Xác định một số axit béo trong dầu gấc bằng kỷ thuật sắc ký khí

I H C QU C GIA HÀ N I
TR

NG

I H C KHOA H C T

NHIÊN

-----------------------

Nguy n Ng c H ng

XÁC

NH M T S

AXÍT BÉO TRONG D U G C

B NG K THU T S C KÝ KHÍ

LU N V N TH C S KHOA H C

Hà N i – 2010


I H C QU C GIA HÀ N I
TR

NG

I H C KHOA H C T

NHIÊN

-----------------------

Nguy n Ng c H ng

XÁC

NH M T S

AXÍT BÉO TRONG D U G C

B NG K THU T S C KÝ KHÍ

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã s : 60 44 29

LU N V N TH C S KHOA H C

NG

IH

NG D N KHOA H C

PGS. TS. Ph m Lu n

Hà N i - 2010

M CL C
Trang
M
U .......................................................................................................................... 1 
CH
NG 1: T NG QUAN ............................................................................................. 2 
1.1. Cây G c và d u G c ............................................................................................... 2 
1.1.1. Cây G c............................................................................................................... 2 
1.1.2.  D u G c .............................................................................................................. 3 
1.2. T ng quan v axít béo không no ............................................................................. 5 
1.2.1. Axít linoleic ........................................................................................................ 5 
1.2.2. Axít oleic ............................................................................................................ 7 
1.3. Các ph ng pháp phân tích axít béo....................................................................... 8 
1.3.1. Các ph ng pháp chung ..................................................................................... 8 
1.3.2. Các ph ng pháp s c ký ................................................................................... 12 
CH
NG 2:
I T NG - PH
NG PHÁP NGHIÊN C U ..................................... 24 
2.1.
i t ng, m c tiêu và nhi m v nghiên c u ...................................................... 24 
2.1.1.
i t ng và m c tiêu nghiên c u................................................................... 24 
2.1.2. Nhi m v nghiên c u ........................................................................................ 25 
2.2. Ph ng pháp nghiên c u ..................................................................................... 26 
2.2.1. Ph ng pháp s c ký khí ..................................................................................... 26 
2.2.2. nh l ng các axit béo b ng GC – FID ........................................................... 32 
2.2.3. Ph ng pháp x lý và đánh giá k t qu ............................................................. 33 

2.3. Hóa ch t và d ng c ............................................................................................. 34 
2.3.1. Hóa ch t ............................................................................................................. 34 
2.3.2. D ng c .............................................................................................................. 35 
CH
NG 3: K T QU VÀ TH O LU N.................................................................... 36 
3.1. Kh o sát các đi u ki n s c ký t i u đ i v i vi c phân tích các axít béo ............... 36 
3.1.1. L a ch n c t tách .............................................................................................. 36 
3.1.2. Kh o sát ch ng trình nhi t đ c t tách ........................................................... 36 
3.1.3. Kh o sát t c đ khí mang ................................................................................. 39 
3.1.4. Kh o sát th tích b m m u ............................................................................... 41 
3.1.5. T ng k t đi u ki n ch y s c ký......................................................................... 43 
3.2. T i u hóa quá trình metyl este hóa ...................................................................... 43 
3.2.1. Kh o sát nh h ng c a th tích NaOH/MeOH 0,5M....................................... 43 
3.2.2. Kh o sát nh h ng c a th tích BF3/MeOH 20% ........................................... 46 
3.2.3. Kh o sát nh h ng th i gian este hóa ............................................................. 48 
3.2.4. Qui trình chu n b m u chu n h n h p ............................................................. 51 
3.3. Xây d ng ph ng pháp đ nh l ng h n h p hai axít béo ...................................... 51 
3.3.1. Kh o sát gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh l ng .......................................... 51 
3.3.2. Kh o sát kho ng tuy n tính .............................................................................. 53 
3.3.3. Kh o sát đ l p l i c a phép đo ......................................................................... 56 
3.4. ng d ng qui trình phân tích các m u d u G c .................................................... 57 
3.4.1. X lý s b m u phân tích ................................................................................ 57 
3.4.2. Phân tích m u th t ............................................................................................ 58 
K T LU N..................................................................................................................... 64 
TÀI LI U THAM KH O ............................................................................................... 67 


M

U

T xa x a, ông cha ta đã bi t s d ng các cây c trong thiên nhiên đ
làm thu c c ng nh các ch ph m sinh h c nh m t ng c
kh e c a mình. N

ng và b o v s c

c Vi t Nam n m trong khu v c nhi t đ i, gió mùa, thu n
c phát tri n, trong đó có cây G c. Các b ph n

ti n cho nhi u lo i th o d

c a G c có nhi u công n ng khác nhau, trong đó d u G c đã đ
đ dùng nh m t lo i th c ph m ch c n ng nh m t ng c

c chi t xu t

ng s c đ kháng,

ch ng lão hóa t bào, cung c p vitamin, … cho c th .
D u G c có ch a nhi u nhi u ch t b d

ng, trong đó có các axít béo

no và không no mà vai trò c a các axít béo không no là quan tr ng h n c .
Hi n nay đã có nhi u ph

ng pháp phân tích các axít béo không no v i nhi u

k thu t khác nhau, tuy nhiên khi áp d ng trong d u G c thì có r t ít công

trình công b m t cách t m và chi ti t.
đóng góp thêm ph

ng pháp phân tích cho đ i t

ng này, chúng tôi

ti n hành nghiên c u các đi u ki n tách c ng nh xác đ nh đ ng th i hai axít
béo không no có hàm l
b ng ph

ng cao trong d u G c là axít oleic và axít linoleic

ng pháp s c ký khí (GC) s d ng detector FID.

1


CH

NG 1: T NG QUAN

1.1. Cây G c và d u G c
1.1.1. Cây G c
G c có tên khoa h c là Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng, h
Bí (Cucurbitaaceae) b

Violales. G c còn có tên khác là Muricia

cochinchinensis Lour., Momordica macrophuylla Gage, Momordica mixta

Roxburgh.
m ts n

c, G c đ

c g i là: M c Mi t (Trung Qu c), Spiny bitter-

cucumber, Chinese bitter-cucumber, Chinese cucumber (Anh), Margones à
piquants (Pháp), Makkao (Kh me) [1,5].
1.1.1.1.

c đi m th c v t

G c là loài cây thân th o dây leo thu c chi M

p đ ng. Cây g c leo

kh e, chi u dài có th đ n 15m. Thân dây có ti t di n góc. Lá g c nh n, thùy
hình chân v t phân ra t 3 đ n 5 d , dài 8-18 cm. G c là loài đ n tính khác
g c (dioecious). Hoa s c vàng. Qu hình tròn, s c xanh, khi chín chuy n sang
màu đ cam, đ

ng kính 15-20 cm. V g c có gai r m. B ra m i qu th

ng

có sáu múi. Th t g c màu đ cam. H t g c màu nâu th m, hình d p, có khía.
G c tr hoa mùa hè sang mùa thu, đ n mùa đông m i chín. M i n m g c ch
thu ho ch đ

c m t mùa. Do v thu ho ch t

ng đ i ng n (vào kho ng tháng

12 hay tháng 1), nên g c ít ph bi n h n các lo i qu khác.
1.1.1.2. Thu hái
Qu G c chín hái v , đem b ngang, vét h t v i c màng đ . N u đ
n u xôi thì dùng h t v i c màng đ tr n v i g o (có th thêm ít r

u). N u

đ ch d u thì ph i ph i hay s y khô h t t i khi không còn còn dính tay. Bóc
l y l p màng h t r i l i ph i hay s y khô

2

nhi t đ th p (60 – 700C).


1.1.1.3. Công d ng c a các b ph n
ng đ

H t G c (Semen Momordicae) th

c g i là M c mi t t là h t

qu G c chín đã bóc v màng và ch bi n khô, đã đ

l y

đi n Vi t Nam (1983) và D

c ghi vào D

c

c đi n Trung Qu c (1963, 2000).

D u G c (Oleum Momordicae) ép t màng đ bao xung quanh h t đã
ph i hay s y khô và đã đ

c ghi vào D

c đi n Vi t Nam I (1971).

R G c (Radix Momordicae) còn g i là Phòng k nam là r cây G c thu hái
vào mùa đông đã ph i khô.
1.1.2. D u G c
1.1.2.1. Các ph

ng pháp s n xu t

Mu n ch d u G c, tr
áp d ng m t trong các ph

c h t s y khô màng h t G c, sau đó tán nh r i

ng pháp sau [3]:

- Chi t b ng dung môi ete d u h a: L y ki t b ng dung môi ete d u

h a, sau đó thu h i ete d u h a b ng cách đun cách th y trong môi tr

ng khí

tr , c n còn l i là d u G c.
- Ép: Màng đ đã s y khô, tán nh đem đ lên r i ép.
- Ph

ng pháp th công nghi p: Màng h t G c đã s y khô tán nh cho

vào ch o d u l c hay m l n đã đun nóng

nhi t đ 60 – 700C. D u l c hay

m l n s hòa tan ch t d u ch a trong màng d u G c.
D u G c sau đó đ

c b o qu n trong chai màu nâu, đóng đ y, nút kín.

1.1.2.2. Tính ch t lý hóa
- D u G c là ch t l ng, sánh, trong, màu đ máu, mùi th m ng t đ c
bi t, v béo, không khé c . N u đ lâu ho c

nhi t đ 0 – 50C xu t hi n

c n, c n đó là các tinh th carotenoid.
-

hòa tan: D tan trong ete d u h a, cloroform và ete.

- T tr ng: D = 0,9151 – 0,9156 g/cm3

3

150C.


- Ch s khúc x : 1,4681 – 1,4685 [2].
- Thành ph n hóa h c: 100g d u này có 150 - 175mg

- caroten, kho ng

4g lycopen và 12mg alpha tocopherol (vitamin E thiên nhiên). Axít
panmitic (33,4%), axít stearic (7,9%), đ c bi t là các axít không no nh
axít oleic (44%) và axít linoleic (14,7%) là hai axít béo r t c n thi t cho
c th . D u G c c ng còn ch a các vi l

ng c n thi t nh : s t, đ ng,

coban, kali và k m ...[1,5].
1.1.2.3. Tác d ng sinh h c và công d ng
Khi vào c th ,

- caroten (ch t ti n vitamin A) s đ

c chuy n hoá

thành vitamin A tu theo nhu c u, vì v y khi dùng d u g c, không có hi n
t

ng th a vitamin A. Hàm l

ng vitamin A trong d u g c cao g p 1,8 l n so

v i d u gan cá thu, g p 15 l n so v i c cà r t và g p 68 l n so v i qu cà
chua.

ây là ngu n vitamin A thiên nhiên r t quý giá, có tác d ng phòng

ng a và ch a b nh thi u vitamin A, là nguyên nhân gây khô giác m c m t,
b nh quáng gà, suy dinh d
trên th tr

ng và ch m l n

tr em. Các thu c vitamin A

ng là ch t t ng h p, n u u ng quá nhi u s có h i, đ c bi t gây

nguy c gãy x

ng háng

ph n . N u không có ch đ nh c a th y thu c thì

không nên u ng tr c ti p vitamin A mà c n thay th b ng các lo i th c n có
ch t

- caroten thiên nhiên là ngu n cung c p vitamin A giúp c th d h p

th an toàn và không đ c h i cho gan.
D u g c còn có hàm l

ng lycopen r t cao nên có tác d ng làm gi m

nguy c ung th (nh t là ung th tuy n ti n li t và ung th d dày).

-

caroten và lycopen là các ch t carotenoid, lo i ch t ch ng oxy hoá c a th c
v t có tác d ng d n s ch các g c t do (các nguyên t và phân t

tr ng thái

không n đ nh, có ho t tính hoá h c r t cao) và các s n ph m oxy hoá đ c h i
do các g c t do sinh ra, giúp c th kho m nh và kéo dài tu i thanh xuân.
Có th ví ch t carotenoid nh cái ch i quét rác trong c th có nhi m v "quét
4


d n" th

ng xuyên các s n ph m oxy hoá không nh ng làm cho c th b già

nhanh, mà nó còn tham gia gây nhi u b nh hi m nghèo nh s v a đ ng
m ch, thoái hoá th n kinh, đ c thu tinh th m t, b nh Alzheimer, viêm
nhi m, ung th ...
D u g c còn có tác d ng phòng ng a và đi u tr b nh viêm gan, x gan
ho c nguy c phát tri n ung th gan, lo i tr đ c h i cho ng

i làm vi c trong

ng có ch t đ c. G n đây, nhi u công trình nghiên c u ch ra r ng

môi tr

-

caroten, lycopen và alpha - tocopherol trong d u g c có kh n ng làm m t tác
d ng c a 75% nh ng ch t gây b nh ung th nói chung, đ c bi t ung th vú.
Nó đ

c dùng cho b nh nhân b ung th sau khi c t b kh i u, sau hoá tr và

x tr . Axít linoleic trong d u g c là m t vitamin F, có nh h

ng đ n chuy n

hoá các lipit, phospholipit, giúp c th th i b t cholesterol ch ng nhi m m
và làm v ng b n thành m ch máu. Nó c ng có tác d ng b o v da và t ng s c
ch ng đ c a c th .
D u g c còn kích thích sinh ra l p mô m i, làm cho v t th

ng mau

lành, đ ch a các v t b ng, loét và n t k vú … [4].

1.2. T ng quan v axít béo không no
D u G c ch a nhi u các axít béo no và không no, trong đó có các axít
không no oleic ( 9) và linoleic ( 6) là nhi u h n c .

ây là các axít quan

tr ng nh t vì nó c n thi t cho s phát tri n c a c th con ng
c ng đ

c g i là các vitamin F [7],[12],[30].

1.2.1. Axít linoleic
- Công th c c u t o

5

i. Các axít này


- Tên IUPAC: axít (9Z, 12Z) – octadeca – 9,12 – dienoic.
- Công th c phân t : C18H32O2.
- Kh i l

ng phân t : 280,45 g.mol-1.

- T kh i: 0,9 g.cm-3.
-

i m nóng ch y: - 5 0C.

-

i m sôi: 229 0C.

-

tan trong metanol : 903,05 g.l-1.

- Tên khác: Omega 6.
- Tác d ng:
Axít linoleic là m t axít béo không no nhi u l n đ

c s d ng đ sinh t ng

h p axít arachidonic và sau đó là prostaglandin. Axít linoleic n m trong nhóm
các axít béo c n thi t g i là các vitamin F mà c th chúng ta không t ng h p
đ

c [18].
Nó đ

c tìm th y trong lipid c a màng t bào. Nó c ng có nhi u trong d u

th c v t c a các lo i h t cây anh túc, hoa h
trên 50% kh i l

ng và tinh d u ngô v i

ng.

S thi u h t axít linoleic s d n đ n hi n t
n ng lành v t th

ng d

ng kém [27].

6

ng khô và r ng tóc [14] kh


1.2.2. Axít oleic
- Công th c c u t o

- Tên IUPAC: axít (9Z) – octadec – 9 – enoic.
- Công th c phân t : C18H34O2.
- Kh i l

ng phân t : 282,4614 g.mol-1.

- T kh i: 0,895 g.cm-3.
-

i m nóng ch y: 14 0C.

-

i m sôi: 360 0C.

- Tên khác: Omega 9.
- Tác d ng:
Axít béo c n cho s phát tri n bình th

m nh, cân b ng l

ng và giúp cho màng t bào kh e

ng hormon và h th ng mi n d ch.

Axít béo c n thi t cho vi c t ng h p các mô m , gi vai trò quan tr ng
trong vi c cân b ng m c cholesterol, đi u ch nh m c protagladin, hormon.
V i da, axít béo cung c p ch t dinh d

ng, làm cho tóc và da óng m

t,

kh e m nh. Nó c ng có vai trò trong quá trình t ng h p hormon adrenalin và
hormon sinh d c. Axít béo no c ng có tác d ng kích thích h vi khu n có ích
trong ru t. Phù c ng m t ph n do thi u các axít béo. Axít béo có l i cho b nh
viêm kh p, chúng giúp vi c v n chuy n d n truy n th n kinh. N u thi u axít
béo có th d n đ n kém thông minh và nh h
7

ng đ n trí nh [14].


1.3. Các ph
1.3.1. Các ph
Các ph

ng pháp phân tích axít béo
ng pháp chung

ng pháp chung thông th

béo ch không th xác đ nh đ

ng dùng đ xác đ nh t ng các axít

c các axít riêng r . Có th chia chúng thành

ng pháp sau đây:

các ph

1.3.1.1. Ph
Ph

ng pháp chu n đ hóa h c
ng pháp chu n đ hóa h c dùng đ xác đ nh các axít béo v i n ng

đ b ng ho c l n h n 1mM. Ph

ng pháp này th

ng dùng đ xác đ nh ch

s axít trong d u th c v t và ch t béo.
Ph

ng pháp chu n đ hóa h c đ

c th c hi n theo qui trình sau:

Cân 0,1 đ n 10 gam d u hay ch t béo, sau đó hòa tan và đ nh m c
b ng h n h p dung môi, etanol 95% và dietylete v i t l th tích là 1:1, đ n
50ml. Dung d ch sau ph n ng đ

c chu n đ b ng dung d ch KOH 0,1M

trong metanol v i ch th là phenolphatalein.
Ch s axít đ

c qui ra b ng s mg KOH dùng đ trung hòa axít béo t

do có trong 1 gam ch t béo.
Vào n m 2005, Bahruddin Saad và các c ng s đã k t h p ph
pháp tiêm dòng ch y và ph

ng pháp chu n đ khi xác đ nh các axít béo t

do có trong d u c . H th ng 1 kênh và 2 kênh thu c th đã đ
v i các thu c th l n l

đ t

ng pháp PORIM, k t qu cho th y 2 ph

ng quan cao (R2 = 0,92). M t khác, ph
8

ng

ng là 35 – 74 và 21 –

46 m u / gi đ i v i h th ng 1 và 2 kênh. 50 m u d u c đã đ
c so sánh v i ph

c kh o sát

t là phenolphtalein và bromthymol xanh. Ph

pháp trên cho th i gian phân tích khá nhanh v i s l
đ

ng

c kh o sát và
ng pháp có

ng pháp trên không b

nh


h

ng c a màu n n c a m u khi ph h p th UV-VIS ch ra r ng đ h p th

c a m u là c c ti u t i b

c sóng phát hi n c a phenolphthalein (562 nm) và

bromthymol xanh (627 nm) [11].
ng pháp chu n đ đo nhi t (trong môi tr

1.3.1.2. Ph

ng không n

c)

ng pháp chu n đ đo nhi t d a trên k thu t CETT, Catalyzed

Ph

Endpoint Thermometric Titrimetry [29]. K thu t này t
hóa h c thông th
trong m u đ

ng nh ng l

ng t nh chu n đ

ng d ion OH- sau khi trung hòa các axít béo

c dùng làm xúc tác cho m t ph n ng t a nhi t m nh gi a các

c u t trong h n h p dung môi (axeton và clorofom, 25/2, v/v) dùng đ hòa
tan m u các ch t béo hay m u d u.
ng pháp s d ng m t đ u đo nhi t đ đ n gi n và cho k t qu

Ph

phân tích nhanh khi đ

c t đ ng hóa. Th i gian phân tích th

ng ch m t t

1 – 3 phút v i đ chính xác cao. Ngoài ra đ u dò nhi t không c n ph i chu n
hóa tr

c khi đo, thí nghi m ti n hành

l i c a ph

đi u ki n th

ng c ng là m t thu n

ng pháp.

1.3.1.3. Ph

ng pháp đo d a vào s t o ph c c a axít béo và kim lo i

D a vào s t o ph c c a các axít béo và m t s ion kim lo i (Cu2+,
Co2+) ng

i ta đã phát tri n ph

nhiên, các ph

ng pháp trên có đ nh y kém và th i gian phân tích lâu.

c i ti n đ nh y c a ph
đã s d ng ph

ng pháp đo quang đ xác đ nh chúng. Tuy

ng pháp này, Ho R.J. [19] và các c ng s

ng pháp phóng x đ phân tích ph c c a axít béo và 60Co.

M u axít béo sau khi đ

c hòa tan trong ung môi n-hexan đ

c thêm vào

thu c th Co(NO3)2 và 60Co(NO3)2 trong dung môi n-hexan và clorofom. Sau
khi ly tâm, h n h p sau ph n ng tách l p; ph n ph c c a axít béo và kim

9


lo i đ

c chi t ra

pha h u c đem đi đo ho t đ phóng x . K t qu đ

c so

sánh v i dung d ch chu n g c c a các axít béo.
Vào n m 2005, Marta Bernárdez [26] và các c ng s đã bi n đi u
ng pháp Lowry khi phân tích các axít béo t do trong th t cá. Ông đã

ph

thay th dung môi benzen b ng dung môi ít đ c h n là xiclohexan. M u ch t
béo làm khô đ

c hòa tan trong 3 ml xiclohenxan và tr n l n v i 1 ml thu c

th đ ng axetat – pyridin. Sau khi l c đ u và li tâm, l p trên c a h n h p
đ

c chi t ra và đem đo quang

quan cao khi so sánh v i ph
1.3.1.4. Ph
Ph

b

c sóng 715 nm. K t qu cho s t

ng

ng pháp chu n đ truy n th ng.

ng pháp enzim
ng pháp enzim c ng đ

c dùng đ xác đ nh l

béo t do có trong huy t thanh và huy t t

ng. Ph

ng nh các axít

ng pháp d a trên s axyl

hóa các axít béo m ch không phân nhánh b i enzim acyl-CoA synthetase
(ACS) t o ra m t l

ng đ

ng t

monophosphate). Sau đó s

ng acyl-CoA và AMP (adenosine

d ng các ph n

ng ghép c p c a AMP v i

myokinase (MK), pyruvate kinase (PK) và lactate dehydrogenase (LHD) đ
t o ra NADH (nicotinamide adenine dinucleotide). NADH đ

b ng ph

c xác đ nh

ng pháp hu nh quang.

Vào n m 1992, Jebens E. [23] và các c ng s đã dùng ph
trên đ xác đ nh m t l

ng nh các axít béo b ng cách chi t chúng v i thu c

th Triton X-100. Các phép đo đ
huy t thanh và huy t t
thu đ

ng pháp

c ti n hành l p l i trong 5 m u c a m u

ng v i kho ng n ng đ t 0 đ n 2 mmol.l-1. K t qu

c khá t t v i h s bi n thiên gi a các m u và trong m i m u l n l

là 1,7 và 4%.

10

t

1.3.1.5. Ph

ng pháp quang h c

Ngày nay, v i s phát tri n c a máy tính hi n đ i cùng v i các thu t
toán m i mà các ph

ng pháp quang h c c ng đ

c ng d ng r ng rãi đ xác

đ nh các axít béo.
Satoshi Yoshida [32] và các c ng s đã ng d ng ph

ng pháp ph

h ng ngo i chuy n hóa Fourier (FTIR) đ phân tích các axít béo no và không
no có trong các mô niêm m c và đ
n

c ng d ng phân tích m u mô c a 3

c là Iran, Vi t Nam và Indonesia. Ph h ng ngo i b c hai và thu t toán

bình ph

ng t i thi u riêng ph n đã đ

c áp d ng và cho k t qu t t. H u

nh t t c các thành ph n axít béo có trong niêm m c mi ng khá g n nhau khi
ng pháp GC-MS) và giá tr tiên đoán

so sánh gi a giá tr chu n (đo b ng ph
d a trên ph

ng trình h i qui. Ph

ng pháp này c ng có th áp d ng phân

tích axít béo trong các l nh v c nh th c ph m, y t d phòng hay d ch t h c.
Vào n m 2008, Di Wu [15] và các c ng s đã s d ng ph

ng pháp

quang ph c n h ng ngo i đ xác đ nh axít -linolenic và axít linolenic trong
8 lo i d u n và h n h p c a chúng. Các tác gi đã s d ng phép bi n đ i
wavelet đ gi m kích th
qui bình ph
ph

ng t i thi u riêng ph n. Ph

ng pháp bình ph

K t qu thu đ
khác nh .

c t p s li u đ u vào tr

c khi cho vào mô hình h i

ng pháp trên đ

c đ i chi u v i

ng t i thi u riêng ph n s d ng đ y đ d li u ph .

c cho th y 2 ph

ng pháp có đ t

i v i axít -linolenic l n l

axít linoleic là 0,9054 và 0,0437. Ph

ng quan cao và đ sai

t là 0,9345 và 0,0123; còn đ i v i

ng pháp cho k t qu nhanh, chính xác

và có th áp d ng trong nhi u m u khác nhau.

11


1.3.2. Các ph

ng pháp s c ký

T khi ra đ i đ n nay, s c ký v n luôn là ph

ng pháp h u hi u nh t

khi c n xác đ nh riêng r các ch t trong cùng m t h n h p. Trong khi đó các
axít béo hay đi cùng v i nhau và vi c xác đ nh riêng bi t chúng là m t vi c
làm c n thi t. Vi c áp d ng các ph
hi n nay là ph

ng pháp s c ký xác đ nh các axít béo

ng pháp ph bi n và có r t nhi u công trình nghiên c u v

v n đ nay. Trong khuôn kh c a lu n v n ch đ c p đ n các qui trình nghiên
c u chính khi s d ng ph
1.3.2.1

Ph

ng pháp s c ký trong phân tích axít béo.

ng pháp s c ký khí (GC)

S c ký khí đ

c xem là ph

ng pháp h u hi u nh t hi n nay dùng đ

phân tích các axít béo trong các lo i n n m u khác nhau. Tuy nhiên do s c ký
khí ch áp d ng đ i v i nh ng ch t d bay h i trong khi các axít béo có trong
t nhiên đa s có nhi t đ sôi cao nên chúng ph i đ
m t qui trình xác đ nh axít béo b ng s c ký khí th

c d n xu t hóa. Do đó
ng bao g m 2 giai đo n

chính là d n xu t hóa và xác đ nh.
a)

Các ph
Tr

ng pháp d n xu t hóa axít béo:

c khi phân tích s c ký khí, vi c làm đ u tiên là chuy n hóa các axít

béo thành các d n xu t d bay h i nh là metyl este hay các d n xu t khác.
Các lipid trong ch t béo, d u th c v t th

ng đ

c este hóa đ chuy n

glyxerol thành các ancol nh h n (metanol hay butanol . . . ) trong môi tr

ng

axít (HCl, H2SO4 hay BF3).

Quá trình metyl este hóa không nh ng có th th c hi n trong môi
tr

ng axít, môi tr

ng ki m đ i v i các axít béo t do, hay lipid đã đ

c

tách ra kh i n n m u mà nó còn có th th c hi n tr c ti p trong qui trình m t

12


b

c b ng cách k t h p vi c chi t và chéo hóa este trong m t l

ng nh m u

khô.
qui mô l n, các metyl este c a axít béo (FAMEs), đ
là nhiên li u diesel sinh h c, đ

c s d ng nh

c đi u ch b ng ph n ng chéo hóa este c a

d u th c v t v i natri metylat, NaOH hay KOH trong môi tr

ng khô.

Ngoài ra, đ i v i m t s m c đích nh t đ nh, chúng ta có th t o các
d n xu t khác nhau đ i v i axít béo.
•

Este hóa v i xúc tác axít:
D n xu t thông d ng nh t c a axít béo là metyl este đ

b ng cách đun nóng axít béo t do v i m t l

c đi u ch

ng d metanol khan v i s có

m t c a xúc tác axít, BF3.
+ Hóa ch t:
o Dung d ch BF3 14% trong metanol (Altech ho c Sigma),
o Pentan, chloroform.
+ Qui trình:
M t l

ng nh d ch chi t lipid (10 mg) cho vào ng nghi m có nút

xo n. Thêm vào đó 1 ml BF3/metanol. N u ch phân tích trianxylglyxerol hay
sterol este, ho c chúng có hàm l

ng cao trong d ch chi t thì d ch chi t đ

c

hòa tan trong 0,75 ml chloroform/metanol (1/1,v/v) và 0,25 ml BF3/metanol
đ

c cho vào. Sau đó, đóng ch t nút xo n, đun nóng trong n

cách cát

c sôi (ho c b p

1000C). Th i gian đun tùy thu c d ng m u, thông th

phút.

13

ng t 5 – 45


ng nghi m sau đó đ

c làm l nh, thêm vào đó 1 ml n

c và 2 ml

pentan. L c ng nghi m trong vòng 1 phút, ly tâm t i t c đ th p và chi t l y
trên. Pentan đ

pha h u c

c cho bay h i và ph n d đ

– 100 µL hexan ngay l p t c. Dung d ch trên đ

c hòa tan trong 50

c đem tiêm tr c ti p vào c t

s c ký khí.
+ Các ph

ng pháp khác:

* Vào n m 2008, Ernesto Mendez Antolin và các c ng s [16] đã nghiên
c u 5 ph

ng pháp t o d n xu t khác nhau khi xác đ nh các axít béo no t C24

– C36. Các ph

ng pháp t o d n xu t bao g m:

- Metyl hóa b ng diazometan
- Metyl hóa v i h n h p axít sulfuric – metanol
- Metyl hóa v i h n h p axít clohidric – metanol
- Metyl hóa v i h n h p BF3 – metanol
- Metyl hóa b ng N-metyl-N-trimetylsilyltrifloaxetamit.
Sau khi đánh giá các thông s nh giá thành, t c đ phân tích, tính an
toàn, đ nh y, các tác gi k t lu n ph

ng pháp s d ng h n h p axít sulfuric

– metanol cho k t qu t t nh t.
* Ph

ng pháp metyl hóa b ng axít clohidric th

khác nhau c ng đ

ng m i t các ngu n

c Ichihara K. và c ng s [20] nghiên c u khi xác đ nh

axít béo trong các m u sterol este, trianxylglyxerol, photpholipit. Hi u su t
quá trình este hóa đ

c so sánh v i BF3 – metanol. Ph

ng pháp cho hi u

su t este hóa cao, đ n 96% trong khi v n s d ng hóa ch t r ti n, an toàn và
thu n l i, d ki m. Qui trình phân tích tóm t t nh sau:
14


H n h p t o d n xu t đ

c t o thành t 9,7 ml dung d ch HCl đ c

(35%, v/v) pha loãng v i 41,5 ml metanol và đ

ch t béo đ

c gi trong t l nh. M u

c hòa tan trong 0,2 ml toluen, sau đó thêm ti p 1,50 ml metanol

và 0,3 ml h n h p t o d n xu t.

ng nghi m đ

c l c m nh và đun nóng

1000C trong 1 gi . Sau khi làm l nh, thêm vào h n h p 1 ml n-hexan và 1 ml
n

c, chi t l y l p metyl este

•

pha n-hexan.

Chéo hóa este b ng xúc tác baz :
Các este c a axít béo khi có s hi n di n c a các ancolat trong môi

tr

ng d ancol s x y ra s chéo hóa este t o thành m t este m i. Nh tính

ch t này mà ta có th chéo hóa các este c a axít béo thành các metyl este đ
thu n ti n cho vi c phân tích s c ký.

H n h p t o d n xu t th

ng g p nh t là dung d ch Na hay K metoxi

1M hay 2 M trong metanol khan. Dung d ch trên b n v ng trong nhi u tháng
khi l u tr t i 40C. Các glyxerollipit có th chéo hóa este trong vòng 2 – 5
phút khi s d ng ph

ng pháp này t i nhi t đ phòng.

Vào n m 1996, Ichihara K. và c ng s [21] đã có c i ti n qui trình trên
đ phân tích nhanh các axít béo trong trianxylglyxerol và photpholipit nh
sau:
+ Hóa ch t: n-hexan, dung d ch KOH/metanol 2M.
+ Qui trình:
ng nghi m ch a 20 - 40 mg ch t béo đ

c hòa tan trong 2 ml n-

hexan, sau đó thêm vào h n h p 0,2 ml KOH/metanol 2 M. ng nghi m đ

c

l c m nh trong 2 phút t i nhi t đ phòng. Sau đó ly tâm nh , chi t l y l p n-

15


trên đ b m vào c t GC. Ph

hexan

ng pháp trên không dùng đ

c cho

sterol este và sáp.
Ichihara K và các c ng s c ng đã bi n đ i ph

ng pháp trên đ đi u

ch tr c ti p các este metyl c a axít béo t các lipit phân c c (photphotlipit)
trong h n h p ch t béo mà không c n ph i phân l p tr

c [22]. Quá trình

metyl hóa các glyxerollipit phân c c trong h n h p ch t béo x y ra hoàn toàn
trong 2,5 phút khi s d ng máy khu y và 20 phút khi l c v i dung d ch KOH
0,7M trong metanol v i s có m t c a n-hexan
trình este hóa l n h n 95% và ph

ng pháp trên đ

300C. Hi u su t c a quá
c ng d ng khi phân tích

thành ph n các glyxerollipit phân c c trong d u th c v t và m u máu. So v i
các ph
ph

ng pháp truy n th ng thông qua s chi t lipit b i cloroform/metanol,

ng pháp trên không có s sai khác đáng k và cho th i gian c ng nh

hi u qu phân tích nhanh, chính xác.
•

Quá trình metyl hóa tr c ti p:
iv im tl

ng m u nh nh m u mô t 1 – 10 mg, m u ch t l ng

sinh h c có th tích nh (50 µL) ta có th th c hi n ph n ng chéo hóa tr c
ti p ngay trong m u mà không c n qua khâu tách chi t.
+ Qui trình:
M u (ch a hàm l

ng lipid không quá 10 µg) đ

c cho vào đáy c a

ng nghi m có nút xo n làm b ng Teflon. Sau đó thêm vào 1 ml HCl trong
metanol, 1 ml metanol và 0,5 ml n-hexan.

óng ch t nút ng nghi m và đun

nóng t i 1000C trong 1 gi (l c nhi u l n).
Sau khi làm l nh, thêm vào 2 ml n-hexan và 2 ml n
l c nh , l y l p n-hexan sau khi ly tâm. Tr
th đ

c

c khi phân tích GC, d ch chi t có

c làm giàu b ng cách th i khí nit qua b m t.
16

c. H n h p đ


Vào n m 2000, Carrapiso AI và các c ng s [13] đã nghiên c u m t s
ph

ng pháp chi t và chéo hóa este tr c ti p khi phân tích các lipit. Các

ph

ng pháp chi t bao g m chi t b ng vi sóng và chi t b ng ch t l ng siêu

t ih nđ
đ

c so sánh v i ph

c cho th y ph

ng pháp chéo hóa este tr c ti p . K t qu thu

ng pháp chéo hóa este tr c ti p có đ chính xác cao và

đáng tin c y, đ ng th i ti t ki m đ

c hóa ch t và th i gian phân tích.

Khi phân tích các axít béo trong m u d u trong h t cây, m u th t b ng
ph

ng pháp chéo hóa este tr c ti p, Jordi Eras và các c ng s [25] đã thay

đ i qui trình trên b ng vi c t o este pentyl. Ph n ng s d ng clotrimetylsilan
và 1-pentanol là các ch t t o d n xu t. Ph n ng đ

c th c hi n t i 900C

trong 40 phút. Th i gian và nhi t đ trên đ đ chuy n hóa hoàn toàn các lipit
thành các pentyl este c a axít béo. T

ng t nh qui trình trên, khi phân tích

các m u th t, Albert Tomas và các c ng s [10] đã s d ng lò vi sóng đ t ng
nhanh th i gian phân tích. Quá trình chéo hóa este tr c ti p đ
trong lò vi sóng

c th c hi n

900C trong kho ng th i gian 30 giây, trong khi các quá

trình khác c n t 1 – 2 gi . H n n a ph

ng pháp này cho hi u su t thu h i

cao đ i v i m i axít béo no và không no. Thành ph n c a các axít béo c ng
không b nh h
b)

ng b i các b c x vi sóng.

Xác đ nh axít béo b ng GC:
Các axít béo sau khi este hóa đ

c b m vào c t GC. Tùy thu c vào

thành ph n và tính ch t c a axít béo mà ta có th s d ng các c t tách và các
qui trình khác nhau. B ng 1.1 cho bi t m t s c t tách s d ng đ phân tích
axít béo trong th c ph m [28].

17


B ng 1.1: Thành ph n hóa h c c a m t vài pha t nh thông d ng dùng đ
phân tích axít béo trong th c ph m b ng GC
Thành ph n hóa h c

Tên th

100% Cyanopropylsilicon

CP – Sil – 88 (Silar
-10c)

SP – 2340, OV –
275

100% Cyanoetylsilicon

Metylsilicon polyme, 25%
cyanopropyl – 25% phenyl –
50% metyl
Metylsilicon polyme, 1%
vinyl – 5% phenyl
Metyl silicon
68% Biscyanopropyl – 32%
dimetylsiloxan

Polyetylenglycol

95% Dimetyl –
diphenylpoysiloxan

5

ng m i

%

100% Dimetylpolysiloxan

86%
Dimetyl
–

14%
cyanopropylphenylpolyxiloxan

phân
c c
VP
VP

OV – 225, DB –
225, SP – 2300

P

SE – 54

NP

SPB – 1
SPB - 5
SP – 2330

NP

SP – 2560

P

DB-WAX,
Supelcowa–10,
Omegawax,

Carbowax 20M

P

DB-5, SPB-5, CPSIL 8CB

NP

DB-1, Rt-1, SPB-1,
SP-2100, OV-1,
OV-101, CP-SIL
5CB

NP

DB - 1701

P

VP

ng d ng
D uđ u
nành
S a, d u
th c v t đã
hydro hóa
Th t

D u các h t

ng c c
D u cá
D u h t cây
B , d u th c
v t
D u th c v t
đã hydro
hóa.
Men, b , d u
đ u nành,
d u các h t
cây, d u h t
cây bông
D u h t cây
bông, d u
th c v t
Men

Men

(Chú thích: VP: r t phân c c, P: phân c c, NP: không phân c c).

18


Tùy thu c vào c t tách và thành ph n m u mà ta có các đi u ki n phân
tích khác nhau. Sau đây xin gi i thi u m t vài đi u ki n phân tích axít béo
b ng GC.
+ Pha t nh ít phân c c:
- C t SPB – 5 (30m x 0,32m x 0,25 µm).

- Ch

ng trình nhi t đ c t: Nhi t đ đ u 40 0C; t ng 5 0C/phút lên 120

C gi 0,5 phút; t ng 1 0C/phút lên 180 0C gi trong 1 phút, sau đó t ng

0

5 0C/phút lên 250 0C, gi

nhi t đ này trong 5 phút. T ng th i gian

phân tích 100 phút.
- Bu ng b m: Nhi t đ

injector là 250 0C; b m không chia dòng

splitless; th i gian không chia dòng là 1 phút.
- Khí mang: Heli, t c đ 0,8 ml/phút.
+ Pha t nh phân c c:
- C t DB – WAX (20m x 0,12 mm x 0,18 µm).
- Ch

ng trình nhi t đ c t: Nhi t đ đ u 100 0C, t ng 5 0C/phút đ n 250

0

250 0C 1 phút.

C, gi

- Bu ng b m: Nhi t đ injector là 250 0C, b m chia dòng.
- Khí mang: Heli, t c đ 1 ml/phút.
1.3.2.2 Ph

ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC)

Thông th

ng, khi phân tích các axít béo, ng

pháp GC. Tuy nhiên trong m t s tr

i ta hay s d ng ph

ng h p đ c bi t, ph

ng

ng pháp HPLC

l i t ra h u d ng. Giá tr l n nh t c a HPLC là phân tích các axít d bay h i
19


(các axít có m ch ng n), ho c dùng đ nghiên c u ph

ng pháp đ ng v đánh

d u các axít béo. Các đ ng phân v trí hay đ ng phân c u d ng khi tách b ng

HPLC c ng cho k t qu kh quan h n GC. Khi tách b ng HPLC có th s
d ng nhi u lo i detector khác nhau, nh ng đ i v i các ph
d n xu t thì detector UV và detector hu nh quang đ
c . Ngày nay ng

ng pháp có t o

c dùng ph bi n h n

i ta c ng k t h p detector kh i ph v i HPLC đ cho k t

qu phân tích chính xác h n [17]. Sau đây là các ph

ng pháp t o d n xu t

chính khi xác đ nh axít béo b ng HPLC v i detector UV và hu nh quang.
a) T o d n xu t đo UV
D n xu t hay dùng nh t đ đo UV là este c a phenacyl. Qui trình s
d ng 4-bromphenacyl bromua nh là thu c th t o d n xu t.

Dung d ch 0,2 mM trimetyl amin trong axeton khan đ
t o môi tr

c s d ng đ

ng ki m; ngoài ra có th dùng natri cacbonat hay kali hidroxit.

- Thu c th : 4-bromphenacyl bromua, ete 18-crown-6, KOH/metanol 50
mM. Axetonitrin.
- Qui trình:

Hòa tan m u axít béo t do trong metanol và trung hòa b ng dung d ch
KOH hay trimetyl amin v i ch th là phenolphtalein. H n h p đ

c làm

bay h i b i khí N2.
Thêm 0,1 ml ete 18-crown-6 trong axetonitrin có n ng đ 2 mM và 0,1
ml 4-bromphenacyl bromua vào ph n còn l i.
20

un nóng

80 0C trong 15


phút; v a đun nóng v a l c đ u h n h p. Làm l nh h n h p, sau đó pha
loãng b ng axetonitrin đ đ

c n ng đ axít béo phù h p.

d ng c t C18, gradient pha đ ng (axetonitrin trong n

S

axetonitrin/n

c (1/1, v/v) v i t c đ dòng là 1ml/phút. Detector UV đ

c)
c

thi t l p t i 242 nm.
Tùy thu c các axít béo c n tách và lo i c t mà ta có các cách gradient
khác nhau nh ng thông th

ng ng

i ta hay s d ng gradient sau: ch y

tuy n tính trong 60 phút đ u, và sau đó đ ng dòng (80% axetonitrin) trong
30 – 40 phút.
Ph

ng pháp trên đã áp d ng thành công trong nhi u đ i t

nh ng đ i t

ng khó nh huy t thanh ng

ng và có

i [9].

b) T o d n xu t đo hu nh quang
t ng đ nh y và đ ch n l c khi xác đ nh axít béo b ng HPLC,
ng

i ta đã t o ra các d n xu t đ đo hu nh quang.
Jinmao You và các c ng s đã đ ngh m t ph

ng pháp t o d n xu t

nhanh, đ n gi n và có đ nh y cao khi xác đ nh các axít béo có m ch ng n
l n m ch dài [24]. Các tác gi s d ng 9-(2-hydroxietyl)-cacbazol nh là
thu c th t o hu nh quang. Ph

ng pháp cho gi i h n phát hi n th p 45 –

68 fmol đ i v i các axít béo t C14 – C20 và còn th p h n đ i v i các axít
ng n h n. Tuy nhiên ph
trên th tr

ng pháp này có h n ch là thu c th không có

ng mà ph i t ng h p tr

Do đó trên th c t , ng

c khi phân tích.

i ta hay s d ng brommetylmetoxicoumarin

(Br-MMC) làm thu c th t o hu nh quang. Br-MMC có th t o ra h p
ch t phát hu nh quang m nh và nó c ng s n có trên th tr
21

ng.


J.H.Wolf và các c ng s đã s d ng qui trình sau đây đ xác đ nh các

axít béo t do c ng nh là các axít béo đã đ
v i gi i h n phát hi n

c axyl hóa cho k t qu r t t t,

m c ng [31].

- Hóa ch t:
Dung d ch 1: 5 mg Br-MMC hòa tan trong 5 ml axetonitrin khan.
Dung d ch 2: 13 mg ete 18-crown-6 trong 5 ml axetonitrinkhan.
L u tr các dung d ch này

- 20 0C.

Dung d ch làm vi c: 40 µL dung d ch 1 và 2 µL dung d ch 2 đ
cho vào 2 ml axetonitrin khan tr

c

c khi t o d n xu t.

Kali cacbonat (khan).
- Qui trình:
D n xu t hóa: 1- 2 µg axít béo và vài ng c a ch t n i chu n (C17:0)
đ

c hòa tan trong m t th tích nh c a diclometan. H n h p sau đó đ

c hút

b ng pipet vào ng nghi m nh . Sau khi làm bay h i b ng khí nit , thêm 100
µL dung d ch làm vi c và 2 – 4 mg kali cacbonat. Siêu âm nhanh, sau đó làm
nóng dung d ch

60 0C trong 15 phút. Làm l nh dung d ch r i l c b i ph u

l c nilon 0,22 µm.

22