Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
--- o0o ---

TRẦN THỊ THÚY HẰNG

MSSV: 54130320

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN
CÓ ĐỘ DEACETYL CAO

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: PGS.TS TRANG SĨ TRUNG

NHA TRANG, NĂM 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Trải qua 3 tháng cùng với sự nỗ lực hết mình và được sự giúp đỡ từ nhiều
phía, tôi đã hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp của mình. Qua đây tôi xin chân
thành gửi lời cảm ơn đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm
và các thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy, trang bị cho tôi những kiến thức
trong suốt thời gian học tập tại trường.
PGS.TS Trang Sĩ Trung, Th.S Nguyễn Công Minh đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô giáo phụ trách tại
các phòng thí nghiệm – Trung tâm thí nghiệm thực hành đã tạo điều kiện cho
tôi về hóa chất và trang thiết bị thí nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình và các bạn lớp 54TP2, các bạn cùng
thực hiện nghiên cứu trên phòng thí nghiệm đã động viên và giúp đỡ tôi rất
nhiều trong thời gian vừa qua.
Khánh Hòa, tháng 6 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thúy Hằng


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v
DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................. vi
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 4
1.1. Chitosan có độ deacetyl cao, tính chất và ứng dụng .............................. 4
1.1.1. Tính chất của chitosan. ............................................................... 6
1.1.2. Ứng dụng của chitosan ............................................................. 10
1.2. Quy trình sản xuất chitosan .................................................................. 12
1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ deacetyl trong quá trình sản xuất
chitosan ............................................................................................... 14
1.2.2. Ảnh hưởng của độ Deacetyl đến tính chất và ứng dụng của
Chitosan .............................................................................................. 16

1.2.2.1. Ảnh hưởng của độ deacetyl đến tính chất của chitosan .... 16
1.2.2.2. Ảnh hưởng của độ deacetyl đến khả năng ứng dụng của
chitosan ........................................................................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 19
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................. 19
2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết.................................................. 20
2.2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quá trình deacetyl lần 1 ............... 20
2.2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quá trình deacetyl lần 2 ............... 24
2.2.3.Các phương pháp phân tích. ...................................................... 25


iii

2.2.3.1. Xác định độ ẩm và hàm lượng khoáng[14] (phụ lục 3) ... 25
2.2.3.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp
microbiuret[14] (phụ lục 3) .......................................................... 25
2.2.3.3. Xác định độ nhớt của chitosan bằng máy đo độ nhớt
Brookfiel[22] (phụ lục 3) ................................................................ 25
2.2.3.4. Xác định độ deacetyl (DD) (Tao và cộng sự) (phụ lục 3) . 25
2.2.3.5. Xác định trong lượng phân tử theo phương pháp đo độ
nhớt nội (phụ lục 3) ....................................................................... 25
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................ 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 26
3.1. Kết quả chất lượng chitin ban đầu ...................................................... 26
3.2. Kết quả nghiên cứu điều kiện Deacetyl lần 1 ...................................... 26
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến DD của chitosan ............. 26
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến DD của chitosan ......................... 29
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến DD của chitosan ....................... 31

3.3. Kết quả nghiên cứu điều kiện deacetyl lần 2 ....................................... 33
3.4. Đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl > 90% ................. 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ............................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 40


iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl (Trung và cộng
sự, 2006) .................................................................................................... 6
Bảng 1.2. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan ......................... 8
Bảng 1.3. Mô tả một số quy trình deacetyl bằng phương pháp hóa học ........ 13
Bảng 2.1. Tính chất của chitin ........................................................................ 19
Bảng 3.1. Kết quả chất lượng chitin ban đầu ................................................. 26
Bảng 3.2. Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt
(mpa.s) của chitosan ................................................................................ 27
Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt
(mpa.s) của chitosan ................................................................................ 30
Bảng 3.4. Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt
(mpa.s) của chitosan ................................................................................ 32
Bảng 3.5. Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt
(mpa.s) của chitosan ................................................................................ 36
Bảng 3.6. Kết quả chất lượng chitosan sau 2 lần deacetyl ............................. 38


v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitosan. ......................................................... 5
Hình 1.2. Quá trình Deacetyl. ........................................................................... 13
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. .................................................... 20
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH
đến độ deacetyl của chitosan................................................................... 21
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ
deacetyl của chitosan. ............................................................................. 22
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ
deacetyl của chitosan. ............................................................................. 23
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ
deacetyl của chitosan. ............................................................................. 24
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl (DD) và phân tử
lượng (Mw) của chitosan. ...................................................................... 27
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ khử acetyl đến độ deacetyl (DD) và phân tử
lượng (Mw) của chitosan. ....................................................................... 29
Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian khử acetyl đến độ deacetyl (DD) và phân
tử lượng (Mw) của chitosan. ................................................................... 31
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian và số lần deacetyl đến DD của chitosan. . 34
Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian và số lần deacetyl đến phân tử lượng của
chitosan. .................................................................................................. 35
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan có độ Deacetyl >90%. ................ 37


vi

DANH MỤC VIẾT TẮT

CTS

: Chitosan

CT

: chitin

DD

: Degree of deacetylation

Mw

: Molecular weight

VSV

: Vi sinh vật

w/v

: Weight/volume


1

LỜI MỞ ĐẦU
Chitosan là một polymer sinh học, có nhiều ứng dụng trong công nghiệp
và cuộc sống, đặc biệt là trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Khi chế biến
những loài thủy sản giáp xác (tôm, cua), lượng chất thải (có chứa chitin) chiếm
tới 50% nguyên liệu đầu vào và con số trên thế giới là 5,11 triệu tấn/năm (theo
www.chinhphu.vn), nó là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi

trường, ảnh hưởng xấu đến môi trường sống của con người và thiên nhiên. Tuy
nhiên, đây lại là nguồn nguyên liệu chính trong sản xuất chitosan. Vì vậy, ứng
dụng chitosan vào trong bảo quản nguyên liệu, bán thành phẩm nhằm thúc đẩy
ngành công nghệ sản xuất chitosan phát triển, tăng giá trị sản phẩm, làm giảm
ô nhiễm môi trường do phế thải trong quá trình chế biến các sản phẩm thủy sản
giáp xác, đồng thời làm tăng thời gian bảo quản sản phẩm. Ở nước ta sản phẩm
tôm đông lạnh chiếm một sản lượng rất lớn (theo ước tính ở nước ta chỉ riêng
tôm nuôi đã có khoảng hơn 1 triệu ha diện tích với năng suất bình quân 1 – 1,5
tấn/ha), chính vì vậy vỏ tôm phế liệu là nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền, có
sẵn quanh năm, nên rất thuận tiện cho việc cung cấp chitin và chitosan.
Tính cấp thiết của đề tài:
Qua khảo sát và tìm hiểu nhiều tài liệu nghiên cứu thấy được chitosan có
rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, tuy nhiên khả năng ứng
dụng của chitosan còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có mức độ deacetyl
của chitosan. Mức độ deacetyl của chitosan có ảnh hưởng rất nhiều đến khả
năng ứng dụng của chitosan đặc biệt là chitosan có độ deacetyl cao. Theo nhiều
nghiên cứu cho biết chitosan có độ deacetyl cao có khả năng kháng khuẩn,
kháng nấm và chống oxy hóa rất tốt. Theo Dương và cộng sự (2009), chitosan
có độ deacetyl càng cao, nồng độ dung dịch càng cao thì khả năng tiêu diệt
VSV tổng số càng lớn. Bên cạnh đó, thực phẩm ta dùng hằng ngày như cá, thịt,


2

trái cây,… có thể nói rất dễ bị hư hỏng bởi sự xâm nhập của các loại vi khuẩn,
dễ bị oxy hóa bởi không khí khi ta chỉ bảo quản ở các điều kiện thông thường,
thời gian bảo quản lại ít, do đó việc bổ sung chất bảo quản nhằm giảm thiểu hư
hỏng đối với các nguyên liệu thực phẩm đang được rất nhiều người quan tâm.
Tuy nhiên, hiện nay với sự phát triển của khoa học, việc lạm dụng hóa chất bảo
quản vào trong thực phẩm đang là vấn đề rất được quan tâm, và việc sử dụng

chất bảo quản vào trong thực phẩm là một vấn đề rất nhạy cảm, như là “con
dao hai lưỡi” và rất tốn kém. Dựa vào sự tạo màng và khả năng kháng khuẩn
của chitosan ta có thể sử dụng chitosan để bảo quản thực phẩm mà không gây
hại đến người tiêu dùng và kéo dài thời gian bảo quản. Chitosan có độ deacetyl
trung bình 75 – 85% có thể được ứng dụng làm màng bao trong bảo quản các
loại thực phẩm nhưng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa
kém hơn chitosan có độ deacetyl cao với một số loại thực phẩm dễ bị hư hỏng
bởi vi khuẩn, vì vậy cần phải sản xuất ra chitosan có độ deacetyl cao để nâng
cao khả năng ứng dụng vào thực phẩm, đảm bảo thực phẩm sạch và an toàn.
Vấn đề được đặt ra ở đây là làm thế nào để sản xuất chitosan có độ deacetyl
cao để đáp ứng nhu cầu trên? Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Chủ
nhiệm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Nha Trang, tôi xin thực
hiện đề tài: “ Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao” để
phục vụ trong bảo quản thực phẩm.
Mục tiêu của đề tài
Xác định được các điều kiện deacetyl thích hợp nhất để tạo ra sản phẩm
chitosan có DD cao.


3

Tính mới của đề tài
Hiện nay trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về
chitosan, tuy nhiên có ít tài liệu nghiên cứu để sản xuất chitosan có độ deacetyl
cao, và chưa có công bố chính thức về quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl
cao.
Nội dung của đề tài
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ khử acetyl và thời
gian khử acetyl của chitosan trong quá trình deacetyl lần 1.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử acetyl của chitosan trong quá

trình deacetyl lần 2.
- Đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao.
Tính khoa học
Xác định được các nồng độ NaOH thích hợp, nhiệt độ và thời gian khử
acetyl thích hợp để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao.
Tính thực tiễn
Sản xuất được chitosan có độ deacetyl cao và mở rộng ứng dụng nó vào
việc bảo quản thực phẩm. Phù hợp với điều kiện sản xuất của phòng thí nghiệm
và cho các nhà máy sau này.


4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Chitosan có độ deacetyl cao, tính chất và ứng dụng
Tên hóa học của chitosan là: Poly-β-1,4-D-glucosamine, hay còn gọi là
Poly-β-1,4-2-amino-2-deoxy-D-glucose. Qua đây ta thấy chitosan là một
polymer hữu cơ, có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β-D Glucosamine liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid[5, 6, 10, 12], là dẫn xuất của chitin sau
khi đã được deacetyl, có cấu trúc mạch thẳng, được hình thành từ hai monomer
là N-acetyl-glucosamine (GlcNAc – tiểu phần A) và glucosamine (GlcN – tiểu
phần D), với một tỷ lệ phần trăm thấp hơn của tiểu phần A (0 – 40%). Trong tự
nhiên, chitosan tồn tại trong vách tế bào của các loài nấm nhưng với một tỷ lệ
thấp hơn đáng kể so với chitin. Chitosan là tên gọi chung của các polymer là
dẫn xuất từ chitin với độ deacetyl (DD) trên 60%. Tùy thuộc vào mức độ
deacetyl, hàm lượng nitơ trong chitosan sẽ dao động từ 7-9,5% và chitosan sẽ
có sự khác nhau về hoạt tính sinh học, tính chất lưu biến ngoại trừ tính chất
chung là đều có thể tan trong dung dịch acid hữu cơ có pH thấp hơn 6,0 như
acid acetic, acid formic, acid lactic, acid citric[8].
DD của chitosan thể hiện hàm lượng -NH2 trong phân tử chitosan. Các

thí nghiệm đều chứng tỏ chitosan với DD cao thể hiện tính kháng khuẩn và khả
năng làm sạch nước hiệu quả. Điều này có thể được giải thích là do sự tăng lên
về khả năng ion hóa và tạo phức của chitosan[4].
Khi chitosan có độ DD càng lớn thì nhóm NH3+ càng nhiều dẫn đến khả
năng kháng khuẩn lớn hơn. Đồng thời độ DD lớn thì sự tạo phức với nhóm NH2 có trong phân tử chitosan với các ion kim loại của tế bào vi sinh vật, làm
tăng khả năng ức chế sự phát triển của VSV do sự mất cân bằng. Theo kết quả
của Lê Tùng Dương (2009), ứng dụng chitosan trong bảo quản cá Đổng Quéo
thì với chitosan có nồng độ càng cao, độ DD càng lớn thì khả năng tiêu diệt vi


5

sinh vật càng mạnh và ngược lại. Cụ thể với CTS có DD = 95%, nồng độ 2% thì
tiêu diệt được 90,21%, trong khi đó CTS với DD = 85% tiêu diệt được 88,345%;
CTS với DD = 75% tiêu diệt được 87,31% VSV tổng số[7].
Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan mạch ngắn, khối lượng phân tử thấp,
độ deacetyl cao có hoạt tính sinh học cao hơn so với chitosan được sản xuất
theo quy trình thông thường. Một trong số những tính chất đó là hoạt tính chống
oxy hóa[1].
Một số tài liệu cho rằng độ deacetyl trong khoảng 55% – 70% gọi là mức
độ deacetyl thấp, khoảng 70% – 80% gọi là mức độ deacetyl trung bình và 85%
– 95% được gọi là mức độ deacetyl cao của chitosan[25]. Còn có tài liệu cho
thấy độ deacetyl thấp nhất tương ứng với chitosan có độ deacetyl dao động từ
40% đến 60%. Phần lớn các mẫu chitosan thương mại có độ deacetyl trung bình
từ 70% đến 90%. Đối với một số ứng dụng sinh học đặc biệt, chitosan có độ
deacetyl cao trên 95% (Tolaimatea et al., 2003)[21].
Công thức cấu tạo của chitosan:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitosan.
Công thức phân tử: (C6H11O4N)n

6

1.1.1. Tính chất của chitosan.
Độ deacetyl của chitosan
Quá trình deacetyl là quá trình tách nhóm acetyl ra khỏi phân tử chitin.
DD là thông số quan trọng, đặc trưng cho tỉ lệ giữa 2-acetamido-2-deoxy-Dglucopyranose với 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose trong phân tử chitin và
chitosan. Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan có độ deacetyl cao, tức là
chứa nhiều nhóm amino[1].
Tính chất của chitosan như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất
màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang DNA…
phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả
năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại tốt hơn. Tương tự, khả năng
kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ
deacetyl cao. Cụ thể, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có độ deacetyl
trên 90%. Tuy nhiên, khả năng hút nước của chitosan thì giảm đi khi tăng độ
deacetyl. Kết quả nghiên cứu của Trung và công sự (2006) cho thấy khả năng
hút nước của chitosan có độ deacetyl hóa thấp (75%) đạt đến 659% cao hơn
nhiều so với chitosan có độ deacetyl hóa cao chỉ đạt 486% (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl (Trung
và cộng sự, 2006)
Chitosan với độ deacetyl khác nhau
Tính chất

75%

87%

96%

111,2 ± 9,5

103,4 ± 7,9

107,3 ± 9,6

Tính thấm nước
(%)

659 ± 33

472 ± 35

486 ± 29

Độ tan (%)

99,4 ± 0,1

99,6 ± 0,3

99,5 ± 0,2

Độ nhớt (cP)

Phân tử lượng của chitosan


7

Phân tử lượng của chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, nó quyết
định tính chất của chitosan như khả năng tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ
chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Thông thường, phân tử lượng
của chitosan nằm trong khoảng từ 100.000 dalton đến 1.200.000 dalton (Li và
cộng sự, 1997). Phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin, điều
kiện deacetyl và thường rất khó kiểm soát. Chitosan có phân tử lượng thấp thì
thường có hoạt tính sinh học cao hơn, thường có nhiều ứng dụng trong nông
nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Chitosan có phân tử lượng lớn có khả
năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt. Độ nhớt của
chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng. Chitosan có phân tử lượng thấp có độ
nhớt từ 30 – 200 cps và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ
nhớt lên đến 3000 – 4000 cps. Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc
vào độ deacetyl, cường độ ion, pH, nhiệt độ[1].
Tính tan của chitosan
Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan
tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid
propionic, acid citric, acid lactic. pKa (hằng số phân ly) của chitosan có giá trị
từ 6,2 đến 6,8. Khi hòa tan chitosan trong môi trường acid loãng tạo thành keo
dương. Đây là một điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharite tự nhiên
tích điện âm. Chitosan tích điện dương sẽ có khả năng bám dính bề mặt các ion
tích điện âm và có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với
các polymer tích điện âm. Chitosan có DD càng cao thì khả năng tan càng tốt.
Một số dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan được trình bày ở Bảng
1.2. Chitosan không hòa tan trong nước, kiềm, cồn[1].


8

Bảng 1.2. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan

Dung môi

Nồng độ thường sử dụng (%)

Acid acetic

1–2

Acid formi

1–2

Acid lactic

1–2

Acid propionic

1–2

Acid HCl

0,25 – 0,5

Acid citric

5 – 10

Acid glutamic

1–3

Acid ascorbic

1–2

Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan
Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật: vi khuẩn Gram âm,
vi khuẩn Gram dương và vi nấm. Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ
thuộc vào DD và Mw. So với chitin, chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng
nấm tốt hơn vì chitosan tích điện dương ở vị trí C thứ ở pH nhỏ hơn 6.
Chitosan có độ deacetyl cao trên 85% thì có khả năng kháng khuẩn,
kháng nấm tốt. Chitosan có Mw ≤ 2000 dalton thì khả năng ức chế vi sinh vật
kém. Chitosan có Mw ≥ 9000 dalton thì có khả năng ức chế vi sinh vật cao
(Jeon và cộng sự, 2000). Tuy nhiên, chitosan có phân tử lớn thì khả năng kháng
khuẩn cũng thấp.
Chitosan được hòa tan trong các dung môi hữu cơ như acid acetic, acid
lactic và được sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm. Chitosan có khả năng
ức

chế

Staphylococus

aureus,

Bacillus

cereus,

Escherichia

coli,

Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutensis, Botrytis cinerea, Rhizopus


9

stolonifer, Aspergillus niger. Nồng độ ức chế của chitosan phụ thuộc vào loại
chitosan, loài vi sinh vật, điều kiện áp dụng và thường sử dụng trong khoảng
0,0075% đến 1,5%. Ngoài ra, các dẫn xuất của chitosan cũng có khả năng
kháng nấm, kháng khuẩn tốt. N-carboxymethylchitosan ở nồng độ 0,1 – 5
mg/ml trong môi trường pH 5,4 làm giảm khả năng sinh độc tố aflatoxin của
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (Shahidi và cộng sự, 1999)[1,
13].
Khả năng tạo màng của chitosan
Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt. Tính chất cơ lý của màng chitosan
như độ chịu kéo, độ rắn, độ ngấm nước, phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng và
độ deacetyl hóa của chitosan[1].
Chitosan có độ deacetyl cao có ứng suất kéo và độ giãn dài giới hạn cao
hơn màng chitosan độ deacetyl thấp, tuy nhiên chúng có độ trương nở thấp hơn
(Phụ lục 1, Bảng 1).
Các tính chất khác của chitosan:
Ngoài các tính chất nêu trên, chitosan còn có khả năng chống oxy hóa.
Khả năng chống oxy hóa của chitosan cũng phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử
lượng và độ nhớt của chitosan. Chitosan có độ nhớt thấp thì có khả năng chống
oxy hóa cao. Hơn nữa, chitosan có thể gắn kết tốt với lipid, protein, các chất
màu. Do chitosan không tan trong nước nên chitosan ổn định hơn trong môi
trường nước so với các polymer tan trong nước như alginate, agar. Khả năng

tạo phức, hấp phụ với lipid, protein và chất màu phụ thuộc nhiều vào phân tử
lượng, độ deacetyl hóa, độ rắn và độ tinh khiết của chitosan và thường biến
động lớn với các mẫu chitosan (Bảng 1.5). Chitosan có độ deacetyl cao thường
hấp phụ màu tốt.


10

Chitosan phản ứng với acid đậm đặc hình thành muối khó tan. Chitosan
phản ứng với iod và các acid sulfuric cho phản ứng màu tím nên người ta dùng
để phân tích định tính.
1.1.2. Ứng dụng của chitosan
Trong nông nghiệp: Chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống
nhằm chống lại sự tấn công của nấm gây hư hỏng hạt trong đất, đồng thời có
tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm cho
hạt. Ngoài ra, chitosan còn được sử dụng trong việc bảo quản kéo dài thời gian
sử dụng của các sản phẩm sau thu hoạch từ nông nghiệp.
Trong y dược: Chitosan được sử dụng làm chỉ tiêu tự hủy là do chitosan
là một polymer hữu cơ có thời gian phân hủy nhanh hơn nhiều so với các hợp
chất tổng hợp. Mặt khác, nó có tính kháng khuẩn không độc hại làm cho vết
thương mau lành.
Chitosan được sử dụng để tạo da nhân tạo chống nhiễm khuẩn và cầm
máu. Chitosan có đặc tính làm giảm cholesterol. Theo một số nghiên cứu thì
tác dụng hạ cholesterol của IMS (N,N,N-Trimethychitosan) là do có chứa phân
tử N+(CH3)3 các nhóm này có khả năng kết hợp với gốc Cl- của acid béo và
được đào thải khỏi cơ thể.
Ngoài ra chitosan là một keo dương, có khả năng “bẫy” lượng mỡ và đào
thải ra ngoài vì vậy đã có nhiều loại thuốc giảm béo với sự có mặt của chitosan
đã có mặt trên thị trường.
Trong công nghệ thực phẩm: chitosan là hợp chất polymer dương do

đó nó có khả năng bắt các keo âm có trong dịch quả, bia, rượu vang, nước giải
khát nên chúng được sử dụng như là một chất trợ lọc mang lại hiệu quả cao.
Chitosan được sử dụng bảo quản thực phẩm tươi sống để thay thế một số chất
bảo quản gây ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng. Với tính ưu việt của


11

chitosan là kháng nấm, kháng khuẩn, chống mất nước trong quá trình bảo quản,
không gây hại đối với người sử dụng.
Năm 2001 trường Đại Học Nha Trang đã ứng dụng thành công việc sử
dụng chitosan trong bảo quản thịt bò, kết quả kéo dài thời gian bảo quản và chất
lượng thịt ít biến đổi.
Năm 2004 trường Đại Học Nha Trang đã ứng dụng thành công chitosan
trong bảo quản cá, kết quả kéo dài thời gian bảo quản và giữ được chất lượng
của cá.
Ngày nay các nhà công nghệ thực phẩm đã nghiên cứu và sản xuất màng
chitosan trong đó có sự phối trộn chitosan, polyetylen và sorbitol tạo màng bền,
dai, bóng, đẹp sử dụng để bao bọc sản phẩm như xúc xích. Màng này dễ bị phân
hủy khi ta loại bỏ do đó giải quyết tốt vấn đề ô nhiễm môi trường.
Mặt khác, chitosan có thể được sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm
trong sản xuất giò chả để thay thế hàn the.
Trong mỹ phẩm: Do chitosan có thể dễ dàng cố định trên lớp biểu bì
của da nhờ các nhóm NH4, các nhóm này liên kết với tế bào sừng hóa của da.
Nhờ vậy khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm kem dưỡng da chống
nắng bằng cách ngăn chặn tia cực tím.
Chitosan là một polymer mang điện tích dương có thể kết hợp với protein
của tóc nhờ độ keo của nó khi khô làm cho tóc cứng và giữ được nếp tóc.
Trong lĩnh vực khác: Do cấu trúc tương tự cenllulose nên chitosan được
nghiên cứu bổ sung vào trong quá trình sản xuất giấy, làm tăng độ bóng, bền,

dai của giấy.


12

Ngoài ra, người ta còn sử dụng chitosan để thay thế tinh bột trong quá
trình hồ hóa vải, kết quả làm tăng độ bền của sợi, tạo độ bóng đẹp, cố định hình
in trên vải được rõ nét.
Chitosan có DD trong khoảng 75 – 85%: thường được sử dụng để làm
màng bao trong bảo quản thực phẩm. Nguyễn Thị Hằng Phương đã tiến hành
nghiên cứu ảnh hưởng của độ deaectyl chitosan đến khả năng bảo quản na, tác
giả cho rằng với chitosan có DD = 75%, nhúng na vào dung dịch chitosan 1%
kết hợp bao gói bằng màng film PE (polyetylen) có độ dày 0,04 mm, bảo quản
ở 10oC có thể làm chậm quá trình chín, giảm cường độ hô hấp và có thể kéo dài
thời gian bảo quản đến 12 ngày[10].
Ứng dụng của chitosan có độ deacetyl cao: Chitosan có độ deacetyl
cao thường được ứng dụng trong thực phẩm, y dược, sinh học, có khả năng
kháng khuẩn, kháng nấm tốt. Chien và cộng sự (2006) bảo quản được các lát
thanh long trong 7 ngày ở 8oC khi đã nhúng vào chitosan 1% (MW = 12,36
kDal, DD = 95 – 98%). Durango và cộng sự (2005) dùng chitosan 1,5% (MW
= 48,5 kDal, DD = 88,76%) để đánh giá lượng vi sinh vật trên trên carrot cắt
lát dày 5mm, bảo quản ở 10oC trong 15 ngày. Với nồng độ chitosan 1,5% đã
ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn lactic và coliform tổng số - các vi
khuẩn có liên quan đến sự hư hỏng của carrot trong thời gian bảo quản[16].
1.2. Quy trình sản xuất chitosan
Quá trình sản xuất chitosan từ chitin được thực hiện bởi công đoạn
deacetyl (deacetylation), đây là quá trình tách nhóm acetyl khỏi phân tử chitin.
Thông thường quá trình deacetyl được thực hiện bằng cách ngâm chitin trong
dung dịch NaOH hoặc KOH đậm đặc. Nồng độ thường sử dụng từ 40 – 50%,
ở nhiệt độ 100oC hoặc cao hơn. Công đoạn deacetyl được thực hiện ở các chế

13

độ rất đa dạng, phong phú, tùy thuộc vào nguồn chitin và yêu cầu về tính chất
của chitosan[3, 23] (Phụ lục 1, Bảng 2).
Quá trình deacetyl theo phản ứng sau:

Hình 1.2. Quá trình Deacetyl.
Một số quy trình sản xuất chitin-chitosan bằng phương pháp hóa học:
Bảng 1.3. Mô tả một số quy trình deacetyl bằng phương pháp hóa học

STT

1

2

3

Nồng độ
NaOH

15M

50%

40%

Thời gian

(giờ)

Nhiệt độ
(oC)

1

150

120

Nhiệt độ
phòng
(26 – 29)

5

o

80 ± 2 C

Độ deacetyl
(%)

Nguồn tài liệu

>70%

Yamashaki và
Nakamichi

(Nhật Bản)

80.22

Trần Thị
Luyến và cộng
sự (2004)

76.25

Trần Thị
Luyến, ĐH
Thủy Sản


14

1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ deacetyl trong quá trình sản xuất
chitosan
Độ deacetyl của chitosan: là khả năng cắt mạch nhóm acetyl của chitin
để tạo thành chitosan, sự cắt nhóm acetyl càng nhiều thì độ deacetyl càng lớn,
hay nói cách khác độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng
đặc trưng cho tỉ lệ giữa 2-acetamido-2-deoxy-Dglucopyranose với 2-amino-2deoxy-Dglucopyranose trong phân tử chitin và chitosan. Chitin có độ deacetyl
thấp còn chitosan có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amino[13].
Nhiệt độ của quá trình deacetyl: Nhiệt độ càng cao thì quá trình deacetyl
diễn ra càng nhanh. Sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl cao. Tuy nhiên,
nhiệt độ cao ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng của chitosan.
Thời gian và nồng độ kiềm: Quá trình deacetyl diễn ra nhanh ở giai đoạn
đầu. Theo Wu và Bough (1978), quá trình deacetyl đạt được 68% trong thời
gian 1 giờ khi thực hiện deacetyl với nồng độ NaOH 50% ở nhiệt độ 100oC.

Tuy nhiên, quá trình deacetyl diễn ra chậm lại, sau 5 giờ chitosan chỉ đạt được
78% DD. Kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy, sau 2 giờ xử lý độ deacetyl
không thay đổi nhiều so với 1 giờ mà chỉ có phân tử lượng của chitosan xử lý
sau 2 giờ giảm đáng kể, điều đó cho thấy, từ sau 1 giờ đến hết 2 giờ, chủ yếu
diễn ra quá trình cắt mạch chitosan. Ngoài ra, nồng độ kiềm cũng ảnh hưởng
đến chất lượng chitosan. Nếu nồng độ kiềm quá cao thì sẽ ảnh hưởng đến độ
nhớt và phân tử lượng của chitosan. Tuy nhiên, nếu nồng độ kiềm xử lý nhẹ
dẫn đến sản phẩm chitosan sẽ không tan hoặc tan không hoàn toàn.
Tỷ lệ giữa chitin và dung dịch kiềm: Tỷ lệ chitin: dung dịch NaOH
thường dùng là 1:10, trong một số nghiên cứu sử dụng tỷ lệ 1:15.
Ảnh hưởng của chất lượng chitin ban đầu: nếu chitin ban đầu không được
chiết rút trong điều kiện phù hợp (ví dụ: xử lý tách khoáng ở nồng độ acid HCl
quá cao, thời gian dài) thì chitin bị cắt mạch dẫn đến chitosan thu được có phân
tử lượng và độ nhớt thấp. Kích thước của chitin ban đầu, kích thước hạt càng nhỏ


15

thì quá trình deacetyl hóa diễn ra nhanh và sản phẩm chitosan thu được có chất
lượng cao hơn (độ nhớt, phân tử lượng, độ tan tốt hơn).
Điều kiện môi trường xử lý: Để hạn chế sự cắt mạch chitin trong quá
trình deacetyl hóa, người ta thực hiện công đoạn này trong môi trường khí nitơ
để hạn chế sự tiếp xúc với oxy không khí. Kết quả nghiên cứu của Bough và
cộng sự (1978) khẳng định deacetyl hóa trong môi trường khí nitơ thì tạo ra sản
phẩm chitosan có phân tử lượng và độ nhớt cao hơn sản phẩm chitosan được
deacetyl hóa trong môi trường không khí[21].
Quá trình deacetyl diễn ra chậm, đặc biệt ở nhiệt độ thấp, vì vậy muốn
rút ngắn thời gian sản xuất thì công đoạn deacetyl nên thực hiện ở nhiệt độ cao.
Độ deacetyl của sản phẩm chitosan thu được phụ thuộc nhiều vào các yếu tố
nồng độ NaOH sử dụng, nhiệt độ, thời gian xử lý và tỷ lệ. Nồng độ NaOH và

nhiệt độ xử lý càng cao thì độ deacetyl đạt càng cao. Tuy nhiên, phân tử lượng
của sản phẩm chitosan thu được sẽ thấp (Phụ lục 1, Bảng 3).
Để đạt được độ deacetyl cao trên 90% thì một thì cần thực hiện quá trình
deacetyl nhiều lần. Kết quả nghiên cứu của Trung và cộng sự (2006) cho thấy
muốn chitosan thành phẩm đạt được độ deacetyl 96% khi sử dụng chitin từ phế
liệu tôm thì cần phải thực hiện công đoạn deacetyl ở nhiệt độ 65oC và xử lý
2 lần (Phụ lục 1, Bảng 4). Thực hiện quá trình deacetyl một lần khó đạt được
độ deacetyl cao trên 90% vì giai đoạn cuối của quá trình deacetyl thì tốc độ
tách nhóm acetyl diễn ra rất chậm. Tuy nhiên, sau khi rửa sạch mẫu và tiếp
tục deacetyl thì quá trình deacetyl diễn ra nhanh hơn và đạt được độ deacetyl
cao.
Tuy nhiên, cần phải lưu ý là chế độ deacetyl ảnh hưởng lớn đến phân tử
lượng và độ nhớt của chitosan của sản phẩm chitosan, chế độ deacetyl càng cao
(nồng độ NaOH cao, nhiệt độ cao, thời gian dài) thì chitosan thu được có phân
tử lượng thấp (Phụ lục 1, Bảng 5). Do đó, để đạt được độ nhớt cao, phân tử
lượng lớn thì thực hiện quá trình deacetyl ở chế độ phù hợp, không nên sử dụng
nồng độ NaOH quá cao, nhiệt độ quá cao.


16

1.2.2. Ảnh hưởng của độ Deacetyl đến tính chất và ứng dụng của Chitosan
1.2.2.1. Ảnh hưởng của độ deacetyl đến tính chất của chitosan
Tính chất của chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh khiết, độ deacetyl
hóa, phân tử lượng và độ rắn. Chitosan có độ tinh khiết càng cao thì càng dễ
tan, màu sắc dung dịch hòa tan có độ trong cao, có tính kết dính cao và được
ứng dụng vào nhiều lĩnh vực hơn. Khả năng thấm nước của màng chitosan có
độ deacetyl hóa thấp thì cao hơn so với màng chitosan có độ deacetyl hóa cao.
Phân tử lượng của chitosan cũng là một thông số quan trọng, nó quyết định tính
chất của chitosan như khả năng hấp phụ chất màu. Độ rắn của chitosan phụ

thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn gốc chitin, độ deacetyl hóa, phân tử lượng
và thường có 2 peak chính ở khoảng 9 – 10oC và 20oC quét khi xác định bằng
nhiễu xạ tia X.
Mức độ deacetylation (DDA) ảnh hưởng đến vật lý, hóa học và sinh học
của chitosan, chẳng hạn như cơ sở acid và đặc điểm tĩnh điện, phân hủy sinh
học, tính chất hấp phụ,... Có nhiều phương pháp để tăng hoặc giảm mức độ
deacetyl. Sự gia tăng nhiệt độ hay nồng độ NaOH có thể tăng cường việc loại
bỏ các nhóm acetyl từ chitin và tạo ra các loại chitosan có tính chất khác nhau
và dựa vào đó để ứng dụng nó vào các loại thực phẩm hay dược phẩm phù hợp
(Baxter et al., 1992).
Độ deacetylation thấp nhất tương ứng với chitosan có độ deacetyl dao
động từ 40% - 60%. Phần lớn các mẫu chitosan thương mại có độ deacetyl
trung bình từ 70% - 90%. Đối với một số ứng dụng sinh học đặc biệt, chitosan
có độ deacetyl cao trên 95% (Tolaimatea et al., 2003)[20].
1.2.2.2. Ảnh hưởng của độ deacetyl đến khả năng ứng dụng của chitosan
Chitosan với độ deacetyl hóa thấp có khả năng hấp thụ nước cao hơn so
với chitosan có độ deacetyl hóa cao. Các loại màng được hình thành từ chitosan
có độ deacetyl hóa thấp cũng thể hiện khả năng hấp thụ nước và khả năng thẩm
thấu cao hơn các loại màng từ chitosan với độ deacetyl hóa cao. Điều này có lẽ
là do chitosan với độ deacetyl hóa thấp có độ rắn thấp hơn[9].


17

Khả năng hấp thụ chất béo và chất màu của chitosan có độ deacetyl hóa
cao lại cao hơn chitosan với độ deacetyl hóa thấp. Điều này là do số nhóm
amine tích điện dương trong mạch chitosan có độ deacetyl hóa cao lại nhiều
hơn[9, 24].
Màng chitosan với độ deacetyl hóa cao có độ căng dãn và dẻo dai cao
hơn màng chitosan với độ deacetyl hóa thấp, có lẽ là do độ rắn cao hơn và do

sự hình thành liên kết hydro nội phân tử nhiều hơn. Điều này cũng có thể giải
thích rằng độ trương nở của màng chitosan bị ảnh hưởng chủ yếu bởi những
nhóm ưa nước trong những vùng vô định hình của màng và sự hình thành liên
kết hydro nội phân tử[9, 15, 24].
Khả năng kháng khuẩn của chitosan tăng lên theo độ deacetyl hóa của
chitosan. Vì chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì khả năng hòa tan của nó
càng lớn và chitosan tích điện dương càng nhiều trong môi trường acid[9, 24].
Các công trình nghiên cứu trước đó:
Ahn và cộng sự (2003) báo cáo rằng màng bao chitosan (120kDa, DD =
85%) cải thiện được thời hạn sử dụng và chất lượng của bánh mỳ bằng cách ức
chế sự sinh trưởng của vi sinh vật, làm chậm quá trình oxy hóa và thoái hóa[16].
Park và cộng sự (2005) đánh giá hiệu quả kháng nấm của chitosan 2%
(DD = 89,9%; hòa tan trong 0,5% acid acetic) và chitosan 2% chứa 0,3%
potassium sorbate (PS) chống lại Cladosporium sp. và Rhizopus sp. đã được
phủ trên dâu tây tươi bằng cách ngâm[16].
Del Blanco và cộng sự (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan DD
(73% đến 95%) trên tính nhũ tương hóa. Kết quả cho thấy rằng tất cả DD cho
ra hệ nhũ tương nước/dầu/nước phân tán ổn định với các độ nhớt khác nhau.
Hai giá trị DD tối ưu đã được tìm thấy là 81% và 88%, cho hệ nhũ tương hóa
hoàn toàn không có dầu dư hoặc lắng[16].
 Các phương pháp đánh giá độ deacetyl chitosan
Bên cạnh phân tử lượng, độ deacteyl – DA hoặc (deacetyl – DD) cũng là
một chỉ tiêu quan trọng có nhiều ảnh hưởng đến các tính chất lý hóa và chức


18

năng của chitin, chitosan. Độ acetyl hay deacetyl của chitin, chitosan có thể
được đánh giá thông qua nhiều phương pháp khác nhau, các phương pháp này
có thể xếp thành 3 nhóm chính: (1) nhóm phương pháp quang phổ

(spectroscopic methods) gồm phương pháp NMR, UV và IR; (2) nhóm phương
pháp truyền thống (conventional methods) với các phương pháp chuẩn độ và
nhuộm màu với ninhydrin; và nhóm phương pháp phá vỡ cấu trúc (destructive
methods) gồm phương pháp phân tích nguyên tố, thủy phân với acid/enzyme
kết hợp với phân tích sắc ký hoặc so màu.
Mỗi phương pháp đều có những ưu và hạn chế riêng, việc lựa chọn
phương pháp phân tích sẽ tùy thuộc vào đặc điểm của mẫu cần phân tích và
điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, tuy nhiên các phương pháp thuộc
nhóm 1 và 3 thường được sử dụng rộng rãi hơn[8, 19]. Đối với các nghiên cứu
cần xác định độ deacetyl thường xuyên với số lượng mẫu lớn thì các phương
pháp xác định thông qua đo mức độ hấp thụ tia cực tím của N-acetyl
glucosamine tỏ ra có ưu thế vì đơn giản, nhanh và chi phí thấp[8, 17], đặc biệt
thủ tục phân tích sử dụng acid phosphoric làm dung môi hòa tan chitin, chitosan
do Hsiao và cộng sự đề xuất, sau đó được phát triển bởi Hein và cộng sự, được
chứng minh là có độ tin cậy cao với một phổ DD rộng vì vậy thích hợp cho cả
chitin và chitosan[8, 17, 18]. Độ deacetyl của mẫu sau deacetyl là giá trị trung
bình độ deacetyl của phần tan và không tan trong acid loãng của sản phẩm, và
việc phân riêng hay không phân riêng phần tan và không tan không có ảnh
hưởng đến kết quả[8, 23].