọn ra được 17 dòng/giống có
triển vọng từ tập đoàn đậu xanh làm nguồn vật liệu phục vụ cho công tác nghiên cứu
chọn tạo giống tiếp theo (Bảng 3.6 và 3.7).


13

Bảng 3.7: Danh sách các nguồn gen đậu xanh kháng bệnh khảm vàng được đánh giá
tại Phú Yên qua 2 năm 2012 và 2013
STT

SĐK

Tên giống

Tỷ lệ bệnh

Chỉ số bệnh TB

Khả

(55 ngày)

năng
kháng

1

3227

Xanh Đắc Lắc

93

3,78

MR

2

4292

VC 6372 (45-8)

100

3,93

MR

3

4329

Đậu xanh mỡ

82

3,72

MR

4

4332

Đậu xanh mỡ

100

3,83

MR

5

8493

VC 3960-88

53

1,13 - 1,64

HR

6

8923

NM 92

38

1,22 - 1,89

HR

7

12195

NM 94

56

1,53 - 1,73

HR

100

5,58 - 5,93

S

8

12200

KPS2 (Đ/c nhiễm
chuẩn)

3.2.2. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh
Các đặc điểm nông sinh học chính và các yếu tố cấu thành năng suất là những
tính trạng cần thiết được đánh giá để từ đó chọn ra các nguồn gen triển vọng có thể
trực tiếp giới thiệu ra sản xuất hoặc sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chọn tạo
giống năng suất, chất lượng. Đồng thời, trong công tác chọn tạo giống kháng bệnh,
các nhà chọn tạo giống phải kết hợp chọn tổ hợp lai có sự đối lập nhau về khả năng
kháng/nhiễm bệnh đồng thời một trong hai bố mẹ phải có đặc điểm nông sinh học tốt
và cho năng suất khá để có thể tạo ra các dòng vừa kháng bệnh vừa có các đặc điểm
nông sinh học tốt, cho nang suất cao. Chính vì vậy, nội dung đánh giá đặc điểm nông
sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất của tập đoàn đậu xanh nghiên cứu được
tiến hành.
Từ kết quả sàng lọc khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng tại Phú
Yên và kết quả đánh giá các đặc điểm nông sinh học của 98 nguồn gen đậu xanh
nghiên cứu, chúng tôi đã chọn lọc 17 nguồn gen đậu xanh triển vọng dựa trên tiêu chí
năng suất cao hoặc có khả năng kháng bệnh khảm vàng từ mức trung bình đến kháng
cao giới thiệu cho sản xuất góp phần là làm phong phú bộ giống đậu xanh trong sản


14

xuất (Bảng 3.11).
Bảng 3.11: Danh sách các giống đậu xanh triển vọng trong tập đoàn đậu xanh vụ Hè 2013
STT

SĐK

Tên giống

Cao

Ngày

Ngày

cây

ra

thu

(cm)

hoa

hoạch

P100

NS

(g)

(kg/ha)

Số
quả/
cây

Nhiễm
MYMV

1

3210

Mốc Quảng Ngãi

51,40

39

56

4,8

1.255

9,9

MS

2

3211

Sẻ sơn T.Quảng Ngãi

72,20

42

65

5,5

1.349

9,4

S

3

3217

Xanh Bình Định

56,60

45

63

5,0

1.225

9,5

S

4

3222

Xanh Buôn Mê Thuật

41,40

44

59

6,9

1.755

10,0

MS

5

3225

Sẻ Kon Tum

51,80

45

59

6,2

1.258

8,5

HS

6

3226

Xanh Lâm Đồng

68,00

42

65

4,5

1.219

10,7

MS

7

3227

Xanh Đắc Lắc

69,60

49

65

5,1

1.372

10,3

MR

8

3232

Mỡ Tân Ba Sông Bé

47,00

46

63

5,7

1.310

8,2

MS

9

3233

Mỡ Biên Hòa

36,40

45

59

6,2

1.316

8,2

HS

10

3234

Mỡ Đồng Nai

50,80

44

59

6,3

1.359

7,9

HS

11

4347

Đậu xanh

71,20

42

63

6,1

1.341

7,9

MS

12

6497

Đậu xanh

67,40

49

62

5,4

1.290

8,3

HS

13

8493

VC 3960-88

46,40

48

70

5,3

975

7,4

HR

14

8923

NM 92

57,60

42

64

4,6

1.105

9,5

HR

15

12195 NM 94

56,80

41

65

4,6

1.151

9,8

HR

16

12199 KPS1

70,50

39

60

5,0

1.274

9,1

HS

17

12200 KPS2

70,50

39

60

5,3

1.381

9,4

HS

3.3. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen đậu xanh
3.3.1. Thống kê các chỉ tiêu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT
Kết quả đánh giá được thể hiện ở Bảng 3.12. Ở nghiên cứu này giá trị PIC trung
bình rất thấp chỉ đạt 0,157, thấp hơn rất nhiều so với các nghiên cứu đa dạng di truyền
sử dụng DArT trước đó trên các đối tượng cây trồng như lúa mạch (0,38) (Castillo et
al., 2013), sắn (0,42) (Xia et al., 2005), cao lương (0,41) (Mace et al., 2008), đậu triều
(0,42) (Yang et al., 2011). Điều này chứng tỏ đậu xanh có nền di truyền hẹp.


15

Bảng 3.12: Các giá trị nội dung thông tin đa hình (PIC)
cho 560 chỉ thị DArT
Giá trị PIC

Số lượng chỉ thị DArT

Tỉ lệ phần tram

0-0,1

340

60,71

0,1-0,2

61

10,89

0,2-0,3

31

5,54

0,3-0,4

25

4,46

0,4-0,5

103

18,39

Tổng

560

100

Giá trị PIC trung bình 0,157

Khi phân tích riêng đa dạng di truyền 50 nguồn gen đậu xanh đóng góp từ
Việt Nam và 4 nguồn gen có nguồn gốc từ AVRDC (NM92, NM94, KPS1, KPS2)
trong nghiên cứu, kết quả cho thấy giá trị PIC trung bình đạt 0,248. Đây cũng là
giá trị PIC thấp so với giá trị PIC lý tưởng, cũng chứng tỏ các nguồn gen đậu xanh
từ Việt Nam này cũng có nền di truyền hẹp.
3.3.2. Phân tích khoảng cách di truyền của các giống đậu xanh nghiên cứu
Kết quả phân tích đa dạng di truyền 94 nguồn gen đậu xanh cho thấy hầu hết
các nguồn gen có cùng nguồn gốc thu thập được phân nhóm cùng nhau trong các
nhóm phụ, tuy nhiên sự phân nhóm này chưa phản ánh rõ ràng nguồn gốc địa lý
của các nguồn gen đậu xanh nghiên cứu. Đối với 54 nguồn gen đậu xanh gồm 50
nguồn gen từ Việt Nam đóng góp và 4 nguồn gen đậu xanh từ AVRDC (NM92,
NM94, KPS1 và KPS2) cho thấy sự phân nhóm theo vùng địa lý thu thập của các
nguồn gen đậu xanh Việt Nam cũng không rõ ràng thể hiện ở sự xen kẽ các nguồn
gen có nguồn gốc thu thập khác nhau trong cả nước vào cùng nhóm chứng tỏ
nguồn vật liệu nghiên cứu có nền di truyền hẹp và phân nhóm theo vùng địa lý
không rõ ràng (Hình 3.13).

16

Hình 3.13: Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của 54 nguồn gen đậu xanh nghiên
cứu (theo phương pháp neighbour-joining UPGMA dựa trên chỉ số khác biệt DICE
sử dụng 119 chỉ thị có P>80)
3.3.3. Kết quả chọn tổ hợp lai để xây dựng quần thể lập bản đồ
Dựa vào sự đối lập về tính kháng/nhiễm bê ̣nh, khoảng cách di truyền và các đặc
điểm nông sinh học của các nguồn gen đậu xanh trong tập đoàn, chúng tôi đã chọn
được 1 cặp lai: NM94 x KPS2 là cặp lai có sự khác biệt di truyền lớn nhất và có
khoảng cách di truyền xa nhất tạo quần thể lập bản đồ di truyền, bản đồ liên kết gen
dựa vào chỉ thị phân tử SNP bằng phương pháp GBS và xác định chỉ thị liên kết gen
kháng bệnh khảm vàng (Bảng 3.16).
Bảng 3.16: Bảng tổng hợp các chỉ tiêu chọn các cặp bố mẹ làm vật liệu lai tạo quần thể
Đặc điểm

KPS1

KPS2

NM92

NM94

Khả

Tỷ lệ bệnh (%)

100

100

38

56

năng

Chỉ số bệnh trung bình

5,93

5,98

1,22

1,53

kháng

Ngày xuất hiện bệnh (ngày)

<16

<16

35-45

35-45

Sự khác biệt di truyền với NM92

0,500

0,615

-

-

Sự khác biệt di truyền với NM94

0,615

0,750

-

-

Khoảng cách di truyền với NM92

0,550

0,549

-

-

bệnh

17

Khoảng cách di truyền với NM94

0,657

0,657

-

-

Thời gian từ gieo - ra hoa (ngày)

39

39

41

42

Thời gian gieo-thu hoạch (ngày)

60

60

64

65

Đặc

Chiều cao cây (cm)

70,5

70,5

57,6

56,8

điểm

Số quả/cây

9,1

9,4

9,5

9,8

nông

Số hạt/quả

12,0

12,0

10,9

11,3

Chiều dài quả (cm)

10,23

10,35

8,52

9,56

5,30

5,00

4,62

4,60

1.274

1.381

1.105

1.151

sinh
học

P100 hạt (g)
Năng suất thực thu (kg/ha)
3.4. Nghiên cứu lập bản đồ gen ở cây đậu xanh.

3.4.1. Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng
Kết quả đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng của quần thể đậu xanh
trong điều kiện áp lực bệnh tự nhiên trên đồng ruộng cho thấy phân bố kiểu hình
kháng bệnh của quần thể F2:3 được chia thành 4 nhóm: kháng, kháng trung bình,
nhiễm trung bình và nhiễm. Chỉ số bệnh trung bình của quần thể là 3,57, chỉ số bệnh
cao nhất của quần thể là 4,78, chỉ số bệnh thấp nhất là 2,04 (Hình 3.14).

Hình 3.14: Phân bố kiểu hình kháng bệnh khảm vàng của quần thể F2:3 đậu xanh
Để đánh giá kiểu gen bằng phương pháp GBS quần thể đã được rút xuống 71
dòng (Phụ lục 8) và đánh giá kiểu hình bằng lây nhiễm nhân tạo trong nhà lưới sử dụng
môi giới truyền bệnh là bọ phấn.
Kết quả đánh giá phân ly kiểu hình của 71 dòng quần thể F2:3 bằng lây nhiễm
nhân tạo cho thấy chỉ có 18 dòng biểu hiện kiểu hình kháng thực sự với MYMV (so với


18

kiểu hình kháng thu được ngoài đồng là 28 dòng), 12 dòng biểu hiện kiểu hình kháng
vừa, 24 dòng biểu hiện kiểu hình nhiễm vừa và 17 dòng biểu hiện kiểu hình nhiễm. Dựa
vào kiểu hình phân ly đối với 71 dòng này cũng cho thấy gen kháng của NM94 không
phải là một gen đơn mà được quy định bởi nhiều gen (QTL). Số liệu kiểu hình chính xác
thu được từ 71 dòng này hoàn toàn có thể sử dụng cho việc xây dựng bản đồ gen.

Hình 3.16: Phân lớp kiểu hình kháng bệnh MYMV của 200 dòng và 71 dòng quần
thể đậu xanh F2:3
Trong quá trình đánh giá kiểu hình đã chọn được một số dòng kháng bệnh và có
những đặc điểm nông học tốt để tiếp tục đánh giá và giới thiệu ra sản xuất mà điển
hình là dòng 148 (VR2011-2-189) và dòng 178 (VR2011-2-223) (Bảng 3.19).
Bảng 3.19: Một số đặc điểm nông sinh học chính của hai dòng đậu xanh F5 triển
vọng: dòng 148 và dòng 178 vụ Xuân 2015 tại Hà Nội
Tính trạng
Chiều cao cây (cm)

NM94

KPS2

Dòng 148

Dòng 178

(VN2011-2-189)

(VN2011-2-223)

62,8

70,5

67,2

70,3

Ngày ra hoa

43

39

42

40

Ngày thu đầu

65

60

62

63

Số hạt/quả

11,0

12,0

11,6

12,2

Số quả/cây

13,8

15,4

18,3

26,8

P100 hạt (g)

5,4

5,8

6,1

5,61

1.551

1.781

2.437

2.910

Mức độ kháng

1,73

5,93

1,92

2,03

nhiễm MYMV

(HR)

(HS)

(HR)

(R)

Năng suất thực thu
(kg/ha)


19

3.4.2. Đánh giá kiểu gen kháng bệnh khảm vàng bằng giải trình tự
Tổng số 50 Gb số liệu thô đã được tạo ra từ công nghệ giải trình tự Illumina và
thư viện ADN gồm 2 bố mẹ và 71 dòng F2:3 trong đó chứa 98.297.247 đoạn đọc ngắn
có chất lượng base, vị trí đầu treo và barcode tốt. Trung bình cứ mỗi mẫu cho ra
1.346.537 đoạn đọc ngắn với chiều dài đoạn đọc là 101bp và số lượng đoạn đọc ngắn
cụ thể trên mỗi mẫu được thể hiện trên Hình 3.22.

Hình 3.22: Biểu đồ biểu diễn số lượng đoạn đọc ngắn trên mỗi mẫu thu được
từ giải trình tự
Kết quả đã gọi ra được 110.574 chỉ thị SNP phân bố trên 11 nhiễm sắc thể (Bảng
3.20) và chọn lọc được 2016 chỉ thị có tỉ lệ phân ly mong đợi 1:2:1 của quần thể F2:3
đậu xanh ở mức ý nghĩa P<0,05. Đây là số lượng chỉ thị SNP đa hình được sử dụng
nhiều nhất cho lập bản đồ từ trước đến nay.
Bảng 3.20: Kết quả gọi ra chỉ thị SNP từ phân tích GBS

Vr1

14.438

Số chỉ thị
cho đa hình
giữa bố và
mẹ
981

Vr2
Vr3
Vr4
Vr5
Vr6

Vr7

7.164
3.127
5.077
6.614
9.830
12.207

332
246
380
634
1.226
946

Nhiễm sắc thể

Số chỉ thị

Số chỉ thị có ý
Số chỉ thị có
nghĩa lập bản đồ
tỉ lệ phân li
(tỉ lệ missing <=
1:2:1 ở mức ý
15%)
nghĩa p<0,05
517
316

134
182
206
408
658
366

51
46
51
170
308
126


20

Vr8
Vr9
Vr10
Vr11
Scaffold
Tổng số chỉ thị
Trung bình

8.250
7.097
3.545
4.796
28.429

110.574
9214,5

648
636
598
657
1.216
8.500
708,3

362
366
369
404
558
4.530
377,5

159
99
170
201
319
2016
182,3

3.4.3. Lập bản đồ liên kết di truyền, bản đồ vật lý của quần thể đậu xanh
2016 chỉ thị SNP đa hình đã được sử dụng để lập bản đồ liên kết di truyền của
quần thể đậu xanh bằng phần mềm QTLicmapping 4.0. Kết quả 2016 chỉ thị đã được

nhóm vào 11 nhiễm sắc thể, trong đó nhiễm sắc thể số 1 và số 6 có số chỉ thị nhiều
nhất với 333 và 332 chỉ thị. Nhiễm sắc thể số 3 ít chỉ thị nhất với 46 chỉ thị. Trung
bình có 183,27 chỉ thị trên một nhiễm sắc thể. Tổng chiều dài bản đồ lập được là
19.114,14 cM. NST số 6 dài nhất (2801,44 cM), tiếp theo là nhiễm sắc thể số 1
(2261,49 cM) và nhiễm sắc thể số 8 (2209,98 cM). NST số 3 là NST ngắn nhất
(657,10 cM). Khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị ngắn nhất ở nhiễm sắc thể số 1
(6,79 cM), dài nhất ở nhiễm sắc thể số 4 (15,04 cM) và khoảng cách trung bình giữa
các chỉ thị của cả bản đồ đạt 9,48 cM (Bảng 3.21).
Bảng 3.21: Tổng hợp lập bản đồ di truyền đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP
Nhiễm
sắc thể

Số chỉ
thị
SNP

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Tổng

333

81
46
68
180
332
132
202
120
244
278
2016

Số NST
trên
Scaffold
được
nhóm
17
30
0
17
10
24
6
43
21
74
77
319

Chiều dài
bản đồ
(cM)

Khoảng
cách TB
(cM)

Chiều
dài vật
lý (Mb)

Khoảng
cách TB
(Mb)

2261,49
1083,62
657,10
1022,47
1848,57
2801,44
1736,40
2209,98
1463,23
1947,24
2082,60
19114,14

6,79

13,38
14,28
15,04
10,27
8,44
13,15
10,94
12,19
7,98
7,49
9,48

36,49
23,31
12,92
20,58
36,08
37,37
55,37
43,17
20,97
20,87
19,36
326,49

0,109
0,288
0,281
0,303
0,200

0,113
0,419
0,213
0,175
0,086
0,069
0,162


21

Công nghệ GBS được dùng để lập bản đồ vật lý quần thể đậu xanh nghiên cứu.
2016 chỉ thị SNP có ý nghĩa đã bao phủ được 326,49 Mb bản đồ bộ gen đậu xanh,
579 Mb (Somta và Srinves, 2007) chiếm 62,6% (Bảng 3.21, Hình 3.24). Trong đó
NST số 7 có chiều dài vật lý lớn nhất (55,37 Mb), NST có chiều dài vật lý ngắn nhất
là NST số 3 (12,92 Mb). Khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị SNP trên bản đồ vật
lý này là 0,162 Mb.
3.4.4. Lập bản đồ QTL cho tính trạng kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh
Dựa vào vị trí di truyền của chỉ thị, đề tài đã xác định được 4 QTL chính nằm
trên các nhiễm sắc thể 1, 5, 7, 9 là các QTL có chỉ số LOD cao trên 4,5. LOD cao
nhất là QTL nằm trên nhiễm sắc thể số 5 với giá trị LOD là 16,04. Tổng số 4 vùng
QTL chính được xác định có mức độ ảnh hưởng chi phối 80,46% tính trạng kháng
MYMV (Bảng 3.22).
Bảng 3.22: Các QTL quy định tính trạng kháng MYMV của quần thể đậu xanh F2:3
lập bản đồ
Vị trí
Tên vùng
trên
NST
Chỉ thị bên trái

QTL chính
bản đồ
(cM)
mymv1-1
mymv1-2
mymv1-3

mymv1-4

1
5
7
8
8
8
9
10
10
10
10
10

42
1214
561
567
794
1286
1248
530

661
700
777
1352

Vr01:36171544
Vr05:5694513
Vr07:6674722
Vr08:28759842
Vr08:28019682
sc_2045:703
Vr09:20592377
cs_374:126512
Vr10:15597273
Vr10:15597646
Vr10:14474055
Vr10:7954034

Chỉ thị bên phải

Vr01:35678505
Vr05:5179489
Vr07:11673121
Vr08:28052284
Vr08:27690768
sc_251:31242
Vr09:20592336
Vr10:15509740
Vr10:16185682
Vr10:16191195

Vr10:14819052
Vr10:7954058

Giá trị
LOD

6,50
16,04
4,58
2,73
2,63
2,73
10,92
2,68
2,99
2,69
2,59
2,92

Mức độ
ảnh
hưởng
đến kiểu
hình
(PVE%)
11,52
38,91
8,79
3,64
3,58

7,19
21,23
4,71
4,28
3,73
3,43
4,18


22

Danh sách các cặp chỉ thị chặn hai đầu vùng QTL được thể hiện trong Bảng 3.23
Bảng 3.23: Trình tự ADN chứa chỉ thị SNP liên kết với các vùng QTL chính
Tên vùng
QTL
mymv1-1
mymv1-2
mymv1-3
mymv1-4

Ký hiệu chỉ thị

Kiểu SNP

Vị trí vật lý (bp)

Vr01:36171544

A/G

36171544

Vr01:35678505

A/G

35678505

Vr05:5694513

A/T

5694513

Vr05:5179489

T/C

5179489

Vr07:6674722

C/A

6674722

Vr07:11673121

G/A

11673121

Vr09:20592377

T/C

20592377

Vr09:20592336

G/T

20592336

Dựa vào vị trí vật lý của chỉ thị SNP, tiến hành phân tích và lập bản đồ QTL trên
phần mềm Qgen 4.3, bằng phương pháp phân tích SMR đã xác định được 9 vùng
QTL ký hiệu từ mymv2-1 đến mymv2-9 nằm trên các NST 3, 4, 5, 9, 10, bằng phương
pháp phân tích CIM đã xác định được 3 vùng QTL từ mymv3-1 đến mymv3-3 nằm
trên các NST 4, 5, 10 (Bảng 3.24; 3.25)
Bảng 3.24: Các vùng QTL xác định được bằng phương pháp SMR
R2

LOD
Tên vùng
QTL

mymv2-1
mymv2-2
mymv2-3
mymv2-4

mymv2-5
mymv2-6
mymv2-7
mymv2-8
mymv2-9

NST

3
4
5
5
5
9
9
10
10

Vị trí
bắt đầu
(Mb)
10,57
15,34
5,06
8,24
13,33
0,18
12,64
0,23
2,76

Vị trí
kết
thúc
10,57
15,45
5,69
9,67
13,72
0,18
12,64
0,47
3,9

Min

6,19
9,57
8,27
5,21
5,06
5,00
5,37
5,46
5,39

Max

6,19
10,49

11,01
10,66
6,78
5,00
5,37
5,72
9,54

Min

0,33
0,46
0,42
0,29
0,28
0,28
0,29
0,31
0,30

Max

0,33
0,49
0,51
0,50
0,36
0,28
0,29
0,45

0,46

Số chỉ
thị
SNP
trong
vùng
QTL
1
5
5
3
5
1
1
11
15


23

Bảng 3.25: Các vùng QTL xác định được bằng phương pháp CIM
Tên vùng
QTL
mymv3-1
mymv3-2
mymv3-3

NST
4

5
10

Vị trí bắt
Vị trí
đầu
kết thúc
15,03
15,63
2,21
13,41
0
3,4

LOD
Min
6,73
5,92
6,84

Max
10,49
9,22
8,54

R^2
Min
Max
0,35
0,49

0,32
0,45
0,36
0,43

Từ kết quả xác định các vị trí QTL, 7 chỉ thị được lọc là các chỉ thể đơn trong
phân tích SMR (Bảng 3.26) (các chỉ thị này nằm trong vùng QTL có giá trị LOD cao
nhất) và 8 chỉ thị chặn hai đầu của 4 vùng QTL chính (Bảng 3.23) được xác định
bằng QTL icmapping được đề xuất đánh giá để có thể ứng dụng chọn giống kháng
bệnh nhờ chỉ chị trong các nghiên cứu kế thừa của đề tài.
Bảng 3.26: Danh sách các chỉ thị được lựa chọn cho việc đánh giá chỉ thị
Tên chỉ thị

NST

Vị trí vật lý
(Mb)

Giá trị
LOD

R2

Kiểu
SNP

scaffold_183:419936

10

0,42

8,00

0,41

G/A

scaffold_184:377097

10

0,37

9,24

0,45

C/T

Vr03:10571694

3

10,57

6,19

0,33

A/T

Vr04:15430209

4

15,43

10,49

0,49

A/G

Vr05:5694513

5

5,69

11,01

0,51

A/T

Vr05:8244523

5

8,24

10,66

0,50

C/A

Vr10: 3385439

10

3,22

8,01

0,41

T/G

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1. Đã xác định được chủng virus thuộc chi begomovirus gây bệnh khảm vàng trên
đậu xanh tại Nam Trung Bộ là các virus MYMV. Tất cả các virus này có độ tương
đồng về trình tự ADN-A lớn nhất (98,7-98,9%) so với MYMV trên đậu xanh thu thập
từ Campuchia (AY271892) và MYMV thu thập tại Thái Lan (AB017341, D14703).
Các trình tự ADN-B có độ tương đồng về trình tự nucleotide lớn nhất (95,9-96,8%)
với MYMV trên đậu xanh được phân lập tại Thái Lan (D14704).
2. Đề tài đã xác định được ba nguồn gen đậu xanh (NM92, NM94, VC3960-88), nhập
nội từ AVRDC và 5 dòng VR 2011-2-19, VR 2011-2-104, VR 2011-2-189, VR