Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn phân hủy phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển vũng tàu, tỉnh bà rịa vũng tàu

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HƢƠNG
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA CHỦNG VI
KHUẨN PHÂN HỦY PHENOL PHÂN LẬP TỪ NƢỚC NHIỄM DẦU
Ở BỜ BIỂN VŨNG TÀU, TỈNH BÀ RỊA - VŨNG TÀU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015

ii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HƢƠNG
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA CHỦNG VI
KHUẨN PHÂN HỦY PHENOL PHÂN LẬP TỪ NƢỚC NHIỄM DẦU
Ở BỜ BIỂN VŨNG TÀU, TỈNH BÀ RỊA - VŨNG TÀU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K43 - CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2011 - 2015

Giảng viên hƣớng dẫn : PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh
ThS. Nguyễn Thị Đoàn
Thái Nguyên, năm 2015


i
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm
Ngọc Minh và TS. Lê Thị Nhi Công đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá
trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tố Uyên - Phó trưởng phòng – Phụ trách
phòng CNSH môi trường và cùng toàn thể các cán bộ nhân viên của phòng, đặc biệt
là ThS. Vũ Thị Thanh đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên
cứu hoàn thành khóa luận của mình.
Để hoàn thành khóa luận này, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới ThS.
Nguyễn Thị Đoàn và các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm trường Đại học Nông Lâm cùng với lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập, nghiên cứu tại trường cũng như tại Viện.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã
luôn động viên giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Hƣơng

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Vai trò của mạng lưới ngoại bào trong màng sinh học ...................................... 11
Bảng 3.1. Danh mục một số hóa chất sử dụng ..................................................................... 20
Bảng 3.2. Các loại môi trường nuôi cấy cơ bản ................................................................... 20
Bảng 3.3. Danh mục một số máy móc và thiết bị sử dụng.................................................. 21
Bảng 3.4. Các thành phần của phản ứng PCR...................................................................... 28
Bảng 4.1. Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường
khoáng Gost có bổ sung 50 ppm phenol (có và không có glucose) ................................... 34
Bảng 4.2. Mức độ tương đồng của trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng VTPG5 so với
một số chủng vi khuẩn ............................................................................................................ 41


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của phenol ................................................................................... 4
Hình 2.2. Cấu trúc không gian của biofilm với mạng lưới ngoại bào xung quanh........... 12
Hình 3.1. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR .................................................................... 28
Hình 4.1. Mẫu nước nhiễm dầu lấy từ bãi sau thành phố Vũng Tàu ................................. 32
Hình 4.2. Mẫu làm giàu trên môi trường khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol
(có và không có glucose) ........................................................................................................ 33
Hình 4.3. Tập đoàn vi sinh vật trên môi trường khoáng Gost thạch bổ sung 50 ppm
phenol (A) mẫu làm giàu không có glucose và (B) mẫu làm giàu có glucose ................. 33
Hình 4.4. Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học các chủng vi khuẩn sau 48h
nuôi cấy .................................................................................................................................... 35
Hình 4.5. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn ........................................ 36
Hình 4.6. Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn trên môi trường khoáng Gost
dịch có bổ sung 50 ppm phenol ............................................................................................. 37

Hình 4.7. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) của chủng VTPG5 ................. 38
Hình 4.8. Điện di đồ DNA tổng số của chủng vi khuẩn...................................................... 38
Hình 4.9. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi
khuẩn VTPG5 .......................................................................................................................... 39
Hình 4.10. Điện di đồ sản phẩm PCR của chủng VTPG5 sau khi được tinh
sạch...................... ..................................................................................................................... 40
Hình 4.11. Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học chủng Rhodococcus sp.
VTPG5 ở các nhiệt độ khác nhau sau 48 giờ nuôi cấy ........................................................ 42
Hình 4.12. Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo
màng sinh học của chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. VTPG5 ........................................... 43
Hình 4.13. Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học chủng Rhodococcus sp.
VTPG5 ở các pH khác nhau sau 48 giờ nuôi cấy ................................................................ 44
Hình 4.14. Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo
màng sinh học của chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. VTPG5 ........................................... 44


iv

Hình 4.15. Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học chủng Rhodococcus sp.
VTPG5 ở các nồng độ muối NaCl khác nhau sau 48 giờ nuôi cấy.................................... 45
Hình 4.16. Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến
khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. VTPG5 .................... 46
Hình 4.17. Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học chủng Rhodococcus sp.
VTPG5 ở các nguồn carbon khác nhau sau 48 giờ nuôi cấy .............................................. 47
Hình 4.18. Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả
năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. VTPG5 ............................ 47
Hình 4.19. Khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học chủng Rhodococcus sp.
VTPG5 ở các nguồn nitơ khác nhau sau 48 giờ nuôi cấy ................................................... 48
Hình 4.20. Biểu đồ mật độ quang học đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng
tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. VTPG5 ..................................... 48

Hình 4.21. Màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. VTPG5 sau 48 giờ nuôi tĩnh
ở điều kiện tối ưu được nhuộm bằng dịch tím tinh thể 0,1% .............................................. 49
Hình 4.22. Khả năng sinh trưởng và phát triển của màng sinh học chủng vi khuẩn
Rhodococcus sp. VTPG5 ở các nồng độ phenol khác nhau sau 7 ngày ............................ 49
Hình 4.23. Biểu đồ mật độ quang học đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của
màng sinh học chủng vi khuẩn Rhodococcus sp. VTPG5 ở các nồng độ phenol khác
nhau........................................................................................................................................... 50
Hình 4.24. Biểu đồ thể hiện khả năng phân hủy phenol của màng sinh học chủng vi
khuẩn Rhodococcus sp. VTPG5 sau 7 ngày nuôi cấy ......................................................... 50


v

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Biofilm

: Màng sinh học

Bp

: Base pair (cặp base)

cm, mm

: centimeter, milimeter

DDBJ

: DNA Data Bank of Japan

DNA

: Deoxyribonucleic acid

ĐC

: Đối chứng (mẫu không có vi sinh vật)

EPS

: Extracellular Polymeric Substances (hợp chất ngoại bào)

kDa

: KiloDalton

LB

: Luria-Broth

mg, g, kg

: milligram, gram, kilogram

nm, µm

: nanometer, micrometer

NOMs

: Natural Organic Matters (các chất hữu cơ tự nhiên)

OD

: Optical Density (mật độ quang học)

PAHs

: Polycyclic Aromatic Hydrocarbon

PCR

: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

ppm

: parts per million (đơn vị một phần triệu, mg/l)

RNA

: Ribonucleic acid

rRNA

: Ribosomal ribonucleic acid

µl, ml, l

: Microliter, milliliter, liter

vi

MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và nội dung của đề tài .........................................................................2
1.3. Ý nghĩa của đề tài ...............................................................................................3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 4
2.1. Cơ sở khoa học của đề tài ...................................................................................4
2.1.1. Đặc điểm chung của phenol ......................................................................................... 4
2.1.2. Màng sinh học (biofilm) ............................................................................................... 9
2.1.3. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng tạo màng sinh học
(biofilm) của vi sinh vật .......................................................................................................... 12
2.1.4. Các phương pháp phân loại vi sinh vật ..................................................................... 15
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ......................................................16
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................................ 16
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .............................................................................. 17
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 19
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................19
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................... 19
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................................... 19
3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài .............................................................19
3.2.1. Địa điểm ....................................................................................................................... 19
3.2.2. Thời gian ...................................................................................................................... 19
3.3. Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng ...............................................................19
3.3.1. Vật liệu ......................................................................................................................... 19
3.3.2. Hóa chất và môi trường .............................................................................................. 19
3.3.3. Thiết bị và dụng cụ...................................................................................................... 21

3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................21
3.5. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................22


vii

3.5.1. Thu thập mẫu ............................................................................................................... 22
3.5.2. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng phenol ..................................... 22
3.5.3. Đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn ............................. 23
3.5.4. Khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tạo màng tốt
trên nguồn cơ chất phenol....................................................................................................... 25
3.5.5. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng vi khuẩn VTPG5 ...... 25
3.5.6. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng tạo màng sinh học
(biofilm) của chủng vi khuẩn. ................................................................................................ 29
3.5.7. Đánh giá khả năng phân hủy phenol của màng sinh học vi khuẩn ........................ 31
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 32
4.1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn vừa có khả năng phân hủy
phenol và vừa có khả năng tạo biofilm .....................................................................32
4.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy phenol................................... 32
4.1.2. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn đã được phân lập ........................... 35
4.1.3. Khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn tạo màng tốt
trên nguồn cơ chất phenol....................................................................................................... 36
4.2. Đặc điểm hình thái và phân loại chủng vi khuẩn VTPG5 ................................37
4.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào .................................................... 37
4.2.2. Phân loại phân tử chủng VTPG5 dựa vào việc xác định trình tự đoạn gen 16S
rRNA................. ....................................................................................................................... 38
4.3. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự hình thành màng sinh học
chủng vi khuẩn lựa chọn ...........................................................................................42
4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................................. 42
4.3.2. Ảnh hưởng của pH ...................................................................................................... 43

4.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl ......................................................................... 45
4.3.4. Ảnh hưởng của carbon................................................................................................ 46
4.3.5. Ảnh hưởng của nitơ .................................................................................................... 47
4.4. Đánh giá khả năng phân hủy phenol của màng sinh học chủng vi khuẩn lựa
chọn. ..........................................................................................................................49


viii

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................... 53
5.1. Kết luận ............................................................................................................. 53
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Tại Việt Nam, ngành công nghiệp dầu mỏ đang phát triển mạnh mẽ, sản lượng
khai thác ngày càng tăng, đem lại cho Quốc gia nguồn lợi ích kinh tế vô cùng to
lớn. Bên cạnh nguồn lợi về kinh tế mà ngành công nghiệp này mang lại là mối hiểm
họa về ô nhiễm môi trường. Các hoạt động thăm dò, khai thác, vận chuyển dầu
được tiến hành trên biển, không tránh khỏi những sự cố gây ô nhiễm dầu mỏ như:
tràn dầu, dò rỉ, đắm tàu chở dầu, vỡ hoặc dò rỉ ống dẫn dầu ngầm trong lòng
biển,...gây thiệt hại lớn về kinh tế cũng như ảnh hưởng nghiêm trọng và lâu dài đến
môi trường đất, nước, sinh vật. Những chất gây ô nhiễm nghiêm trọng trong nước
nhiễm dầu mỏ phải kể đến là các hợp chất hữu cơ như benzene, phenol, các hợp

chất

hydrocarbon

thơm

đa

vòng

(PAHs

–

Polycyclic

Aromatic

Hydrocarbon)....Trong các hợp chất ô nhiễm đó, phenol là một hợp chất hữu cơ khó
phân hủy và rất độc hại. Phenol có nguồn gốc đa dạng từ nhựa, dầu mỏ, than
đá,...nó có thể tồn tại trong đất, nước, hoặc xâm nhập vào cơ thể con người qua
đường hô hấp, ăn uống, hoặc tiếp xúc trực tiếp qua da....Hậu quả mà nó để lại là vô
cùng nghiêm trọng, có thể gây ung thư; ảnh hưởng đến hệ thần kinh, hô hấp, tiêu
hóa; gây đột biến...Do đó việc xử lý phenol trong nước nhiễm dầu mỏ đặc biệt được
chú trọng.
Qua những bằng chứng thực nghiệm đã chứng minh hiệu quả cao của sự kết hợp
các biện pháp cơ học, vật lý, hoá học và sinh học để xử lý ô nhiễm phenol trong
nước nhiễm dầu mỏ. Trong số các phương pháp này, phương pháp sinh học có ưu
điểm và hiệu quả vượt trội hơn cả là vừa có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện
tự nhiên, vừa cho độ an toàn rất cao, thân thiện với môi trường và giá thành rẻ hơn

so với các phương pháp khác. Một trong những phương pháp phân hủy sinh học rất
thích hợp để ứng dụng trong công nghệ xử lý nước bị ô nhiễm hiện nay đó là sử
dụng màng sinh học do các vi sinh vật tạo ra. Phương pháp này đã mở ra một hướng


2

đi mới mẻ, đầy triển vọng cho ngành công nghệ sinh học môi trường và thu hút
được rất nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước.
Bản chất của màng sinh học (biofilm) là một tập hợp các vi sinh vật gắn trên
một bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ trên
bề mặt đó. Lớp màng này bảo vệ các tế bào vi sinh vật bên trong nó khỏi các tác
nhân có hại từ môi trường bên ngoài, hạn chế sự ảnh hưởng từ những biến động về
nhiệt độ, pH, nồng độ muối, tốc độ dòng chảy và tải lượng ô nhiễm. Do mật độ các
vi sinh vật trong biofilm cao nên chúng hỗ trợ và liên kết với nhau một cách chặt
chẽ tạo thành cấu trúc bền vững giúp khả năng oxi hóa các hydrocarbon xảy ra
nhanh hơn. Do đó, hiện nay biofilm đang được ứng dụng rất nhiều trong việc xử lý
nước nhiễm dầu mỏ.
Vì vậy, để góp phần vào việc xử lý phenol nói riêng và nước nhiễm dầu mỏ nói
chung, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh
học của chủng vi khuẩn phân hủy phenol phân lập từ nước nhiễm dầu ở bờ biển
Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu”.
1.2. Mục tiêu và nội dung của đề tài
 Mục tiêu của đề tài:
 Phân lập, tuyển chọn được chủng vi khuẩn vừa có khả năng tạo màng sinh học
vừa có khả năng phân hủy phenol cao từ nước nhiễm dầu ở bờ biển Vũng Tàu, tỉnh
Bà Rịa - Vũng Tàu.
 Tối ưu hóa các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh
học (biofilm) của chủng vi khuẩn được lựa chọn.
 Nội dung của đề tài

 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn vừa có khả năng tạo màng sinh
học, vừa có khả năng phân hủy phenol tốt.
 Phân loại và định tên chủng vi khuẩn lựa chọn.
 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường: nhiệt độ, pH, nồng độ
muối NaCl, ảnh hưởng của nguồn carbon và nguồn nitơ đến khả năng tạo màng sinh
học chủng vi khuẩn lựa chọn.


3

 Đánh giá khả năng phân hủy phenol của màng sinh học chủng vi khuẩn đó ở
các điều kiện tối ưu.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
 Ý nghĩa trong khoa học
Phân lập được chủng vi khuẩn vừa tạo màng sinh học vừa có khả năng phân hủy
phenol cao. Đồng thời, tối ưu hóa được các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả
năng tạo màng sinh học là tiền đề trong việc nghiên cứu thực hiện ngoài hiện trường
sau này.
 Ý nghĩa trong thực tiễn
Phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học môi trường với sự thành công trong việc
sử dụng màng sinh học để tìm ra các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học
tốt giúp xử lý nguồn nước ô nhiễm dầu chứa hợp chất phenol độc hại. Góp phần
giảm thiểu một lượng chất hữu cơ độc hại trong môi trường.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa học của đề tài

Trong môi trường, có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sử dụng hydrocarbon
như nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Hơn nữa, mật độ các vi sinh vật trong
biofilm cao nên chúng hỗ trợ và liên kết với nhau một cách chặt chẽ tạo thành cấu
trúc bền vững giúp khả năng oxi hóa các hydrocarbon xảy ra nhanh hơn. Do đó,
hiện nay biofilm đang được ứng dụng rất nhiều trong việc xử lý nước nhiễm phenol
nói riêng và nước thải nhiễm dầu nói chung.
2.1.1. Đặc điểm chung của phenol
2.1.1.1. Khái niệm chung
Phenol là hợp chất hữu cơ mà phân tử của chúng có nhóm hydroxyl (-OH) liên
kết trực tiếp với nguyên tử cacbon của vòng benzen (hình 2.1).
Công thức phân tử: C6H6O; công thức cấu tạo: C6H5OH

Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của phenol
2.1.1.2. Tính chất vật lý của phenol
Ở điều kiện thường, phenol là chất rắn, không màu, nóng chảy 43oC, nhiệt độ sôi
cao 182oC. Khối lượng riêng 1,06 g/cm3, khối lượng phân tử 94,11 g/mol, khả năng
hòa tan trong nước (ở 20oC) là 70g/l. Trong quá trình bảo quản, phenol thường bị
chảy rữa, thẫm màu dần do hút ẩm và phenol chuyển thành màu hồng do bị oxi hóa
chậm trong không khí. Ngưỡng ngửi mùi của phenol là 0,04 ppm. Phenol ít tan
trong nước lạnh, tan nhiều trong một số hợp chất hữu cơ như etanol, ete, axeton và
tan vô hạn ở 66oC. Phenol rất độc, rất dễ cháy, gây bỏng nặng khi bị rơi vào da
(Trương Thế Kỷ, 2000) [8].


5

2.1.1.3. Nguồn gốc phát sinh phenol
 Nguồn gốc tự nhiên
Hợp chất phenol được sinh ra tự nhiên từ sự phân hủy của thực vật, các hợp chất
hữu cơ, các phế liệu động vật phân hủy...Phenol được tìm thấy nhiều trong than đá

và dầu mỏ. Phenol còn được tạo ra do sự đốt cháy các nguyên liệu hóa thạch, do
cháy rừng, hầm than…nhưng phần lớn lượng phenol tồn tại trong môi trường hiện
nay đều bắt nguồn từ các hoạt động sản xuất của con người.
 Nguồn gốc nhân tạo
Phenol và dẫn xuất của phenol là một trong những loại chất thải hữu cơ độc hại khó
xử lý. Nó có mặt trong nước thải của quá trình sản xuất nhựa phenolphomanđehit, dược
phẩm, thuốc trừ sâu, công nghiệp dệt và nó còn có mặt trong nghành công nghiệp
nhuộm, thuốc diệt cỏ, chất chống oxi hóa, giấy, công nghệ hóa dầu...Hầu hết các
hợp chất phenol khi được thải rửa từ các nhà máy đều đi vào môi trường gây ô
nhiễm nguồn nước, đất. Chúng không những gây ô nhiễm môi trường sinh thái mà
còn gây hại đến con người, hệ động vật và các loài sinh vật sống trong nước.
2.1.1.4. Tính độc và ảnh hưởng của phenol
 Ảnh hưởng đến hệ sinh thái
Phenol và các dẫn xuất của nó được xếp vào loại chất có tính độc cao. Đây là
nhóm tương đối bền có khả năng tích lũy trong cơ thể sinh vật và có khả năng gây
độc cho hệ động vật. Các hợp chất phenol lại rất dễ bị phân hủy trong môi trường tự
nhiên (từ vài ngày đến một tuần) và phân hủy nhanh dưới tác động của ánh sáng
mặt trời làm ảnh hưởng xấu đến bầu không khí. Phenol có thể gây hại hoặc gây chết
động vật, thực vật, vi sinh vật dẫn đến mất cân bằng sinh thái. Hơn nữa nó còn gây
ô nhiễm nguồn đất, nước gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ sinh thái.
 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người
Phenol có thể thâm nhập vào cơ thể con người thông qua đường hô hấp, tiếp xúc
với da, mắt, màng nhầy của người, gây kích ứng da và gây hoại tử (Clayton và cs,
1994) [16]. Phenol được xem là chất cực độc với con người nếu đi vào cơ thể người
thông qua đường miệng. Khi ăn phải những chất có hàm lượng phenol cao sẽ dẫn


6

đến hiện tượng chết người với những triệu chứng như co giật, không có khả năng

kiểm soát, hôn mê dẫn tới rối loạn hô hấp...Phenol còn làm ảnh hưởng tới gan, thận,
tim, gây đau hệ hô hấp, gây nhiễm acid trong quá trình trao đổi chất, hỏng thận, sự
tuần hoàn máu, ảnh hưởng hệ thần kinh...Liều thấp nhất có thể gây tử vong bằng
đường tiêu hóa là khoảng 4,8 g trong thời gian chưa đến 19 phút. Những triệu
chứng do hít phải phenol trong khoảng 30 - 60 ppm có thể gây tổn thương phổi,
chán ăn, giảm cân, nhức đầu, chóng mặt, tê liệt chân tay...(Bidleman và cs, 1993)
[14]. Với khả năng gây độc mạnh như vậy phenol và các dẫn xuất của nó đã được
phân loại là chất nguy hiểm (Aksu và cs, 1990) [11]. Nếu con người tiếp xúc trong
thời gian dài với các hợp chất phenol có thể dẫn đến sự phát triển một cách chậm
trễ, gây ra sự biến đổi dị thường ở thế hệ sau, tăng tỉ lệ đẻ non ở người mang thai.
Phenol có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người ngay cả ở nồng độ rất thấp,
nó là tác nhân tiềm ẩn gây ung thư (Mohan và cs, 2004) [39].
2.1.1.5. Tình trạng ô nhiễm phenol và các biện pháp xử lý
 Tình trạng ô nhiễm phenol
Trên thế giới
Hiện nay, tình trạng ô nhiễm phenol ngày càng nhiều và nghiêm trọng với nồng
độ khá cao. Phenol là một trong những hợp chất đầu tiên ghi vào dang sách các chất
gây ô nhiễm của cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ. Qua sự khảo sát, lấy mẫu nước ở
nhiều nơi và nghiên cứu cho thấy nồng độ phenol trong nước ở mức báo động.
Trong nguồn cấp nước sinh hoạt tại Hoa Kỳ có nồng độ phenol ở mức 1 mg/l
(Leonard và cs, 1998) [36]. Nồng độ phenol ở các nhà máy chế biến gỗ rất cao có
thể đạt 9,7 µg/m3 (Allen và cs, 1997) [12]. Tại Brazil, có khoảng 64 kg/năm phenol
được phát hiện tại khu đô thị nằm gần các nhà máy điện đốt than (Moreira dos
Santos và cs, 2004) [40]. Phenol đã được phát hiện ở Trung Quốc trong các mẫu
nước lấy ở gần nhà máy nước sông Huanchao, trên sông Tanking và ở gần nhà máy
nước sông Tanking ở các nồng độ tương ứng là: 0,053; 0,044 và 0,033 mg/l (Huang
và cs, 2003) [28]. Nồng độ phenol trong không khí thấp hơn chỉ khoảng 1 mg/m3.
Phenol cũng có mặt trong thực phẩm với nồng độ khoảng 5 mg/kg đã được xác định

7

trong mật ong (Gyroik và cs, 2003) [25] và cũng có trong cà phê. Trong một nghiên
cứu để xác định các chất ô nhiễm trong không khí của khu vực nông nghiệp, phenol
được tìm thấy ở 42 trong số 53 mẫu không khí lấy từ 8 trang trại có nồng độ trung
bình là 10 mg/m3 (Sunesson và cs, 2001) [50]. Phenol được phát hiện trong không
khí trong nhà và ngoài trời ở thành phố Ottawa, Canada có khoảng nồng độ 0,015,16 và 0,01-1,41 mg/m3 (Zhu và cs, 2005) [53].
Tình hình tại Việt Nam
Hiện nay, rất nhiều các nguồn nước thải công nghiệp có chứa các hợp chất hữu
cơ gây ô nhiễm môi trường. Trong đó, phenol và các dẫn xuất của phenol là những
chất có khả năng gây ô nhiễm lớn do tính chất độc hại cũng như khả năng khó phân
hủy của chúng. Tình trạng ô nhiễm phenol cũng xảy ra ở các vùng biển do quá trình
khai thác và vận chuyển dầu có thể gây dò rỉ, tràn dầu, sự cố va chạm hoặc đắm tầu
thuyền vận chuyển dầu trên biển. Ngoài ra, ô nhiễm phenol cũng xảy ra ở các khu
vực làng nghề như dệt, nhuộm, nhựa, giấy, dầu...thường mang tính tự phát, quy mô
nhỏ, thiết bị sản xuất thủ công, lạc hậu, mặt bằng sản xuất nhỏ hẹp. Tình trạng ô
nhiễm phenol càng ngày càng tăng cao và lan rộng. Nguyên nhân chủ yếu khiến
tình trạng ô nhiễm phenol ngày càng nhiều là do ý thức của con người, ý thức bảo
vệ môi trường của các chủ cơ sở sản xuất, kinh doanh, nhà máy, xí nghiệp...chưa
cao, thải chất thải nhiễm phenol không qua xử lý ra môi trường hoặc cũng có thể do
các sự cố ngoài ý muốn. Từ những hạn chế nêu trên dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi
trường - đặc biệt nhiễm phenol và các chất độc hại nguy hiểm (SS, BOD5, COD,
kim loại nặng, NH4... ) ở mức báo động, ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường
sống, sức khỏe con người. Do đó, có thể nói việc loại bỏ phenol ra khỏi nguồn nước
là một vấn đề cấp thiết hiện nay.
 Các biện pháp xử lý tẩy độc phenol
Phenol là mối đe dọa, nguy hại lớn đối với con người và toàn bộ hệ sinh thái do
tính chất độc hại và cấu trúc khó phân hủy của nó trong tự nhiên. Từ đó, con người
đã nghiên cứu và tìm ra rất nhiều biện pháp phân hủy phenol như: biện pháp cơ học,

8

vật lý, hóa học, phân hủy sinh học. Mỗi biện pháp đều có ưu điểm riêng, đem lại
hiệu quả xử lý nhất định.
 Phƣơng pháp cơ học: kết lắng, quang hóa, cho bay hơi hay đào, chôn lấp
đất ô nhiễm được sử dụng để phân hủy phenol trong một số trường hợp nhất định...
 Phƣơng pháp vật lý: sử dụng tia UV hay than hoạt tính để xử lý nguồn ô
nhiễm phenol cũng cho hiệu quả nhất định, đặc biệt là sử dụng than hoạt tính. Than
hoạt tính là chất hấp phụ phổ biến, được áp dụng từ lâu trong các xử lý nước để loại
bỏ các chất hữu cơ tự nhiên (NOMs), các chất ô nhiễm vô cơ, các chất tổng hợp khó
phân huỷ…
 Phƣơng pháp hóa học: phân hủy nhiệt, oxi hóa quang điện, oxy hoá trong
dung dịch nước bằng oxy không khí hoặc các tác nhân oxy hóa mạnh như H2O2,
ozone, chlorine...oxy hóa phenol trong nước thải tạo thành những hợp chất hữu cơ ít
ô nhiễm hoặc chuyển hóa để thành CO2 và H2O, xử lí bằng phương pháp điện hóa,
hấp phụ trên vật liệu có cấu trúc mao quản …
Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi chi phí lớn và có thể gây ra ô nhiễm thứ
cấp. Hiệu quả không triệt để vì sau khi qua các vật liệu lọc vẫn còn tồn dư của
phenol và mất khá nhiều thời gian xử lý.
 Phƣơng pháp phân hủy sinh học
Hiện nay, việc xử lý phenol trong nước thải ô nhiễm dầu theo phương pháp phân
hủy sinh học được nhiều nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam quan tâm
nghiên cứu bởi tính an toàn và hiệu quả mà nó đem lại.
Thực nghiệm cho thấy, phương pháp xử lý phenol bằng công nghệ sinh học có
tính ưu việt vượt trội hơn cả. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành thuận lợi trong
điều kiện tự nhiên, xử lý triệt để không gây ra hiện tượng ô nhiễm thứ cấp, độ an
toàn cao và thân thiện với môi trường. Trong các công nghệ phân hủy sinh học thì
công nghệ sử dụng màng sinh học (biofilm) do các vi sinh vật tạo ra hiện đang được
xem là công nghệ có hiệu quả xử lý ô nhiễm dầu và các hợp chất hydrocarbon vòng

thơm cao. Đối với phenol, phân hủy sinh học được thực hiện chủ yếu làm phá vỡ


9

cấu trúc phân tử của chúng bằng cách sử dụng các enzyme mở vòng do các chủng vi
khuẩn tại chính khu vực ô nhiễm sinh ra.
Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân huỷ sinh học có thể tiến hành theo
hai hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học.
- Tăng cường sinh học: là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã
được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác bổ sung vào các
môi trường bị ô nhiễm (Hirayama và cs, 1991) [27].
- Kích thích sinh học: là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao đổi chất
của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng chất độc hại thông qua việc
điều chỉnh các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, pH, nồng độ, oxy, chất dinh
dưỡng, các cơ chất và chất xúc tác...(Hirayama và cs, 1991) [27].
Quá trình phân hủy sinh học phenol bởi các vi sinh vật thường xảy ra với tốc độ
chậm, vì vậy việc tạo điều kiện thích hợp cho tập đoàn vi sinh vật phát triển tốt nhất
là cần thiết và cũng giúp thúc đẩy quá trình phân hủy phenol nhanh hơn để đem lại
hiệu quả phân hủy sinh học cao nhất có thể. Đây được coi là chìa khóa của công
nghệ phân hủy sinh học (Đinh Thúy Hằng và cs, 1998) [2].
2.1.2. Màng sinh học (biofilm)
2.1.2.1. Khái niệm về biofilm
Màng sinh học (biofilm) là một tập hợp các vi sinh vật gắn trên một bề mặt của
vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ trên bề mặt đó
(Morikawa, 2006) [41]. Phần lớn các vi sinh vật sinh trưởng trên môi trường bán
lỏng đều có khả năng tạo màng sinh học. Hệ vi sinh vật trong biofilm có khả năng
chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt
hơn và hạn chế sự cạnh tranh của vi sinh vật khác (Lazarova và cs, 2009) [34].
Biofilm không phải là một dạng sống quá đặc biệt mà trên thực tế đây là một hình

thức tồn tại khá phổ biến của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên.
2.1.2.2. Sự hình thành và cấu trúc của biofilm
 Sự hình thành của biofilm
Biofilm là cấu trúc thường gặp trong tự nhiên, trên 99% vi khuẩn sống trong
màng sinh học mà chúng ta thường hay gặp nhất như các váng trên mặt nước, cặn


10

máy lọc, đường ống dẫn nước...Để tồn tại trong các điều kiện bất lợi (thiếu dinh
dưỡng, sự cạnh tranh...) vi sinh vật phải học cách bám trên bề mặt, cộng sinh với
các loài khác để bảo vệ mình và sống sót (O’Toole và cs, 2000) [44]. Tỉ lệ và mức
độ bám dính của tế bào vi khuẩn vào một bề mặt phụ thuộc vào đặc tính kị nước của
bề mặt tế bào, sự hiện diện của lông roi, tiên mao và chất kết dính, protein màng tế
bào và sự sản xuất mạng lưới ngoại bào (Dolan, 2000) [21].
Biofilm có thể được hình thành bởi tập hợp các tế bào của một (biofilm đơn
chủng) hoặc nhiều (biofilm đa chủng) loại sinh vật khác như vi khuẩn, nấm, xạ
khuẩn...bám dính trên bề mặt nhất định.
Màng sinh học cung cấp cho vi khuẩn môi trường lý tưởng để sinh trưởng và
phát triển. Mỗi màng gồm nhiều lớp vi khuẩn sắp xếp trật tự, có độ dày từ 600 µm –
900 µm, liên kết với nhau nhờ các sợi cellulose cao phân tử tạo thành quần thể có tổ
chức với các kênh ngang, dọc, cho phép chất lỏng, chất thải và dưỡng chất lưu
thông hoàn hảo. Cấu tạo này không chỉ hỗ trợ vi khuẩn trao đổi thông tin bằng tín
hiệu sinh hóa mà còn bảo vệ chúng khỏi sự tấn công của kẻ thù và các hóa chất độc
hại khác (kháng thể, tế bào miễn dịch…). Khác biệt về môi trường, về loại vi khuẩn,
dưỡng chất, điều kiện sống sẽ hình thành các loại màng sinh học khác nhau.
Thành phần của biofilm gồm 2 thành phần chính:
- Thành phần tế bào: gồm tập hợp các tế bào của một hay nhiều loại vi sinh vật
khác nhau như vi nấm, vi khuẩn, vi tảo, xạ khuẩn, bám dính trên bề mặt nhất định
(Burmolle và cs, 2006) [15]. Trong màng sinh học các tế bào tập hợp thành các đơn

vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá
trình hình thành biofilm đặc biệt là giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình
thành màng sinh học cho từng loài vi sinh vật (Kumar & Anand, 1998) [32], đảm
nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế
bào như lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề
mặt giá thể, liên kết với các loài khác để cộng sinh và tự bảo vệ mình.
- Mạng lưới các chất ngoại bào (extracellular polymeric substances – EPS) bao
quanh các tế bào tạo nên cấu trúc đặc trưng cho biofilm (Bendinger và cs, 1993)


11

[13]. Bao gồm các thành phần như: polysaccharide, protein, axit nucleic, lipit. Tuy
nhiên thành phần EPS rất đa dạng nó còn tùy vào từng loài vi sinh vật, dạng biofilm
và điều kiện hình thành. Trong các thành phần chính thì polysaccharide chiếm
khoảng 40-95%, protein khoảng 1-60%, 1-10% là axit nucleic và 1-40% là lipit
(Czaczyk, 2007) [18]. Các hợp chất này thay đổi theo không gian và thời gian tồn
tại của biofilm. Trên cơ sở đó thì biofilm càng dày và thời gian tồn tại càng lâu thì
có hàm lượng EPS càng nhiều. Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của
màng sinh học và giảm dần theo độ sâu nhưng thành phần EPS lại phong phú hơn ở
vùng phía trong của màng sinh học. Thành phần EPS trong hầu hết các biofilm cũng
khác biệt so với vi khuẩn ở dạng sống tự do. Những thành phần chính được xem xét
trong một biofilm bao gồm polysaccharide, protein và DNA (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Vai trò của mạng lưới ngoại bào trong màng sinh học (Donlan, 2002) [22]
Tác động của mạng
lƣới ngoại bào

Thành phần

Vai trò trong màng

sinh học

Kiến tạo

Polysaccharide, Amyloid

Cấu tạo nên cấu trúc biofilm

Hoạt hóa

Enzyme ngoại bào

Phân hủy chất hữu cơ

Hoạt hóa bề mặt

Amphiplic

Tương tác giữa các bề mặt

Truyền tin

Lectin, Acid nucleic

Chất dinh dưỡng

Nhiều loại polyme

Truyền thông tin giữa các tế
bào trong mạng lưới

Nguồn cung cấp Nitơ,
Carbon, Photpho

 Cấu trúc Biofilm
Cấu trúc biofilm bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách chặt chẽ
và có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục giữa các tế bào. Cấu trúc biofilm
có tổ chức, đặc thù và phản ánh các chức năng nhất định của màng sinh học, chúng
biến mất khi các thành phần của chất gian bào bị loại bỏ như một ảnh hưởng của
chất đột biến. Trong biofilm có các kênh vận chuyển mà qua đó các vi sinh vật được


12

cung cấp nước, các chất dinh dưỡng để chúng tồn tại đồng thời các kênh này cũng
mang các chất thải đi (Steyn, 2005) [48]
Màng sinh học có cấu trúc không đồng nhất, gồm nhiều lớp vi khuẩn hiếu khí
bên trên và nhiều lớp vi khuẩn kỵ khí bên dưới (hình 2.2). Giữa các tế bào vi khuẩn
đều diễn ra sự trao đổi thông tin liên tục đảm bảo cho màng sinh học hình thành
chính xác.

Hình 2.2. Cấu trúc không gian của biofilm với mạng lưới ngoại bào xung quanh
Cấu trúc màng sinh học chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như sự khuếch tán, thành
phần dinh dưỡng, đặc tính bề mặt, nhiệt độ, pH môi trường. Độ dày của màng sinh
học thay đổi từ một vài µm đến vài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật, tuổi của màng
sinh học, lượng dinh dưỡng và áp lực dòng chảy (Cheng và cs, 2010) [19], (Jomeo,
2008) [29].
2.1.3. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng tạo màng sinh học
của vi sinh vật
Có rất nhiều các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của vi sinh vật
như: nhiệt độ, pH, ánh sáng, các chất gây ức chế, các chất xúc tác...Nhưng trong đó

nhiệt độ, pH và nguồn dinh dưỡng như cacbon, nitơ là những yếu tố dễ điều khiển
và có ảnh hưởng nhất định đến khả năng tạo màng của vi sinh vật.
 Nhiệt độ
Mỗi chủng vi sinh vật thích hợp ở những nhiệt độ phát triển riêng. Sự chuyển
hóa chất dinh dưỡng liên quan trực tiếp và phụ thuộc vào sự có mặt của các
enzyme. Vì vậy, sự hình thành của một màng sinh học phụ thuộc vào sự có mặt và
tốc độ phản ứng của các enzyme mà kiểm soát sự phát triển của hệ thống sinh lý và


13

sinh hóa của vi khuẩn. Nhiệt độ có tương quan với tốc độ phản ứng của enzym do
đó nó ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào, từ đó tác động đến quá trình hình
thành màng sinh học. Ngoài ra, nhiệt độ môi trường còn ảnh hưởng đến các đặc tính
vật lý của các hợp chất bên trong và xung quanh tế bào (Garrett và cs, 2008) [24].
 pH
Chỉ số pH có ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh
vật. pH hoạt động của vi khuẩn thường ở trong khoảng từ 4 đến 10, đa số vi khuẩn
sinh trưởng tốt ở pH 7 và bị ức chế sinh trưởng ở các điều kiện quá axit hoặc quá
kiềm. Hơn nữa, phản ứng pH môi trường còn tác động trực tiếp đến khả năng tạo
màng sinh học của vi sinh vật. Nồng độ H+ nằm trong thành phần môi trường làm
thay đổi trạng thái diện tích của thành tế bào. Tuỳ theo nồng độ của chúng mà làm
tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào đối với những ion nhất định. Đồng
thời, tế bào vi khuẩn có các kênh protein liên kết với màng sinh chất. Do đó, những
đáp ứng vi khuẩn đến thay đổi pH bên trong và bên ngoài tế bào thông qua sự điều
chỉnh các hoạt động, tổng hợp các proteins và liên quan trực tiếp đến quá trình sản
xuất các polymer ngoại bào (Garrett và cs, 2008) [24].
 Nguồn dinh dƣỡng
Các nguồn dinh dưỡng chủ yếu cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp của vi sinh
vật: carbon, nitơ, photpho. Nghiên cứu của Hijnen (2009) cho thấy nồng độ càng

cao các chất hữu cơ trong nước càng làm tăng lượng tế bào bám dính lên bề mặt và
tăng khả năng hình thành nên biofilm (Hijnen và cs, 2009) [26].
Carbon là nguyên tố cấu trúc cơ bản nhất tạo nên các thành phần của tế bào vi
sinh vật và cần thiết với số lượng lớn hơn các nguyên tố khác, tỉ lệ carbon:nitơ là
10:1; carbon:photpho là 30:1. Do đó, carbon rất cần thiết cho quá trình hình thành
mạng lưới các hợp chất ngoại bào. Đối với phân hủy sinh học ứng dụng màng sinh
học thì việc sử dụng nguồn carbon ban đầu dễ chuyển hóa cũng góp phần thúc đẩy
sự hình thành màng sinh học tốt hơn.
Đối với vi sinh vật nitơ được tìm thấy trong các protein, enzyme, các thành phần
tế bào và acid nucleic. Các muối nitơ có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp


14

protein của vi sinh vật. Do đó cần phải cung cấp nitơ cho vi sinh vật, vì không có
nitơ quá trình chuyển hóa của vi sinh vật sẽ bị ảnh hưởng khiến mạng lưới các chất
ngoại bào không được hình thành. Sự tổng hợp mạng lưới ngoại bào của các tế bào
vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn carbon và nitơ có sẵn trong môi trường nuôi cấy.
Sleytr (1997) đã chỉ ra rằng, nồng độ nitơ thấp trong môi trường nuôi cấy làm tăng
khả năng hấp thu đường, ảnh hưởng đáng kể đến sự tạo mạng lưới ngoại bào giúp
tạo màng sinh vật thuận lợi (Sleytr, 1997) [46]. Vì vậy, khi nguồn nitơ trong môi
trường tăng sẽ làm giảm khả năng tạo màng của vi khuẩn.
 Nồng độ muối NaCl
Nồng độ muối tác động trực tiếp lên sự hình thành màng sinh học thông qua đáp
ứng một số gene quy định sự hình thành phát triển màng sinh học và tác động gián
tiếp qua ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển vi sinh vật. Đa số vi khuẩn sinh
trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn 2%, nhưng có một số vi
khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối cao.
 Đặc tính tế bào
Các đặc tính tế bào có ảnh hưởng đến việc hình thành biofilm như khả năng tạo

các chất ngoại bào (polysaccharide, protein, lipit...), khả năng di động, lông roi,
lông nhung...(Davey và cs, 2000) [20]. Những vi sinh vật có lông nhung, lông roi sẽ
giúp cho việc di chuyển trong môi trường nước tốt hơn nên có hiệu quả tạo biofilm
cao hơn và do khả năng di chuyển tốt như vậy nó có thể dễ dàng di chuyển đến một
bề mặt giá thể nhất định, nơi mà có điều kiện thuận lợi cho việc hình thành màng
sinh học, đồng thời giúp cho việc bám dính ban đầu của tế bào vi sinh vật bề mặt tốt
hơn. Bên cạnh đó, một số loài không có các phần phụ trợ tế bào vẫn có khả năng
hình thành biofilm mạnh dựa vào khả năng tự tổng hợp sẵn các chất ngoại bào như
polysaccharide, glycoprotein tạo thành cấu trúc màng nhầy (slime), màng giáp
(capsule) bao quanh tế bào. Đặc tính này giúp các thế bào tự kết dính với nhau, ví
dụ như các loài vi sinh vật gây bệnh: Streptococcus mutans, S. salivarius, ...
(Costerton và cs, 1974) [17].


15

Như vậy việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học
là rất quan trọng và cần thiết, nó đảm bảo các điều kiện thuận lợi để các vi sinh vật
tạo màng ở mức tốt nhất.
2.1.4. Các phương pháp phân loại vi sinh vật
2.1.4.1. Phương pháp phân loại truyền thống
Phương pháp phân loại truyền thống là phương pháp dựa trên các đặc điểm hình
thái bên ngoài và các đặc điểm sinh lý của sinh vật để phân loại, cụ thể:
- Các đặc điểm về hình thái: hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc; hình
dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật, cách thức di chuyển của tế bào...
- Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất như: phản ứng nhuộm Gram, nguồn
carbon, nitơ sử dụng, nguồn năng lượng và cơ chế chuyển hóa năng lượng...
Ngoài ra, còn rất nhiều phương pháp cổ điển khác như: kiểm tra các phản ứng
sinh hóa của vi sinh vật với các chất khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các
kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào...

Các đặc trưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính được dùng
cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có ý nghĩa đối với
nhóm khác (vi khuẩn Gram âm). Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền
thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh
vật.
2.1.4.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Ngày nay, những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng
hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật sử dụng một phương
pháp nghiên cứu mới đó là “phân loại học phân tử”. Nếu như các phương pháp
truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh
học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật. Các phương pháp sinh
học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu như: phân tích acid nucleic, phân
tích protein, phân tích lipopolysaccharid, hóa phân loại học.
Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá
mức phân tử acid nucleic. Việc nghiên cứu phân tử rRNA hiện nay được coi là biện