Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây mán đỉa

ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài
Các dạng oxy hoạt động, bao gồm các gốc tự do và các phân tử chứa oxy, có
hoạt tính oxy hóa cao như OH ., HOO., O2-,…có năng lượng cao và kém bền nên dễ
dàng tấn công các đại phân tử như lipit, ADN, protein,… sinh ra nhiều loại bệnh
như ung thư, tim mạch, tiểu đường, béo phì,… và tăng nhanh sự lão hoá. Vì vậy, để
bảo vệ sức khỏe, cần phải bổ sung các chất kháng oxy hóa để kiểm soát hàm lượng
ổn định của các gốc tự do trong cơ thể. Tác dụng kháng oxy hoá mang lại nhiều lợi
ích tốt cho cơ thể như bảo vệ sự toàn vẹn của tế bào, ngăn ngừa một số tai biến, làm
chậm quá trình lão hoá cơ thể, bảo vệ chức năng gan, hạn chế các tác nhân gây
viêm... Như vậy, việc tìm kiếm các dược liệu, định hướng nghiên cứu các hoạt chất
có khả năng kháng oxy hoá là cần thiết trong nỗ lực tìm kiếm thuốc mới phục vụ
công tác phòng và chữa bệnh cho nhân dân.
Việt Nam có nhiều dân tộc sinh sống với nhiều ngôn ngữ khác nhau. Mỗi dân
tộc có một nhóm các cây thuốc chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh đặc thù của dân
tộc mình. Tộc người Pako và Vân Kiều là những cư dân có mặt sớm nhất ở vùng
Trường Sơn trải dài từ Quảng Nam đến Quảng Bình, nhiều nhất là ở địa bàn miền
núi Quảng Trị. Tri thức bản địa về sử dụng cây thuốc có vai trò quan trọng trong
đời sống của người dân nơi đây. Trong đó, cây Mán đỉa (Archidendron clypearia
(Jack) I.Niels) là cây thuốc đã được sử dụng trong y học dân tộc cổ truyền của
Trung Quốc và trong các bài thuốc kinh nghiệm chữa bệnh của các đồng bào dân
tộc Pako, miền Trung Việt Nam [5]. Một số công trình đã công bố cho thấy, thành
phần hóa học chủ yếu của Archidendron clypearia là các hợp chất flavonoid,
saponin, acid hữu cơ...[17], [23], [26]. Tộc người Pako,Vân Kiều và một số nơi
khác đã sử dụng Mán đỉa để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, viêm gan,
xơ gan, bệnh gan mật, tiêu hóa kém, viêm họng, viêm thanh quản, viêm amidan cấp
tính [5]. Theo một số tài liệu, Mán đỉa còn có tác dụng kháng nấm, kháng vi khuẩn
[38], kháng virus [14],[15],[23], tác dụng gây độc tế bào ung thư [27],[30], khả
năng kháng oxy hóa [32], [38].
Cho đến nay, ở Việt Nam mới có công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn
Thị Hoài về sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết metanol [5] nhưng vẫn

chưa đầy đủ về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài Mán đỉa.
Nhằm góp phần làm sáng tỏ về cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc này,
chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của cây Mán đỉa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Cung cấp thông tin về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học, quy trình chiết
xuất, phân lập hợp chất và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là thành phần trên mặt đất của cây Mán đỉa (Archidendron
clypearia (Jack) I. Niels).
4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp sàng lọc và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa
+ Phương pháp nghiên cứu in vitro hoạt tính kháng oxy hóa- bảo vệ gan của
cao toàn phần và các cao phân đoạn của cây Mán đỉa - Archidendron clypearia
(Jack) I. Niels
+ Phương pháp xác định lực kháng oxy hóa tổng (Total antioxidant capacity)
theo mô hình phospho molybden
+ Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa theo mô hình DPPH
4.2. Phương pháp chiết cao toàn phần và cao phân đoạn
+ Phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng
+ Phương pháp chiết lỏng – lỏng
+ Phương pháp chiết pha rắn
4.3. Phương pháp phân lập cấu tử
+ Phương pháp sắc ký cột
+ Phương pháp sắc ký lớp mỏng
4.4. Phương pháp xác định cấu tạo của cấu tử đã phân lập được.
+ Phương pháp phổ: 1H – NMR,
COSYGP.

13

C – NMR, HSQC – NMR, HMBC – NMR,


5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
Kết quả nghiên cứu này cung cấp thông tin khoa học đầu tiên về thành phần hóa
học và hoạt tính sinh học của cây Mán đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I. Niels)
thu hái ở vùng rừng núi của huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị, Việt Nam. Các nghiên
cứu đều dựa trên các phương pháp thường quy và được xử lí số liệu thống kê.
6. Cấu trúc luận văn
Luận văn chia thành các chương sau:
Mở đầu
Chương 1. Tổng quan: Giới thiệu vài nét về họ trinh nữ, thuộc chi
Archidendron F.Mueller, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Archidendron F.
Mueller và loài Mán đĩa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels, thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học, tác dụng và công dụng của chi Archidendron F. Mueller và
loài Mán đĩa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels.
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đưa ra đối tượng nghiên
cứu và sử dụng một số phương pháp nghiên cứu như xác định hoạt tính kháng oxy
hóa, định tính các nhóm chức hữu cơ bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, tiến
hành phân lập bằng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, xác định cấu trúc của các hợp chất
dựa trên dữ liệu các phổ.
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận: Trình bày các kết quả nghiên cứu
bao gồm kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng metanol và các cao phân
đoạn, chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các cấu tử từ phân đoạn có hoạt
tính kháng oxy hóa cao nhất.
Kết luận.

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Mán đỉa - Archidendron clypearia (Jack) I. Niels
1.1.1. Vị trí phân loài cây Mán đỉa - Archidendron clypearia
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, cây Mán đỉa có tên
khoa học là Archidendron clypearia (Jack) I. Niels, có vị trí phân loài như sau[16]:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)
Bộ Ngọc lan (Magnoliales)
Họ Đậu (Fabaceae)
Phân họ Trinh nữ (Mimosaceae)
Chi Archidendron
Mán đỉa (Archidendron clypearia) có nhiều tên đồng nghĩa khác như cây giác,
cây khét, hông linh, lim sẹt, ràng ràng và cũng được sử dụng với một số tên khoa học
đồng nghĩa như Pithecellobium clypearia, Abarema clypearia, Inga clypearia [16],
Inga clypearia Jack ở Malay, Abarema angulata (Bentham) Kostermans,
Pithecellobium angulatum Bentham [16].
1.1.2. Sơ lược về đặc điểm họ Trinh nữ - Mimosaceae
Là họ nguyên thủy nhất và có nhiều loài trong bộ Đậu, có dạng cây gỗ, cây
bụi, cây thảo và dây leo gỗ, cây nhẵn hay có gai. Lá kép lông chim 1-2 lần, lá chét
nhỏ, lá kèm hình sợi hay biến thành gai. Hoa nhỏ, tập hợp thành cụm hoa hình đầu
hay hình bông, hoa đều, mẫu 5 hoặc 4, đài 5, thường dính lại ở dưới. Tràng 5 có tiền
khai van. Nhị nhiều gấp đôi số cánh hoa hoặc bằng số cánh hoa. Hạt phấn thường
dính lại thành khối 4-16 hạt. Quả thuộc loại đậu [29].
Họ Mimosaceae gồm khoảng 60 chi, 2800 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới. Theo “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ [7], họ
Mimosaceae ở Việt Nam có khoảng 16 chi với 85 loài, trong đó bao gồm:
Acacia P. Miller

(28 loài)

Enterolobium C. Martius

(1 loài)

Adenanthera C. Linnaeus (2 loài)

Leucoena J. Lamarck

(1 loài)

Albizia A. Durazzini

Mimosa C. Linnaeus

(4 loài)

(17 loài)


Archidendron F. Mueller

(18 loài)

Neptunia J. Loureiro

Calliandra G. Bentham

(2 loài)

Parkia R. Brown

(1 loài)
(1 loài)

Cathormion (Benth.) Hassk (1 loài)

Pithecellobium C. Martius (2 loài)

Desmanthus C. Willdenow (1 loài)

Samanea (DC.) Merrill

Entada M. Adanson

Xylia W. Roxburgh

(4 loài)

(1 loài)
(1 loài)

1.1.3. Sơ lược về đặc điểm chi Archidendron F. Mueler
Chi Archidendron F. Mueller thuộc phân họ Mimosaceae tập trung chủ yếu ở
vùng nhiệt đới Châu Á với khoảng 100 loài [16]. Ở Việt Nam, chi Archidendron có
18 loài phân bố khắp cả nước [7].
Bảng 1.1. Các loài trong chi Archidendron có ở Việt Nam [7]
STT

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Loài
Archidendron pellitum
(Gagn.) I. Niels
Archidendron clypearia
(Jack.) I. Niels
Archidendron tetraphyllum
(Gagn.) I. Nielsen
Archidendron quocense
(Pierre) I. Niels.
Archidendron turgidum
(Merr.) I. Niels
Archidendron bauchei
(Gagn.) I. Niels
Archidendron lucidum
(Benth.) I. Niels

Archidendron utile (Chun
& How) I. Nielsen
Archidendron eberhardtii I.
Niels.
Archidendron ellipticum
(Bl.) Niels.
Archidendron kerri (Gagn.)
I. Niels.
Archidendron balansae
(Oliv) I. Niels.

Tên thường gọi
Doi da

Nơi phân bố
Gia Lai, Kontum, Lâm
Đồng
Giác, Mán đỉa
Đồng Nai, Bạc Liêu, Phú
Quốc, Quảng Trị, Huế.
Doi, hầm học, lễ Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà
Tây, Hòa Bình, Thanh Hóa
Doi Phú Quốc
Phú Quốc, Côn Sơn
Doi phù
Cổ ướm, cổ áo
Cổ ôm, giác
Doi hữu ích
Doi Eberhardt

Hoàng Liên Sơn, Gia Lai,
Kontum
Từ Thanh Hóa, Huế đến
Cam Ranh
Quảng Bình, Quảng Trị,
Thừa Thiên Huế.
Vĩnh Phúc, Phú Thọ

Doi bầu dục

Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hà
Tây, Hòa Bình, Thanh Hóa
Gia Lai, Kon Tum

Doi Kerr

Bắc Cạn, Thái Nguyên

Cứt ngựa

Từ Cao Bằng, Lạng Sơn,
đến Quảng Bình, Quảng
Trị, Thừa Thiên Huế.
Phú Yên, Khánh Hòa

Archidendron chevalieri
Doi Chevalier
(Kost) I. Niels.
Archidendron tonkinensis I. Doi Bắc Bộ
Niels.

Quảng Ninh


15

16
17
18

Archidendron robinsonii
(Gagn.) I. Niels.

Dái heo

Cao Bằng, Lạng Sơn,
Quảng Bình, Quảng Trị,
Thừa Thiên Huế, Phú Yên,
Khánh Hòa, Đà lạt
Tam Đảo, Bạch Mã,
Kontum, Lâm Đồng
Bạch Mã, Quảng Trị

Archidendron poilanei
Doi Poilane
(Kost.) I. Niels.
Archidendron occultatum
Doi ẩn
(Gagn.) I. Niels.
Archidendron dalatensis

Doi Đà Lạt
Gia Lai, Kontum, Lâm
(Kost.) I. Niels.
Đồng
Các loài Archidendron phân bố khắp cả nước, tập trung nhiều ở miền Bắc,

miền Trung và khu vực Tây Nguyên. Tại khu vực Quảng Trị, Thừa Thiên Huế có
thể tìm thấy một số loài như A. clypearia (Jack) I. Niels, A. bauchei (Gagn.)
I.Niels, A. lucidum (Benth.) I. Niels, A. balansae (Oliv) I. Niels, A. robinsonii
(Gagn.) I. Niels, A. poilanei (Kost.) I. Niels, A. occultatum (Gagn.) I. Niels.
1.1.4. Sơ lược về đặc điểm cây Mán đỉa – Archidendron clypearia
Cây thường thấy trong các rừng đầm lầy, rừng phủ xanh trên đất sét, rừng thưa
và các rừng hỗn giao rụng lá, vùng núi ở độ cao giữa 0 đến 1700m. Cây ưa sáng,
mọc nhanh, ưa đất chua, ưa ẩm, nảy chồi mạnh. Tái sinh hạt khỏe dưới tán rừng có
độ tán che thấp.
Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở nhiều tỉnh phía Bắc, các tỉnh miền Trung cho
tới các tỉnh Nam bộ như Đồng Nai, Bạc Liêu, Phú Quốc, Quảng Trị, Huế...[4].
Mán đỉa thuộc loại cây nhỡ hay cây gỗ cao 10-15m, nhánh ngang, có cạnh. Lá
kép, mang 4-5 cặp cuống bậc hai, mỗi cuống bậc hai mang 3-8 đôi lá chét hình bình
hành, hình trái xoan hay hình ngọn giáo ngược, gốc hình nêm không cân đối. Đầu lá
nhọn và thường có mũi, hơi có lông mịn ở hai mặt hoặc có lông tơ ở mặt dưới.
Ra hoa vào tháng 3-4, cụm hoa chùm tán hay chùy ở ngọn, phân nhánh đến 3
lần, có lông. Các cuống mang tán gồm khoảng 10 hoa có cuống 1-3mm. Đài hình
chén hay hình phễu, tràng hình phễu hay hình chuông, ống nhị bằng ống tràng. Bầu
có lông mịn hay lông tơ.
Có quả vào tháng 6-8, quả cỡ 20 x 1 cm, dẹp, xoắn theo hình trôn ốc, màu cam
vàng ở mặt ngoài, đỏ ở mặt trong, có lông mềm hay lông tơ. Hạt hình bầu dục hay
hình cầu, có vỏ màu đen lam.

1.1.5. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Archidendron
và loài Archidendron clypearia
1.1.5.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Archidendron
Chi Archidendron (hay còn được gọi với tên Pithecellobium) đã được đưa vào
sử dụng với mục đích chữa bệnh từ lâu, nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa
học của chi chỉ mới phát triển trong những năm gần đây, trong đó phải kể đến các
nghiên cứu từ Trung Quốc, Ấn Độ, Hàn Quốc và một số nước Đông Nam Á. Các
nhóm chất chính có trong chi là flavonoid, saponin và một số dẫn chất khác [17],
[23], [26].
a. Nhóm flavonoid
Bảng 1.2. Các hợp chất flavonoid chính có trong chi Archidendron
Tên chất
3 - Prenylapigenine 7-O-rutinoside
Quercitrin
Rutin
Kaempferol
Naringin
Daidzein

Có trong loài
A.dulce

Flavan 3-ol gallate

A.lobatum

’

TLTK
[37]

A. dulce

[29]
[31]

b. Nhóm saponin
Bảng 1.3. Các hợp chất saponin có trong chi Archidendron
Eliptoside A-J
Pitheduloside A-G
Pithelucoside A-C

A. ellipticum
A. dulce
A. lucidum

[15]
[33]
[27]

A. dulce

[36]

3-O-[beta-D-glucopyranosyl (1-2)-alpha-Larabinopyranosyl]-28-O-[beta-D-xylopyranosyl(16)-beta-D-glucopyranosyl]-echinocystic acid.
3-O[alpha-L-arabinopyranosyl (1-2)][alpha-L
arabinopyranosyl (1-6)]2-acetoamido-2-deoxybeta-D-glucopyranosyl oleanolic acid
3-O[alpha-L-arabinopyranosyl (1-2)][alpha-L

A. racemosum

[21]

A.cubense

[20]

arabinopyranosyl (1-6)]2-acetoamido-2-deoxybeta-D-glucopyranosyl echinocystic acid
O(3)- (2-acetylamino-2-deoxy-beta-D-


glucopyranosyl)-oleanolic acid

A.arboreum

c. Các nhóm khác
Ngoài flavonoid, saponin, thành phần trong chi Archidendron còn có các
diterpenoid, acid hữu cơ, các dẫn xuất của axit,…
Bảng 1.4. Các hợp chất khác có trong chi Archidendron
Diterpenoid

(-) 19-beta-D-glucopyranosyl 6,7-

A. albicans

[30]

Acid hữu cơ

dihydroxy kaurenoate.

Metyl panmitat
Metyl stearat

A.

[17]

Axit glucuronic

cauliflorum
A. mangense

[18]

Djenkolic axit (S,S’-

A. jiringa

[39]

và các dẫn
xuất của
acid
Hợp chất
khác

methylenebiscysteine)
Lectin
’
3-O[6 -O-palmitoyl-β-D-glucosyl]-

[38]
A.cauliflorum

spinasta-7,22(23)-dien
3-O[6’-O-stearoyl-β-D-glucosyl]-

[17]

spinasta-7,22(23)-dien

(1) Quercitrin

(3) Kaempferol

(2) Rutin

(4) Naringin


(5) Daidzein

(6) Kaempferol-3-O-alpha-

L-rhamnopyranoside

(7) Flavan 3-ol gallate

(8) Djenkolic acid (S,S’-methylenebiscysteine)

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số cấu tử đã phân lập được từ các loài
thuộc chi Archidendron F.Mueller.
Thành phần hóa học chính của chi Archidendron là flavonoid và các
saponin. Flavonoid thường có hoạt tính chống độc, tạo phức với ion kim loại, bảo
vệ chức năng gan, kháng oxy hóa tốt; còn các saponin có tác dụng chống viêm, một
số có tác dụng ức chế virus [14], [23], kháng nấm và kháng khuẩn [38]. Từ các
thành phần đó phần nào đã giải thích các tác dụng kháng oxy hóa, kháng viêm,
chống dị ứng và kháng nấm… của các loài trong chi Archidendron.
1.1.5.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Archidendron clypearia
Cây Mán đỉa mới được nhà khoa học Trung Quốc quan tâm nghiên cứu trong
vài năm trở lại đây. Cây được người dân đưa vào sử dụng làm thuốc từ lâu. Năm
2013, ở Việt Nam đã có nghiên cứu về thành phần hóa học và một số tác dụng sinh
học của cây Mán đỉa của tác giả Nguyễn Khánh Thùy Linh [8], với sự hướng dẫn
của PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài. Cho đến nay, tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa
học cũng như tác dụng sinh học cây Mán đỉa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels
được tìm thấy không nhiều.


Qua các tài liệu tham khảo được, thành phần chủ yếu của Mán đỉa
(Archidendron clypearia) là flavonoid, saponin, acid hữu cơ...[23]. Theo tổng quan
tài liệu, các hoạt chất đã phân lập từ Mán đỉa được trình bày ở bảng 1.5.
Bảng 1.5. Một số hoạt chất phân lập được từ Mán đỉa
ST Nhóm hoạt
T
chất
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10 Flavonoid
11
12
13
14
15

16
17
18
19
20
21
22

Tên chất
5-hydroxy-3,7,3’,4’-tetramethoxyflavone
5,4’-dihydroxy-3,7,3’-trimethoxyflavone
Luteolin
Luteoloside
7,3’-O-di-gallyoltricetiflavan
7,4’-O-di-gallyoltricetiflavan
(-)-epigallocatechin-7-O-gallate
2(-)-epigallocatechin-7-gallate
3(-)-5,7,3’,4’,5’-pentahydroxyflavan
5(-)-tetrahydroxyflavan-7-gallate

7-O-galloyltricetifavan
7,4’-di-O-galloyltricetifavan
Myricitrin (myricetin-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside)
Quercitrin (quercetin-3-O-alpha-L-rhamnopyranoside)
Quercetin

Acid hữu cơ
và dẫn xuất
của acid

Oleanolic acid
Ursolic acid
Acid gallic
Methyl gallate
Saponin
Alpha-amyrin
Sterol
Beta- Sitosterol
Hydrocarbon Tritriacontane

TLTK

[43]

[41]
[14]
[25]
[26]

[43]

[26]
[43]

Qua bảng 1.2, nhận thấy trong các thành phần phân lập được, flavonoid chiếm
với số lượng lớn. Flavonoid là nhóm chất có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa,
dập tắt các gốc tự do, chống độc, giảm tổn thương gan và bảo vệ gan [2]. Điều này
đã góp phần nào vào việc giải thích tác dụng chữa các bệnh liên quan đến kháng
oxy hóa, bảo vệ gan của dược liệu.
1.1.6. Hoạt tính sinh học của chi Archidendron và loài Archidendron clypearia
1.1.6.1. Hoạt tính sinh học của chi Archidendron


Các loài trong chi Archidendron phân bố ở nhiều nơi trên thế giới, được sử
dụng để làm thực phẩm hay làm thuốc.
a. Hoạt tính kháng oxy hóa
Tác dụng chính của các loài trong chi này là khả năng kháng oxy hóa. Theo
một nghiên cứu đã công bố, dịch chiết methanol từ lá và vỏ quả Archidendron ducle
có tác dụng kháng oxy hóa mạnh với khả năng thu dọn các gốc tự do [29]. Dịch
chiết nước từ quả của A. ducle có khả năng chống lại quá trình oxy hóa làm tổn
thương thận do CCl4 gây ra [33],[34] và theo các nhà nghiên cứu Ấn Độ, chưa phát
hiện bất kỳ độc tính nào từ dịch chiết nước của A. ducle nên có thể sử dụng dược
liệu này trong điều trị [32]. A. jiringa có nguồn gốc từ Đông Nam Á, dịch chiết
etanol của cây chứa thành phần chính là các hợp chất polyphenol có tác dụng ngăn
chặn sự hình thành mạch máu do ức chế sự tăng sinh tế bào nội mô trong các bệnh
tăng sinh mạch máu [38].
b. Hoạt tính kháng nấm, kháng vi khuẩn
Một protein có cấu trúc tương tự với lysozyme lòng trắng trứng gà với hoạt tính
kháng nấm được phân lập từ những hạt giống của A. dulce. Protein này thể hiện hoạt
động kháng nấm Macrophomina phaseolina với khả năng chịu đựng nhiệt độ khá cao
đến lên đến 80 0C trong 15 phút (ở pH = 8,0). Trong khi dịch chiết metanol từ lá A.

jiringa với nồng độ ức chế tối thiểu (100mg/mL) tác dụng chủ yếu trên Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis and Microsporum gypsum, hạt của A. jiringa chứa
lectin, có khả năng ức chế các loài nấm Exserohilum turcicum, Fusarium oxysporum,
Corynespora cassicola và các loài vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Candida albicans [30]. Lectin có tác dụng trên
cả vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương [21]. Vỏ cây A. racemosum chứa 3-O[alpha-L-arabinopyranosyl

(1-2)][alpha-L-arabinopyranosyl

(1-6)]-2-acetoamido-2-

deoxy-beta-D-glucopyranosyl acid oleanolic, có khả năng chống lại Trichophyton
mentogrophytes, Candida albicans và Saccharomyces cerevisiae [38].
c. Hoạt tính chống ung thư, gây độc tế bào ung thư
Với tình hình bệnh ung thư gia tăng hiện nay thì tác dụng gây độc tế bào ung
thư đang là vấn đề nhận được quan tâm của nhiều nhà khoa học. Dịch chiết metanol
của hạt A. jiringa ở nồng độ 200mg/mL được cho rằng có khả năng ức chế tối thiểu


là 30% virus Epstein-Barr [31]. A. ellipticum ở đảo Great Nicbar, Ấn Độ [36] chứa
các saponin ester elliptoside A-J có khả năng gây độc tế bào đặc biệt đối với tế bào
ung thư thận [15]. Rễ loài A. lucidum cũng có khả năng gây độc tế bào chọn lọc trên
dòng tế bào ung thư buồng trứng A2780 ở người với giá trị IC50 là 1,72 mol/l [31].
Bên cạnh các tác dụng nêu trên, các loài trong chi này còn có nhiều tác dụng
khác. Một nghiên cứu của Ibrahim cùng cộng sự cho thấy việc sử dụng trước dịch
chiết A. jiringa ở trên chuột giúp đẩy lùi các tổn thương dạ dày do etanol gây ra
[21], ngoài ra quả A. jiringa còn dùng để chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp, sỏi
bàng quang. Theo nghiên cứu của một số nhà khoa học ở Malaysia, quả A. jiringa
có tác dụng điều trị đái tháo đường hiệu quả, tuy nhiên nếu dùng ở liều cao có thể
gây nên phì đại và tổn thương tim, thận, gan và tuyến tụy [36]. Lá cây A.ducle có

tác dụng điều trị loét dạ dày nhưng cẩn thận với phụ nữ có thai vì có chất làm se có
thể gây sẩy thai [29], hạt của nó có khả năng kiểm soát được đường huyết trong
máu, đặc biệt là sự tăng đường huyết sau ăn [32]. Đặc biệt, dịch chiết từ lá và hạt
giống A. dulce có tiềm năng sử dụng như phương pháp tiếp cận thân thiện môi
trường lý tưởng cho việc kiểm soát muỗi.
1.1.6.1. Hoạt tính sinh học của loài Archidendron clypearia
a. Công dụng
Mán đỉa được sử dụng làm thuốc ở nhiều nước trên thế giới.
Ở Trung Quốc, lá Mán đỉa là vị thuốc y học cổ truyền dùng để trị đau họng,
đau thượng vị, tiêu chảy nhiệt, đắp trên vết thương trị bỏng lửa, bỏng nước, sưng
nhọt, ghẻ lở [27].
Ở Ấn Độ và Malaixia, lá được dùng trị đau chân, sưng tấy, thủy đậu, ho và đậu
mùa. Ở Lào, lá Mán đỉa phơi khô và tán bột dùng để điều trị các vết thương. Lá, vỏ cây
dùng để nhuộm lưới, nấu nước gội đầu, tắm trị ghẻ. Dùng điều trị các bệnh nhiễm trùng
đường hô hấp trên, viêm họng, viêm thanh quản, viêm amidan cấp tính [26].
Ở Việt Nam, Mán đỉa được dùng trị ho, sưng nhọt, thủy đậu, bên cạnh đó lá
còn được dùng để nhuộm đen, nấu tắm trị ghẻ [15]. Nghiên cứu gần đây về tri thức
bản địa, lá Mán đỉa được đồng bào Pako, Vân Kiều (Quảng Trị) dùng trong chữa
bệnh về gan như viêm gan, xơ gan, các bệnh gan mật hay tiêu hóa kém [1].
b. Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý


Cho đến nay, các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Mán đỉa chủ yếu của
Trung Quốc với một số tác dụng đã được chứng minh như điều trị viêm dạ dày,
chống viêm, chống dị ứng và kháng virus.
- Tác dụng kháng viêm
Mán đỉa được coi như là một cây thuốc cổ truyền trong việc điều trị các bệnh
viêm nhiễm khác nhau. Dịch chiết metanol của Mán đỉa thể hiện tính kháng viêm
mạnh trên chuột đại thực bào dòng RAW264.7 do dịch chiết có tác dụng phong bế
yếu tố nhân hoạt hóa (NF)-κB [19] dẫn đến ức chế tiết NO và làm mất hoạt tính của

men Cyclooxydase, hạn chế sản xuất prostaglandin - là chất trung gian gây viêm.
Kết quả phân tích HPLC còn cho thấy một thành phần trong dịch chiết
metanol Mán đỉa là Quercetin có hoạt tính ức chế sản xuất prostaglandin [18].
- Tác dụng kháng virus
Trong một nghiên cứu về 21 loại thảo dược truyền thống sử dụng ở miền N am
Trung Quốc trong hoạt động chống lại virus Herpes simplex type 1 (HSV-1) đã cho
thấy dịch chiết nước của Mán đỉa có khả năng chống lại virus Herpes simplex type 1
do có chứa nhiều chất thuộc nhóm polyphenol [14]. Bên cạnh đó, dịch chiết nước của
dược liệu này cũng có khả năng ức chế virus viêm gan B vịt trong ống nghiệm [14].
Hai dẫn xuất flavan được phân lập từ dịch chiết metanol của Mán đỉa là 7-Ogalloyltricetifavan và 7,4’-di-O-galloyltricetifavan có khả năng chống lại virus hợp
bào hô hấp (RSV), virus cúm A (H1N1), virus Coxsackie B3 (Cox B3), virus
Herpes simplex type 1 (HSV-1) với các giá trị IC 50 lần lượt là 5 và 10 µg/ml, 15,7
và 30 µg/ml, 12,5 và 25 µg/ml, 30 và 20 µg/ml [14]. Ngoài ra dịch chiết Mán đỉa
còn có Quereetin cũng có khả năng chống lại virus hợp bào hô hấp [23].
- Tác dụng chống dị ứng
Dịch chiết etanol của Mán đỉa đã được chứng minh là có tác dụng chống dị ứng
do đặc điểm giàu các chất polyphenol, bên cạnh đó còn ức chế các 2,4dinitrofluorobenzene gây ra phản ứng quá mẫn chậm. Hợp chất2(-)-epigallocatechin-7gallate, 3(-)-5,7,3’,4’,5’-pentahydroxyflavan, 5(-)-tetrahydroxyflavan-7-gallate có trong
Mán đỉa đã được chứng minh có khả năng ức chế đáng kể sự giải phóng histamin và
tham gia vào quá trình chống dị ứng [15].
1.2. Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa


1.2.1. Khái niệm về chất kháng oxy hóa
Trong khoa học thực phẩm, chất kháng oxy hóa là một chất hoặc một nhóm
hợp chất có trong thực phẩm, khi hiện diện ở nồng độ thấp có khả năng làm giảm
đáng kể hoặc ngăn ngừa các tác động có hại của các loại phản ứng oxy hóa trong
chức năng sinh lý bình thường ở người [19].
Theo định nghĩa này, không phải các chất khử tham gia vào phản ứng hóa học
là chất kháng oxy hóa mà chỉ đề cập đến những hợp chất có khả năng bảo vệ các
mục tiêu sinh học chống lại quá trình oxy hóa.

1.2.2. Gốc tự do
Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử mà ở lớp ngoài
cùng còn có những electron không ghép đôi [45].
Gốc tự do có thể tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của các gốc tự do
thường rất ngắn (khoảng một phần triệu đến một phần nghìn giây). Các electron này
có năng lượng cao, rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học
như phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng trùng hợp…[45]
Về bản chất, gốc tự do có một electron độc thân. Các gốc tự do rất không ổn định
và nhạy cảm. Chúng tìm kiếm những electron khác để hình thành một cặp electron mới.
Các gốc tự do gây hại khi chúng kéo những electron từ các tế bào bình thường.
1.2.3. Các chất kháng oxy hóa
1.2.3.1. Khái niệm
Chất kháng oxy hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ
tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp [28].
Chất kháng oxy hóa có thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để
tạo ra những gốc tự do mới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phản
ứng dây chuyền được khơi mào bởi các gốc tự do [28].
Chất kháng oxy hóa cũng có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại
chuyển tiếp trong phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzyme xúc tác cho các quá
trình sinh ra gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể [28].
1.2.3.2. Cơ chế hoạt động của chất kháng oxy hóa
- Cơ chế chuyển electron:


Electron lẻ

Trao đổi
điện tử

Chất kháng oxy hóa

Gốc tự do

Hình 1.2. Cơ chế chuyển electron của chất kháng oxy hóa.
- Cơ chế chuyển hydro:

Chuyển H
+

AH

+

.

A

Chất kháng oxy hóa

Hình 1.3. Cơ chế chuyển H của chất kháng oxy hóa.
Chất kháng oxy hóa chuyển electron hoặc hydro cho gốc tự do làm cho gốc tự
do trở nên bền [46]. Khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân
tử kháng oxy hóa, các gốc tự do trở nên ổn định và không còn khả năng gây ra hại
nữa. Ngoài ra chất kháng oxy hóa còn giúp hạn chế sự phân hủy các hydroperoxide.
1.2.3.3. Một số chất kháng oxy hóa hay sử dụng
a. Axit gallic [35]
Axit gallic thuộc nhóm axit trihydroxybenzoic (là dạng axit phenolic), là một
axit hữu cơ, danh pháp là 3,4,5- trihydroxylbenzoic axit, có trong lá chè và nhiều
loại thực vật khác. Axit gallic có thể ở cả dạng tự do hay là một phần của tannin.
O

OH

HO

OH
OH


Hình 1.4. Công thức cấu tạo của axit gallic
Axit gallic là tên thông dụng trong ngành công nghiệp dược. Nó được sử
dụng làm chất chuẩn để xác định hàm lượng phenol trong một số phép phân
tích sử dụng thuốc thử Folin- Ciocalteu; kết quả phân tích được đưa ra dưới
dạng đương lượng axit gallic.
Axit gallic có tính kháng nấm và kháng khuẩn. Axit gallic hoạt động như
một chất kháng oxy hóa và giúp bảo vệ các tế bào khỏi nguy cơ bị oxy hóa.
Axit gallic cũng có khả năng kháng các tế bào ung thư mà không gây hại đến
các tế bào khỏe mạnh.
b. Curcumin

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của curcumin
Curcumin là một chất kháng gốc oxy hóa tự do mạnh. Các nghiên cứu trên thế
giới đã chứng minh curcumin ức chế sự phát sinh của nhiều tác nhân gây oxy hóa
(ROS) như: anion superoxit, H2O2, gốc nitrit, đồng thời làm giảm lượng ROS
invivo.
c. BHT (Butylated hydroxyl toluene) [48]
BHT có công thức phân tử là C15H24O, danh pháp hóa học là 2,6 – bis (1,1–
dimetyletyl)

–4–metylphenol;

2,6–di–tert–butyl–p–cresol;

2,6–di–tert–butyl–4–

metylphenol.
CH3 OH
H3C C
CH3

CH3
C CH3
CH3

CH3
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của BHT


BHT được tạo thành từ phản ứng 4–metylphenol với 2–metylpropen (xúc tác:
axit sunfuric).
BHT hoạt động tương tự như là một vitamin tổng hợp, chủ yếu ngăn chặn quá
trình oxy hóa.
RO.2

+

ArOH →

RO.2

+

ArO. → Sản phẩm không có gốc tự do

ROOH

+

ArO .

R là alkyl hoặc aryl, ArOH là nhóm phenolic của BHT hoặc có liên quan đến
chất kháng oxy hóa.
Như vậy, BHT loại trừ được hai gốc tự do peroxy. Nó là chất thuộc nhóm chất
kháng oxy hóa có hiệu quả và được sử dụng rộng rộng rãi trong các sản phẩm có
nhiều chất béo.
d. Axit L – ascorbic (Vitamin C) [47]
Axit L – ascorbic có nhiều trong thực phẩm tươi, rau quả và trái cây, đóng vai
trò hết sức quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể.
HO
O
HO

O

H
HO

OH

Hình 1.7. Công thức cấu tạo của axit L – ascorbic

Vitamin C là một chất kháng oxy hóa rất quan trọng, giúp làm lành vết
thương, tăng sức đề kháng cho cơ thể.
Vitamin C cũng có hoạt động cùng với các chất kháng oxy hóa khác và có khả
năng tăng cường hiệu lực kháng oxy hóa của vitamin E vì vitamin C phục hồi, tái
tạo vitamin E từ dạng bị oxy hóa trong cơ thể.
Tuy nhiên, trong vài trường hợp, vitamin C gây hại cho cơ thể vì nó có thể
đóng vai trò là chất tiền oxy hóa. Đặc biệt, khi ở nồng độ cao và có các ion kim loại
chuyển tiếp (Fe3+, Cu2+), vitamin C sẽ đóng vai trò là chất tiền oxy hóa xúc tác cho
phản ứng Fenton, tạo các gốc tự do HO. và H2O2.
1.2.4. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp hóa học
1.2.4.1. Đánh giá dựa vào khả năng cho electron
a. Phương pháp đánh giá qua khả năng kết hợp với Fe(II) [5]


Fe(II) ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác cho phản ứng sinh ra gốc tự do.
Khi cho Fe(II) tác dụng với thuốc thử Ferrozin sinh ra phức màu, có cực đại
hấp thụ tại bước sóng 562 nm.
Mẫu thử sẽ khóa Fe(II) vào dạng phức, không cho Fe(II) tồn tại ở dạng tự do
nên làm mất khả năng xúc tác của Fe(II).
Hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu thử sẽ được thể hiện qua việc ngăn chặn sự
tạo thành phức chất có màu của Fe(II) với thuốc thử Ferrozin.
b. Phương pháp đánh giá qua lực kháng oxy hóa tổng (Total antioxidant
capacity) theo mô hình phospho molybden [35]
Dựa trên quá trình khử Mo(VI) về Mo(V) trong môi trường axit, tạo thành
phức Mo(V) có màu xanh lá cây, độ hấp thụ quang của dung dịch sau phản ứng
được đo ở bước sóng 695 nm.
Lực kháng oxy hóa tổng được biểu diễn theo độ hấp thụ của phức tạo thành
giữa mẫu và Mo(V).
1.2.4.2. Đánh giá dựa vào khả năng cho H
a. Phương pháp đánh giá qua hàm lượng malonyldialdehyde (MDA) [40]

Đánh giá khả năng nhường H của chất kháng oxy hóa nhằm ngăn chặn quá
trình peroxy hóa lipit.
Khi không có chất kháng oxy hóa, MDA được sinh ra trong quá trình peroxy
hóa lipit phản ứng với axit thiobarbituric tạo phức màu hồng, hấp thụ cực đại ở
bước sóng 532 nm trong môi trường pH = 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100 0C trong vòng 10
đến 15 phút.
Khi có chất kháng oxy hóa thì quá trình peroxy hóa lipit bị ngăn chặn, lượng
MDA tạo thành giảm dẫn đến cường độ màu của phức giảm.
b. Phương pháp sử dụng DPPH (1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl)
DPPH là chất tạo ra gốc tự do, được dùng trong trắc quang đo cường độ màu
để sàng lọc tác dụng kháng oxy hóa của các chất nghiên cứu.
Chất kháng oxy hóa nhường H cho gốc DPPH, khả năng kháng oxy hóa thể
hiện qua việc làm giảm cường độ màu, được đo ở bước sóng 517 nm.


Hình 1.8. Phản ứng cho H vào gốc DPPH
c. Phương pháp đánh giá qua khả năng kháng oxy hóa theo mô hình ORAC
(Oxygen radical absorbance capacity) [5]
Đánh giá khả năng nhường H của chất kháng oxy hóa cho gốc tự do peroxyl
được tạo thành từ AAPH (2,2’–azo–bis(2–amindinopropan) dihydrochloride) trong
môi trường pH = 7,4.
Khi không có chất kháng oxy hóa, gốc tự do peroxyl hình thành kết hợp với
fluorescein làm giảm cường độ phát huỳnh quang. Chất kháng oxy hóa có khả năng
tác dụng với gốc tự do peroxyl mạnh hơn fluorescein, vì vậy, cường độ phát huỳnh
quang thay đổi.

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Phần trên mặt đất của cây Mán đỉa được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh

thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, xác
định tên khoa học là Archidendron clypearia (Jack) I. Niels.
Mẫu được thu hái tại huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng 6/2013. Sau
khi thu mẫu, nguyên liệu được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50 – 60 0C, sau đó


xay thành bột thô và bảo quản nơi khô thoáng.

Hình 2.1. Hình ảnh cây Mán đỉa
2.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Mán đỉa Archidendron clypearia
(Jack) I. Niels thu thập theo định hướng kháng oxy hóa bảo vệ gan.
2.3. Cách tiếp cận và nội dung nghiên cứu
2.3.1. Cách tiếp cận
- Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của cao toàn phần, các cao phân đoạn
và chất phân lập được từ cây Mán đỉa Archidendron clypearia (Jack) I. Niels.
- Từ phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa tốt, tiến hành phân lập các cấu tử
và xác định công thức cấu tạo của các cấu tử phân lập được.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
- Chiết xuất cao toàn phần metanol và các cao phân đoạn có độ phân cực tăng
dần.
- Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao toàn phần và các cao phân đoạn
+ Sàng lọc in vitro hoạt tính kháng oxy hóa bảo vệ gan của cao toàn phần và
các cao phân đoạn


+ Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp lực kháng oxy hóa
khử Mo(VI) về Mo(V)
+ Đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tựu do DPPH
- Phân lập và xác định công thức hóa học của một số cấu tử đã phân lập.

2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu, nguyên liệu và mẫu động vật thí nghiệm
2.4.1. Hóa chất và thiết bị
2.4.1.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn
DĐVN IV [6]. Dung môi sử dụng: metanol, n-hexan, clorofom, n-butanol, etyl axetat,
axeton, nước cất, DPPH (2,2 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl), axit formic, axit axetic…
Thuốc thử: dung dịch axit sunfuric 10%, dung dịch ammoniac đậm đặc, …
Chất nhồi cột sắc ký: silicagel pha thường (Silicagel 60 0,040-0,063mm (230
– 400 mesh ASTM), Merck), pha đảo (YMC, 30 - 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.),
Sephadex LH - 20 và Dianion HP – 20, sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC –
Silicagel 60 F254 Merck), pha đảo (RP18 Merck).
2.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204-S, độ chính xác 0,0001g. Máy đo
phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT – NMR, máy đo phổ UV
Jacob. Micropipette 100, 200, 500 µL (Human), micropipette 50 µL (Excel
monopette 8000). Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, pipet, đũa thủy tinh, cốc có mỏ
thể tích khác nhau, bình tam giác thể tích khác nhau, bình cầu hai cổ nhám, ống sinh
hàn, bình gạn, bình chạy sắc ký. Bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato,
bình chiết, máy lọc hút chân không.
2.4.2. Nguyên liệu và mẫu động vật thí nghiệm
Phần trên mặt đất của cây Mán đỉa được lấy ở huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị.
Nguyên liệu cây Mán đỉa (Archidendron clypearia) được các cán bộ của Viện Sinh
thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác
nhận tên khoa học. Sau khi rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, sấy khô ở 50 0C, xay
thành bột nguyên liệu.
Chuột nhắt trắng, khoẻ mạnh khoảng 8 tuẩn tuổi, nặng 25-30 gam được nuôi
ở khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam bằng thức ăn và nước uống tiêu chuẩn.

2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
2.5.1.1. Lấy mẫu
- Mẫu được thu hái tại huyện Đăkrông, tỉnh Quảng Trị
- Bộ phận sử dụng: phần trên mặt đất của cây Mán đĩa (lá và cành)
2.5.1.2. Định danh
- Thu mẫu có đầy đủ các bộ phận cần thiết như cành, lá, hoa, quả.
- Làm tiêu bản mẫu khô, sử dụng để phục vụ công tác xác định tên khoa học.
- Xác định tên khoa học dựa trên phân tích hình thái thực vật, đối chiếu
với các tài liệu phân loại thực vật.
Nội dung này do TS. Nguyễn Thế Cường chuyên ngành thực vật học của Viện
Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam thực hiện.
2.5.1.3. Xử lý mẫu
Sau khi thu hái, mẫu nguyên liệu được làm sạch, phơi khô tự nhiên, sấy ở 60
0

C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản nơi khô thoáng.

2.5.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng oxy hóa bảo
vệ gan in vitro [16], [33]
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào gan. Gây chết chuột
bằng etanol 800, sau đó sử dụng panh, kéo mổ chuột, tách lấy gan. Gan chuột sau
khi tách được rửa bằng PBS (Phosphate Buffered Saline) có 10% kháng sinh PSF
(Penicillin-Streptomicin-Fungizone) (Invitrogen), sau đó dùng panh, kéo, kim tiêm
gạt, tách tế bào gan trong PBS. Thu dịch có tế bào gan, ly tâm, loại bỏ dịch nổi. Cao
tế bào được hoà trong NH4Cl để phá vỡ hồng cầu. Sau khi ly tâm, các tế bào thu
được hòa lại vào môi trường MEME có 10% FBS (Fetal Bovine Serum) và các
thành phần cần thiết khác. Sau khi được phân lập, tế bào gan sẽ được đưa vào đĩa
thí nghiệm 96 giếng với mật độ 1 x 104 tế bào/giếng để nuôi qua đêm trong tủ ấm

5% CO2, ở 37 0C. Tế bào sau đó sẽ được ủ hoạt chất ở các nồng độ khác nhau trong


2 h. Tiếp theo, 100 µM H2O2 sẽ được đưa vào mỗi giếng và để tác động trong 2 h.
Để xác định số tế bào gan sống sót sau tác động của H 2O2 cũng như tác dụng bảo vệ
của hoạt chất nghiên cứu, MTT nồng độ 1 mg/mL (50 µL/giếng) sẽ được đưa vào
các giếng và ủ tiếp trong 4 h ở 37 0C. Loại bỏ toàn bộ dịch nổi và đưa vào mỗi
giếng 100 µL/giếng DMSO 100% và đo mật độ quang học của chất formazan tạo
thành bằng máy Microplate Reader ở 492 nm. Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần
để tránh sai số.

[OD(chất thử) - OD(H2O2)] x 100

tế bào gan sống sót (%) =
Trong đó:

OD(Tế bào) - OD(H2O2)

OD(chất thử) là giá trị mật độ quang đo ở giếng có chất mẫu cần kiểm tra hoạt tính
OD(H2O2) là giá trị mật độ quang đo ở giếng đối chứng âm, gây chết tế bào bằng H2O2
OD(tế bào) là giá trị mật độ quang đo ở giếng mà tế bào hoàn toàn khỏe mạnh, không
bị gây chết bằng H2O2
Giá trị ED50 (nồng độ bảo vệ được 50% đối với sự sống sót của tế bào), được
xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve.
Nội dung này được các cán bộ Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam thực hiện.
2.5.3. Phương pháp đánh giá lực kháng oxy hoá tổng (Total antioxidant
capacity) in vitro theo mô hình phospho molybden [35]
Lực kháng oxy hoá tổng của các mẫu khảo sát được nghiên cứu thông qua
mô hình phospho molybdenum. Lấy 0,3 mL dịch chiết, thêm vào 3 mL dung dịch

thuốc thử (nồng độ 0,6 M H2SO4, 28 mM NaH2PO4 và 4 mM (NH4)2MoO4 trong
nước cất), đậy kín và ủ 95 0C trong 90 phút. Sau đó, mẫu được làm lạnh về nhiệt độ
phòng. Độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng được đo ở bước sóng 695 nm.
Trong mẫu trắng, dung dịch cần phân tích được thay bằng nước cất. Lực kháng oxy
hoá tổng được biểu diễn theo độ hấp thụ quang của mẫu. Curcumin được sử dụng
làm chất so sánh.
Tiến hành thí nghiệm với chất chuẩn curcumin trong cùng điều kiện, theo quy
trình trên: thay 0,3mL mẫu khảo sát bằng 0,3mL chất chuẩn cùng nồng độ, thể tích


3 mL dd thuốc thử

0,3 mL mẫu

Hỗn hợp 1
Đậy kín và ủ 95 0C trong 90 phút
Làm lạnh về nhiệt độ phòng
Hỗn hợp 2
Đo quang λ = 695 nm
Mật độ quang A
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình đánh giá lực kháng oxy hóa tổng cộng theo mô hình phospho molybden

thuốc thử, phương pháp lên màu, tiến hành đo quang như sơ đồ trên, rồi lấy kết quả
mật độ quang và so sánh với kết quả của mật độ quang mẫu khảo sát.
2.5.4. Phương pháp đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH in vitro [5]
Pha dung dịch DPPH nồng độ 100 µM trong metanol ngay trước khi dùng.
Hỗn hợp phản ứng 3000 µL, gồm hai thành phần: 1500 µL mẫu khảo sát pha loãng
lần lượt thành các nồng độ 100 µg/mL, 20 µg/mL, 4 µg/mL, 0,8 µg/mL và 1500 µL
DPPH, pha thành nồng độ 100 µM. Các hỗn hợp phản ứng được lắc trong 1 phút và
ủ trong bóng tối khoảng 30 phút ở 30 0C), rồi tiến hành đo quang ở bước sóng 517

nm. Mẫu trắng được tiến hành tương tự nhưng thay 1500 µL mẫu khảo sát bằng
1500 µL metanol.

SA DPPH (%) = [(Ac –As)/Ac] x 100

Trong đó:
SA DPPH (%): tác dụng bắt gốc tự do (Scavenging Activity) của DPPH
As : mật độ quang của mẫu khảo sát
Ac: mật độ quang của mẫu trắng
Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh sai số. Tác dụng bắt gốc tự do
được đánh giá qua giá trị IC50.
2.5.5. Phương pháp chiết xuất, phân lập các hợp chất
2.5.5.1. Phương pháp chiết xuất
a. Chiết xuất cao toàn phần bằng phương pháp chiết rắn – lỏng


Dược liệu sau khi đã xử lý thích hợp được chiết với metanol tuyệt đối bằng
pháp ngâm lạnh trong 3 lần, mỗi lần 48 giờ. Gộp dịch chiết metanol và cất thu hồi
hết dung môi dưới áp suất giảm thu được cao toàn phần.
b. Chiết xuất các cao phân đoạn bằng phương pháp chiết phân đoạn lỏng – lỏng
Phương pháp chiết lỏng - lỏng thực hiện trong phễu chiết. Cao đặc thu được từ
dịch chiết của dược liệu được phân tán vào nước, sau đó lần lượt lắc với các dung
môi hữu cơ không tan trong nước với độ phân cực tăng dần để tiến hành phân tách
các nhóm chất có tính phân cực khác nhau khỏi pha nước [14].
c. Rửa giải các chất bằng phương pháp chiết pha rắn
Chiết pha rắn được tiến hành trên cột sắc ký thủy tinh có kích cỡ khác nhau
tùy thuộc vào lượng mẫu đem chiết.
Pha tĩnh đươc sử dụng là silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 - 0,063 mm
(230-400 mesh ASTM), Merck). Cao đặc của dược liệu được tẩm với lượng vừa đủ
silicagel rồi thực hiện cất loại dung môi cho đến khi được bột khô tơi. Lượng bột

khô này được đưa lên cột sắc ký, sau đó rửa giải bằng các hệ dung môi được lựa
chọn có độ phân cực tăng dần [14].
2.5.5.2. Phương pháp phân lập
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột, chủ yếu là sắc ký cột hấp
phụ và sắc ký cột lọc qua gel, sử dụng phương pháp nhồi cột ướt. Theo dõi quá
trình rửa giải bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
a. Sắc ký cột hấp phụ
Chất nhồi cột là silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 - 0,063mm (230-400
mesh ASTM), Merck), silicagel pha đảo YMC (silicagel 30-50 µm, FuJisilisa
Chemical Ltd.).
Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử
trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn: pha thứ nhất là chất hấp phụ đóng vai trò
pha tĩnh được nhồi trong cột thủy tinh, pha thứ hai là dung môi rửa giải cột, đóng
vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ dạng bột mịn. Đối với mỗi chất riêng biệt
trong pha hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó
với dung môi rửa giải cột để lấy ra lần lượt trước hoặc sau. Có thể khai triển dung