Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
HIV gồm có 2 týp sinh học đó là HIV-1 và HIV-2, trong đó HIV1 đang lan tràn và gây đại dịch phạm vi toàn cầu. HIV-1 có đặc tính
đa dạng di truyền cao được phân thành các nhóm (Groups), các phân
týp (Subtypes), các dạng dưới phân týp (Sub-subtypes) và các dạng tái
tổ hợp (Circuling recombinant forms - CRFs). HIV-1 gồm có 4 nhóm:
M, O, N và P, trong đó nhóm N và O chỉ thấy ở Tây Trung Phi. Nhóm
P mới phát hiện ở Cameroon là nhóm rất hiếm. Nhóm M có tính đa
dạng di truyền cao phổ biến nhất, đã và đang lây lan nhanh phạm vi
toàn cầu. Nhóm M được chia làm 10 phân týp gồm: A, B, C, D, E, F,
G, H, J và K nhưng chỉ có 7 phân týp hay gặp nhất từ A đến G. Ngoài
ra còn phát hiện khoảng 51 dạng tái tổ hợp và nhiều biến thể chưa xác
định được phân týp. Điều đặc biệt là các phân týp phân bố mang tính
trội cho từng vùng địa lý khác nhau trên bản đồ toàn cầu và mỗi phân
týp lại có tính trội theo đường lây truyền nhất định, kết quả thu được
từ vùng Sahara châu Phi cho rằng phân týp A, C, D và E của HIV-1
thích nghi lây truyền qua đường tình dục khác giới, còn phân týp B lại
ít hiệu quả truyền qua con đường này; ở Bắc Mỹ, Tây Âu, Đông Nam
Á phân týp B lại hiệu quả truyền qua tiêm chích ma tuý và giữa cá
nhân đồng tính; ở Thái Lan, phân týp B trội ở những đối tượng tiêm
chích ma túy, phân týp E trội ở những trường hợp lây nhiễm qua
đường tình. Vì vậy nghiên cứu về phân bố các phân týp, các dạng tái
tổ hợp của HIV-1 có giá trị giám sát dịch tễ học tầm khu vực và toàn
cầu liên quan đến chiến lược dự phòng, phát triển vaccine thích hợp
cho từng khu vực, làm cơ sở cho việc lựa chọn liệu pháp kháng virus,
triển vọng phát triển vaccine dự phòng và dữ liệu cho các nghiên cứu
sau này thiết lập bản đồ dịch tễ phân týp HIV-1 lưu hành tầm quốc gia
và trong khu vực.
Hiện nay có nhiều phương pháp xác định phân týp HIV, trong đó
multiplex PCR (mPCR) hay còn gọi là PCR đa mồi là kỹ thuật dùng

2

xác định nhiều phân týp HIV-1 trong cùng một tube phản ứng với
nhiều vòng phản ứng, mPCR là kỹ thuật có nhiều ưu điểm, phù hợp
với điều kiện của Việt Nam và Lào hiện nay. Vì vậy chúng tôi tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của
HIV-1 ở Hà Nội và Viêng Chăn (2007- 2011) ” với mục tiêu:
1. Tối ưu hóa qui trình multiplex PCR để xác định các phân týp chủ
yếu HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn.
2. Xác định các phân týp chủ yếu của HIV-1 trên các đối tượng ở khu
vực Hà Nội và Viêng Chăn bằng kỹ thuật multiplex PCR.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VỀ MẶT KHOA HỌC
Đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu về phân týp HIV-1 ở Lào.
Nghiên cứu đã đề xuất được qui trình thích hợp cho việc xác định
phân týp HIV-1 áp dụng ở Lào bằng multiplex PCR phù hợp trong
điều kiện hiện tại. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy phân týp dạng tái
tổ hợp CRF01-AE của HIV-1 là phân týp chủ yếu ở cả hai khu vực
(98,57 % ở khu vực Hà Nội và 85% ở khu vực Viêng Chăn). Khu vực
Viêng Chăn có tỷ lệ phân týp HIV phức tạp và đa dạng hơn, ngoài
dạng CRF01-AE còn có cả các phân týp A, B, C phát hiện được với tỷ
lệ thấp (0,7 % - 2,14%) ở các đối tuợng nghiện chích ma túy và gái
mại dâm.
CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 118 trang, đặt vấn đề 3 trang, tổng quan 26 trang, đối
tượng và phương pháp nghiên cứu 36 trang, kết quả nghiên cứu 31
trang, bàn luận 18 trang, kết luận 2 trang, 33 bảng, 03 biểu đồ, sơ đồ
06, 25 hình, 160 tài liệu tham khảo và 6 phụ lục.

3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Tình hình nhiễm HIV/AIDS
1.1.1. Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam
Theo Bộ y tế Việt Nam, trường hợp phát hiện đầu tiên vào năm
1990 ở Thành phố Hồ Chí Minh. Qua các số liệu giám sát cho thấy
dịch HIV/AIDS đã xuất hiện ở 100% tỉnh, thành phố từ năm 1998,
đến cuối năm 2011 đã có 98% số quận, huyện, thị xã và 77% số xã,
phường, thị trấn có người nhiễm HIV được báo cáo.
1.1.2. Tình hình nhiễm HIV ở Lào
Theo trung tâm phòng chống HIV/AIDS và Bệnh lây truyền qua
đường tình dục - Bộ y tế Lào, trường hợp nhiễm HIV đầu tiên ở Lào
phát hiện vào năm 1990. Tính đến đầu năm 2012, qua điều tra trong
phạm vi cả nước phát hiện 4.942 trường hợp nhiễm HIV, 3.650 trường
hợp bị AIDS và 1.290 trường hợp tử vong liên quan AIDS. Tỷ lệ
nhiễm trung bình là 0,2% ở người độ tuổi từ 15- 49 tuổi, ước tính số
nhiễm HIV mới trong năm khoảng 10.350 trường hợp, trong đó
Savannakhet 34% có tỷ lệ nhiễm HIV cao nhất so với tổng số cả nước,
tiếp theo là Viêng Chăn 33% và thứ 3 là tỉnh Champasak 9%.
HIV/AIDS có xu hướng gia tăng theo từng năm.
1.2. Các phân týp HIV
Hiện nay, HIV đươc chia thành 2 týp: HIV-1 và HIV-2, trong đó
HIV-1 được chia thành 4 nhóm: M, N, O, P trong đó nhóm M lại chia
thành 10 phân týp: A, B, C, D, E, F, G, H, J và K. Phổ biến nhất là các
phân týp từ A đến G; phân týp H, J, K hiếm gặp hơn. Ngoài ra còn có
khoảng 51 dạng tái tổ hợp đã được công nhận, và nhiều biến thể chưa
xác định phân týp.

Nghiên cứu về phân bố của các phân týp HIV, thực chất đồng nghĩa
với tìm hiểu sự biến đổi di truyền của HIV ở cấp độ khu vực trên toàn cầu
là cần thiết, không chỉ để tìm hiểu nguồn gốc và giám sát dịch tễ học của


4

HIV, mà còn giám sát sự xuất hiện của các biến thế mới, trong nội bộ các
phân týp và những thay đổi đặc tính sinh học của chúng để đảm bảo cho
chẩn đoán, liệu pháp kháng virus cũng như dự đoán sự phát triển vaccine
của HIV/AIDS trên toàn cầu.
1.3. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở một số khu vực
1.3.1. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Phi
1.3.2. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Âu
1.3.3. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Mỹ
1.3.4. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở Trung Đông
1.3.5. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở Liên Bang Nga
1.3.6. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Úc
1.3.7. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Á
1.3.8. Đặc điểm phân týp HIV-1 tại Việt Nam
1.3.9. Đặc điểm phân týp HIV-1 tại Lào
Hiện chưa có nghiên cứu về phân týp HIV tại Lào.
1.4. Một số kỹ thuật xác định phân týp HIV-1
1.4.1. Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể peptide đặc hiệu HIV-1
Ưu điểm: có thể nghiên cứu với số lượng mẫu lớn, kỹ thuật không
phức tạp. Nhược điểm: hay có phản ứng chéo nên độ tin cậy thấp.
1.4.2. Kỹ thuật Heteroduplex Mobility Assay (HMA):
Ưu điểm: có thể phát hiện được gen kháng thuốc, phát hiện được
hiện tượng đồng nhiễm các phân týp, có thể áp dụng với số mẫu lớn,
giá thành vừa phải. Nhược điểm: hay có phản ứng chéo và đòi hỏi kỹ

thuật viên chuyên sâu.
1.4.3. Kỹ thuật giải trình tự gen (Sequancing)
Được coi là phương pháp chuẩn mực nhất. Tuy nhiên phương
pháp này tiến hành phức tạp, mất nhiều thời gian, đòi hỏi thiết bị và
hoá chất đắt tiền và nhân viên được đào tạo bài bản, chuyên sâu.
1.6.4. Kỹ thuật multiplex PCR hay mPCR (PCR đa mồi)
Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, thời gian nhanh, áp


5

dụng với số lượng mẫu lớn, kết quả chính xác, giá thành thấp. Nhược
điểm là không phát hiện được các dạng đột biến hoặc tái tổ hợp mới.
Đây là phương pháp phù hợp cho việc xác định các phân týp của HIV
ở các quốc gia đang phát triển và là kỹ thuật được lựa chọn cho nghiên
cứu phân týp HIV-1 ở Lào, nơi chưa có điều kiện triển khai các kỹ
thuật giải trình tự gen.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng
Các mẫu máu có HIV (+) từ các đối tượng nghiên cứu được xét
nhiệm khẳng định HIV dương tính với chiến lược 3 theo khuyến cáo
của WHO từ hai khu vực Hà Nội (Việt Nam) và Viêng Chăn (Lào).
Các đối tượng nghiên cứu của mỗi khu vực gồm các nhóm nghiện
chích ma túy (NCMT), gái mại dâm (GMD) và đối tượng khác
(Khác).
Bảng 2.1: Các ký hiệu cho các đối tƣợng nghiên cứu theo khu vực
Nhóm đối tượng (NĐT)

Khu vực

Hà Nội

Khu vực
Viêng Chăn

Tổng
số

Nhóm A: A1 đến A50
Nghiện chích ma túy (NCMT)

50

50

100

Nhóm B: B1 đến B50
Gái mại dâm (GMG)

50

50

100

Nhóm C: C1 đến C40
Đối tượng khác (Khác)

40

40

80

140

140

280

Tổng số

Khi vào mã nghiên cứu ghép thêm ký hiệu khu vực để phân biệt
(A01 của khu vực Hà Nội ký hiệu là HNA01, A01 của khu vực Viêng
Chăn ký hiệu là VCA01…).
Cỡ mẫu nghiên cứu được áp dụng theo công thức (WHO, 1991),


6

n  Z12 / 2

p  (1  p)
d2

Trong đó: Z1- /2 = 1,96 với độ tin cậy α ≥ 95%
p: Tỉ lệ phân týp trội trong những trường hợp HIV (+), khoảng 90%.
d: Sai số tuyệt đối mong muốn (d = 0,05)
n: Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được.

Căn cứ công thức trên, thì cỡ mẫu tìm được là 140 cho mỗi khu
vực (tổng số 280 cho cả hai khu vực).
2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Các sinh phẩm hoá chất chính
2.2.2. Các máy và thiết bị chính
2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu
Tham khảo tác giả Fumihiro (2005), như sau:
2.2.3.1. Phản ứng PCR1: Dùng cặp mồi chung để khuếch đại đoạn
gen gp 41 đặc hiệu cho HIV-1, mồi có trình tự như sau:
 BECO5’(7938 - 7960): 5’GGCATCAAACAGCTCCAGGCAAG3’
 BECO3’(8766 - 8791): 5’AGCAAAGCCCTTTCTAAGCCCTGTCT3’
Sản phẩm PCR của vòng thứ nhất có kích thước 853bp, đây là
DNA đích cho các vòng phản ứng PCR2 tiếp theo.
2.2.3.2. Phản ứng PCR2.1: Vòng phản ứng này để xác định phân týp
B và D, A và E và G, C, F; Sử dụng các cặp mồi BE-ANCH là mồi
xuôi, 4 mồi B-SPEC, E-SPEC, FSPEC, C-SPEC là mồi ngược, có
trình tự như sau:
 BE-ANCH(7963-7985): 5’TCCTGGCTGTGGAAAGATACCTA 3’
 B-SPEC (8384 - 8403): 5’GTCCCCTCGGGGCTGGGAGG 3’
 E-SPEC (8585): 5’GTCTCAGTCCCTTGAGACTGCTG 3’
 C-SPEC(8615-8638): 5’AGACCCCAATACTGCACAAGACTT 3’
 F-SPEC(8720-8744): 5’AACAGCTCTACCAGCTCTTTGCAAA3’


7

Khi sản phẩm PCR2.1 có kích thước 441 bp có thể là phân týp B hoặc
D, để phân biệt giữa hai phân týp cần tiến hành phản ứng PCR 2.3, với sản
phẩm có kích thước 645 bp có thể là phân týp A hoặc E hoặc G, cần tiến
hành phản ứng PCR 2.2, để phân biệt giữa các phân týp này, nếu sản phẩm

có kích thước 697 bp sẽ được xác định là phân týp C và sản phẩn kích
thước 778 bp là phân týp F.
2.2.3.3. Phản ứng PCR 2.2: Để xác định phân týp A, E, G, sử dụng 3
cặp mồi có trình tự như sau:
 A5’(8094 - 8112): 5’GANAACATGACCTGGCTGC 3’.
 A3’(8693 - 8716): 5’TCTATAACCCTATCTGTCCAGCCA 3’
 E5’(8181-8207): 5’CAGGAAAGGAATGAAAAGGATTTGTTA3’
 E3’(8693 - 8713): 5’ATAACCCTATCTGTCCACCCC 3’
 G5’(8131- 8757): 5’ACAATTACACATACCACATATACAGCC3’
 G3’(8694 - 8716): 5’TCTATAACCCTATCTGTCCAGTT 3’
Sản phẩm PCR2.2 có kích thước 644 bp sẽ được xác định là phân
týp A, nếu kích thước 554 bp sẽ được xác định là phân týp E và kích
thước 607 bp sẽ được xác định là phân týp G.
2.2.3.4. Phản ứng PCR 2.3: Để phân biệt phân týp D và B, sử dụng
cặp mồi D5’- D3’ có trình tự như sau:
 D5’(8037 - 8058): 5’ACCACTAATGTGCCCTGGAACT 3’.
 D3’(8356 - 8386): 5’AGGAGGGTCTGAAATGACAGA 3’.
Sản phẩm PCR2.3 có kích thước 350 bp là phân týp D, không có
sản phẩm là phân týp B.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học cắt ngang và phân
tích labo để tối ưu hóa phản ứng mPCR và tìm hiểu phân týp HIV-1
trên các đối tượng nghiên cứu.
Sử dụng phiếu theo dõi để thu thập các thông tin về đối tượng
nghiên cứu, phân tích tìm các yếu tố liên quan.


8

Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê y học để tìm ý
nghĩa và mối liên quan thông qua phần mềm Excel 2007 và SPSS
13.0. Đối với các biến định tính sử dụng kiểm định χ2, các biến định lượng
sử dụng kiểm định T-student; các giá trị p < 0,05 được xem như là có ý
nghĩa thống kê.
Các bƣớc tiến hành xác định phân týp HIV-1

2.3.2. Tách chiết acid nucleic (RNA hoặc DNA)
Do RNA không bền, không thể lưu giữ lâu và thực hiện với nhiều
mẫu đồng thời nên nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách DNA
từ khối bạch cầu (Buffy coat). Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA
bằng kit QIAGEN.


9

2.3.3. Các bước tối ưu chu trình nhiệt và các thành phần của phản
ứng mPCR
2.3.3.1. Tối ưu hoá nhiệt độ gắn mồi thích hợp
Chuẩn bị 8 ống phản ứng giống nhau về thành phần, ứng với 8 mốc
nhiệt độ trên máy PCR gradient nhiệt, chạy đồng thời cùng một điều
kiện chỉ khác nhau về nhiệt độ, chọn nhiệt độ cho phản ứng với kết
quả rõ nhất, không có băng phụ; kết quả lặp lại tối thiểu 2 lần để kiểm
tra.
2.3.3.2. Tối ưu hóa thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi
Chọn ngẫu nhiên 3 mẫu cùng 1 chứng âm để chuẩn bị 16 ống phản
ứng giống hệt nhau về thành phần ứng với 4 mốc thời gian 30 giây, 45
giây, 60 giây, 90 giây, mỗi mẫu đặt 4 ống phản ứng theo 4 mốc thời
gian ở trên cùng 1 mẫu chứng âm, sau đó tiến hành chạy phản ứng
mPCR với nhiệt độ gắn mồi tối ưu đã tìm được ở trên và lần lượt đặt

mốc thời gian gắn mồi: 30 giây,45 giây, 60 giây, 90 giây.
2.3.3.3. Tối ưu hóa nồng độ MgCl2
Chuẩn bị 6 ống phản ứng (tương ứng với 6 nồng độ MgCl2), ký
hiệu từ 1 đến 6 và 1 ống chứng âm, các thành phần giống nhau, có thể
điều chỉnh lượng nước khử ion cho đủ tổng thể tích 25 µl tùy theo
lượng MgCl2 cho vào mỗi phản ứng. Nồng độ MgCl2 (50mM) được
thử ở các mức độ từ 1 đến 3,5 µl cụ thể là 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5µl /25µl
thể tích phản ứng.
2.3.4. Chạy kiểm tra quy trình sau khi tối ưu
Chạy lại 10 mẫu đã chọn sau khi tối ưu hóa quy trình, nếu đạt cả 10
mẫu thì tiến hành cho toàn bộ các mẫu nghiên cứu còn lại; nếu chưa
đạt tiếp tục tối ưu lại theo trình tự trên.
2.3.5. Giải trình tự gen đối chiếu kết quả với kỹ thuật mPCR
Để khẳng định kết quả của kỹ thuật mPCR, chọn một số mẫu ngẫu
nhiên đại diện cho tất các các phân týp đã được xác định bởi kỹ thuật
mPCR tiến hành giải trình tự xác định phân týp để đối chiếu, nếu
không phù hợp thì giải trình tự toàn bộ các mẫu và kiểm tra lại mPCR,


10

nếu phù hợp thì sử dụng kết quả của mPCR cho các phân tích tiếp
theo.
2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.4.1. Địa điểm nghiên cứu: Học viện Quân y, Viện Vệ sinh dịch tễ
trung ương.
2.4.2. Thời gian nghiên cứu: 10/2007 đến tháng 10/2011.

Chƣơng 3
KẾT QUẢ

3.1. Tối ƣu hóa qui trình multiplex PCR để xác định phân týp
HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn
3.1.1. Lựa chọn quy trình phản ứng PCR
Kết quả 10 mẫu áp dụng theo quy trình của tác giả Fumihiro:
M

(-)

1

2

3

4

5

6

645 bp

500 bp

7

8

9 10

Ghi chú
M:Marker
100bp
(-):
Chứng âm
1-10:
Các mẫu
từ1 đến 10

Hình 3.1: Ảnh điện di sản phẩm PCR2.1 trước khi tối ưu quy trình
Qui trình của Fumihiro áp dụng nguyên bản trong điều kiện hiện
tại của phòng xét nghiệm chỉ đạt 50% hiệu quả phát hiện.


11

3.1.2. Kết quả tối ưu hoá quy trình mPCR xác định phân týp HIV-1
3.1.2.1. Kết quả tìm nhiệt độ gắn mồi thích hợp
M (-) 1 2 3 4 5
6 7 8
Ghi chú
M:Marke 100bp
(-): Chứng âm
1: 54,80C (+)
500 bp
554 bp
2: 56,80C (+)
3: 58,80C (+)
4: 60,80C (+)
5: 62,50C (++)

6: 63,90C (+++)
7: 65,10C (++)
8: 680C (+)
Hình 3.2: Ảnh điện di kết quả PCR2.2 tối ưu nhiệt độ gắn mồi
Với dải gradient nhiệt từ 54,80C đến 680C kết quả mPCR được đánh
giá tốt nhất ở nhiệt độ 63,90C cho cả phản ứng PCR 2.1 và 2.2.
3.1.2.2. Kết quả tìm thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi
Tiến hành mPCR với nhiệt độ gắn mồi là 63,90C với lần lượt thời
gian gắn mồi 30 giây, 45 giây, 60 giây, 90 giây.
Kết quả tối ưu hoá thời gian duy trì nhiệt độ được tóm tắt tại như sau:
30 giây
(-) 1 2

45 giây
3

(-) 1 2 3

60 giây

90 giây

(-) 1 2 3

(-) 1 2 3 M

Ghi chú

M: Marker
100bp

554 bp
(-):
Chứng âm
1: mẫu số 1
2: mẫu số 2
500 bp
3: mẫu số 3
Hình 3.3: Ảnh điện di kết quả PCR tối ưu hoá thời gian duy trì nhiệt
độ gắn mồi.


12

Tại mốc thời gian 60 giây cả 3 mẫu đều có band DNA đặc hiệu và rõ.
3.1.2.3. Kết quả tối ưu hoá nồng độ MgCl2
Thiết lập 6 phản ứng mPCR giống hệt nhau, cùng nhiệt độ gắn mồi
63,90C, thời gian duy trì là 60 giây, chỉ khác nhau về nồng độ MgCl 2.
Kết quả tìm được nồng độ MgCl2 tối ưu là 2,5μl (50mM).
M

(-)

1

500 bp

2

3

4

554 bp

5

6

Ghi chú
M:Marker
100bp
(-): Chứng âm
1: 1μl (+)
2: 1,5μl (+)
3: 2μl (++)
4: 2,5μl (+++)
5: 3μl (++)
6: 3,5μl (-)

500dibp
Hình 3.4: Ảnh điện
kết quả PCR tối ưu nồng độ MgCl2
Tại nồng độ 2,5μl ứng với ống số 4 có band DNA đặc hiệu và rõ.
3.1.3. Quy trình xác định phân týp HIV-1 trên các đối tượng nhiễm
ở khu vực Hà Nội và khu vực Viêng Chăn
Trong quá trình tối ưu lại phản ứng cho phù hợp với điều kiện
thực tế, nhóm nghiên cứu nhận thấy nếu sử dụng các cặp mồi xác định
phân týp A, E, G ngay sau PCR1 thì hầu hết các mẫu có kết quả ngay
mà ít phải dùng đến các vòng sau, tiết kiệm được nhiều hóa chất cũng
như thời gian và công sức. Vì vậy nhóm nghiên cứu đã đưa ra qui

trình phù hợp cho các mẫu khu vực Hà Nội và Viêng Chăn như sau:


13

(*) Phân biệt tiếp ở PCR 2.2;

(**) Kết quả đã biết ở PCR 2.0

Biểu đồ 3.1: Tóm tắt quy trình phản ứng mPCR và sản phẩm PCR phân
biệt phân týp HIV-1 bằng các mồi đặc hiệu sau khi đã tối ưu trong
nghiên cứu này.
Về chi tiết, qui trình được thực hiện theo các bước như sau:
3.1.3.1. PCR1: Dùng cặp mồi BECO5’, BECO3’để khuếch đại đoạn
gen gp 41 đặc hiệu cho HIV-1.
3.1.3.2. PCR2.0: Để xác định phân týp A, E, G với các mồi 5’A-3’A,
5’E-3’E, 5’G-3’G.
3.1.3.3. PCR2.1: PCR2.1 để xác định phân týp B, D, C, F (nếu là A,
E, G thì vẫn xuất hiện một băng DNA chung kích cỡ 645bp) với các


14

mồi BEANCH là mồi xuôi, 4 mồi B-SPEC, E-SPEC, F-SPEC, CSPEC là mồi ngược. DNA khuôn là sản phẩm của PCR1.
3.1.3.4. PCR2.2: Tiến hành khi các mẫu tại PCR 2.1 có băng DNA
kích thước 441 bp, sử dụng cặp mồi 5’D-3’D để phân biệt týp B và D,
DNA khuôn vẫn là sản phẩm PCR1. Sản phẩm PCR2.2 có kích thước
350 bp là phân týp D, không có sản phẩm nào tạo ra là phân týp B.
Chu trình luân nhiệt cho các phản ứng PCR như sau: Bước biến tính
ban đầu 950C trong 5 phút; tiếp theo là 35 chu kỳ luân nhiệt (mỗi chu

kỳ 3 bước) gồm: 950C trong 45 giây, 63,90C trong 1 phút, 720C trong
1,5 phút; Bước tổng hợp cuối cùng kéo dài bổ sung 720C trong 10
phút, sau đó giữ ở 40C.
3.2. Kết quả xác định phân týp HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng
Chăn
3.2.1. Kết quả xác định phân týp HIV-1 khu vực Hà Nội và Viêng
Chăn bằng mPCR
Bảng 3.1: Kết quả xác định phân týp HIV-1 bằng mPCR
Kết quả xác định phân týp
Xác định đƣợc
Phân týp E
Phân týp A
Phân týp B
Phân týp C
Chƣa xác định

n= 280
262/280
257/280
1/280
1/280
3/280
18/280

Tỷ lệ (%)
93,57
91,78
0,36
0,36
1,07

6,43

3.2.2. Kết quả giải trình tự gen đối chiếu với kết quả kỹ thuật mPCR
10 mẫu mPCR có kết quả xác định phân týp E được mang ra giải
trình tự vùng gen gp41 để đối chiếu và kiểm chứng kết quả của
mPCR.


15

Bảng 3.2: Kết quả đối chiếu phân týp HIV-1 của 10 mẫu mPCR có
kết quả phân týp E
Ký hiệu
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10

Mẫu
HN A04
HNA31
HNA46
HNB34
HNB39

HNB50
HNC31
HNC33
HNC35
HNC40

Giải trình tự
CRF01-AE
CRF01-AE
CRF01-AE
CRF01-AE
CRF01-AE
CRF01-AE
CRF01-AE
CRF01-AE
CRF01-AE
CRF01-AE

mPCR
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E
554 bp - phân týp E

Với 10 mẫu trong kết quả mPCR ứng với vị trí qui ước là phân
týp E khi phân tích bằng giải trình tự đều cho thấy đây là phân týp tái
tổ hợp CRF01-AE.
Như vậy khi tiến hành mPCR cho kết quả ở vị trí qui ước là phân
týp E được hiểu thực chất là phân týp tái tổ hợp CRF01-AE. Sau khi
kiểm chứng kết quả phân týp E của mPCR, 5 mẫu còn lại có kết quả
khác gồm 01 mẫu phân týp A, 01 mẫu phân týp B và 03 mẫu phân týp
C được giải trình tự kiểm chứng.


16

Bảng 3.3: Kết quả đối chiếu phân týp HIV-1 của 05 mẫu mPCR có
kết quả khác phân týp E

Như vậy kết quả giải trình tự xác nhận sự phù hợp chẩn đoán
của kỹ thuật mPCR trong xác định phân týp HIV-1.
Bảng 3.4: Kết quả xác định phân týp HIV-1 bằng mPCR trên đối
tƣợng nghiên cứu ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn


17

Bảng 3.5: Tỷ lệ phân bố phân týp HIV-1 trên các nhóm nghiên cứu

*CXĐ: chưa xác định được phân týp bằng mPCR.
Bảng 3.6: Tỷ lệ phân bố phân týp HIV-1 trên các nhóm nghiên
cứu ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn

18

Chƣơng 4
BÀN LUẬN
4.1. Tối ƣu hóa quy trình mPCR để xác định phân týp chủ yếu của
HIV-1 trên các đối tƣợng nhiễm ở khu vực Hà nội và Viêng Chăn
4.1.1. Lựa chọn phương pháp tách DNA và RNA
Độ tinh sạch DNA hay RNA là một trong những yến tố quyết định
về sự thành công của các kỹ thuật sinh học phân tử nói chung và các
kỹ thuật PCR nói riêng đặc biệt là kỹ thuật mPCR, do đó việc lựa
chọn phương pháp tách DNA hoặc RNA là một chiến lược và phụ
thuộc vào nhiều yếu tố và điều kiện cụ thể nhất định. Tuy tách chiết
RNA dễ đạt độ tinh khiết cao cho phản ứng PCR nhưng RNA tự do dễ
bị phân hủy, vì RNAases tồn tại ở tất cả các mô và dịch thể cơ thể nên
việc tách chiết RNA tự do của virus cần phải thực hiện sớm trước 7
giờ sau khi lấy mẫu máu. Điều này khiến cho việc áp dụng với cỡ mẫu
lớn, vận chuyển xa là khó khả thi. Tách chiết DNA thao tác dễ dàng
hơn, bảo quản mẫu cũng đơn giản hơn, điều quan trọng là DNA ổn
định hơn ở điều kiện môi trường, cho phép lưu giữ và vận chuyển thời
gian lâu hơn, kết quả phản ứng PCR với DNA của HIV-1 tách từ khối
bạch cầu tương đương kết quả phản ứng PCR với RNA đích từ huyết
thanh. Vì vậy tập thể hướng dẫn và nghiên cứu sinh đã lựa chọn
phương pháp tách DNA của HIV-1 từ khối bạch cầu để nghiên cứu
phân týp HIV-1.
4.1.2. Lựa chọn quy trình phản ứng mPCR
Quy trình của tác giả Fumihiro năm 2005 đã được sử dụng
thành công sau đó nhiều tác giả khác cũng đã áp dụng thành công
chính là sơ sở để nhóm nghiên cứu lựa chọn. Tuy nhiên mỗi phòng xét
nghiệm lại có trang bị khác nhau về cấu hình máy, điều kiện thực
hiện, cơ sở hạ tầng nên không thể áp dụng nguyên bản được mà cần

điều chỉnh các thông số cho phù hợp với điều kiện của mình, quá trình
này được gọi là tối ưu hóa phản ứng cho phù hợp với điều kiện thực


19

hiện của phòng xét nghiệm.
Ban đầu chúng tôi đã áp dụng nguyên bản quy trình của tác giả
Fumihiro với 10 mẫu, cho thấy hiệu quả xác định phân týp là thấp, đối
với PCR2.1 chỉ xác định được 5/10 mẫu xuất hiện băng DNA đặc hiệu
với kích thước 645 bp có thể là phân týp A hoặc E hoặc G. Để xác
định phân týp này cần phải tiến hành phản ứng PCR2.2. Với phản ứng
PCR 2.2 cho kết quả 7/10 mẫu xuất hiện băng DNA đặc hiệu với kích
thước 554 bp được xác định là phân týp E. Với kết quả thu được từ hai
vòng phản ứng chưa đạt kỳ vọng, để đạt được mục tiêu nghiên cứu
chúng tôi chọn phản ứng PCR2.1 và PCR2.2 của tác giả Fumihiro tối
ưu lại một số chỉ tiêu. Khi tối ưu lại, nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm
với 25l thể tích phản ứng giúp tiết kiệm hóa chất.
4.1.3. Kết quả tìm nhiệt độ gắn mồi thích hợp
Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng mPCR, được thực hiện
trên máy Thermol Cycler có chức năng gradient nhiệt.
Kết quả cho thấy với phản ứng PCR 2.1 sử dụng các cặp mồi đặc
hiệu BEANCH, là mồi xuôi, 4 mồi B-SPEC, E-SPEC, F-SPEC, CSPEC thì nhiệt độ gắn mồi tốt nhất là 63,90C.
Phản ứng PCR 2.2 với các cặp mồi 5’A-3’A, 5’E-3’E, 5’G-3’G
cho xác định phân týp A, E, G cũng được đánh giá tốt nhất với nhiệt
độ 63,90C.
4.1.4. Kết quả tìm thời gian duy trì nhiệt độ gắn mồi
Thời gian duy trì nhiệt nhiệt độ gắn mồi cũng là một thông số quan
trọng. Theo quy chuẩn của phản ứng PCR các mồi có độ dài từ 18-30
bp cần thời gian duy trì gắn mồi từ 30 giây đến 90 giây.

Kết quả, với nhiệt độ gắn mồi 63,90C tại khoảng thời gian duy trì 60
giây, các mẫu cho kết quả băng DNA đặc hiệu và rõ.
4.1.5. Kết quả tối ưu hoá nồng độ MgCl2
Trong quá trình tối ưu hoá nồng độ MgCl2, 6 ống phản ứng cho 6
nồng độ MgCl2, thông thường từ 1 đến 3,5μl (50Mm) đã được thử


20

nghiệm. Kết quả cho thấy lượng MgCl2 cho vào mỗi ống phản ứng là
2,5μl (50Mm) được chọn cho các phản ứng tiếp theo.
4.1.6. Kiểm tra qui trình tối ưu
Trong quá trình tối ưu lại phản ứng cho phù hợp với điều kiện thực
tế, nhóm nghiên cứu nhận thấy nếu sử dụng các cặp mồi xác định
phân týp A, E, G ngay sau PCR1 thì hầu hết các mẫu có kết quả ngay
mà ít phải dùng đến các vòng sau, tiết kiệm được nhiều hóa chất cũng
như thời gian và công sức. Vì vậy nhóm nghiên cứu đã đưa ra qui
trình phù hợp cho các mẫu khu vực Hà Nội và Viêng Chăn như sau:
Bước đầu nhân gen đích gp41 bằng phản ứng PCR1 với cặp mồi
BECO5’ và BECO3’ làm cơ sở cho các phân tích tiếp theo tìm phân
týp HIV-1.
Ở các vòng phản ứng tiếp theo, Fumihiro dùng phản ứng PCR2.1
với 4 cặp mồi B-SPEC, C-SPEC, E-SPEC, F-SPEC cho các phân týp
B hoặc D, C, hoặc A, E, G hoặc F.
Nhưng thực tế ở Việt Nam, Lào có thể hiếm gặp B, D, F nên PCR
2.1 hay bị âm tính. Tham khảo một số công bố về phân týp ở Việt
Nam, Thái Lan và các nước xung quanh theo một số công bố trước
đây hay gặp phân týp E (CRF01-AE), vì vậy chúng tôi chuyển cặp
mồi A5’-A3’ đặc hiệu cho phân týp A, cặp mồi E5’- E3’đặc hiệu cho
phân týp E và cặp mồi G5’- G3’đặc hiệu cho phân týp G cho phản

ứng PCR 2.0 trước khi thực hiện PCR 2.1 như của Fumihiro. Kết quả
cho thấy hiệu suất tăng rõ rệt, tiết kiệm thời gian, công sức và hóa
chất. Chỉ một số ít các trường hợp âm tính với phân týp A, E, G mới
thực hiện tiếp PCR 2.1 với các cặp mồi B-SPEC, C-SPEC, E-SPEC,
F-SPEC để tìm bổ sung các phân týp B, C, D và F.
Riêng trường hợp phân týp B hoặc D ở PCR 2.1 chỉ có chung 1
băng 441bp thì cần đến phản ứng PCR2.2 sử dụng với cặp mồi D5’D3’. Nếu kết quả là băng 350bp thì là phân týp D, không xuất hiện
băng là phân týp B.
Thành phần hỗn hợp chung cho một phản ứng PCR với thể tích


21

25μl cũng đã được tối ưu thành công như sau: Buffer Taq X10
(Invitrogen) 2,5μl, dNTP mix (10mM) (Invitrogen) 0,5μl, MgCl2
(50mM) 2,5 μl, mồi (10 pmol) mỗi loại tương ứng cho từng vòng PCR
là 0,5 μl, Taq DNA-polymerase (Invitrogen) 0,2 μl, DNA đích 3 μl và
bổ xung thêm nước khử ion vừa đủ 25 μl thể tích.
Như vậy mục tiêu 1: “Tối ưu hóa qui trình multiplex PCR để
xác định các phân týp chủ yếu của HIV-1 ở khu vực Hà Nội và
Viêng Chăn” đã được hoàn thành. Khi so sánh với qui trình ban
đầu của tác giả Fumihiro, qui trình tối ưu có ưu điểm hơn như sau:
Tiết kiệm được sinh phẩm, dụng cụ tiêu hao do tổng thể tích 1 ống
phản ứng chỉ 25μl (so với ban đầu là 50μl). Hiệu suất xác định
phân týp cao hơn do điều chỉnh thứ tự vòng phản ứng như mô tả
trên dẫn đến tiết kiệm được nhiều sinh phẩm, dụng cụ tiêu hao, thời
gian công sức, giảm kinh phí và giá thành, cho kết quả nhanh.
4.2. Ứng dụng quy trình mPCR xác định phân týp HIV-1 trên các
đối tƣợng ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn
Sau khi tìm được qui trình tối ưu như nêu trên, nhóm nghiên cứu

đã áp dụng cho toàn bộ 280 mẫu thu thập được ở khu vực Hà Nội và
Viêng Chăn. Kết quả cho thấy, quy trình này đã xác định được phân
týp 262/280 mẫu (đạt hiệu suất 93,57%). Trong đó ngay từ phản ứng
PCR 2.0 đã xác định 257/280 mẫu (91,78%) có băng DNA kích thước
554bp theo qui ước là phân týp E và 1/280 mẫu (1,07%) có băng DNA
kích thước 644bp tương ứng với phân týp A. Sau đó sản phẩm
PCR2.1 có 3 mẫu (1,07%) có băng DNA với kích thước 697 bp tương
ứng với phân týp C và 1 mẫu (1,07%) có băng DNA kích thước 441bp
nhưng không xuất hiện sản phẩm ở PCR 2.2 nên theo qui ước là phân
týp B.
Còn 18/280 mẫu (6,43%) chưa xác định được phân týp bằng kỹ
thuật mPCR có thể là phân týp khác hoặc nhóm khác không thuộc
phạm vi phát hiện của các cặp mồi trong nghiên cứu này hoặc là các
dạng tái tổ hợp mới. Tuy nhiên kết quả này đã đạt hiệu suất cao của


22

phản ứng mPCR do tính đa dạng di truyền phức tạp của các phân týp
HIV-1 khi so sánh với các tác giả khác.
Với kết quả như trên, nghiên cứu này có thể sẽ được áp dụng cho
các nghiên cứu tiếp theo ở Lào về phân týp HIV-1 khi chưa có điều
kiện triển khai các phương pháp khác.Do không có chứng dương với
từng phân týp HIV-1 nên nhóm nghiên cứu lấy sản phẩm PCR của các
vòng phản ứng sau khi xác định phân týp mang đi giải trình tự để
kiểm tra kết quả của kỹ thuật mPCR bằng cách chọn ngẫu nhiên 10
mẫu đã được xác định là phân týp E (phân týp chiếm số lượng chủ
yếu). Kết quả giải trình tự trên máy ABI System 3130XL, được xử lý
qua phần mềm Bio Edit, sau đó phân tích số liệu bằng công cụ Viral
Genotyping và công cụ Blast so sánh với trình tự của các phân týp đã

biết trước trên ngân hàng gen Quốc tế (GenBank). Kết quả cho thấy cả
10 mẫu có băng tương ứng qui ước là phân týp E ở mPCR đều cho kết
quả giải trình tự đối chiếu là phân týp tái tổ hợp CRF01-AE.
Tham khảo các tài liệu về phân týp E công bố gần đây cho biết hầu
hết các phân týp E hiện nay không còn ở dạng đơn độc mà ở dạng kết
hợp với phân týp A tạo nên kiểu tái tổ hợp CRF01-AE và kiểu này
ngày càng phổ biến ở khu vực Đông Nam Á. Cặp mồi xác định phân
týp E trong mPCR được kế thừa từ công bố của Fumihiro năm 2002
nên vẫn gọi là phân týp E nhưng thực chất hiện nay là CRF01-AE
theo kết quả phân tích trình tự gen. Kết quả kiểm chứng với giải trình
tự gen cũng cho thấy độ tin cậy của mPCR trong nghiên cứu.
Ngoài phân týp E, trong kết quả của mPCR còn có 01 mẫu xác
định phân týp A, 01 mẫu xác định phân týp B và 03 mẫu xác định
phân týp C; Cả 5 mẫu này đều được giải trình tự đối chiếu. Kết quả
giải trình tự hoàn toàn phù hợp với kết quả của mPCR mà nhóm
nghiên cứu đã thực hiện.
Khi so sánh sự phân bố phân týp HIV-1 giữa Hà Nội và Viêng
Chăn cho thấy (bảng 3.21), khu vực Hà Nội xác định được 138/140
mẫu chiếm 98,57% đều là phân týp E (CRF01-AE), có 2/140 mẫu


23

chưa xác định týp bằng mPCR chiếm 1,43%. Khu vực Viêng Chăn có
124/140 (88,57%) mẫu xác định được phân týp HIV-1 trong đó 119
mẫu xác định là phân týp E (CRF01-AE) chiếm 85%. Ngoài ra còn
xuất hiện các phân týp khác ngoài phân týp E (CRF01-AE) gồm 03
mẫu (2,14%) xác định là phân týp C, 01 mẫu (0,71%) là phân týp A và
01 mẫu (0,71%) là phân týp B. Như vậy phân týp HIV-1 ở Viêng
Chăn đa dạng hơn ở Hà Nội nhưng chủ yếu vẫn là phân týp E

(CRF01-AE) phản ánh đặc điểm chung của khu vực Đông Nam Á.

KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu ứng dụng multiplex PCR để xác định phân týp của
HIV-1 ở Hà Nội và Viêng Chăn (2007- 2011) chúng tôi rút ra kết
luận sau:
1. Đã tối ƣu hóa đƣợc qui trình multiplex PCR để xác định các
phân týp chủ yếu của HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng Chăn
nhƣ sau:
*Thành phần hỗn hợp cho một phản ứng với thể tích 25μl như sau:
BufferTaq X10 (Invitrogen) 2,5 μl, dNTP mix (10mM) (Invitrogen)
0,5 μl, MgCl2 (50mM) 2,5 μl, mồi (10 pmol) mỗi loại cho cac vòng
phản ứng PCR 0,5 μl, Taq DNA-polymerase (Invitrogen) 0,2 μl, DNA
đích 3 μl và bổ xung thêm nước khử ion vừa đủ 25 μl thể tích. Với các
PCR vòng sau lấy 1μl sản phẩm của PCR 1 làm khuôn cho phân tích
tiếp theo.
*Thứ tự tiến hành phản ứng mPCR phát hiện phân týp HIV-1 như sau:
+ PCR1 với cặp mồi BECO5’ và BECO3’ để khuếch đại đoạn gen gp
41 đặc hiệu kích thước 853bp dùng làm đích cho các vòng phản ứng
tiếp theo.


24

+ PCR2.0 sử dụng 3 cặp mồi (A5’- A3’), (E5 - E3’), (G5’- G3’) để
phân biệt phân týp A, E và G. Sản phẩm có kích thước 644 bp là phân
týp A, 554 bp là phân týp E và 607 bp là phân týp G.
+ PCR2.1 sử dụng các mồi BE - ANCH, B - SPEC, E-SPEC, F-SPEC,
C-SPEC. Sản phẩm kích thước 697 bp là phân týp C, 778 bp là phân týp F.
Kích thước sản phẩm 441 bp có thể là phân týp B hoặc D cần tiếp tục PCR

2.2.
+ PCR2.2 sử dụng cặp mồi D5’- D3’, sản phẩm có kích thước 350 bp
là phân týp D, không có sản phẩm là phân týp B.
*Chu trình luân nhiệt chung cho các vòng phản ứng mPCR
(95 5 phút) (95oC/45giây - 63,9oC/1phút -72oC/1,5 phút) x 35 chu kỳ72oC/10 phút, sau đó giữ ở 4oC.
oC

2. Xác định các phân týp chủ yếu của HIV-1 trên các đối tƣợng ở
khu vực Hà Nội và Viêng Chăn bằng kỹ thuật multiplex PCR
Kỹ thuật mPCR đã được xác minh kết quả bằng giải trình tự gen
được ứng dụng xác định phân týp HIV-1 ở khu vực Hà Nội và Viêng
Chăn, kết quả 262/280 mẫu (93,57%) xác định được phân týp; trong
đó phân týp E (CRF01-AE) là 257/280 (91,78%), phân týp A là 1/280
(0,36%), phân týp B là 1/280 (0,36%) và phân týp C là 3/280 (1,07
%). Có 18/280 mẫu (6,43%) chưa xác định được phân týp bằng
mPCR.
Phân týp dạng tái tổ hợp CRF01-AE của HIV-1 là phân týp chủ
yếu ở cả hai khu vực (98,57 % ở khu vực Hà Nội và 85% ở khu vực
Viêng Chăn). Khu vực Viêng Chăn có tỷ lệ phân týp HIV phức tạp và
đa dạng hơn, ngoài dạng CRF01-AE còn có cả các phân týp A, B, C
phát hiện được với tỷ lệ thấp (0,7 % - 2,14%) ở các đối tuợng nghiện
chích ma túy và gái mại dâm.