Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh giai đoạn nảy mầm ở hạt đậu tương(Glycine max

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ LAN PHƢỢNG

ẢNH HƢỞNG CỦA ÁP SUẤT THẨM THẤU
ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, HOÁ SINH
GIAI ĐOẠN NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƢƠNG
(Glycine mahx)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS NGUYỄN VĂN MÃ
Học viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LAN PHƢỢNG

HÀ NỘI, 2010


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây Đậu tƣơng (Glycine max (L) Merrill) hay còn gọi là đậu nành, là
cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị về mặt kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng
cao. Trong hạt đậu chứa: 40% protein, 12-25% lipid, 10-15% glucid, các chất
khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các vitamin A, B1, B2, D, E, F và các
enzym, sáp, nhựa, cellulose 1 , 4 .
Trong cây đậu tƣơng có nhiều loại axit amin cơ bản isoleucin, leucin,
lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu tƣơng đƣợc coi là
một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng kể các amino

axit không thay thế cần thiết cho cơ thể ngƣời và động vật. Một đặc tính khác
nữa ở cây đậu tƣơng là có vi khuẩn nốt sần ở rễ, tạo khả năng cố định nitơ không
khí, vì vậy trồng đậu tƣơng có tác dụng cải tạo đất và bảo vệ môi trƣờng 4 .
Ở Việt Nam, đậu tƣơng là cây trồng quan trọng và có mặt tƣơng đối sớm,
sản phẩm từ đậu tƣơng đƣợc sử dụng phổ biến trong các bữa ăn hàng ngày nhƣ:
đậu phụ, sữa đậu nành, dầu ăn, nƣớc tƣơng, bột đậu. Ngoài ra đậu tƣơng đƣợc
dùng nhƣ một số bài thuốc cổ truyền ngừa ung thƣ, giảm sỏi thận... 8]. Không
những đậu tƣơng đƣợc sử dụng cho ngƣời mà còn đƣợc sử dụng làm thức ăn cung
cấp protein thực vật cho động vật nhƣ: khô dầu đậu tƣơng, bột đậu tƣơng...
Đậu tƣơng là loại cây trồng quan trọng ở một số nƣớc trên thế giới nhƣ
Mỹ, Braxin, Achentina, Trung Quốc, Ấn Độ, Paragoay, Canađa, Inđônêsia và
các nƣớc khác. Sản lƣợng đậu tƣơng cũng tăng theo từng năm. Theo dự báo
của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng xuất khẩu đậu tƣơng trên thế giới năm 2010 dự
báo đạt 88,24 triệu tấn, tăng so với 86,35 triệu tấn của năm 2009. Vì vậy tổng
sản lƣợng dầu đậu tƣơng thế giới dự báo đạt 39,97 triệu tấn trong năm 2010,
tăng so với 37,98 triệu tấn của năm 2009. Tổng xuất khẩu dầu đậu tƣơng thế
giới dự báo đạt 9,06 triệu tấn so với 9,01 triệu tấn của năm 2009.


2

Việc nâng cao năng suất cây đậu tƣơng mang lại nhiều lợi ích. Tuy
nhiên vấn đề cơ bản hạn chế năng suất đậu tƣơng ở Việt Nam là điều kiện khí
hậu, đặc biệt là hạn hán. Nƣớc ta có địa hình đa dạng, diễn biến khí hậu phức
tạp, lƣợng mƣa phân bố không đều giữa các vùng và các thời kỳ trong năm
nên hạn hán có thể xảy ra ở bất kỳ vùng nào, mùa nào, khi gặp điều kiện thiếu
nƣớc năng suất sẽ giảm đáng kể 6 , 10 , 14 .
Các nghiên cứu tìm hiểu bản chất khả năng chịu hạn của cây trồng nói
chung và đậu tƣơng nói riêng ngày càng đƣợc mở rộng. Với sự tiến bộ của khoa
học kĩ thuật hiện đại, các nhà khoa học có điều kiện đi sâu tìm hiểu cơ chế sinh

lý liên quan đến tính chịu hạn của thực vật nhƣ: ảnh hƣởng của thiếu nƣớc đến
sự phát triển của hạt [44], [50], đến quá trình hô hấp [45] và quang hợp [46],
[48]. Một số cơ chế hóa sinh và sinh học phân tử cũng đã đƣợc nghiên cứu
nhằm: xác định vị trí của gen liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu [17],
gen tổng hợp một số chất hình thành và tích lũy nhiều khi hạn hán: prolin [3],
[12], nhóm amin bậc 4, một số đƣờng [27], [33], [37], [51]... Trên thế giới đã có
một số nhà khoa học nghiên cứu nhƣ: James A.Bunce [42], Miquel Ribas Carbo [46], Sheila A.Blackman [52], tìm hiểu ảnh hƣởng của sự thiếu nƣớc đến
quang hợp, hô hấp, sinh trƣởng đã đạt đƣợc kết quả nhất định.
Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn
khi xử lý phân vi lƣợng, khả năng quang hợp, chất lƣợng hạt khi gây hạn, nâng
cao khả năng chịu hạn của đậu tƣơng: Ngô Đức Dƣơng [6], Điêu Thị Mai Hoa
[11], Nguyễn Huy Hoàng [13], [16], Trần Thị Phƣơng Liên [17], Nguyễn Văn
Mã [19], [20], [22], [23].
Đối với thực vật, để có thể tồn tại đƣợc với điều kiện bất lợi của môi
trƣờng phải có những cơ chế thích nghi. Một trong những phản ứng thích nghi
đó là việc tăng hàm lƣợng một số chất điều hoà áp suất thẩm thấu. Vì vậy việc
nghiên cứu về áp suất thẩm thấu và ảnh hƣởng của áp suất thẩm thấu lên thực


3

vật nói chung, đậu tƣơng nói riêng là một việc quan trọng, xuất phát từ vấn đề
này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của áp suất thẩm
thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh giai đoạn nảy mầm ở hạt đậu
tương (Glycine max)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định một số chỉ tiêu trong điều kiện áp suất thẩm thấu (ASTT) khác
nhau: khả năng nảy mầm, sinh trƣởng thân mầm, rễ mầm, khối lƣợng tƣơi, khối
lƣợng khô, hàm lƣợng prolin, hoạt độ một số enzym trong mầm đậu tƣơng.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xác định một số chỉ tiêu sinh lý nhƣ: tỷ lệ nảy mầm, sinh trƣởng thân
mầm, rễ mầm, khối lƣợng tƣơi, khối lƣợng khô của mầm đậu tƣơng trong các
điều kiện ASTT khác nhau.
- Xác định hàm lƣợng prolin của mầm đậu tƣơng trong các điều kiện
ASTT khác nhau.
- Xác định hoạt độ các enzym proteaza, lipaza và -amylaza của mầm
đậu tƣơng ở các điều kiện ASTT khác nhau.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng: Giống đậu tƣơng DT96, AK02.
Phạm vi nghiên cứu: một số chỉ tiêu sinh lý (tỉ lệ nảy mầm, chiều dài
thân mầm, rễ mầm, khối lƣợng tƣơi, khối lƣợng khô của mầm), hàm lƣợng
prolin, hoạt độ các enzym proteaza, lipaza và -amylaza của mầm đậu tƣơng.
5. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
Bổ sung nguồn tài liệu cho việc nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hoá
sinh của mầm đậu tƣơng trong điều kiện ASTT khác nhau và mối quan hệ của
chúng với khả năng chịu hạn của cây.
Xác định đƣợc giống chịu đƣợc điều kiện ASTT cao phục vụ cho việc
gieo trồng ở vùng ngập mặn hoặc vùng hạn.


4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây đậu tƣơng
1.1.1. Nguồn gốc cây đậu tương
Cây đậu tƣơng thuộc họ Đậu (Fabaceae), bộ Fabales là một trong
những cây trồng cổ nhất của nhân loại. Năm 1948, Ricker và Morse đã khẳng
định tên thực vật đúng của đậu tƣơng là Glycine max (L.) Merrill. Chi phụ
Soja có hai loài Glycine max (L.) Merrill và Glycine soja Sieb et Zucc.

Glycine max (L.) Merrill là cây trồng hàng năm, không phát hiện thấy loài
hoang dại. Nó có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc). Xuất phát từ
một loài đậu nành dại thân mảnh, dạng dây leo, ít phân nhánh, dạng bụi, xẻ lá
chét lông chim, phiến lá hình ô van, chùm hoa có cuống ngắn, hoa tím hoặc
trắng, quả thẳng hoặc cong, thƣờng có nhiều lông. Mỗi quả thƣờng có ba hạt
hình tròn hoặc cầu. Vỏ hạt có màu sắc biến đổi từ vàng sáng đến nâu, đen,
xanh. Khối lƣợng của hạt dao động từ 10g đến 20g [1], [4], [10].
Từ Trung Quốc, cây đậu nành đã đƣợc nhân rộng ra khắp thế giới. Theo các
nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trƣớc công nguyên, đậu nành đƣợc
đƣa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật. Giữa thế kỷ 17, đậu nành mới
đƣợc nhà thực vật học ngƣời Đức Engelbert Caempfer đƣa về Châu Âu và đến năm
1954, đậu nành đƣợc du nhập vào Hoa Kỳ [28]. Những nghiên cứu về nguồn gốc
cây đậu tƣơng chứng tỏ nó bắt nguồn từ Trung Quốc, các kết quả nghiên cứu về tế
bào học, hình thái học, protein trong hạt và ADN của ty thể đã chứng tỏ rằng G.
soj2a là tổ tiên hoang dại của cây đậu tƣơng trồng [4].
1.1.2. Tình hình gieo trồng cây đậu tương
Cây đậu tƣơng là cây có ý nghĩa về mặt kinh tế và môi trƣờng. Nó có tác
dụng cải tạo đất. Trên thế giới, diện tích đậu tƣơng ngày càng đƣợc mở rộng, năng


5

suất ngày càng tăng. Đậu tƣơng có mặt ở khắp các châu lục, tập trung nhiều nhất ở
châu Mỹ, tiếp đến là châu Á và một số nơi khác trên thế giới.
Ở Việt Nam, cây đậu tƣơng đƣợc trồng tƣơng đối sớm nhƣng do tập
quán canh tác nên đậu tƣơng chƣa phát triển về diện tích và năng suất. So với
bình quân chung của thế giới, năng suất đậu tƣơng của Việt Nam chỉ đạt 57%.
Cả nƣớc hình thành 6 vùng sản xuất đậu tƣơng: vùng Đông Nam Bộ có diện
tích lớn nhất chiếm 26,2% diện tích đậu tƣơng cả nƣớc, miền núi Bắc Bộ
24,7%; Đồng bằng sông Hồng 17,5%; Đồng bằng sông Cửu Long 12,4%; còn

lại là vùng đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên chiếm 33,4%. Về
sản lƣợng: 3 vùng Đồng bằng sông Hồng, Đông Nam Bộ, Đồng bằng sông
Cửu Long chiếm 63% sản lƣợng đậu tƣơng cả nƣớc. Đặc biệt vùng Đồng
bằng sông Cửu Long với 12,4% diện tích nhƣng lại chiếm 20,9% sản lƣợng
đậu tƣơng cả nƣớc, năng suất bình quân đạt 16 tạ/ha [4].
1.2. Các giai đoạn sinh trƣởng phát triển của đậu tƣơng
1.2.1. Giai đoạn nảy mầm
Sau khi trồng, hạt đậu tƣơng ngấm nƣớc rất nhanh, trừ 1 vài giống đặc
biệt là loại hoang dại, khả năng ngấm nƣớc chậm hơn. Trong điều kiện thuận
lợi rễ xuất hiện sau khi trồng từ 1 đến 2 ngày. Rễ này gọi là rễ chính nó phát
triển nhanh xuống phía dƣới đến ngày thứ 4, ngày thứ 5 rễ phụ bắt đầu xuất
hiện. Sau 3-4 ngày lá mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất do sự sinh
trƣởng mạnh của phần trên trụ mầm dƣới. Lúc đầu lá mầm có màu vàng nhạt,
sau có màu xanh, sau cùng chuyển sang vàng và rụng xuống [1], 4 , [15].
Thực chất quá trình nảy mầm là một chuỗi biến đổi sinh lý, sinh hoá
mạnh mẽ diễn ra trong hạt, chuẩn bị cho sự hình thành cây non. Đậu tƣơng
thuộc cây hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các pha nhƣ sự nảy mầm
của cây hai lá mầm, đó là:


6

+ Pha trƣơng hạt: Tính từ khi bắt đầu nảy mầm, hạt hút nƣớc rất mạnh
làm trƣơng hạt.
+ Pha hình thành và hoạt hoá enzym: Hạt có một lƣợng enzym nhất
định nhƣng chủ yếu ở dạng liên kết, khi hạt hút nƣớc thì enzym mới đƣợc giải
phóng ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh.
+ Pha tích luỹ chất dinh dƣỡng: Ngay trong những phút đầu tiên ngâm trong
nƣớc, độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt chu trình hexozomonophotphat tăng
lên nhiều lần, do vậy lƣợng ATP tích luỹ nhiều.

+ Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trƣng
cho cơ thể trong giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dƣỡng trong hạt chủ yếu
thuộc 3 nhóm chất hữu cơ là: gluxit, protein, lipit. Trong quá trình nảy mầm
enzym -amilaza tác động vào liên kết 1,4- glucozit phân giải tinh bột thành
các đextrin tham gia vào quá trình hô hấp ở các dạng saccarôzơ tích luỹ ở các
tế bào trụ phôi. Protein đƣợc phân giải bởi enzym proteaza thành các axit amin
và các amít. Phần lớn các axit amin tạo thành đƣợc vận chuyển vào trụ phôi để
tổng hợp các phân tử protein đặc trƣng cho cơ thể. Enzym lipaza phân giải lipit
thành axit béo và glixerol. Ngoài ra lipit còn đƣợc tái chuyển hoá thành gluxit
cung cấp năng lƣợng cho hạt nảy mầm.
Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nƣớc, nhờ cơ chế hút trƣơng của hạt
làm hạt trƣơng lên. Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ, trong hạt bắt đầu tăng tính thuỷ
hoá của keo nguyên sinh chất, giảm tính ƣa mỡ và độ nhớt của keo, dẫn đến
những biến đổi sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đổi chất trong hạt liên
quan đến sự nảy mầm. Đặc trƣng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính enzym thuỷ
phân, polisaccarit, protein và các chất phức tạp khác thành các chất đơn giản dẫn
đến thay đổi hoạt động thẩm thấu. Các sản phẩm thuỷ phân này dùng làm
nguyên liệu cho quá trình hô hấp tăng lên mạnh mẽ của phôi hạt, vừa làm tăng
ASTT trong hạt, giúp cho quá trình hút nƣớc vào hạt nhanh chóng.


7

1.2.2. Giai đoạn cây con
Sau khi gieo 5-7 ngày, thân rễ vƣơn dài và đƣa hai lá mầm lên khỏi mặt
đất, hai lá mầm mở ra, thân mầm phát triển thành thân chính. Lúc này, cây
con sống chủ yếu nhờ vào thức ăn dự trữ trong lá mầm. Khi bộ rễ phát triển
hút chất dinh dƣỡng từ đất nuôi cây là lúc lá mầm chuyển thành màu vàng,
rụng xuống đất (sau khi gieo 15-20 ngày) [15].
Nhu cầu về nƣớc của giai đoạn này khá lớn. Để đảm bảo hạt nảy mầm,

hàm lƣợng nƣớc trong hạt phải đạt 50% so với khối lƣợng hạt [4], [15]. Thiếu
nƣớc ở thời kỳ cây con sẽ làm giảm quá trình tăng trƣởng, nhƣng ít ảnh hƣởng
nghiêm trọng đến năng suất nếu hạn không cản trở sự khép tán hoàn toàn [10].
1.2.3. Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng
Thân lá phát triển nhanh từ khi mọc đến khi ra hoa. Có hai loại đặc tính
chính ở cây đậu tƣơng là sinh trƣởng của thân và ra hoa chính. Đối với đặc
tính sinh trƣởng vô hạn, cây tiếp tục sinh trƣởng sinh dƣỡng hầu nhƣ trong
suốt vụ trồng. Đặc tính sinh trƣởng hữu hạn, cây ngừng sinh trƣởng khi ra
hoa. Ở giai đoạn này, bộ rễ phát triển nhanh cả về chiều rộng và chiều
sâu. Nốt sần hình thành nhiều và bắt đầu hoạt động cố định đạm, cung cấp
dinh dƣỡng cho cây [4 , [28].
Sự sinh trƣởng, phát triển của cây là kết quả của các quá trình trao đổi
chất nhƣ quang hợp, hô hấp, vận chuyển các chất đồng hoá… Tất cả các quá
trình này đều bị kìm hãm bởi sự thiếu nƣớc. Vì vậy, ở giai đoạn này nhu cầu
về nƣớc cho cây sinh trƣởng, phát triển tăng hơn so với giai đoạn cây con.
1.2.4. Giai đoạn sinh trưởng sinh thực
* Giai đoạn ra hoa
Thời gian ra hoa đầu tiên đến ra hoa cuối cùng kéo dài từ 3 đến 4 tuần, tùy
thuộc vào giống chín sớm hay chín muộn. Ở những giống sinh trƣởng hữu hạn, có


8

chùm hoa ở cả ngọn và nách lá, quả hình thành phân bố đều dọc theo
thân, phía ngọn có phần nhiều hơn. Cây đậu tƣơng ra nhiều hoa nhƣng tỷ
lệ hoa không đậu quả chiếm khoảng 20 - 80% [6], [10], [15]. Hoa rụng do
nhiều nguyên nhân nhƣng chủ yếu là sự ảnh hƣởng bất lợi từ môi trƣờng,
đặc biệt là hạn hán. Các nghiên cứu về nhu cầu nƣớc của cây đậu tƣơng
cho thấy cây cần rất nhiều nƣớc ở giai đoạn này. Thiếu nƣớc dẫn đến
giảm số chùm hoa, rụng hoa và giảm số quả [37].

* Giai đoạn hình thành quả và hạt
Quả đầu tiên hình thành trong phạm vi 7 - 8 ngày sau khi hoa đầu
tiên nở. Trong điều kiện bình thƣờng, quả sẽ phát triển đầy đủ sau khoảng
20 ngày, các chất dinh dƣỡng trong cây đƣợc vận chuyển vào hạt, quả
mẩy dần [15]. Nhu cầu về nƣớc ở giai đoạn này của cây tăng cao, thiếu
nƣớc làm rụng quả, giảm kích thƣớc hạt, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến
năng suất và phẩm chất của hạt [37].
* Giai đoạn quả chín
Hạt phình to, kín khoang hạt, quả mẩy đều, cây ngừng sinh trƣởng, độ
ẩm trong hạt giảm dần cho đến khi chỉ còn 13 - 15%. Lá đậu chuyển sang
mầu vàng và rụng xuống đất [13]. Nhu cầu về nƣớc của cây đậu tƣơng ở giai
đoạn này giảm hơn so với các giai đoạn trƣớc. Khi quả chín, để duy trì chất
dinh dƣỡng, tránh bị nhiễm bệnh và nẩy mầm sớm cần phải điều chỉnh độ ẩm
của đất giảm dần.
Tính mẫn cảm của cây đậu tƣơng đối với sự thiếu hụt nƣớc ở các
giai đoạn sinh trƣởng là khác nhau. Giá trị của tính mẫn cảm ở mỗi giai
đoạn đƣợc cho là phần năng suất bị giảm do thiếu nƣớc nghiêm trọng ở
giai đoạn đó. Kết quả cho thấy giá trị mẫn cảm của đậu tƣơng ở giai đoạn
sinh dƣỡng là 0,12; ở thời kì ra hoa là 0,24; cuối ra hoa hình thành quả là


9

0,35 và giai đoạn quả chín là 0,13 [4]. Sử dụng giá trị này để có kế hoạch
tƣới tiêu hợp lý cho từng giai đoạn sinh trƣởng của cây đậu tƣơng. Theo
đó cần tƣới nƣớc khi sự suy kiệt nƣớc trong đất đạt tới 80% ở giai đoạn sinh
trƣởng sinh dƣỡng, 45% ở giai đoạn ra hoa, 30% ở giai đoạn cuối ra hoa, làm
quả và 80% ở giai đoạn quả chín. Nhƣ vậy, không nên để cây thiếu nƣớc ở
giai đoạn cây ra hoa, tạo quả mà tƣới nƣớc là rất cần thiết ở giai đoạn này.
1.3. Ảnh hƣởng của áp suất thẩm thấu đến khả năng nảy mầm của hạt

ASTT là lực gây ra sự chuyển dịch của dung môi vào tế bào qua màng
sinh chất. Nó không phụ thuộc vào bản chất của chất tan, mà phụ thuộc vào
nồng độ phân tử chất tan, nhiệt độ, sự phân li của dung dịch. ASTT bao gồm
ASTT bên trong (ASTT thấu nội bào) và bên ngoài (ASTT môi trƣờng).
ASTT bên trong: Dịch tế bào có chứa hàm lƣợng lớn các chất hữu cơ là
sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Các chất này trong dịch tế bào đã tạo
nên ASTT cao, giúp cho quá trình xâm nhập của nƣớc vào trong tế bào bằng
con đƣờng thẩm thấu.
ASTT bên ngoài chủ yếu do tính mặn của môi trƣờng gây nên. Đất bị
nhiễm mặn chứa hàm lƣợng muối cao, đặc biệt là NaCl. Điều đó đã hạn chế
khả năng hút nƣớc, dẫn đến khó khăn trong việc hút chất dinh dƣỡng [11].
Nếu cây sinh trƣởng trong môi trƣờng không có muối, thì nƣớc sẽ dễ dàng
thấm qua màng bán thấm để đi vào tế bào chất nhờ hiện tƣợng thẩm thấu. Đất
bị nhiễm mặn sẽ gây nên 2 tác hại đối với thực vật:
Tác hại thứ nhất, gây ra hiện tƣợng hạn sinh lí. Hàm lƣợng muối cao
trong đất làm cho ASTT môi trƣờng lớn. Nếu ASTT nội bào không thắng nổi
áp suất của môi trƣờng, cây sẽ bị khô héo do nƣớc từ trong tế bào đi ra ngoài.
Thiếu nƣớc nhẹ thì làm giảm tốc độ sinh trƣởng, thiếu nƣớc trầm trọng sẽ dẫn
đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng quá trình già hoá tế bào. Khi bị


10

khô kiệt nƣớc, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn
thƣơng và chết.
Tác hại thứ hai, liên quan đến tính gây độc của các ion đối với thực vật.
Đất bị nhiễm mặn chứa hàm lƣợng cao các ion, đặc biệt Na+ và Cl-, ngoài ra
còn có các ion khác: SO42-, HCO3-, Li+,... Hàm lƣợng cao các ion này đều gây
hại cho sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật.
Nƣớc là điều kiện quan trọng cho sự nảy mầm. Nƣớc tham gia vào quá

trình trao đổi chất, các phản ứng sinh hoá trong tế bào, là nguồn nguyên liệu
của nhiều phản ứng. Nƣớc đảm bảo cho cây tồn tại và phát triển.
Hạt khô có hàm lƣợng nƣớc từ 10 - 14% thì không nảy mầm. Nhờ lực
hút trƣơng nƣớc của keo nguyên sinh mà hạt hút đƣợc nƣớc và khi hàm lƣợng
nƣớc bằng 50 - 70% khối lƣợng hạt thì các hoạt động sống tăng lên mạnh mẽ
và phôi phát động sinh trƣởng hay nảy mầm.
Sự thiếu nƣớc ở thực vật chủ yếu do hạn hán và ASTT môi trƣờng gây nên.
Khi thiếu nƣớc thƣờng làm cho tế bào mất sức căng, đỉnh sinh trƣởng bị héo và
các quá trình sinh lý diễn ra không bình thƣờng. Hoạt động của enzym thuỷ phân
thƣờng diễn ra nhanh hơn là enzym tổng hợp dẫn đến tế bào mất chất dinh
dƣỡng. Đồng thời cũng gây ảnh hƣởng trầm trọng đến quá trình hô hấp. Khi
thiếu nƣớc cƣờng độ hô hấp tăng nhƣng hiệu quả năng lƣợng bị giảm sút. Thiếu
nƣớc gây ảnh hƣởng xấu đến sinh trƣởng và phát triển của cây, cuối cùng ảnh
hƣởng đến năng suất và phẩm chất của chúng.
Thực vật nói chung và đậu tƣơng nói riêng sống trong điều kiện thiếu
nƣớc có khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nƣớc bằng những biến đổi
hình thái hoặc những phản ứng hoá sinh phù hợp.
Biến đổi hình thái đƣợc chú ý nhiều là ở bộ rễ. Bên cạnh đó là sự giảm
diện tích lá của đậu tƣơng khi gặp hạn, nhằm giảm sự thoát hơi nƣớc của lá.


11

Các thay đổi hoá sinh thƣờng liên quan đến cơ chế chống mất nƣớc do
sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nƣớc.
Điều chỉnh ASTT nội bào thông qua tích luỹ các chất tan, các protein và axit
amin nhờ enzym thuỷ phân là cơ chế giúp tế bào duy trì lƣợng nƣớc tối thiểu.
Trong điều kiện thiếu nƣớc, các phản ứng hoá sinh diễn ra nhằm khử độc các
sản phẩm đƣợc tạo nên trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử
hoặc xúc tiến phục hồi các cấu trúc bị tổn thƣơng.

Về khả năng chịu mặn của thực vật, trƣớc hết phải nói đến cơ chế tích
luỹ và duy trì nồng độ cao các chất hoà tan trong tế bào nhằm đảm bảo cạnh
tranh nƣớc với môi trƣờng nhiễm muối và chống lại hiện tƣợng hạn sinh lí.
Hàm lƣợng NaCl cao trong đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống thƣờng
xuyên trên đất này phải có khả năng thu nhận và tích trữ Na+, Cl- cao hơn
nhiều thực vật vốn có khả năng chịu mặn.
Ngoài ra còn có những thay đổi về các phản ứng sinh lí nhƣ: hô hấp, quang
hợp, thoát hơi nƣớc của lá cho phù hợp với điều kiện thiếu nƣớc của cây.
Đã có một số công trình nghiên cứu sự ảnh hƣởng của ASTT trên các đối
tƣợng động vật (lƣỡng cƣ, bò sát… ). Trên thực vật, các nhà khoa học cũng đã
đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của ASTT đối với khả năng hút nƣớc, sinh trƣởng
của rễ, thân và lá.
Trong nuôi cấy mô, ảnh hƣởng của manitol đến tích lũy prolin và
glucose liên quan đến khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus
cà chua [7]. Đã có một số công trình nghiên cứu ảnh hƣởng của ASTT trên
đối tƣợng đậu tƣơng, nhƣng nghiên cứu mới chỉ dừng lại việc đánh giá sự
ảnh hƣởng của một ASTT nhất định (7 hoặc 9 atm). Hiện nay vẫn chƣa có
một công trình nghiên cứu nào đƣợc công bố việc đánh giá tổng thể ảnh
hƣởng của các mức ASTT khác nhau từ thấp đến cao.


12

1.4. Prolin và vai trò của prolin đối với khả năng chịu hạn của cây
1.4.1. Cấu tạo prolin
COOH
H2N

C

H2C

CH2

H

CH2

Công thức cấu tạo
Prolin hay

- pirolidin cacboxylic là một

Cấu trúc không gian
- iminoaxit ƣa nƣớc có công thức

phân tử C5H9NO2, có mạch bên là hidrocacbua khác với các axit amin khác ở chỗ,
nhóm amin bậc 1 ở Cα liên kết với cacbon của mạch bên tạo thành vòng pirolidin.
1.4.2. Vai trò của prolin
Prolin đƣợc tổng hợp từ L-glutamat bởi enzym chìa khoá

-pyrrolin-

cacboxilat-synthetaza (P5CS), enzym này đƣợc điều hoà bởi prolin thông qua
cơ chế ức chế ngƣợc. Ở thực vật chịu stress nƣớc, sự điều hoà ngƣợc này đã
biến mất và đây có thể là nguyên nhân làm tăng sự tích luỹ prolin dƣới các
điều kiện stress.
Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu. Chúng có khối lƣợng
phân tử nhỏ, các hợp chất này có chung tính chất không tích điện ở pH trung
tính (nhƣ các ion vô cơ) và có khả năng hòa tan tốt trong nƣớc, không độc khi

tập trung với nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc của các phân tử protein,
giúp thành tế bào chống lại ảnh hƣởng làm biến tính của sự tập trung muối
cao và các chất tan khác có hại cho tế bào [49]. Prolin tự do trong khi stress
có hiệu ứng sinh học đa năng, không chỉ trong chức năng điều chỉnh ASTT
mà còn có tác động bảo vệ hàng loạt enzym trong điều kiện biến tính (nhiệt


13

độ cao, nồng độ muối cao…) [3]. Bên cạnh đó prolin còn thể hiện khả năng
bảo vệ gián tiếp protein và màng khỏi tổn thƣơng. Prolin còn đƣợc xem nhƣ
một dạng dự trữ nitơ. Khi gặp stress, nó dễ đƣợc sử dụng ở giai đoạn khử nhƣ
thành phần của hệ thống giữ gìn pH của tế bào và điều chỉnh thế khử của tế
bào. Prolin còn là nguồn cung cấp năng lƣợng và đƣơng lƣợng khử [30].
Phân tử prolin có cấu trúc vòng (pirolidin). Cấu trúc này tạo cho prolin
một hình dáng vững chắc hơn so với các axit amin khác. Nhƣ vậy, vai trò của
prolin trong chống chịu stress nƣớc ở thực vật thể hiện: prolin tham gia điều
chỉnh ASTT của nội bào, tham gia vào cấu trúc bảo vệ màng và protein, dự
trữ nitơ và năng lƣợng.
Sự tích lũy prolin là một phản ứng chuyển hóa thông thƣờng ở thực vật
trong điều kiện thiếu hụt nƣớc và stress muối. Đây là chủ đề đƣợc các nhà khoa
học nghiên cứu hơn 20 năm qua (Stewart and Larher, Thompson, Stewart,
Hanson and Hizt, Rhodes, Delauney and Verma, Samaras, Taylor, Rhodes) [50].
Đã có nhiều công trình trên thế giới nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng
thực vật và cây trồng khác nhau, nhằm tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyển
hoá prolin,… liên quan đến vai trò của prolin đối với tính chịu hạn của thực
vật. Trong dòng tế bào thuốc lá đƣợc nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428
mM NaCl, prolin chiếm trên 80% axit amin tự do (Rhodes and Handa, 1989)
[50]. Ngƣời ta thừa nhận rằng, có sự phân bố đồng đều prolin trong toàn bộ
thể tích nƣớc của nội bào, kết quả xác định axit amin tại thời điểm này vƣợt

quá 129 mM. Tuy nhiên, nếu chỉ hạn chế trong nội bào thì sự tích lũy prolin
có thể vƣợt quá nồng độ 200 mM trong các tế bào này vì thế nó góp phần căn
bản vào việc điều chỉnh thẩm thấu nội bào (Binzel et al, 1987) [33]. Tƣơng tự
nhƣ vậy, sự tích lũy prolin nội bào ở các tế bào Distichlis spicata trong điều
kiện stress muối (xử lí ở nồng độ 200 mM NaCl) ƣớc tính trên 230 mM
(Ketchum et al, 1991) [43]. Kishor P.B.K và cộng sự (1995) [44] nghiên cứu


14

cây thuốc lá đƣợc chuyển gen (gen liên quan đến sinh tổng hợp prolin – P5CS)
trong điều kiện hạn nƣớc, hạn muối. Kết quả cho thấy hàm lƣợng prolin tăng
khoảng từ 10 - 18 lần so với đối chứng. Thực vật đƣợc chuyển gen (gen
P5CS) cũng đƣợc nghiên cứu trên đối tƣợng là cây đậu tƣơng (J.A.de Ronde;
R.N. Laurie; T.Caetano; M.M. Greyling; I.Kerepesi 2004) [41]. Kết quả so
sánh tính chịu hạn giữa dòng đậu tƣơng chuyển gen P5CS và dòng đối chứng
(không chuyển gen) cho thấy dòng chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn.
Ngoài ra, còn có nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng: dƣa hấu, cà chua, lúa mỳ,
củ cải đƣờng, khoai tây,... [34], [36], [38], [39], [40], ... cũng cho kết quả
tƣơng tự.
Theo Delauney AJ, Verma DPS (1993) [35] con đƣờng tổng hợp prolin
trong thực vật nhƣ sau:

P5CS:

-pyrrolin-5-cacboxilat synthetaza

P5CR:

-pyrrolin-5-cacboxilat reductaza

Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu vai trò của prolin đối với
khả năng chịu hạn của nhiều loại cây trồng. Theo Nguyễn Hữu Cƣờng
(2003) [3]: bằng việc xử lí lạnh, mặn, hạn trên các giống lúa đã cho thấy
có mối tƣơng quan thuận giữa tính chống chịu của cây với hàm lƣợng


15

prolin gia tăng của các giống lúa nghiên cứu. Tác giả Đinh Thị Phòng
(2001) [27] cho biết: khi xử lí hạn, hàm lƣợng prolin đều tăng lên, mức độ
tăng lên khác nhau ở mỗi giống. Những giống chịu hạn tốt hàm lƣợng
prolin tăng 9 lần sau khi xử lí hạn 8 ngày.
Nhƣ vậy, prolin có ảnh hƣởng lớn tới tính chịu hạn ở thực vật và
cây trồng nói riêng. Sự tổng hợp axit amin prolin ở thực vật hay cây trồng
diễn ra khi chúng sống trong điều kiện thiếu nƣớc, stress muối. Những
nghiên cứu về prolin trên đối tƣợng lúa, đậu xanh, cà chua, cây thuốc lá…
cho thấy sự tƣơng quan thuận giữa gia tăng hàm lƣợng prolin với tính
chống chịu sự thiếu nƣớc, stress muối của chúng [3], [11], [34], [39]... Do
đó, có thể xem axit amin này nhƣ một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn
của thực vật hay sự tích lũy prolin là biểu hiện của phản ứng thích nghi của
thực vật với điều kiện cung cấp nƣớc khó khăn.
1.5. Một số enzym trong hạt nảy mầm
Trong hạt nảy mầm xuất hiện một số enzym để thuỷ phân các chất có
trong hạt, xúc tác cho sự nảy mầm của hạt. Một số enzym có vai trò quan trọng
đối với sự nảy mầm của hạt đậu tƣơng là enzym proteaza, lipaza, -amylaza...
Enzym có bản chất là protein. Đến nay đã biết và phân loại đƣợc hơn
3500 enzym. Nhiều enzym đƣợc sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác
nhau nhƣ: nghiên cứu cấu trúc phân tử, định lƣợng các chất trong công
nghiệp, nông nghiệp, y học...

Ở đậu tƣơng đang nảy mầm, diễn ra quá trình phân giải các chất hữu cơ
cung cấp năng lƣợng cho cây sinh trƣởng và phát triển. Enzym hoạt động chủ
yếu trong giai đoạn này là enzym thuỷ phân thuộc nhóm hiđrolaza (các
enzym xúc tác cho phản ứng thuỷ phân) nhƣ: proteaza, lipaza, -amilaza,...


16

Proteaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptit, tạo thành peptit
phân tử thấp và các axit amin. Proteaza đóng vai trò quan trọng trong cơ
thể sống, nhất là thời kỳ nảy mầm của hạt. Thời kỳ này protein bắt đầu
đƣợc phân giải thành axit amin dƣới tác dụng của enzym proteaza. Proteaza
không chỉ tham gia vào phân giải protein dự trữ trong hạt mà chúng còn
tham gia vào quá trình vi xử lý phân tử protein, phân giải các protein lạ
hoặc bị biến tính khi gặp điều kiện cực đoan (lạnh, mặn, hạn, tác động cơ
học...) [17]. Trần Thị Phƣơng Liên (1999) khi nghiên cứu so sánh phổ
điện di hoạt tính proteaza của các giống đậu tƣơng chịu nóng, chịu hạn
khác nhau đã nhận xét rằng: proteaza trong quá trình nảy mầm của hạt ở
tất cả các giống đậu tƣơng nghiên cứu rất đa dạng, có hoạt tính cao, có
khả năng phân giải hoàn toàn chất dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp
protein cho cơ thể mới [17]. Có nhiều loại proteaza trong hạt đậu tƣơng,
chúng có kích thƣớc phân tử, nhiệt độ tối ƣu và pH tối ƣu là 5 (gần với pH của tế
bào). Các axit amin là nguồn nguyên liệu cho quá trình tổng hợp mới các chất
đồng thời góp phần tăng ASTT của tế bào thực vật. Proteaza còn tham gia trong
nhiều lĩnh vực quan trọng của đời sống nhƣ công nghiệp chất tẩy rửa, công
nghiệp hoá chất, y học và nhiều ngành công nghiệp khác.
Lipaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân triaxilglixerol tạo thành các axit
béo tự do và glixerol. Lipaza xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lƣợt từng este
trong phân tử chứ không cắt đứt cả 3 liên kết este cùng lúc. Axit béo và
glixerol là nguyên liệu cho hô hấp giải phóng năng lƣợng và kiến tạo các

thành phần của tế bào. Chuẩn độ lƣợng axit béo sinh ra bằng kiềm từ đó xác
định hoạt độ lipaza.
-amilaza: phân giải liên kết 1,4-glucozit ở giữa chuỗi mạch polisacarit
tạo các đextrin phân tử thấp. Dƣới tác dụng của enzym này dung dịch tinh bột
nhanh chóng mất khả năng tạo màu với dung dịch iot và bị giảm nhanh độ
nhớt. Do đó, để xác định hoạt độ của enzym -amilaza ngƣời ta thƣờng dựa
vào sự biến đổi màu của iot khi cho tác dụng với enzym này.


17

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên 2 giống đậu tƣơng AK02 và giống DT96.
- AK02: giống đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp chọn lọc cá thể từ giống
đậu tƣơng vàng Mƣờng Khƣơng và đƣợc công nhận giống chính thức năm
1987 [9]. Giống đƣợc trồng 3 vụ trong năm. Vùng đất gieo trồng thích hợp:
đồng bằng, trung du và miền núi phía Bắc. Một số đặc tính chủ yếu nhƣ
chiều cao cây từ 30-40 cm, ít phân cành, thuộc nhóm ngắn ngày. Thời gian
sinh trƣởng (TGST) từ 75-85 ngày. Hạt có dạng bầu dục hơi tròn, màu hạt
vàng nhạt. Khối lƣợng 1000 hạt đạt khoảng 100-120g. Năng suất trung
bình đạt khoảng 10-12 tạ/ha. Khả năng chống chịu sâu bệnh và rét trung
bình [9].
- DT96 do Viện Di truyền nông nghiệp (DTNN) cung cấp. Sau 7 năm
khảo nghiệm liên tục (1998-2004) tại nhiều vùng sinh thái khác nhau, Viện
DTNN đã sản xuất thành công giống đậu tƣơng chịu hạn DT96. Giống mới
đƣợc Bộ NN&PTNT công nhận chính thức là giống Quốc gia vào tháng 72004. Giống đƣợc tạo bằng phƣơng pháp lai hữu tính giữa 2 giống phổ biến
trong sản xuất là DT90 và DT84. DT96 kết hợp đƣợc nhiều đặc tính tốt của
2 giống, chịu nóng tốt nhƣ DT84 và chịu lạnh nhƣ DT90. Ngoài ra còn một

số đặc điểm ƣu việt hơn DT84 và DT90 nhƣ chất lƣợng hạt thƣơng phẩm,
tính kháng sâu bệnh [29]. DT96 có TGST ngắn (90 - 98 ngày), phù hợp
trồng thuần. Cây cao 45 - 58cm, thân có 12 - 15 đốt, sinh trƣởng hữu hạn,
phân cành vừa phải, lá hình tim nhọn, màu xanh sáng, lông nâu. Hạt màu
vàng sáng, rốn hạt màu trắng, hạt to, khối lƣợng 1000 hạt đạt 190 - 220g, tỉ
lệ protein 42,86%, lypit 18,34% [5].


18

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu (P) đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Schardakov
& Grodzinsk (1981), tính giá trị bằng phƣơng trình Van– Hoff:
P = i×C×R×T
Trong đó:

P: Áp suất thẩm thấu (atm)
C: Nồng độ mol/l của dung dịch (M)
R: Hằng số khí (R=0,0821)
T: Nhiệt độ tuyệt đối (K)
i: Hệ số điều chỉnh sự phân ly
(Đối với dung dịch saccarôzơ i= 1)

2.2.2. Lập đường chuẩn prolin
* Xây dựng đường chuẩn prolin
Cân 10 mg prolin tinh khiết hoà tan trong 100ml nƣớc, ta đƣợc dung
dịch gốc (gọi là dung dịch B) nồng độ 0,1 mg/ml (hoặc 100 g/ml). Lấy 5
ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 đến 5, cho các chất tham gia phản ứng nhƣ
sau. Pha 10ml dung dịch A có nồng độ lần lƣợt là 20, 40, 60, 80, 100

( g/ml) nhƣ sau:

1

10 ml dung
dịch A ( g/ml)
20

V nƣớc
(ml)
8

VB
(ml)
2

0,45

2

40

6

4

0,81

3

60

4

6

1,17

4

80

2

8

1,52

5

100

0

10

1,88

STT

OD


19

Sau đó đo OD các dãy dung dịch prolin chuẩn ở bƣớc sóng 520nm trên
máy UV- Visible Spectrophotometer, UV- 2450 do h·ng SHIMADZU- Mü
s¶n xuÊt. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả đƣợc xử lý theo phƣơng pháp
thống kê, sau đó lập đƣờng chuẩn bằng phần mềm Excel, thu đƣợc đƣờng
chuẩn sau:
Mật độ
OD520
2
y = 0.0179x + 0.095
2

R = 0,99

1.5
1
0.5
0
0

20

40

60

Đường chuẩn prolin

80
100
120
Nồng độ prolin (ug/ml)

Sau khi xây dựng đƣờng chuẩn để tính prolin là:
Y= 0,0179X + 0,095

(R2=0,99)

Trong đó: Y: Hàm lƣợng prolin ( g/ml)
X: Giá trị mật độ quang học đo đƣợc ở bƣớc sóng 520nm
R2: Hệ số tƣơng quan
2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học
và Chuyển giao công nghệ - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
Để xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, hạt đƣợc gieo trong dung dịch
đƣờng theo phƣơng pháp xác định khả năng chịu hạn của Volcova:


20

Chọn hạt giống đều, khoẻ, có phôi sáng, không nấm mốc. Khử trùng
khay, bình, tay,... bằng cồn 960. Giấy lọc đƣợc sấy 130oC trong vòng 1 giờ,
hạt đƣợc khử trùng bằng dung dịch KMnO4 1% trong 5 phút.
Gieo trên khay có giấy thấm, bổ sung kháng sinh nistatin 1/2 viên trong
1/2 lít thành 2 phần vào các mẫu thí nghiệm:
+ Phần 1: lô đối chứng (ĐC) cho hạt nảy mầm trong nƣớc cất.

+ Phần 2: lô thí nghiệm (TN), cho hạt nảy mầm trong dung dịch đƣờng
saccarôzơ với ASTT từ 1 atm đến 12 atm tƣơng ứng từ M1 đến M12)
Hạt nảy mầm trong dung dịch đƣờng. Hàng ngày bổ sung lƣợng nƣớc
hoặc dung dịch đƣờng ở các lô nhƣ nhau.
2.2.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
Các chỉ tiêu sinh lý: đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Volcova
(1984) [31]
2.2.4.1. Xác định tỉ lệ nảy mầm
Đếm số hạt nảy mầm trong các mẫu từ khi hạt đầu tiên nảy mầm cho đến
khi không còn có thêm hạt nảy mầm mới. Hạt đƣợc coi là đã nảy mầm khi có
chiều dài rễ mầm đạt từ 3 mm trở lên. TLNM đƣợc tính theo công thức:
T=
Trong đó:

a
×100
b

T: tỉ lệ nảy mầm
a: số hạt nảy mầm
b: tổng số hạt đem gieo

2.2.4.2. Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của mầm
- Chiều dài thân, rễ mầm (mm): sử dụng thƣớc chia đơn vị đến mm để
đo chiều dài của thân mầm, rễ mầm vào các ngày 3, 5, 7 sau khi hạt nảy mầm.


21

- Khối lƣợng tƣơi của mầm (g/mầm): mầm đƣợc rửa sạch bằng nƣớc

cất, sau đó cân khối lƣợng của mầm vào ngày thứ 3 và ngày thứ 7 sau khi hạt
nảy mầm.
- Khối lƣợng khô của mầm (g/mầm): mầm đƣợc rửa sạch bằng nƣớc
cất, đem sấy khô ở 1050C đến khi khối lƣợng không đổi (3h). Cân khối lƣợng
khô, thời gian cân vào ngày thứ 3 và ngày thứ 7 sau khi gieo hạt.
2.2.4.3. Phân tích hàm lượng prolin
Hàm lƣợng prolin của mầm đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Bates
và cộng sự (1973) [31], đã đƣợc Đinh Thị Phòng cải tiến (2001) [27]
Cân 0,5 g mầm/1 mẫu, nghiền kĩ, thêm 10 ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%,
li tâm 4000 vòng trong 30 phút, lọc lấy dịch trong. Lấy 2 ml dịch chiết cho vào
bình (hoặc ống nghiệm) thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin
(dung dịch này gồm 30 ml dung dịch axit axetic + 1,25 g ninhydrin), đậy kín. Ủ
nƣớc nóng 1000C trong 1h. Sau đó ủ đá 5 phút. Tiếp theo, bổ sung vào bình
phản ứng 4 ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch mầu hồng ở bên trên, đo mật độ
quang học ở bƣớc sóng 520 nm trên máy quang phổ UV- Visible
Spectrophotometer, UV- 2450 do h·ng SHIMADZU- Mü s¶n xuÊt.
Tất cả các α - axit amin của protein đều phản ứng màu với ninhydrin tạo
hợp chất màu xanh tím. Riêng imino axit nhƣ prolin tạo thành màu vàng với cơ
chế phản ứng phức tạp. Tính chất này có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng λ= 520 nm.
Hàm lƣợng axit amin prolin đƣợc tính theo công thức sau: (công thức
suy ra từ việc lập đƣờng chuẩn prolin)
Y= 0,0179X + 0,095

(R2= 0,99)

Trong đó: Y: hàm lƣợng prolin ( g/ml)
X: giá trị mật độ quang học đo đƣợc ở bƣớc sóng 520nm
R2: hệ số tƣơng quan
Sau đó hàm lƣợng prolin đƣợc đổi ra đơn vị g/g theo công thức:

22

A
Trong đó:

Y V
P

A: hàm lƣợng prolin ( g/g)
P: khối lƣợng mẫu (g)
V: thể tích dịch prolin chiết đƣợc.

2.2.4.4. Xác định các chỉ tiêu hoá sinh của hạt nảy mầm
* Hoạt độ của enzym proteaza
- Xác định hoạt độ enzym proteaza theo Phạm Thị Trân Châu [2].
Cách tiến hành: Lấy hai bình nón (V= 100ml), cho vào mỗi bình 2g cơ
chất đã nghiền nát và 10ml KH2PO4 0,1N, lắc nhẹ để tạo môi trƣờng pH thích
hợp với hoạt động của proteinaz có trong cơ. Thêm vào bình 1 (đối chứng)
10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzym. Cho vào mỗi
bình 2ml dung dịch protein 5%. Đặt 2 bình trong tủ ấm 370c, thời gian 1 giờ.
Sau đó thêm vào bình 2: 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động
của enzym kết thúc quá trình thủy phân protein . Dùng ống đong đo dung dịch
mẫu (V). Lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích dịch lọc, chuyển
sang bình tƣơng ứng với bình thí nghiệm (2) và bình kiểm tra (1). Thêm vào
mỗi bình chứa dịch lọc 10ml foocmaldehit và 5 giọt timolphtalein để làm chất
chỉ thị màu. Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi xuất hiện màu
xanh mực cửu long
Hàm lƣợng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu đƣợc tính theo công thức:
X=

Trong đó:

(V -V ) 2,82 V
2 1
V g
3

f

X: hàm lƣợng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu
V: số ml dung dịch mẫu
V1: số ml dung dịch NaOH 0,2N chuẩn độ bình đối chứng
V2: số ml dung dịch NaOH 0,2N chuẩn độ bình thí nghiệm


23

V3: số ml dịch lọc đem chuẩn độ
g: số gam mẫu phân tích
f: hệ số điều chỉnh NaOH 0,2N
* Hoạt độ của enzym lipaza
Xác định hoạt độ của enzym lipaza theo Nguyễn Văn Mùi [25]
- Cách tiến hành
+ Cân 5 ghạt nghiền nhỏ thành dạng đồng thể, chuyển vào bình nón
100ml, cho thêm 10ml nƣớc cất, lắc đều.
+ Cho thêm 10ml dầu lạc làm cơ chất và 5 ml dung dịch đệm axetat
pH= 4,7 với vài giọt toluen. Trộn đều hỗn hợp cho vào tủ ấm 300c trong 20
đến 24 giờ
+ Bình kiểm tra phải đun sôi dịch enzym 3 đến 5 phút để làm mất
hoạt động của enzym trƣớc khi cho tiếp xúc với cơ chất

+ Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96% và 15
đến 25ml ete. Lắc đều, để lắng
+ Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N với 0,5ml chỉ thị màu
phenolphtalein
- Tính kết quả: Hoạt độ của lipaza đƣợc biểu thị bằng số mililit (ml) NaOH
0,1N dùng để chuẩn độ axit béo từ sự phân hủy dầu thực vật trong 10g hạt
theo công thức:
X=

(a b) f 10

Trong đó: X: là hoạt độ enzym lipaza
a: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm
b: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình đối chứng
f: hệ số chỉnh lí NaOH 0,1N
w: khối lƣợng hạt


24

* Hoạt độ của enzym - amilaza
Xác định hoạt độ enzym -amilaza theo Nguyễn Văn Mùi [25].
- Cách tiến hành
+ Cho vào 2 bình nón 50ml, mỗi bình 10ml dung dịch tinh bột 1% và
đặt vào máy ủ nhiệt ở 300c, giữ 10 phút.
+ Thêm vào bình 2 (bình thí nghiệm) 5ml dịch chiết enzym. Khuấy đều
và giữ trong 10 phút.
+ Lấy từ mỗi bình 0,5ml hỗn hợp cho vào 2 bình khác có chứa 50ml dung
dịch iot. Lắc đều. Bình đối chứng có màu xanh, bình thí nghiệm có màu tím.
+ Đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 656nm. Mật độ quang của bình đối chứng

(OD1) là lƣợng tinh bột ban đầu. Mật độ quang của bình thí nghiệm (OD2) là
lƣợng tinh bột còn lại khi -amilaza thủy phân. Sự khác nhau giữa mật độ quang
của bình đối chứng và bình thí nghiệm là lƣợng tinh bột bị enzym thủy phân.
- Tính kết quả
Lƣợng tinh bột bị thuỷ phân tính theo công thức:

(OD OD )
1
2
c=
0,1
OD
1
Trong đó:

c: lƣợng tinh bột bị thuỷ phân
OD1 : mật độ quang ở dung dịch đối chứng
OD2 : mật độ quang ở dung dịch thí nghiệm

Hoạt độ của enzym -amilaza tính theo công thức:
X=
Trong đó:

X: là hoạt độ

(6,889 c 0,029388) 100

-amilaza

c: lƣợng tinh bột bị thuỷ phân (g)

w: lƣợng chế phẩm enzym phân tích (mg)