ĐỒ án công nghệ sinh học thực vật CNSHTV

MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học là sự ứng dụng tổng hợp của sinh hóa học, vi sinh vật học và
các khoa học về công nghệ để đạt đến sự ứng dụng công nghiệp các năng lực của
vi sinh vật, của các tế bào, các tổ chức nuôi cấy và các thành phần của chúng.
Công nghệ sinh học như một thân cây mà những rễ chính của cây này là vi sinh vật
học, di truyền học, sinh hóa học, điện tử học, nông học, công nghệ học…và trên
vòm lá với hàng nghìn quả đó là các loại sản phẩm phục vụ trồng trọt, chăn nuôi, y
học, năng lượng mới, vật liệu mới, tuyển khoáng, bảo vệ môi trường...
Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền, người ta có thể tạo ra được những
giống cây trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu
bệnh, hạn hán và điều kiện nghèo phân bón. Nhờ bỏ qua được việc lai chéo và
khắc phục được sự tương khắc sinh sản mà việc lai tạo giống rút ngắn được nhiều
thời gian. Kỹ thuật tái tổ hợp AND và các kỹ thuật in vitro mở ra khả năng lai khác
loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền.
Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đã đem
lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt.
Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời
ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị
kinh tế cao.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng, được
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế. Ý thức được triển vọng to lớn của
ngành khoa học hiện đại này, chúng tôi xin giới thiệu quyển sách công nghệ nuôi
cấy mô tế bào thực vật nhằm phục vụ sinh viên, học viên sau đại học và các cơ
quan có liên quan.


CHỌN VÀ XỬ LÝ MẪU CẤY
I.

Thực Vật

Cây sử dụng để lấy mẫu cấy được gọi là cây mẹ hay cây gốc là cây được sử
dụng như một nguồn cung cấp mẫu nuôi cấy và được chọn lọc theo các kiểu hình
mong muốn. Cây lấy mẫu nuôi cấy muốn đạt được kết quả cần lưu ý đến các điều
kiện sau:
-

-

II.

Chế độ đinh dưỡng của cây mẹ: mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy mô là các
mẫu cấy được lấy trên các cây được cung cấp đủ dinh dưỡng.
Tình trạng sạch bệnh của cây mẹ: cây mẹ được chọn để lấy mẫu nuôi cấy
phải hoàn toàn không bị nhiễm với bất cứ mầm bệnh nào. Thông thường
những cây bị nhiễm bệnh thường tạo ra chồi hoặc phân sinh mô chồi có kích
thước nhỏ.
Thời gian lấy mẫu: các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, độ dài ngày, tình
trạng nước trong cây,…ảnh hưởng rất nhiều đến hàm lượng carbohydrate,
protein dự trữ và các chất điều hòa sinh trưởng trong mô cây. Tùy thuộc cây
mẹ được trồng tự nhiên ngoài đồng hay được chăm sóc đặc biệt trong nhà
lưới mà có thể lấy mẫu nuôi cấy theo mùa hoặc có thể lấy mẫu quanh năm.
Mẫu nuôi cấy ( explants )

Mẫu vật để nuôi cấy là một mảnh vật liệu thực vật được tách từ cây mẹ để
được nuôi cấy ( Hình 2.3 ).

Phẩm chất của mẫu cấy sẽ quyết định sự thành công của mẫu vật được nuôi cấy
vào môi trường. Đối với các mẫu nuôi cấy cần lưu ý một số đặc tính sau:

-

-

Các vị trí thực vật được sử dụng làm mẫu nuôi cấy ở trên mặt đất sạch hơn
các vị trí thực vật dưới đất.
Mẫu nuôi cấy càng nhỏ càng càng dễ tránh các vấn đề về nhiễm bệnh thực
vật ( virus, microplasma, bacteria ) nhưng giảm mức độ sống sót sau khi khử
trùng.
Mô bên trong ít nhiễm hơn mô bên ngoài.

Tuổi của mẫu nuôi cấy tùy thuộc vào tuổi của các cành được lấy mẫu:
-

Vị trí tuổi cành ở phía dưới thường non hơn vị trí tuổi cành ở phía trên
( Hình 2.4 ).


III.

Sự vô trùng

Nuôi cấy mô là một kỹ thuật nuôi cấy cần điều kiện vô trùng. Một số từ
chuyên môn cần được làm rõ.
-

Sự vô trùng (asepsis): Tránh nhiễm bằng cách sử dụng phương pháp tuyệt
trùng.
Làm sạch quan hệ với các sinh vật sống khác (Axenic).

Tiệt trùng (Sterilization): Giết hoặc loại vi sinh vật hoặc bào tử của nó bằng
nhiệt, lọc, hóa chất hoặc các chất tiệt trùng khác.

Nguồn tạp nhiễm
Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi tồn tại các sợi nấm , bào tử vi khuẩn
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hay vi khuẩn theo bụi lên môi trường
3.1 Khử trùng bề mặt mẫu cấy
Khử trùng bề mặt mẫu cấy thường được thực hiện với các chất diệt nấm
bệnh. Sản phẩm dùng để khử trùng tốt nhất là các sản phẩm rẻ tiền, không độc với
mẫu vật cũng như đối với người thao tác và hiệu quả loại các vi sinh vật trong một
phạm vi rộng. Các bước thao tác khử trùng mẫu được trình bày ở hình 2.8.


3.2 Hóa chất khử trùng: có nhiểu loại hóa chất được sử dụng để khử trùng bề
mặt.
Dung dịch hypochloride
Ion hypochloride có trong sodium hypochloride ( NaOCl) hoặc Caldium
hypochloride (Ca(OCl)2). Sodium hypochloride hòa tan trong nước ở dạng lỏng.
Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox. Nồng độ
cuối cùng cần thiết có thể thay đổi từ 0,25-2% trọng lượng/thể tích tùy thuộc vào
vật liệu thí nghiệm và thời gian ngâm mẫu. Dung dịch này thường bằng với 5-20%
thể tích/thể tích của các dung dịch Javel hoặc Clorox. Tuy nhên, nên xem kỹ liều
lượng của dung dung tẩy rửa thương mại.
Tác dụng diệt khuẩn của dung dịch hypochloride là cả hypochloride acid
(HOCl) và ion OCl- . Người ta cho rằng HOCl hiệu quả hơn OCl- do hiệu quả diệt
khuẩn Chlorine tốt nhất ở dung dịch hypochloride acid nhẹ. Dung dịch
hypochloride nên được sử dụng ở pH 6-7. Cả sodium và calcium hypochloride có
quan hệ đến khả năng oxy hóa.

Calcium hypochloride được bán ở dạng bột và thường rẻ hơn sodium
hypochloride. Về mặt lý thuyết calcium hypochloride (Ca(OCl)2) chứa 99,2 %
Chloride, nhưng trong thực tế thì chiếm 65-70% độ tinh khiết.
Dung dịch khử calicium hypochloride được chuẩn bị bằng cách hòa tan bột
calcium hypochloride vào trong nước sau đó lọc qua giấy lọc và sử dụng ngay.
Calcium hypochloride sẽ phóng thích chloride khi nó được hòa tan trong nước.
Điều này có nghĩa là chloride sẽ bị mất nếu bột calcium hypochloride bị ẩm , trong
khi đó sodium hypochloride sẽ bị mất hoạt tính theo thời gian và nếu đặt nơi ánh
sáng mạnh.Nồng độ sử dụng từ 5-10% để ngâm mẫu trong 20 phút.
Các hỗn hợp chloride và halogen khác
-

Nước chloride
Nước Bromide
Iodine
Hỗn hợp Chloramine hữu cơ

Cồn
Trong số các loại cồn được sử dụng để khử trùng, cồn ethanol được sử dụng
rộng rãi nhất. Cồn không những giết khuẩn mà còn lấy đi các chất sáp từ mô mẫu
cấy. Cồn khử trùng thường sử dụng nồng độ từ 70-95%. Cồn Methanol ít hiệu quả
hơn cồn ethanol. Tuy nhiên, một số trường hợp cồn isopropanol rất có hiệu quả
nhưng thời gian khử trùng tương đối ngắn 0,5-1 phút ở nồng độ 100%.
Ion kim loại nặng
-

-

Trong các kim loại nặng thì Mercuric Chloride (HgCl) là chất khử trùng
thông dụng nhất. Sử dụng hóa chất này phải hết sức cẩn thận vì độc cho thực
vật lẫn động vật, cũng như chất thải sau khi khử trùng có ảnh hưởng đến môi
trường. Ở các nước phát triển, các chất thải sau khi khử trùng bằng HgCl sẽ
được thu hồi và tái sử dụng lại. Các chất này không được thải ra môi trường
tự nhiên nếu chưa chưa xử lý.
Các ion Ag và Cu đôi khi cũng được sử dụng như là các chất diệt khuẩn.

Các chất khử trùng khác


Hai chất oxy hóa mạnh đó là hydrogen peroxide (H2O2) và potassium
permanganate (KMnO4) cũng được báo cáo có hiệu quả cao trong khử trùng bề
mặt. Tuy nhiên, các chất này thường được kết hợp trước hoặc sau khi khử trùng
với chất khử trùng khác.
Chất khử nấm
Nhiều chất khử nấm có nguồn gốc là thuốc bảo vệ thực vật cũng được sử
dụng trong khử trùng. Ví dụ Benomyl, Carbendazim, Fenbendazol là các chất khử
nấm của thuốc bảo vệ thực vật được khử trùng trong khử trùng bề mặt. Nồng độ và
liều lượng thay đổi theo loại mẫu thực vật. Người ta cũng cho các chất này vào
trong môi trường nuôi cấy.
Chất kháng sinh
Một số chất kháng sinh cũng được sử dụng cho khử trùng bề mặt để loại trực
tiếp các vi khuẩn trong mẫu cấy. Các chất kháng sinh thường được sử dụng là:
-

0,15% streptomycin 0,01% merthiolate thêm vào trong 4% NaOCl cho khử
trùng bề mặt trái Euterpe trong 12 giờ.
100μg/l của hỗn hợp penicilin/streptomycin trong 15 phút của chồi cây Đào.
17% Alcide trong 1 giờ sau đó trong rifampicin (50μg/l) để khử trùng nốt

thân cây Naucle.

3.3 Thời gian khử trùng
Nồng độ hóa chất và thời gian khử trùng mẫu cực kỳ quan trọng. Nếu
nồng độ quá cao và thời gian khử trùng khá dài mẫu có thể bị tổn thương và
chết. Còn nếu nồng độ quá thấp và thời gian khử trùng quá ngắn thì không giết
được vi sinh vật. Nồng độ thấp và thời gian khử trùng dài cũng có hiệu quả như
nồng độ cao và thời gian khử trùng ngắn.


Một số ví dụ về cách khử trùng bề mặt
Đoạn cành của cây trồng ngoài đồng Pseudotsuga và Pinus (Gupta và
Durzan, 1985).
-

Rửa nước máy trong 3-4 phút.
Ngâm trong bột giặt 0,1% trong 5-10 phút, sau đó rửa lại bằng nước máy.
Thực hiện trong tủ vô trùng.
Ngâm trong hydrogen peroxide 30% trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất vô
trùng 3 lần.
Ngâm trong sodium hypochloride 0,53% trong 10 phút, rửa lại nước cất khử
trùng 3 lần.
Ngâm trong HgCl 0,53% trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 5-6
lần.

Một phương pháp khác ( Debergh, 2003)
Ngâm mẫu và rửa mẫu bằng nước và bột giặt .
-

Lắc trong alcohol trong vài giây

HgCl (0,1-1%) + Teepol 2 giọt/100ml: 3-5 phút.
Rửa trong nước cất đã tiệt trùng.
Chất tẩy thương mại 7-15% + Teepol 2 giọt/100ml: 10-30 phút
Rửa vài lần trong nước cất tiệt trùng.


Chú thích:
-

IV.

Nước máy và bột giặt để lấy các phần nhỏ bám dính trên bề mặt.
Ethanol 70% hầu như hiệu quả để làm biến tính protein. Đối với ethanol
95% được sử dụng để hòa tan các lớp sáp bề mặt.
NaOCl (chất tẩy thương mại như Javel, Clorox) hoặc Ca(OCl)2 hoạt động
trên cơ sở cả ion Cl- và các phản ứng oxy hóa khác.
HgCl hoạt động trên cơ sở ion Cl- và kim loại nặng làm biến tính protein,
chất thấm (wetting agar) (ví dụ Teepol) có thể được thêm vào để tăng sự
bám dính bề mặt.
Khử trùng phòng cấy và tủ cấy

Phòng cấy thường có diện tích hẹp, rộng từ 10 -15 m2 , có hai lớp cửa để
tránh đưa không khí chuyển động trực tiếp từ bên ngoài đem bụi vào. Sàn và tường
nhà được lát gạch men để dễ lau chùi. Trước khi tiến hành cấy cần khử trùng tủ cấy
và môi trường trong phòng cấy. Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng
trước: tủ quần áo choàng, mũ vải, khẩu trang, dao kéo, … Trên bàn cần thường
xuyên có đèn cồn để sử dụng khi cấy và cốc hoặc ống nghiệm đựng cồn 96o để
nhúng dụng cụ làm việc.
Trước khi cấy, thí nghiệm học viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến
khuỷu tay bằng cồn 70o. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có một đèn tử ngoại

treo trên trần.
Phòng cấy lớn cần được khử trùng bằng đèn cực tím. Thời gian khử trùng tùy
theo kích thước của phòng và đèn cực tím chỉ được sử dụng khi không có người.
Phòng có thể khử trùng bằng lau rửa hai lần một tháng bằng các hóa chất
tẩy nấm. Phòng nhỏ hơn có thể được khử trùng bằng tia cực tím và các dung dịch
khử trùng. Tủ sấy thổi gió có thể khử trùng bằng phương pháp thổi quạt gió và lau
tất cả bề mặt bằng cồn 96o trong 15 phút trước khi bắt đầu làm việc.
Phòng nuôi cũng được khử trùng trước hết là bằng xà phòng bột. Sau đó lau
bằng cồn 96o. Tất cả sàn, trần đều được lau như vậy mỗi tuần. Cẩn thận không nên
khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử. Cần giảm thiểu chuyển
động của không khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu vì vậy dụng cụ phục vụ


việc cấy phải được chuẩn vị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại ra vào buồng cấy
nhiều lần.
V.
Khử trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy
Thành phần chịu nhiệt thì được hấp khử trùng. Thành phần không chịu nhiệt
được lọc.
Hấp khử trùng: Môi trường được hấp khử trùng cần ở một nhiệt độ chọn sẵn
và ở một áp suất tương ứng trong một thời gian ẩn định. Ví dụ 50kPa tương ứng
với 1120C và 100kPa tương ứng với 1200C.
5.1 Các kiểu nồi hấp khử trùng


5.2 Khử trùng dụng cụ và môi trường cấy
a. Dụng cụ:
Dụng cụ thủy tinh dung cho nuôi cấy mô và thế bào thực vật là bình thủy tinh
trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ bình
thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy. Cần rửa sạch dụng cụ

thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng, xử lý tiệt trùng các dụng cụ thủy tinh ấy.
Dụng cụ kim loại, giấy nhôm,… cần được khử trùng bằng khí nóng (130 –
170oC) trong 2 – 4 giờ trong tủ sấy. Tất cả các vật dụng này phải được gói kín
trước khi khử trùng nhưng không được gói bằng giấy vì giấy bị phân rã ở nhiệt độ
170oC. Không nên hấp khử trùng kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm cho dụng
cụ kim loại bị rỉ sét và bị ăn mòn.
Trước khi sử dụng các dụng cụ đã được khử trùng bằng khí nóng, các dụng cụ
được lấy ra khỏi giấy gói, nhúng vào cồn 96o và đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Sau khi
dùng xong, dụng cụ phải được đốt trên ngọn lửa đèn cồn trước khi sử dụng tiếp.
Khi sử dụng cồn cần lưu ý an toàn tối đa vì rất dễ bị phụt.


Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới áp suất nhất định.
Các dụng cụ khác nhau đều có thể khử trùng bằng nồi hấp. Hầu hết tất cả các vi
sinh vật đều chết bởi hơi nước trong nồi hấp trong 10 – 15 phút ở 121oC.
Nhiệt độ(oC)
160
170
180
190

Thời gian khử trùng(phút)
45
18
7,5
1,5

b. Nút đậy:
Thường dùng nhất là nút đậy làm bằng bông không thấm nước. Nút phải
tương đối chật để đảm bào bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường

không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
c. Khử trùng môi trường khoáng:
Để khử trùng môi trường khoáng thường sử dụng hai phương pháp là hấp vô
trùng hay sử dụng màng lọc vô trùng. Môi trường nuôi cấy, nước cất và các hóa
chất ổn định khác có thể chứa trong bình thủy tinh và đậy bằng nút bông gòn, giấy
nhôm hoặc nút nhựa.
Tuy nhiên môi trường các chất không bền nhiệt thì cần sử dụng phin lọc
milipore. Nói chung môi trường khoáng được hấp ở nhiệt độ 121oC, 1 atm. Với
những môi trường có thể tích nhỏ (100ml hoặc ít hơn) thời gian khử trùng khoảng
15 -20 phút. Còn với lượng môi trường lớn thì phải khử trùng trong 30 – 40 phút,
áp suất không nên quá 1 atm, vì áp suất cao có thể sẽ làm phân hủy carbohydrate
và các phức hợp nhạy cảm với nhiệt độ.
Thể tích môi trường(ml)
Thời gian khử trung tối thiểu(phút)
20 – 25
24
50
26
100
28,5
250
31,5
500
35
1000
40
2000
48
3000
55

4000
63


Nhiều loại protein, vitamin, amino acid, phytohormone, … không bền nhiệt
vì vậy nên dùng phin lọc micropore để khử trùng. Phin lọc milipore hoặc phin lọc
seitz đều có thể sử dụng với kích thước lỗ không lớn hơn 0,25µm. Các loại bình
đựng thủy tinh cần được hấp tiệt trùng trước khi lọc.

NUÔI CẤY BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
TÚI PHẤN


Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải tiến bao
gồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn trong các
thế hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối cùng tạo ra các dòng đồng hợp tử. Nuôi cấy
bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các dòng đồng hợp tử
ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn
thời gian cần thiết để tạo ra giống mới.
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử
hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra cây đơn bội. Số
nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử
hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy bao phấn rất có ích đối với nhà
chọn giống vì thế đơn bội kép có thể được sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây
tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời gian cần thiết để tạo ra một giống hay một dòng
tự phối bằng phương pháp đơn bội kép được rút ngắn nhiều thế hệ so với phương
pháp truyền thống. Các dòng đơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải thiện hiệu
quả chọn lọc đối với nhiều tính trạng vì trong quần thể không có phương sai trội,
đồng thời gene lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này đã được áp dụng
thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra giống lúa và lúa mì. Tuy nhiên, hạn chế

trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả năng nuôi cấy khó và tính đặc
thù cao của kiểu gene.
Ví dụ, các nhà chọn giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu
quả bằng các nhà chọn giống lúa Japonica do các kiểu gene Indica khó nuôi cấy
hạt phấn còn bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của bao phấn, điều kiện sinh lý
của cây cho phấn, điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, điều
kiện nuôi cấy và hiệu quả lưỡng bội hoá bằng colchicine.

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn do Guha and Maheshwari nghiên cứu năm 1964.
Kỹ thuật này có thể ứng dụng tạo cá thể đơn bội cho hơn 200 loài cây trồng, bao
gồm cà chua, lúa, thuốc lá, lúa mạch, cây phong lữ.
Kỹ thuật cấy túi phấn


I.

Điều kiện sinh trưởng của cây mẹ

Ở cây túi phấn, tình trạng sinh lý của cây mẹ rất quan trọng ( Ví dụ: quang
kỳ, nhiệt độ và sử dụng nông dược).Điều kiện sinh trưởng của cây mẹ được sử
dụng để cung cấp túi phấn cho nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể trên thành công của
việc nuôi cấy. Mỗi loài cần một chế độ môi trường khác nhau. Các yếu tố môi
trường bên ngoài như nhiệt độ, quang kỳ và cường độ ánh sáng ,ví dụ về nuôi cấy
túi phấn đã được thực hiện hoàn hảo nhất trên cây Thuốc Lá ( Nicotiana tabacum )
trong điều kiện quang kỳ ngắn (8 giờ) và cường độ ánh sáng cao ( 16000 lux ) là
rất có lợi cho nuôi cấy túi phấn. Trong khi đó, cây lúa mạch (Hordeum vulgare)
cần giảm nhiệt độ (12oC) và cường độ ánh sáng cao (20000 lux) được khuyến cáo.
II.

Tuổi cây mẹ và giai đoạn phát triển hoa

Người ta khuyến cáo là túi phấn được lấy ở giai đoạn cây ra hoa, nhưng hoa
chưa già. Mỗi loài ra hoa theo chu kỳ sống khác nhau, có cây sau khi hoa đã chết,
nhưng có cây ra hoa sau đó sinh trưởng rồi ra hoa tiếp. Sức sống của hạt phấn tùy
thuộc vào sức sống của cây mẹ. Cây mẹ còn non cung cấp hoa mang hạt phấn có
sức sống mạnh hơn cây mẹ già. Qúa trình hình thành và phát triển hoa thay đổi
theo từng loài. Đối với cây thuốc lá, hoa dược lấy ở giai đoạn 2 (hình 5.2) thì cấy
dễ thành công.

Giai đoạn đặc biệt của giai đoạn phát triển túi phấn ở thời gian cấy là yếu tố
quan trọng nhất để đạt được thành công trong sự thành lập cây đơn bội. Ở cây hạt


kín, có nhiều túi phấn khó xác định cho mỗi mầm hoa, có thể chọn vài túi phấn ở
các giai đoạn khác nhau của sự phát triển hạt phấn. Ở các loài có nhiều túi phấn
trên mỗi hoa, một loạt mầm hoa phải được xác định để cho tất cả các giai đoạn của
sự phát triển của hạt phấn. Một số đặc tính có thể quan sát được và phân biệt dễ
dàng có thể sử dụng vào giai đoạn phát triển thích hợp nhất ví dụ giai đoạn 2, cánh
hoa hơi lớn hơn đài hoa.
III.

Giai đoạn phát triển hạt phấn

Giai đoạn tối ưu về sự phát triển của hạt phấn vào thời gian thu hoạch mầm
hoa rất quan trọng. Ở cây Thuốc lá, giai đoạn phân bào hạt phấn (Pollen grain
mitosis = PGM) cho kết quả tốt nhất, trong khi ở cây ngũ cốc và cây Cải (Brassica)
giai đoạn tối ưu là thời kì đơn nhân (uninucleate).
Các báo cáo cho thấy rằng túi phấn rơi vào một trong ba loại: trước phân bào
(premitotic), phân bào (mitotic) hoặc sau phân bào (postmitotic).
Sự đáp ứng tốt nhất từ cấy túi phấn mà ở đó các vi bào tử đã hoàn tất giai

đoạn gián phân (meiosis), nhưng chưa bắt đầu phân chia hạt phấn lần đầu ví dụ cây
Hyoscyamus. Đáp ứng tốt nhất từ cây hạt phấn ở vào thời điểm phân chia hạt phấn
đầu tiên ví dụ cây thuốc lá (Nicotiana tabacum). Đáp ứng tốt nhất từ hạt phấn ở
giai đoạn hai tế bào đầu của sự phát triển hạt phấn (Atropa belladonna).


Các phương pháp khử trùng
Sự khử trùng được thực hiện với các hóa chất khử trùng. Thông thường khử
trùng toàn bộ phát hoa trước khi khử trùng từng hoa.
V.
Tiền sử lý mầm hoa hoặc túi phấn
Xử lý hoa hoặc phát hoa chứa hạt phấn ở giai đoạn thích hợp được cho thấy
là có sự cải thiện sản lượng phôi hình thành ở một số cây.
Xử lý nhiệt độ trước trong 2-30 ngày ở nhiệt độ 3-100C, khi cấy Nicotiana,
Datura hoặc 350C ở cây Capsicum có thể kích thích sự tạo phôi.
Ngân hoa được cắt vào nước trong vài ngày.
Ly tâm túi phấn ở 3-5gs-1
Áp dụng chân không.
VI.
Phương pháp tách ra từng phần nhỏ
IV.

-

-

Một số loài có túi phấn dễ tách ra từ hoa. Tuy nhiên, ở một số loài cây lấy
hạt vùng nhiệt đới như Panicum, Penisetum và Setaria việc tách các thành phần túi
phấn nhỏ rất khó khăn và tốn nhiều thời gian, nên người ta khuyến cáo là nên cấy
toàn bộ phát hoa và có thể đặt trong môi trường lỏng, lắc chậm.

Sự phóng thích hạt phấn ngẫu nhiên
Hạt phấn được lấy từ túi phấn bằng cơ học hay bằng sự nứt tự nhiên của túi
phấn. Hạt phấn được tách ra, cấy vào môi trường agar hoặc môi trường lỏng và sự
phát triển của hạt phấn sẽ xảy ra bên trong túi phấn.
Kỹ thuật tách
Kỹ thuật này bao gồm tách túi phấn để phóng thích bào tử tốt hơn là để nứt
ra tự nhiên. Kỹ thuật này đã thành công trên cây thuốc lá và cũng thành công trên
các cây khác như Pennisetum typhoides.
Túi phấn lấy từ mầm hoa non được làm đồng nhất với máy đồng nhất mẫu.
Theo cách này, một dung dịch hạt phấn thô được làm sạch. Dung dịch được lọc, ly
tâm và được gạn lấy phần bên dưới và chủng bằng pipette trên môi trường đĩa petri
(Debergh, 1974 trích từ Pierik, 1987) (Hình 5.5)

Môi trường nuôi cấy
Môi trường rắn hoặc lỏng : Trong nhiều năm nghiên cứu, người ta nhận thấy
rằng, hầu hết các kiểu agar được sử dụng để làm cứng môi trường chứa các
hỗn hợp gây hại cho sức khỏe của hạt phấn. Một dạng gel được đề nghị sử
VII.

-


-

-

-

dụng là agarose hoặc sử dụng môi trường lỏng. Tuy nhiên, bất lợi của môi
trường lỏng là yếm khí, mặc dù tạo nhiều callus nhưng khả năng biến đổi
thành cây thấp.
Áp suất thẩm thấu: Mặc dù ít có thông tin về vấn đề này, nhưng hàm lượng
đường cao trong môi trường (8-12%) cũng hạn chế sự phát triển của mẫu
cấy. Các kết quả cho thấy, hàm lượng đường trong môi trường thấp (2-4%)
cho kết quả tốt hơn.
Chất điều hòa sinh trưởng: Một số loài không cần chất điều hòa sinh trưởng,
nhưng một số loài khác cần chất điều hòa sinh trưởng, trong đó 2,4-D; BAP
và IAA thì rất cần.
Chất hữu cơ và nitrogen khác: Khoai Tây là thành phần môi trường thích
hợp cho nuôi cấy túi phấn và các cây lấy hạt.
Hỗn hợp khác: Than hoạt tính là thành phần chủ yếu được khuyến cáo nên
sử dụng nuôi cấy túi phấn, bởi vì chất này có thể hấp thụ các chất như
vitamin, phenol, sắt…được phóng thích ra từ mô già. Một khả năng khác là
sự ngoại hấp bởi than của 5(hydroxymethyl)-2-furfural, một sản phẩm phân
hủy của đường bị hấp khử trùng.

Điều kiện ủ
Nhiệt độ: Nhiệt độ ủ là một yếu tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy. Túi
phấn của hầu hết các loài nuôi cấy thường thích hợp ở 250C. Tuy nhiên,ở
VIII.

-


-

-

một vài loài đặc biệt cần nhiệt độ 350C trong một thời gian ngắn như
Brassica.
Ánh sáng: Ít có bằng chứng hiệu quả của ánh sáng trong quá trình nuôi cấy.
Tuy nhiên kinh nghiệm cho thấy, cấy túi phấn nên để trong tối cho đến khi
thành phôi hay callus.
Mật số túi phấn: Người ta khuyến cáo là nếu cấy trong môi trường lỏng ít
nhất 60 túi phấn được đặt trong mỗi ml môi trường.

Các tế bào của cây đơn bội thực sự chứa một bộ nhiễm sắc thể đơn. Kiểu
hình của nó là sự biểu hiện một bản đơn thông tin di truyền.
Một lãnh vực thường được đề cập trong cấy túi phấn là tạo tế bào đực
(androgenesis). Tuy nhiên, chúng thường được sử dụng theo một nghĩa hạn chế
để chỉ tạo cây đơn bội hoặc đơn bội nhân đôi từ các túi phấn này.
Khi bắt đầu nuôi cấy từ cây tứ bội (tetraploid), kết quả tạo đơn bội có một
bộ đôi thông tin di truyền được gọi là nhị đơn bội (dihaploid).


Trước khi sự phân bào hình thành hạt phấn đầu tiên xuất hiện, người ta gọi
nó là vi bào tử (micropore)và sau này được gọi là hạt phấn.
IX.

Lợi ích của cấy vi bào tử (micropore) trong cấy túi phấn

Trong quá trình phát triển vi bào tử thường không tiến triển qua phân chia
đầu do chất ngăn cản ở túi phấn.
Sự sinh sôi nhanh của mô vách túi phấn có thể xảy ra kết quả nhị bội
(diploid) không đồng nhất.
Bắt đầu với vi bào tử được tách rời sẽ luôn tạo ra các cây đồng nhất, ngay cả
nếu chúng là diploid (trường hợp của các hạt cốc khác) hoặc ngay cả triploids
(Petunia).

Cấy vi bào tử cho một quần thể đồng nhất của cây, kết quả từ sự phát triển vi
bào tử hoặc từ hạt phấn, trong khi lấy đi mô vách túi phấn


X.

Ưu điểmvà nhược điểm của phương pháp

Một số ưu điểm của phương pháp này như sau:
-

Kỹ thuật khá đơn giản

Ở một số loài sự phân chia tế bào dễ dàng ngay cả khi những tế bào hạt
phấn chưa thực sự chín
Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với môi trường nuôi cấy cao (tần suất cảm
ứng môi trường cao)
Có thể sản xuất thể đơn bội với số lượng lớn va nhanh chóng. Trong những
thí nghiệm sử dụng môi trường Datura innoxia, tần suất cảm ứng với môi trường
của hạt phấn đạt tới 100% và trong điều kiện tối ưu có thể sản xuất hơn 1000 callus
cây con từ một bao phấn. Có thể xác định kết quả trong vòng 24 giờ từ khi tế bào
bắt đầu phân chia.


Một số nhược điểm chính của tạo thể đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn là:
-

Đối với một số loài nhiều cây tạo ra không phải là đơn bội

Ở cây ngũ cốc, chỉ thu được cây xanh rất ít; nhiều cây bạch tạng hoặc bị thể

khảm
-

Dễ vất bỏ đi những bao phấn có thể tạo được thể đơn bội

Để đạt được những kết quả mong muốn cần thiết phải có những định
hướng cụ thể.

Nguồn tài liệu tham khảo
-

Sách Công Nghệ Sinh Học Thực Vật (Trường Công Nghệ TP HCM-Biên
soạn: ThS. Trịnh Thị Lan Anh)
Trang Wed Diễn Đàn Sinh Học Trẻ
Trang Wed TaiLieu.vn
Tài liệu Nuôi cấy mô tế bào thực vật ( GS. Trần Văn Minh )