định lượng coliforms và e coli bằng phương pháp MPN

Trường Đại học Công nghiệp
thực phẩm TP.HCM

2010

THỰC HÀNH PHÂN TÍCH
VI SINH THỰC PHẨM

ThS. Lê Thùy Linh
Lưu hành nội bộ

0


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

NỘI DUNG
Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli

Trang
2

1.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.2. Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN

2
3

1.3. Cách tiến hành thí nghiệm

4

1.4. Cách tính kết quả

10

Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus

10

2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
2.2. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
2.3. Cách tiến hành và cách tính kết quả
Bài 3. Định tính Salmonella

10
10
11
14

3.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
3.2. Qui trình định tính Salmonella trong thực phẩm
Bài 4. Định lượng Bacillus cereus

14
14
20

4.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
4.2. Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc

20
20
24

5.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
5.2. Quy trình phân tích

24
26

Tài liệu tham khảo
1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ
phẩm, NXB Giáo dục, 2006
2.
3.
4.
5.

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 1


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli
1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.1.1 Định nghĩa

Hình 1: phát hiện Coliforms và E.
coli trong thực phẩm hay nước bằng
môi trường CHROMagar ECC

Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử,
hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và
sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi
sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước
hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện
diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:
E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa
đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I),
Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24h khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh
indole khi ủ khoảng 24h ở 440C trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết
quả thử nghiệm IMViC là ++-- (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -)
1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN)
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Quy trình thực hiện như sau:
Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp.
Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng
trưởng của vi sinh vật cần kiểm định
Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính

ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady
Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 2


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Chú ý:
Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch
được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích,
người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Lượng mẫu với các độ
pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi
1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích.
Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng
tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử dụng
1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng
độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy, trị số tra
bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10.
1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ
pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh
LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ
Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL,
ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ
Số ống (+)(sinh hơi )ở
mỗi độ pha loãng

Cấy vào ống canh EC, ủ
ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ
Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
Cấy lên thạch EMB, ủ ở 370C,
24 giờ

Coliforms

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Xem
trang
sau

Page | 3


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Tiếp
theo

Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có

ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP,
SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống canh EC (+) và
IMViC ++--, tra bảng MPN

E. coli
1.3 Cách tiến hành thí nghiệm
Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)
1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ
Bước 1: pha môi trường
Tên môi trường
SPW
(Saline
Water)

Thành phần

NaCl : 42.5g
Pepton Pepton: 5g

Tryptose: 20g
LSB
(Lauryl Sulphate Lactose: 5g
Broth)
Sodium chloride: 5g
KH2PO4: 2.75g
K2HPO4: 2.75g

Lauryl sulphate: 0.1g
BGBL

Peptone: 10g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Tổng thể tích Ghi chú
500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml
cất
SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 1)
1000 ml nước Phân phối 90ml LSB cho
cất
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
pH 6.8 ± 0.2
trước khi khử trùng. (buổi 1)

1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho
Page | 4


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

PCA
(Plate
Agar)

Casein enzymic

Count hydrolysate: 5g
Yeast extract: 2.5 g

1000 ml nước Phân phối 100ml PCA cho
cất
mỗi tổ (15ml/petri). (buổi
pH 7.0 ± 0.2

5)

Dextrose: 1g
Agar: 15g
Glucose: 10g
DRBC
(Dichloran Rose Peptone: 5g
Bengal
KH2PO4: 1g
Chloramphenicol MgSO4: 0.5g
Agar)

1000 ml nước Phân phối 100ml DRBC
cất
cho mỗi tổ (15ml/petri).
pH 5.6 ± 0.2. (buổi 5)
Lưu ý: trộn lẫn

Rose bengal (dung dịch các thành phần
5%, w/v): 0.5ml
trừ
Dichloran (0.2%(w/v) chloramphenicol,

trong ethanol): 1ml
đun nóng để hòa
Chloramphenicol: 0.1g tan hết agar, hấp
Agar: 15g
khử trùng. Để
nguội đến 500C,
bổ sung 1ml
dung dịch kháng
sinh 100X vào
100ml
môi
trường.

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
Bước 3: pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)
Bước 4: thực hiện như qui trình

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 26


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Cách tính kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn số đĩa có số đếm
trong khoảng 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men

nấm mốc được tính như sau:

Trong đó:

A (CFU/g hay CFU/ml) =

N
n1 x V x f1 + ⋯ + ni x V x i

A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm
men) trong 1g hay 1ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng.
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở
nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g.
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ ở
nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 102 CFU/g.

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 27