MIỄN DỊCH bài 7 kết hợp kháng nguyên kháng thể

KẾT HỢP
KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ

PGS.TS. Đỗ Hoà Bình


MỤC TIÊU
• Trình bày các đặc tính và lực liên kết của
phản ứng kết hợp kháng nguyên (KN)-kháng
thể (KT).
• Trình bày nguyên lý và các loại phản ứng tủa
• Trình bày nguyên lý và các loại phản ứng
ngưng kết
• Trình bày các loại miễn dịch đánh dấu

30/1/2007


1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Ba đặc tính của phản ứng kết hợp KN-KT.
• Đặc hiệu: KT chỉ kết hợp đặc hiệu với KN.
Ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh và
nghiên cứu.
• Thuận nghịch: Kết hợp và phân ly, cấu trúc
KN và KT không thay đổi. Sự phân ly phụ
thuộc vào một số yếu tố như pH, nồng độ
muối, nhiệt độ.
• Tạo nhiệt: 2-4Kcal/mol.
30/1/2007

1.2. Các lực liên kết giữa KN-KT
Là những lực hóa lý thông thường, gặp trong các liên kết enzymecơ chất, hocmon với receptor…

Các lực

Nguồn gốc

Lực hút tĩnh điện

Tương tác giữa các nhóm
mang điện trái dấu

Cầu nối hydro

Hydro liên kết với các nguyên
tử mang điện âm (N,O)

Lực Van der Waal

Chuyển động của các đám
mây điện tử xung quanh
các phân tử làm cho phân
tử có cực

Lực hút kỵ nước
30/1/2007

Các nhóm kỵ nước gần
nhau tương tác và giải
phóng các phân tử H20

1.3. Khái niệm epitop và paratop
• Epitop là vị trí kháng nguyên
kết hợp trực tiếp với kháng thể.
Có nhiều loại epitop khác nhau
(xem hình)
Paratop là vị trí của kháng thể
kết hợp với kháng nguyên

KN nhỏ: 2 epitop; Vị trí KHKN: 2

KN
6 epitop;KHKN:
KN trung
vừa: 6bình:
epitop;
Vị trí KHKN: 44

KN lớn: 10 epitop; Vị
trí KHKN:
8
KHKN:
8

30/1/2007


1.4. Ái tính và háo tính
1.4.1. Ái tính (affinity) của

KTvới KN được biểu thị
bằng tổng hợp tất cả các
lực liên kết giữa 1 paratop
với 1 epitop.

KT + KN
[KN.KT]
[KN]x[KT]

KN-KT

K

K: là hằng số kết hợp
30/1/2007

Sự kết hợp và phân ly của 1 KN
đơn hóa trị

Sự kết hợp và phân ly của 1 KN
đa hóa trị


1.4.2. “Háo tính”(avidity) của KT
là biểu thị tất cả các lực liên
kết giữa các KT và KN đa hóa
trị
• Háo tính phụ thuộc vào số
epitop của KN và số hóa trị
của KT (IgG, IgM..), pH, các

lực, nhiệt độ và hằng số kết
hợp.
• Ái tính có ý nghĩa lý thuyết,
còn háo tính có ý nghĩa thực
tế.
30/1/2007

Sự kết hợp và phân ly của 1 KN
đơn hóa trị

Sự kết hợp và phân ly của 1 KN
đa hóa trị


2. CÁC LOẠI PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN-KT
• Phản ứng tủa
• Phản ứng ngưng kết
• Phản ứng miễn dịch đánh dấu

30/1/2007


2.1. Phản ứng tủa
Nguyên lý chung.

Các loại phản ứng tủa:
• Môi trường lỏng
• Môi trường gel
30/1/2007

Thừa KT

Tương
đương

Thừa KN

Lượng KT ngưng kết

Các KN hoăăc KT ở dạng
hòa tan kết hợp với KT
hoăăc KN đặc hiệu tương
ứng tạo thành các phức
hợp miễn dịch (tủa) có
thể nhìn thấy được.

Lượng KN thêm vào


2.1.1. Phản ứng tủa trong môi trường lỏng
để phát hiện KN hoặc KT (Định tính)
2.1.1.1. Vòng tủa trong môi trường lỏng
- Cho

KT vào mỗi ống nghiê m
ă
- Nhỏ từ từ KN lên trên lớp KT
- Vòng tủa xuất hiêăn giữa 2 lớp KN và KT (ống 5)
- Các ống chứng: 1,2,3,4:

1

30/1/2007

2

3

4

5

Vòng tủa


2.1.1.2. Tủa đều trong môi trường lỏng
- Cho KT vào môăt ống nghiêăm
- Thêm môăt lượng KN tương ứng
- Lắc đều và quan sát tủa hình thành

1

KT 100µl
KN 100µl

30/1/2007

2

Tủa: mờ, đục

Dung
dịch
đệm

KN
KT

Lượng tủa

2.1.2.3. Kết tủa
trong môi trường
lỏng: Heidelberger
và Kendall
Thừa KT

Tương
đương

Thừa KN

Lượng KN tăng dần

30/1/2007


2.1.2. Kết tủa trong môi trường gel (argarose)
2.1.2.1. Định tính
•

•
•
•

Khuếch tán một chiều trong gel
Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony.
Điện di đối lưu, kỹ thuật Kohn
Điện di miễn dịch.

2.1.2.2. Định lượng
• Khuếch tán vòng đơn. Mancini
• Điện di tên lửa-Laurell
• Điện di miễn dịch hai chiều
30/1/2007


Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony
•
•

Nguyên lý
KN và KT hòa tan từ 2 vị trí khác nhau khuyếch tán vào môi trường gen thạch sẽ
tạo nên đường tủa khi gặp KT và KN tương ứng.

•
•

Tiến hành
Chuẩn bị lam kính: Lam rửa sạch, để khô, đánh số và đặt trên mặt phẳng thăng
bằng.

Đun sôi cách thủy dung dịch gen thạch (1,5% trong đệm Veronal pH 8,6) để gen
thạch tan đều.
Dùng pipette trải trên mỗi lam kính 2,5 ml gen thạch sao cho lớp gen thạch dàn
đều và có độ dày khoảng 3mm. Để ở nhiệt độ phòng cho thạch đông lại, sau đó
để ở 4độ C khoảng 15-20 phút cho thạch đông chắc.
Dùng khuôn để đục các lỗ trên bảng thạch, khoảng cách giữa các lỗ khoảng 5-7
mm.
Dùng ống mao dẫn cho KN và KT vào các lỗ.
Để các lam vào buồng ẩm trên một tiết diện phẳng, ở nhiệt độ phòng trong 24
giờ.

•
•
•
•
•
•
•

Đọc kết quả
Nếu KN và KT là đặc hiệu thì giữa 2 lỗ sẽ hình thành 1 vệt tủa trắng đục.

30/1/2007


Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony
KN1

KN1

1

KT

KN

KT1

2

KN1

Cơ chế
hình thành
hình cựa
gà

30/1/2007

β 2m
thỏ

β 2m
lợn

KT
kháng
β2m

KN2

KT1
KT2

3


Điện di miễn dịch
Nguyên lý: Gồm 2 bước
•
Bước 1: Điện di dung dịch KN (HT người) để tách riêng các thành phần KN
khác nhau.
•
Bước 2: Phản ứng tủa miễn dịch.
Tiến hành
• Chuẩn bị lam gen thạch: Giống như Ouchterlony
• Đục 1(hay 2) giếng ở gianh giới 1/3 lam gen thạch, nhỏ KN vào đó (huyết thanh
người và IgG).
• Đặt lam gen thạch vào máy điện di sao cho lỗ chứa KN gần cực âm hơn cực
dương. Kết quả, tốc độ di chuyển của các thành phần KN trong huyết thanh sẽ
khác nhau tùy theo TLPT.
• Bỏ lam gen thạch ra khỏi máy, đục một rãnh dài theo chiều dọc lam gen thạch
và nhỏ vào đó KT(kháng HT người toàn phần) và chút ít chất đánh dấu.
•
Để lam thạch vào buồng ẩm trên một tiết diện phẳng, ở nhiệt độ phòng trong
24 giờ.
Đọc kết quả: KN và KT tương ứng sẽ khuếch tán và hình thành các vệt tủa trắng
đục.
30/1/2007

Điện di miễn dịch
- Lam kính đã phủ kín môăt lớp gel
- KN: HT người bình thường
- KT: Kháng HT người bình thường (ngựa)

+

+

Nơi để huyết thanh

Rãnh để kháng HT

30/1/2007

-


Kỹ thuật Mancini
Nguyên lý:
•
KN hòa tan từ một giếng khuếch tán ra xung quanh vào gen thạch chứa KT
tương ứng. Sự tiếp xúc KN-KT sẽ tạo một vòng tủa hình tròn. Diện tích vòng
tủa tỉ lệ thuận với nồng độ KN.
Tiến hành
•
Điều chế gen thạch chứa KT: Đun sôi cách thủy gen thạch cho tới khi tan đều,
để gen thạch và KT vào nồi ấm cách thủy 56độ C. Cho KT vào gen thạch theo
tỉ lệ 2-5%.

•
Đổ gen thạch chứa KT lên lam kính sao cho lớp gen thạch có độ dày 2mm, để
ở nhiệt độ phòng 20-30 phút, sau để ở 4độ C cho đông.
•
Dùng khuôn có đường kính 2mm đục các lỗ trên bản gen thach(khoảng cách
giữa các lỗ 7-8mm tùy nồng độ KN).
•
Cho vào các lỗ Dd cần thử và 3 nồng độ KN chuẩn tương ứng đã biết để vẽ
đường chuẩn.
•
Để lam thạch vào buồng ẩm trên một tiết diện phẳng, ở nhiệt độ phòng trong
48 giờ.
Đọc kết quả:
•
KN và KT tương ứng sẽ khuếch tán và hình thành các vòng tủa trắng đục.
Căn cứ vào đường chuẩn, sẽ tính được nồng độ KN của mẫu thử.
30/1/2007


Mancini- KN: HT ngựa bình thường+ KT kháng chuỗi gamma
- Gel chứa KT
- A6 - A1:HT ngựa: Không pha loãng, ½, ¼ …

- C: Các mẫu HT ngựa cần định lượng IgG
1
A
B

2

3

4

5

6

Nồng đôă IgG (mg/ml)

- B: IgG ngựa tinh khiết đã biết nồng đôă (từ
trái sang phải: 30,15,7,2 và 15 mg/ml)

C
Đường kính vòng tủa (mm)
30/1/2007


Điện di tên lửa
Nguyên lý:
• KN di chuyển trong điện trường gặp KT tương ứng trong gen sẽ tạo một vòng
tủa hình “tên lửa”. Chiều dài hình “tên lửa” tỉ lệ thuận với nồng độ KN, kết quả
đọc sau 2-6 giờ thay vì 48 giờ của Mancini.
Tiến hành
• 1. Điều chế gen thạch chứa KT: Đun sôi cách thủy gen thạch cho tới khi tan
đều, để gen thạch và KT vào nồi ấm cách thủy 56độ C. Cho KT vào gen thạch
theo tỉ lệ 2-5%.
• 2. Đổ gen thạch chứa KT lên lam kính sao cho lớp gen thạch có độ dày 2mm,
để ở nhiệt độ phòng 20-30 phút, sau để ở 4độ C cho đông.
• 3. Dùng khuôn có đường kính 2mm đục các lỗ trên bản gen thach(khoảng cách

giữa các lỗ 7-8mm tùy nồng độ KN).
• 4. Cho vào các lỗ Dd cần thử và 3 nồng độ KN chuẩn tương ứng đã biết để vẽ
đường chuẩn.
• 5. Để lam thạch vào máy điện di, KN di chuyểntrong điện trường gặp KT tương
ứng trong gen sẽ tạo một vòng tủa hình “tên lửa”.
Đọc kết quả:
•
Sau 2-6 giờ thay vì 48 giờ của Mancini. Chiều dài hình “tên lửa” tỉ lệ thuận với
nồng độ KN.

30/1/2007


Điện di tên lửa

KT đã được
trộn đều
trong gel

Nồng đôă KN
30/1/2007


Nơi đặt mẫu

Điện di miễn
dịch hai chiều

KT đã trộn đều
trong gel

30/1/2007


2.2. Phản ứng ngưng kết
2.2.1. Nguyên lý chung:
KN nằm trên bề mặt tế bào (hồng cầu, bạch
cầu…) hoặc các hạt nhân tạo mang kháng
nguyên kết hợp với KT đặc hiệu tạo thành các
mạng lưới KN-KT (ngưng kết) và có thể quan
sát được.

30/1/2007


2.2.2. Các loại ngưng kết:
– Chủ động (KN là các tế bào hồng cầu, bạch cầu,
tiểu cầu, tinh trùng…).
– Thụ động (KN hoặc KT gắn nhân tạo lên các hạt
… Khi KN gắn lên hạt nhân tạo như HC nhóm O,
HC cừu hoặc hạt latex thì phản ứng gọi là
ngưng kết thụ động thuận, còn khi KT gắn lên
các hạt trên thì gọi là thu động ngược).

30/1/2007


2.2.3. Một số ví dụ.
• Ngưng kết chủ động (xác định nhóm hồng cầu)
Các loại

hồng
Các
loạicầu
hồng cầu

Các cấu trúc cacbohydrat
Các
loại
HT
HT
mẫu

KTK A&B

KTK B

KTK

A

Không
KTK A&B

30/1/2007