quy trình nuôi cấy vi tảo

Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

lời cảm ơn.
Thời gian qua, tôi đã thực hiện và hoàn thành đồ án tốt
nghiệp này tại Phòng Quang Sinh, Viện Công Nghệ Sinh Học,
Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia . Tôi xin
bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TSKH Trần Văn Nhị và ...đã
tận tình hớng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị cán bộ làm việc tại Phòng

Quang Sinh, Viện Công Nghệ Sinh Học, Trung Tâm Khoa Học
Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia cùng toàn thể các thầy cô giáo
trong Viện Công Nghệ Sinh Học, Trờng Đại Học Bách Khoa Hà
Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn tới gia đình và toàn thể các bạn đã
quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Kính chúc các thầy cô cùng các bạn sức khoẻ và hạnh phúc!

Nguyễn Văn Nho

Mục lục.

Trang

mở đầu..............................................................................................
Chơng i tổng quan tài liệu....................................................
I.1. Một số đặc điểm sinh học vi tảo........................................

I.1.1. Phân loại.................................................................................
I.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc..................................................
I.1.3. Hình thức sinh sản..................................................................

I.1.4. Dinh dỡng vi tảo...................................................................
I.1.4.1. Dinh dỡng Cacbon...............................................................
I.1.4.2. Dinh dỡng Nitơ....................................................................
I.1.4.3. Dinh dỡng Phospho............................................................
I.1.4.4. Dinh dỡng vi lợng.............................................................
I.1.4.5. Các vitamin,chất kích thích sinh trởng................................
I.2. Một số đặc tính sinh lí của vi tảo......................................
1


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

I.2.1. ánh sáng.................................................................................
I.2.2. Nhiệt độ.....................................................................................
I.2.3. Độ mặn......................................................................................
I.2.4. pH. ............................................................................................
I.3. Khả năng ứng dụng của vi tảo trong chăn nuôi thuỷ
sản..............................................................................................................
I.3.1 Lịch sử quá trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng vi tảo
làm thức ăn cho con giống động vật biển trên thế giới và ở Việt
Nam...................................................................................................
I.3.2. Giá trị dinh dơng của tảo đơn bào sử dụng trong nuôi trồng
thuỷ sản.................................................................................
I.3.3. Vai trò của VI tảo trong tự nhiên và trong chăn nuôi thuỷ
sản..................................................................................................
I.3.4. Yêu cầu của vi tảo trong việc sử dụng làm thức ăn chăn
nuôi giống động vật biển............................................................
I.3.5. Các lớp, chi vi tảo thờng sử dụng làm thức ăn cho con
giống động vật biển. ...................................................................
I.3.6. các phơng pháp nuôi thu sinh khối vi tảo......................

chơng 2 đối tợng và CáC phơng pháp nghiên cứu.

Ii.1. Đối tợng nghiên cứu...........................................................
II.1.1. Một số đặc điểm của đối ttợng nghiên cứu......................
II.1.2. Thành phần hoá học
II.1.3. Sinh trởng và phát triển......................................................
II.1.4. ứng dựng của vi tảo Nannochloropsis................................
II.2. Các phơng pháp nghiên cứu.............................................
II.2.1. Các phơng pháp phân lập vi tảo.......................................
II.2.2. Làm sạch vi tảo.....................................................................
II.2.3. Bảo quản giống tảo..............................................................
II.2.4. Các phơng pháp đánh giá sinh trởng tế bào vi tảo.......
II.2.5. Phơng pháp đo cờng độ quang hợp..............................
II.3. Dụng cụ, thiết bị, hoá chất sử dụng trong nghiên
cứu.......................................................................................................
II.3.1. Dụng cụ, thiết bị....................................................................
II.3.2. Môi trờng, hoá chất

chơng iii kết qủa và bàn luận..

III.1. Nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm.
III.1.1. Phân lập lại và bảo quản giống.
III.1.2. Nhân giống sơ cấp
III.1.3. Nhân giống thứ cấp..
III.1.4. Nghiên cứu ảnh hởng của các yếu tố môi trờng. .
III.1.4.1. Xác định phơng pháp khử trùng phù hợp với điều kiện
nuôi vi tảo trong thí nghiệm cũng nh khi ứng dụng vào sản
xuất.
III.1.4.2. Cải tiến môi trờng Walne..

III.1.4.3. Xác định ảnh hởng của nồng độ muối
III.1.4.4. Nghiên cứu ảnh hởng của môi trờng nuôi bằng nớc biển
nhân tạo và bán nhân tạo tới sự phát triển của vi tảo.
III.1.4.5. Nghiên cứu ảnh hởng của ánh sáng...
III.1.4.6. Nghiên cứu ảnh hởng của nhiệt độ.
III.1.4.7. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính quang hợp vi tảo...
iii.2. Nghiên cứu trong điều kiện tự nhiên
III.2.1. Tìm kiếm môi trờng phân bón thích hợp nuôi sinh khối vi
tảo..

2


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

III.2.1.1. Sử dụng phân bón N,P làm nguồn thức ăn nuôi sinh khối
vi tảo..
III.2.1.2. Bổ sung ure vào môi trờng phân bón..
III.2.1.3. Bổ sung môi trờng giàu axit amin vào môi trờng phân
bón
III.2.2. Nhân giống thứ cấp và thử nghiệm nuôI sinh khối trong
điều kiện tự nhiên..
III.3. triển khai áp dụng thực tiễn.
Chơng 5 kết luận và kiến nghị..
Tài liệu tham khảo..

mở ĐầU.
I.1.TíNH CấP THIếT CủA Đề TàI.
Nớc ta có đặc điểm là có bờ biển trải dài 3260 km, có hệ thống ao hồ
và kênh rạch chằng chịt, lại có thuận lợi về khí hậu nên có tiềm năng lớn

trong ngành nuôi trồng thuỷ sản. Hiện nay ngành thuỷ sản nớc ta đang
ngày càng đợc phát triển và mở rộng. Trong thuỷ sản cần đặt ra 3 vấn đề
đó là: con giống, thức ăn và bệnh của thuỷ sản. Trong vấn đề thức ăn lại
bao gồm thức ăn cho động vật nuôi và thức ăn cho con giống. Thức ăn
của con giống trong tự nhiên chủ yếu là thức ăn tơi sống nh : vi tảo, động
vật phù du,...Trên thế giới, nhiều nớc đã nghiên cứu và sử dụng chủ yếu
là nguồn thức ăn tơi sống cho con giống động vật biển. ở nớc ta cũng có
một số cơ sở thuỷ sản đã chủ động về giống cũng nh thức ăn tơi sống
cho con giống nhng chủ yếu là ở một số tỉnh phía Nam còn ở miền Bắc
thì còn hạn chế, chủ yếu sử dụng thức ăn cho con giống là các loại thức
ăn tổng hợp, bột tảo nghiền. Việc sử dụng thức ăn tổng hợp và bột tảo
nghiền có kích thớc không đồng đều và thờng không phù hợp với miệng
của ấu thể nên ấu thể khó sử dụng, đồng thời các chất d thừa, các chất
tan của thức ăn tổng hợp dễ dàng làm ô nhiễm môi trờng nuôi. Thức ăn
tổng hợp không thể cung cấp đầy đủ các dỡng chất cần thiết cho sự phát
triển của ấu thể. Trong khi đó việc cung cấp thức ăn tơi sống vừa đảm
bảo giảm thiểu đợc sự ô nhiễm môi trờng vừa cung cấp đợc những hoạt
chất sinh học tối cần cho ấu thể , nâng cao khả năng chống chịu bệnh
của ấu thể do đó làm nâng cao tỷ lệ sống và chất lợng của con giống.
Việc nghiên cứu và ứng dụng vi tảo làm thức ăn tơi sống cho con giống
động vật biển ở miền Bắc nớc ta còn nhiều hạn chế, các kĩ thuật nuôi còn
cha ổn định, gặp nhiều khó khăn khi thời tiết khí hậu thay đổi.
Vì vậy chúng tôi xây dựng đề tài :Nghiên cứu xây dựng kĩ thuật
nuôi trồng vi tảo làm thức ăn cho con giống động vật biển.
Với các mục tiêu: Xây dựng đợc quy trình công nghệ sản xuất vi tảo
làm thức ăn cho con giống động vật biển và áp dụng vào thực tiễn.

I.2.nội dung của đề tài .
Đề tài có các nội dung sau:
* Nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm:

3


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

-Làm sạch lại và bảo quản giống thuần chủng.
- Nhân giống sơ cấp, thứ cấp trong điều kiện nuôi cấy phòng thí
nghiệm.
-Nghiên cứu ảnh hởng của các điều kiện ngoại cảnh tới sự sinh trởng và
phát triển của vi tảo.
* Nghiên cứu trong điều kiện tự nhiên:
-Tìm kiếm môi trờng phân bón thích hợp cho nuôi sinh khối vi tảo.
-Nhân giống thứ cấp và thử nghiệm nuôi sinh khối vi tảo trong điều kiện
tự nhiên.
-Triển khai áp dụng vào thực tế.

Phần 1 tổng quan tài liệu.
I.1. Một số đặc điểm sinh học vi tảo.
Tảo là những thực vật bậc thấp, có tản (cơ thể không thân rễ lá) ,Tế
bào chứa diệp lục tố và sống chủ yếu trong nớc. Tảo chiếm 1/3 sinh khối
trên trái đất. Hiện nay tảo đợc xác nhận là tập hợp một số ngành thực vật
đơn bào, độc lập về nguồn gốc tiến hoá.
I.1.1.Phân loại.
là:

Căn cứ vào màu sắc ngời ta phân chia tảo thành 10 ngành khác nhau
tảo lam (Cyanophyta).
tảo giáp (Pyrrophyta).

4


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

tảo vàng ánh (Chrysophyta).
tảo silic (Bacillariophyta).
tảo vàng (Xanthophyta)
tảo nâu (Phaeophyta).
tảo đỏ (Rhodophyta).
tảo mắt (Euglenophyta).
tảo lục (Chlorophyta).
tảo vòng (Charophyta).
Ngoài ra ngời ta còn căn cứ vào sự có mặt của các chất dự trữ, thành
phần vỏ, cấu tạo tự nhiên, cấu trúc gen của các tế bào để làm chỉ tiêu
phân loại. Một số tác giả xếp tảo lam và vi khuẩn vào cùng nhóm sinh vật
tiền nhân (Procariota), do tảo lam cha có nhân điển hình và khá gần với
cấu trúc vi khuẩn.
I.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc.
Vi tảo có cấu trúc hết sức đa dạng, bao gồm những dạng đơn bào, đa
bào hoặc tập đoàn với kích thớc và cấu tạo khác nhau. Có thể bắt gặp
những cấu trúc sau:
- Cấu trúc momat: Tế bào có roi. Có thể là đơn bào hay tập đoàn.
- Cấu trúc palmella: Là sự liên kết của một số tế bào trong một
bao nhầy chung, không có sự phụ thuộc giữa tế bào này với tế bào
khác.
- Cấu trúc hạt: Bao gồm các tế bào không chuyển động, có hình
dạng khác nhau. Có thể đơn độc hoặc hoặc liên kết thành tập đoàn
nhng không ở dạng sợi.
- Cấu trúc sợi: Các tế bào liên kết thành sợi, phân nhánh hoặc

không phân nhánh, không có khả năng chuyển động
- Cấu trúc dạng bản: Tảo có dạng bản lá rộng hoặc hẹp.
- Cấu trúc ống(Siphon): Thờng gặp ở các loài tảo có kích thớc rất
lớn.
I.1.3. Hình thức sinh sản.
Nhìn chung vi tảo có ba phơng thức sinh sản là: Sinh dỡng, vô tính và
hữu tính.
-Sinh sản sinh dỡng: Thực hiện bằng cách phân chia tế bào hoặc các
tập đoàn phân chia thành các tập đoàn mới. Các vi tảo đơn bào thờng sinh
sản theo hình thức này.
-Sinh sản vô tính: Là hình thức sinh sản phổ biến ở tảo đợc thực hiện
bằng sự hình thành các bào tử chuyên hóa. Đa số tảo có các bào tử có khả
năng chuyển động và đợc gọi là động bào tử.
-Sinh sản hữu tính: Đợc thực hiện bằng những tế bào chuyên hóa gọi
là giao tử và kèm theo quá trình sinh sản hữu tính.
I.1.4. Dinh dỡng vi tảo.
Về dinh dỡng, vi tảo đợc phân thành hai loại chính : tự dỡng
(autotrophy) và dị dỡng (heterotrophy), dạng trung gian của hai hình thức
trên là tạp dỡng (mixotrophy).ở dạng tạp dỡng quang hợp vẫn là quá trình
cơ bản. Ngoài ra ở tảo còn tồn tại dạng khuyết dỡng (auxotrophy): để sinh trởng bình thờng, tế bào tảo cần có một lợng rất nhỏ các chất hữu cơ quan
5


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

trọng nh vitamin. Các môi trờng dinh dỡng dùng cho nuôi trồng tảo phải dựa
trên nhu cầu dinh dỡng của từng loài. Mặc dù vậy việc xác định chính xác
nồng độ của từng yếu tố dinh dỡng cho một loài nào đó là rất khó khăn vì
nồng độ dinh dỡng phụ thuộc rất nhiều vào mật độ quần thể, ánh sáng, nhiệt
độ và pH môi trờng.

I.1.4.1. Dinh dỡng Cacbon.
Đa số vi tảo sử dụng nguồn cacbon vô cơ trong môi trờng nớc, có thể
tồn tại ở các dạng: H2CO3, CO2,, HCO3- , CO32- phụ thuộc vào giá trị pH.
Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng CO2 là dạng duy nhất đợc tảo trực tiếp sử
dụng trong quá trình quang hợp. Cacbon dới dạng HCO3- xâm nhập vào tế
bào tảo nhờ vận chuyển tích cực hoặc nhờ tác động của enzym
cacbonhydrase (CA) phân hủy HCO3- thành CO2 và nớc theo các phản ứng
thuận nghịch sau:
CO2 + H2O

H2CO3

H+ + HCO3-

Nguồn cacbon vô cơ đóng vai trò quan trọng trong nuôi sinh khối tảo
bằng phơng pháp tự dỡng quang năng vì cacbon vô cơ là nguồn nguyên liệu
đầu cho quá trình quang hợp.
Một số vi tảo có khả năng đồng hóa nguồn cacbon hữu cơ dới dạng
axetat, đờng saccarose, glucose... Do đó để nuôi thu sinh khối vi tảo ngời ta
cũng có thể sử dụng phơng pháp dị dỡng.
Các vi tảo tự dỡng quang năng đợc coi là các thực vật bậc thấp chứa
diệp lục, vi tảo thực hiện quá trình quang hợp nh ở thực vật bậc cao. Hoạt
động đầu tiên của quá trình quang hợp là quá trình hấp thu ánh sáng. Trong
tổng số bức xạ điện từ đến đợc thực vật quang hợp chỉ có ánh sáng nhìn
thấy (bớc sóng 400-720 nm) là đợc hấp thụ và sử dụng cho quang hợp. Tảo
chứa 3 sắc tố chính:
Chlorophyll hấp thụ ánh sáng lam và đỏ.
Carotenoit hấp thụ ánh sáng lam và lục.
Phycobilin hấp thụ ánh sáng lục và da cam.
Đa số các sắc tố nằm trong cả hai hệ quang hoá là PSI và PSII nhng

với tỷ lệ khác nhau. Ví dụ: PSII của tảo lục có tỷ lệ chlorophyll a trên
chlorophyll b thấp hơn ở PSI, còn ở tảo có phycobilin thì đa số các sắc tố
này tập trung trong PSII.
I.1.4.2. Dinh dỡng Nitơ.
Nitơ chiếm từ 1- 10% trọng lợng chất khô tế bào tảo. Hầu hết các loài
tảo có khả năng sử dụng nitơ vô cơ dới dạng : NO3- , NH4+ , một số vi tảo
procaryote lại có khả năng cố định nitơ dạng khí trời. Nếu sử dụng NH 4+ làm
nguồn nitơ duy nhất thì pH môi trờng sẽ giảm nhanh gây tác động tiêu cực
tới sự phát triển của vi tảo. Một số loài vi tảo có khả năng sử dụng các nguồn
nitơ hữu cơ nh: axit amin, ure, amid, asparagin
I.1.4.3. Dinh dỡng Phospho.
Photpho là một trong những nguyên tố quan trọng trong thành phần
của vi tảo.Nó có vai trò chính trong các quá trình xảy ra ở tế bào, đặc biệt
quá trình truyền năng lợng và tổng hợp axit nucleic. Tảo sử dụng photpho vô
cơ là chủ yếu. Khi nồng độ phospho hữu cơ trong môi trờng vợt quá lợng

6


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

Phospho vô cơ thì phospho hữu cơ thờng đợc phân huỷ bởi các enzim ngoại
bào nh phosphoesterase,phosphatase để chuyển sang dạng phospho vô cơ
dễ tiêu.
Việc hấp thu phospho ở vi tảo dợc kích thích bởi nồng độ phospho
trong môi trờng, ánh sáng, pH, Na+, K+ , Mg2+ .
Phospho đóng vai trò trong việc chuyển hoá orthophosphate sang
dạng phân tử năng lợng cao năng ATP theo 1 trong 3 con đờng : phosphorin
hoá cơ chất , phosphoryl hoá oxi hoá, phosphoryl hoá quang hoá.
Phản ứng tổng quát :

ADP + Pi + năng lợng
ATP .
I.1.4.4. Dinh dỡng vi lợng.
Các nguyên tố vi lợng đợc coi là không thay thế đối với sự sinh trởng
của vi tảo là : Fe , Mn, Cu, Zn, Mo, Cl.
Các nguyên tố vi lợng quan trọng khác khác:Co, B, V, Si, Iod.
Fe tham gia quá trình đồng hoá Nitơ vì ferredoxin là chất cho điện tử
trong hoạt động cuả nitratereductase và nitritereductase
Fe tác động đến quá trình sinh tổng hợp Chlorophyl a, C-phycocyamin
và cytocrom trong hệ quang hợp.
Mn, Cu quan trọng trong hệ truyền điện tử quang hợp, là các cofactor
của enzim.
I.1.4.5. Các vitamin,chất kích thích sinh trởng.
Vi tảo có nhu cầu về vitamin và các chất kích thích sinh trởng. Một số
loài vi tảo có khả năng tự tổng hợp vitamin và các chất kích thích sinh trởng
có thể nội bào hoặc ngoại bào.
I.2. Một số đặc tính sinh lí của vi tảo.
I.2.1. ánh sáng.
Vi tảo phát triển tốt trong phổ ánh sáng trắng (400-720nm), vùng ánh
sáng nhìn thấy. Sinh trởng của tảo bị ức chế dới điều kiện chiếu sáng mạnh
gọi là hiện tợng quang ức chế. Hiện tợng quang ức chế có thể làm tảo chết
hoặc làm giảm đáng kể năng suất nuôi trồng. Một số vi tảo bị ức chế mạnh
trong điều kiện nuôi trồng ngoài trời, cờng độ ánh sáng lớn và lợng oxi hoà
tan nhiều. Vi tảo có khả năng thích ứng với điều kiện sáng tối bằng sự tổng
hợp phycobiliprotein và carotenoit. Ngời ta phát hiện thấy ở vi tảo có hai cơ
chế phản ứng thích nghi với ánh sáng :
-Giảm hàm lợng chlorophyll a trong điều kiện ánh sáng cao nh ở tảo
chlorella.
-Giảm nồng độ của các enzim tham gia quá trình quang hợp khi cờng
độ ánh sáng cao nh ở tảo Cyclotella.

ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hởng đến
vận động của hầu hết các loại tảo có khả năng vận động.
I.2.2. Nhiệt độ.
chế :

ảnh hởng của yếu tố nghiệt độ có thể đợc giải thích thông qua hai cơ
- Nhiệt độ tác động lên cấu trúc tế bào.
- Nhiệt độ ảnh hởng lên tốc độ phản ứng trao đổi chất.

7


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

Chính vì vậy việc chọn chủng có khả năng chịu nhiệt trong sản xuất là
rất quan trọng. Mặt khác nhiệt độ thấp cũng ảnh hởng xấu đến sự phát triển
của vi tảo.
I.2.3. Độ mặn.
Nồng độ NaCl cao không chỉ ảnh hởng đến cơ chế điều hoà áp suất
thẩm thấu mà còn ảnh hởng trục tiếp tới hoạt tính quang hợp và hô hấp của
tế bào vi tảo. Một số loài có khả năng chịu đợc nồng độ muối thấp, vài mM .
Trong khi một số khác lại có khả năng chịu đợc nồng độ muối cao, đó là do
chúng có các cơ chế thích nghi nh sinh Glyxerol, sucrose, prolin, hoặc tích
luỹ beta- caroten để điều hoà áp suất thẩm thấu, duy trì cân bằng nội môi.
I.2.4. pH.
Mỗi loài vi tảo lại sinh trởng tối u trong môi trờng có dải pH nhất định.
Giá trị pH ảnh hởng tới:
- Khả năng phân ly muối và các phức chất. Nh vậy pH là yếu tố gián
tiếp ảnh hởng tới sinh trởng của vi tảo.
- pH ảnh hởng tới tính hoà tan của các muối kim loại.

ở điều kiện pH cao hay thấp đều ức chế sinh trởng của vi tảo. PH phải
đợc điều chỉnh tới già trị tối u cho từng loài vi tảo nhng phải đảm bảo hạn
chế đợc sự thất thoát cacbon. Điều này đợc thực hiện bằng cách bổ sung
vào môi trờng CO2 hoặc NaHCO3 .
Khi amon đợc sử dụng nh là một nguồn Nitơ duy nhất cho vi tảo thì
môi trờng nuôi nhanh sẽ giảm nhanh độ pH, gây ra các hiệu ứng phụ, gây
ảnh hởng tới sinh trởng của tảo.
I.3. Khả năng ứng dụng của vi tảo trong chăn nuôi thuỷ
sản.
I.3.1 Lịch sử quá trình nghiên cứu, tình hình sản xuất và ứng
dụng vi tảo làm thức ăn cho con giống động vật biển trên thế giới
và ở Việt Nam.
Việc nghiên cứu nuôi tảo làm thức ăn tơi sống cho động vật thuỷ sản
nói chung đợc bắt đầu từ nhiều thập kỉ trớc (Watanabe & CTV,1994). Và từ
khi các nhà khoa học nghiên cứu và phát hiện ra tảo là nguồn dinh dỡng quy
giá cần thiết cho sự phát triển của ấu thể thì công nghệ nuôi con giống động
vật biển mới bắt đầu hình thành và phát triển.
Năm 1910 Allen và Nelson đã dùng tảo Silic làm thức ăn cho 1 số loài
động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Năm 1939 Bruce và Cộng sự đã phân lập
và nuôi tảo đơn bào Isochrysis galvana và Pyraminonas grossii để nuôi ấu
trùng hàu. Năm 1969, Liao & CTV đã sử dụng thành công tảo Skeletonema
costatum làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú.Từ đó một số loài tảo khác cũng
đợc sử dụng làm thức ăn nuôi ấu trùng động vật giáp xác, cá bột, ấu trùng,
con giống, và cả con trởng thành động vật thân mềm,các loại động vật phù
du (Zooplankton) nh luân trùng, copepod, artemia, rotifer, và những động vật
phù du này lại đợc sử dụng làm thức ăn cho con giống động vật biển ở các
giai đoạn khác nhau (Yufera và Lubian, 1990; Okauchi,1991; Liao & CTV,
1993; Reintan & CTV, 1993).
8

Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

Các loài tảo đơn bào nh: Platymonas sp, Chaetoceros muelleri,
Chlorella sp, Isochrysis galbana, Nannochloropsis sp, Thalassiosira sp,
Amphiprora sp đợc sử dụng trong sản xuất giống nhân tạo điệp
Pectinopecten yesssensis (Khang Hu,Cheng & CTV, 1982), Chlamys nobilis
(Toma, Teruya & Oshira, 1983); Nghêu Meretrix lusoria (Chen, 1984),
Meretrix meretrix (Kalyanasundaram, Ramamoorthi, 1987); Nghêu tím
Hiatula diphos (Lai, 1984); Tapes variegata; sò Manila (Yen,1985),Sò huyết
Anadara granosa (Tsai, 1986).
Tại Việt Nam, Nhật Bản,Thái Lan,Malaixia,Đài Loan đã dùng tảo
Silic skeletonema costatum và Chaetoceros sp làm thức ăn nuôi ấu thể tôm
giống đặc biệt ở giai đoạn 2 của sự phát triển của ấu thể (Zoea) sử dụng
100% thức ăn là vi tảo.
Hiện nay nhiều cơ sở nuôi tôm giống ở nớc ta đã tự tiến hành nuôi tảo
Skeletonema, Chaetoceros sp trong các bể 4-8m3 đạt 200-260 ngàn tế
bào/ml.
I.3.2. Giá trị dinh dỡng của vi tảo sử dụng trong nuôi trồng thuỷ
sản.
Tảo đơn bào là nguồn thức ăn đặc biệt quan trọng cho tất cả các giai
đoạn phát triển của động vật thân mềm hai mảnh vỏ (Bivalvia) nh : hàu, vẹn,
điệp, sò. Chúng còn là thức ăn cho ấu trùng của hầu hết các loàI tôm cá và
cho các động vật phù du. Đã có hàng trăm loài tảo đợc thử nghiệm làm thức
ăn cho giống động vật biển nhng chỉ có khoảng 20 loài tảo đợc sử dụng rộng
rãi trong nuôi trồng thuỷ sản (Brown, 2002). Tính u việt của tảo đơn bào là
không làm ô nhiễm môi trờng, cung cấp đầy đủ các Vitamin, khoáng chất, vi
lợng, đặc biệt chúng chứa rất nhiều axit béo không no. Tảo đơn bào có tốc
độ tăng trởng nhanh, có khả năng thích ứng với sự thay đổi của môi trờng
nh : nhiệt độ, ánh sáng, độ mặn

Giá trị dinh dỡng của vi tảo có thể bị thay đổi rất lớn ở các pha phát
triển và dới các điều kiện nuôi khác nhau (Enright,1986; Brown & CS ,1997).
Kết quả nghiên cứu của Renaud, Thinh và Parry (1999) chỉ ra rằng: Tảo
phát triển đến cuối pha logarit thờng chứa 30-40% protein ,10 - 20% lipid và
5 -10% là carbonhydrate. Khi tảo phát triển qua pha cân bằng thì thành phần
này bị thay đổi rất lớn. Ví dụ: nếu hàm lợng nitrat giảm thì hàm lợng
cacbonhydrat có thể tăng gấp đôi hàm lợng protein. Mối quan hệ giữa giá trị
dinh dỡng của tảo với hàm lợng lipid tổng cộng, carbonhydrat và protein
không đợc thể hiện rõ nét (Webb & Chu & Brown, 2002).
Ví dụ hai loài tảo Phaeodactylum tricornutum và Nannochloropsis atomus
giàu hàm lợng protein và carbohydrate nhng giá trị dinh dỡng của chúng lại
thấp. Mặt khác thành phần của các amino axit của các protein lại tơng đối
giống nhau giữa các loài tảo, tơng đối bền vững ở các pha phát triển khác
nhau và dới tác động của các điều kiện ánh sáng khác nhau. Hơn nữa, hàm
lợng các amino axit cần thiết của vi tảo lại gần giống ở ấu trùng hàu
(C.gigas ; Brown & CS,1993). Điều này càng chỉ ra rằng Protein không phải
là yếu tố xây dựng lên sự khác nhau về giá trị dinh dỡng của các loài vi tảo.
Tuy nhiên thành phần lipid rất quan trọng việc dự trữ năng lợng cho ấu trùng
trong điều kiện thiếu thức ăn (Millar & Scott,1967). Sử dụng tảo có hàm lợng
Protein cao cho sự phát triển của vẹm giống (Mytilus trossolus; Kreeger &
Langdon, 1993) và hàu (Crassostrea gigas; Knuckey et al, 2002), tảo có

9


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

hàm lợng hydratcarbon cao cho sự phát triển tốt nhất của hàu giống và ấu
trùng điệp (Whyte, Bourne & Hodgson, 1989).
Phân tích 40 loài tảo thuộc 7 lớp, Brown và cộng tác viên (1997) đã

xác định rằng trong tảo đơn bào hàm lợng protein dao động từ 6 - 52%;
carbohydrate từ 5 - 23% và lipid từ 7 - 23%. Các loài tảo khác nhau không
có hàm lợng protein và lipid nhng các loài trong lớp tảo Chlorophyceae và
Prymnesiophyceae giàu hàm lợng cacbonhydrate hơn các loài thuộc các lớp
tảo khác.
Các axit béo không no (PUFA) có trong tảo ví dụ nh:
docosahexaenoic acid (DHA), eicosapentaenoic acid (EPA), arachidonic
acid (AA) rất cấn thiết đối với động vật nuôi thuỷ sản (McEvoy & Bell,1997;
Brown và CTV, 1997; Vilchis & Doktor, 2001). Hầu hết các loài vi tảo đều
chứa các loại axit béo không no EPA ở mức độ từ trung bình tới cao (7-34%).
Lớp tảo Bacillariophyceae (Chaetoceros, Thalassiosira, Nitzchia,
Skeletonema), Prymnesiophyceae (Issochrysis, Paplova), Cryptophyceae
(Rodomonad,
Criptomonad),
Rhodophyceae
(Rhodosorus),
Eustigmatophyceae (Nannochloropsis) rất giàu 1 hoặc cả hai loại acid béo
không no DHA và EPA. Từ 0,2-11% DHA có trong tảo Prymnesiophyceae,
trong khi đó Eustigmatophyceae lại có nhiều nhất AA (0-4%).
Prasinophyceae (Tetraselmis, Micromosas, Pyraminonas) chứa khoảng 410% DHA hoặc EPA ngợc lại Chlorophyceae (Chlorella, Nannchloris,
Dunalienlla) chỉ có khoảng 0-3 % vì vậy chúng đợc xem là có giá trị dinh dỡng thấp.
Vi tảo đợc xem là có giá trị dinh dỡng tốt cho các đối tợng nuôi nếu
hàm lợng PUFA dao động từ khoảng 1-20 mg/ml tế bào (Thing, 1999).
Mỗi loài tảo khác nhau thì chúng có giá trị dinh dỡng khác nhau. Một
loài tảo có thể thiếu ít nhất 1 thành phần dinh dỡng cần thiết. Ví dụ Galbana
có nhiều DHA nhng lại thiếu EPA, ngợc lại khuê tảo lại chứa nhiều EPA và
thiếu DHA (Leonardos và Lucas,2000). Vì việc sử dụng hỗn hợp các loài tảo
làm thức ăn cho động vật thuỷ sản sẽ cung cấp chất dinh dỡng tốt hơn cho
chúng. Tuy nhiên việc kết hợp các loài tảo làm thức ăn phải hợp lí cả về tỷ lệ
và thành phần, thích ứng với nhu cầu dinh dỡng của từng đối tợng nuôi cụ

thể thì mới đem lại hiệu quả cao.
Vi tảo là nguồn cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tợng nuôi
thủy sản. Theo thống kê của Brown (2002), hàm lợng acid ascobic (vitamin
C) trong vi tảo có sự khác biệt lớn giữa các loài vi tảo. Ví dụ: ở C.muelleri là
16mg/g trọng lợng khô còn ở tảo T.pseudonana là 1,1 mg/g. Còn lại các
vitamin khác nh thiamin-B1, riboflavin-B2, pyridoxine-B6, cyanocobanaminB12, biotin-H, ...chỉ khác nhau 2- 4 lần giữa các loài vi tảo. Điều này chứng
tỏ rằng việc lựa chọn các loài vi tảo kết hợp với nhau sẽ đảm bảo cung cấp
đầy đủ vitamin cho chuỗi thức ăn của con giống động vật biển.
Ngoài ra các khoáng chất, sắc tố trong tảo cũng đóng góp 1 vai trò
quan trọng trong việc xây dựng nên giá trị dinh dỡng của 1 loài tảo (Fabreas
& Herrero, 1986). Thành phần chủ yếu của các sắc tố là chlorophyll và các
loại carotenoid chiếm 0,5-5% trọng lợng khô. Ngoài ra còn có phycoerythin
và phycocyanin nhng chỉ chiếm một lợng nhỏ khoảng 1% khối lợng khô.
Beta-caroten (provitamin A) đợc xem là rất quan trọng trong chuỗi thức ăn
của giáp xác. Ngiên cứu của Ronnestad, Helland & Lie (1998) đã phát hiện
ra rằng sắc tố lutein và astaxanthin có khả năng chuyển đổi thành vitamin A
trong chuỗi thức ăn của động vật biển.
I.3.3. Vai trò của VI tảo trong tự nhiên và trong chăn nuôi thuỷ sản.

10


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

Hình1: Vi tảo, mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của động vật biển.
Trong tự nhiên vi tảo đóng một vai trò cực kì quan trọng. Chúng có khả
năng quang hợp, hấp thu năng lợng mặt trời để hấp thu, chuyển hoá CO 2
thành các dạng Carbon hữu cơ cao phân tử , oxi và tạo sinh khối. Sinh khối
tảo trở thành mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn trong tự nhiên. Oxi do vi
tảo tạo ra có thể làm tăng nồng độ oxi trong nớc, cung cấp oxi cho các động

vật thuỷ sinh và cho quá trình tự làm sạch của nớc.
Trong chăn nuôi thuỷ sản, vi tảo đã trở thành nguồn thức ăn tơi sống
không thể thiếu đợc đối với ấu thể của một số các động vật thuỷ sinh nh ấu
trùng của một số loài động vật thân mềm, ấu trùng tôm, cá Do đó hiện nay
chế độ thức ăn cho con giống hải sản hầu hết là phối hợp giữa vi tảo tơi
sống và một số thức ăn nhân tạo.
Việc bổ sung vi tảo tơi sống vào thành phần dinh dỡng cho con giống
sẽ có các tác dụng sau:
Làm tăng khả năng chống chịu của con giống với bệnh tật,với
sự thay đổi của môi trờng,do đó làm tăng khả năng sống xót
của chúng,giảm đợc tổn thất.
Trong vi tảo tơi sống có hàm lợng các axit béo không no cao rất
cần thiết cho sự phát triển của ấu trùng của các loài động vật
biển,giúp chúng phát triển nhanh và tạo sự đồng đều.
Các cơ sở thuỷ sản có thể chủ động về thức ăn tơi sống (tảo).
Điều đó có thể là tốn kém cho chi phí ban đầu nhng lại co lợi về
sau,vì việc nuôi tảo băng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm
thay vì sử dụng hoá chất có thể làm giảm nhiều giá thành sản
xuất.
I.3.4. Yêu cầu của vi tảo trong việc sử dụng làm thức ăn chăn
nuôi giống động vật biển.
Để làm thức ăn tơi sống cho con giống động vật biển ,vi tảo phải đáp
ứng đợc các yêu cầu sau:
11


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

Không làm hại con giống.
Kích thớc phù hợp với miệng của ấu thể.

Thành tế bào dễ dung giải.
Thành phần tế bào phù hợp.
Trong các chỉ tiêu về thành phần hoá học thì chỉ tiêu về thành phần
axit amin và axit béo là quan trọng nhất.Ví dụ:một số axit béo mạch dài
không no ở vi tảo là 1 trong những yếu tố có ỳ nghĩa quyết định đến tỷ lệ
sống và khả năng sinh trởng của cá biển,tôm và các động vật thân mềm 2
mảnh.Thiếu một số axit béo có thể làm giảm giá trị dinh dỡng của một số
loài vi tảo.
Ngoài ra để áp dụng vào sản xuất,vi tảo phải đáp ứng đợc các yều
cầu sau:
Tốc độ tăng trởng cao.
Khả năng chịu muối và sự thay đổi của nồng độ muối(sinh trởng
và phát triển đợc trong dải nồng độ muối thấp nhng chịu đợc
nồng độ muối cao khi đa vào bể nuôi ấu trùng động vật biển).
Giá thành sản xuất thấp.
Có khả năng đạt mật độ tế bào cao.
Chịu đợc khuấy sục mạnh.
Có khả năng bảo quản đợc lâu dài.
I.3.5. Các lớp, chi vi tảo thờng sử dụng làm thức ăn cho con
giống động vật biển.
Các lớp, chi vi tảo thờng sử dụng làm thức ăn cho con giống động vật
biển đợc phân loại theo bảng sau:

Lớp

Bacillarriophyceae

Haptophyceae
Prasinophyceae
Chrysophyceae

Chi

Đối tợng dùng vi tảo

Skeletonema
Thalassiosira
Phaeodactylum
Chaetoceros
Nitzschia,Cyclotella
Isochrysis
Pseudoisochrysis
Dicrateria,Coccolithus
Tetraselmis
Pyraminonas
Monoshrysis
Chroomonas

PL,BL,BP
PL,BL,BP
PL,BL,BP,ML,BS
PL,BL,BP,BS
BS
PL,BL,BP,BS
BL,BP,ML
BP
PL,BL,BP,AL,BS,MR
BL,BP
BL,BP,BS,MR
BP

12


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

Cryptophyceae
Xanthophyceae

Cryptomonas
Olisthodiscus

BL,BP
BP

Chlorophyceae

Carteria,Chrorococum
Brachiomonas
Dunaliella
Chlamydomonas
Chlorella
Scenedesmus
Spirulina

BP
BP
BP,BS,MR
BP,BS,MR
BL,BP,FZ,MR,BS

FZ,MR,BC
PL,PP,BS,MR

Cyanophyceae

Bảng 1: Các lớp chi vi tảo sử dụng trong chăn nuôi thuỷ sản.
Ghi chú:
PL:ấu trùng tôm.
AL:ấu trùng bào ng.
BL:ấu trùng nhuyễn thể hai vỏ.
MR:Luân trùng.
ML:ấu trùng tôm nớc ngọt.
BS:Artemia.
BP:Hậu ấu trùng nhuyễn thể hai vỏ.
SC:Saltwatercopepods.
FZ:Phù du động vật.
Các loài tảo trên có kích thớc vài àm đến hơn 100àm,đa số là nớc
mặn và đợc sản xuất làm thức ăn tơi sống.(Đặng Đình Kim, 1998).

I.3.6. các phơng pháp nuôi thu sinh khối vi tảo.
sau:

Việc nuôi thu sinh khối vi tảo có thể tiến hành theo các phơng pháp

-Phơng pháp gián đoạn : là phơng pháp nuôi thu sinh khối gián đoạn
theo mẻ sau đó thiết bị lại đợc khử trùng ,bổ sung môi trờng và giống cho mẻ
mới.Giống phải luôn sẵn sàng cung cấp đủ cho các mẻ.
Ưu,nhợc điểm của phơng pháp là :kĩ thuật nuôi đơn giản,chi phí thấp,
dễ sử lý khi gặp tạp nhiễm,nhng vận hành khó khăn,tốn nhiều nhân lực.
-Phơng pháp nuôi bán liên tục: sau khi thu hoạch sinh khối tảo đợc giữ

lại 1 phần từ 10-50% tuỳ theo từng loại tảo và từng trờng hợp,điều kiện nuôi
sau đó tiếp tục bổ sung môi trờng ,cứ làm nh vậy vài mẻ thì khử trùng toàn
bộ và bổ sung giống và môi trờng mới hoàn toàn cho một chu kì mới.
Ưu,nhợc điểm của phơng pháp:Kĩ thuật nuôi đơn giản,khá hiệu quả,dễ
xử lý khi tạp nhiễm nhng vận hành phức tạp,tốn nhiều nhân công lao động.
-Phơng pháp nuôi liên tục: là phơng pháp nuôi thu sinh khối mà môi trờng nuôi đi vào liên tục và dịch tảo đi ra liên tục.
Ưu,nhợc điểm của phơng pháp:Hiệu quả cao,năng suất cao,vận hành
đơn giản nhng đồi hỏi thiết bị phức tạp,đắt tiền,kĩ thuật cao,khó sử lý khi tạp
nhiễm.
-Phơng pháp nuôi trong nhà: toàn bộ hệ thống nuôi đợc bố trí trong
nhà nuôi và sử dụng hoàn toàn bằng ánh sáng nhân tạo.
Ưu,nhợc điểm của phơng pháp:Có thể dễ dàng khống chế đợc các
yếu tố tác động nh nhiệt độ, ánh sáng nhng giá thành cao.

13


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

-Nuôi ngoài trời :Việc nuôi tảo cũng nh bố trí hệ thống nuôi đợc tiến
hành trong điều kiên tự nhiên,tận dụng đợc ánh sáng mặt trời nên chi phí
thấp hơn nhng khó khăn trong việc khống chế các điều kiện môi trờng tự
nhiên, tính ổn định không cao.
-Nuôi trong hệ thống kín:Toàn bộ môi trờng nuôi đợc cách li với môi trờng bên ngoài bởi hệ thống kín.
Ưu,nhợc điểm của phơng pháp:Hạn chế đợc khả năng tạp nhiễm nhng
chi phí cao,thiết bị phức tạp.
-Nuôi trong hệ thống hở:Thiết bị đơn giản hơn,chi phí giảm nh dễ bị
tạp nhiễm nhng.
ở Việt Nam ngời ta thờng tiến hành theo phơng pháp nuôi từng đợt và
phơng pháp bán liên tục.

chơng 2 đối tợng và CáC phơng pháp nghiên cứu.
Ii.1. Đối tợng nghiên cứu.

Hình2 : Chủng vi tảo Nannochloropsis sp.
II.1.1. Một số đặc điểm của đối tợng nghiên cứu.
Đối tợng nghiên cứu là chủng Nannochloropsis sp có nguồn gốc từ
Trung Quốc và đợc cung cấp bởi TS. Nguyễn Hữu Đại,Viện Hải Dơng Học
Nha Trang dới dạng chủng sản xuất. Khoá phân loại của đối tợng nh sau:
Nhóm tảo(algae) .
Ngành tảo lục (Chlorophyta).
Họ (family): Monodopsidaceae.
Lớp (class): Eustigmatophyceae.
Giống, loại (genus): Nannochloropsis.
Chủng, loài (Species): Nannochloropsis sp.
Để phân loại chủng N.sp với các vi tảo khác ngời ta dựa vào các đặc
điểm đặc thù của chúng nh : sự thiếu các sắc tố quang hợp chlorophyll b, c ,
14


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

có thành phần axít béo ecosapentaenoic acid (EPA) cao (Maruyanma et
al.,1986) và sự tồn tại của các sterol đặc thù (Pattersol et al.,1994; Gladu &
Pettersol, 1995). Ngoài ra ngời ta còn sử dụng kĩ thuật phân tử xác định
chuỗi gen rARN 18s để phân biệt và thiết lập nên khoá phân loại.
Chủng Nannochloropsis sp lần đầu tiên đợc mô tả bởi Hibbered
(1981). N.sp rất khó xác định và phân biệt với các loài tảo lam dới kính hiển
vi quang học vì chúng có kích thớc nhỏ bé. N.sp là những cá thể đơn bào có
dạng hình hạt nh hình...., kích thớc từ 2-3 àm.Dới kính hiển vi điện tử, ngời ta

quan sát thấy những túi mỏng dẹt bên trong tế bào chất, kết nối với màng tế
bào chất và màng nhân (Santos & Leedale, 1995). Ngoài ra trong tế bào
chất còn có các bào quan khác nh lục lạp, nhân, màng thylacoid, và các giọt
lipid.
II.1.2. Thành phần hoá học.
Nannochloropsis là giống tảo có nhiều thành phần axit béo,đặc biệt là
các axít béo không no với hàm lợng cao và cân đối.Mà các axít béo không
no đợc xem nh là chỉ tiêu hàng đầu để đánh giá giá trị dinh dỡng của một
loài vi tảo khi sử dụng chúng làm thức ăn trong chăn nuôi thuỷ sản.Hàm lợng
lipid chiếm 18%, Protein chiếm 35%,hydratecacbon chiếm 7,8% trọng lợng
khô (Brown,1991). Thành phần Eicosapentaeinoic acid của Nannochloropsis
cao chiếm khoảng 28,8% tổng số acid béo, hàm lợng Vitamin C và
Riboflavin đạt giá trị tơng ứng là 8mg/g và 50àg/g trọng lợng khô(Volkman
và cộng sự,1993), có đầy đủ 19 loại axit amin cần thiết cho cơ thể động vật (
Brown và cộng sự,1993) do đó chúng đã đợc sử dụng phổ biến ở nhiều nớc
trên thế giới. Brown và cộng sự (1993) khi nghiên cứu Nannochloropsis đã
thấy rằng thành phần protein thay đổi mạnh ở các pha sinh trởng khác nhau,
cao nhất ở giữa và gần cuối pha logarit,hàm lợng này giảm dần ở pha cân
bằng. Tơng tự nh hàm lợng protein,hàm lợng lipid tổng số cũng biến đổi rất
nhiều trong điều kiện dinh dỡng bị hạn chế(Sukenik, 1986, McGinnis và
cộng sự ,1991,trích theo Reintan và cộng sự ,1997).Dới đây là bảng các
thành phần hoá học của tảo Nannochloropsis sp (% khối lợng khô):
STT
1

Thành phần
Khối lợng khô

% trọng lợng khô
18.40%

2
3
4
5
6
7

năng lợng từ
10ml sinh khối khô
Protein tổng số
Carbohydrate
Lipid tổng số
Vitamin C
Chlorophyl a

44.4 calo
52.11%
16%
27.64%
0.85%
0.89%

Bảng 2: Thành phần hoá học của tảo Nannochloropsis.
Thành phần các axit amin và các axít béo của tảo Nannochloropsis đợc thể hiện theo bảng sau:

15


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

STT

Thành phần
axit amin(a)

%

Thành phần axit béo
(b)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Aspatic
Glutamic
Serin
Histidin
Glysin
Prolin

Alanin
Arginin
Tyrosin
Threonin
Valin
Methionin

8.4
9.48
3.31
0.61
5.11
9.2
1.54
3.57
1.06
5.28
6.9
2.64

Lauric acid
Myristic acid
Pentadecanoic acid
Palmitic
Palmitoleic acid
Heptadecanoic acid
Stearic acid
Oleic acid
Linoleic acid
Linolenic acid

Octadecatetraenoic
cis-8,11,14Eicosatrienoic acid

13
14

Phenynalanin
Isoleucin

1.92
1.47

15

Leucin

8.57

16

Lysin

9.07

Arachidonic acid(AA)
Eicosatetraenoic
acid
Eicosapentaenoic
acid
Docosahexaenoic

acid

%
0.35
3.29
0.23
16.57
21.25
0.36
0.54
5.3
3.4
0.47
0.47
0.21
3.94
0.21
31.42
0.22

Bảng 3: Thành phần axitamin và axit béo của tảo Nannochloropsis.
(a):Theo số liệu của Brown và cộng sự,1993.
(b):Theo số liệu (2)
Nh vậy các axit amin không thay thế ở tảo Nannochloropsis sp nh :
Phenylalanin,methiolin,Leucin,Lizin...,những axit béo không no quan trọng
nh EPA,DHA,AA,có hàm lợng khá cao, và đợc đánh giá là cao hơn hẳn ở tảo
chlorella sp và ở nấm men (Kobayashi và CS, 1995).
Thành phần sắc tố quang hợp: Nannochloropsis.sp thiếu sắc tố
chlorophyll b, c (Whittle and Caselton, 1975). Sắc tố quang hợp chính ở
chủng N.sp là violaxanthin, vaucherxanthin, beta-caroten (Anita và Cheng,

1982; Karsol et al .,1996). Zeaxanthin và anthraxanthin là hai sắc tố phụ nhng lại đợc xem là thành phần của chu trình xanthophyll ở vi tảo
Nannochloropsis (L.M.Luban,personal communication).
II.1.3. Sinh trởng và phát triển.
Quá trình phát triển của vi tảo Nannochloropsis đợc chia thành 4 pha
chính gồm: pha thích nghi, pha luỹ tiến, pha cân bằng, và pha tàn lụi.
Với các đặc trng của các pha nh sau:
-Pha thích nghi: Dung dịch tảo có màu xanh trong.
-Pha luỹ tiến: Dung dịch tảo có màu xanh đục.
-Pha cân bằng: Dung dịch tảo có màu xanh đậm, có độ đục cao.

16


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

-Pha tàn lụi: Dung dịch tảo nhạt màu, trở lên trong, tảo kết tụ lắng
xuống đáy, có màu xanh bạc, có mùi tanh.
II.1.4. ứng dựng của tảo Nannochloropsis.
Khi sử dụng 100% Nannochloropsis cho ấu trùng sò huyết ở giai đoạn
sống trôi nổi, có tốc độ tăng trởng nhanh nhất, và tỷ lệ sống cao nhất. Nhng
ở giai đoạn sống đáy của sò huyết lại sử dụng hỗn hợp vi tảo
Nannochloropsis (50%), Chaetoseros sp (25%) và Isochrysis sp (25%) thì
sò có tốc độ tăng trởng nhanh và tỷ lệ sống cao. Đó là do ở giai đoạn ấu
trùng sò (cũng nh các loại ấu trùng khác) có kích thớc nhỏ chỉ 60-120 àm
và chỉ có khả năng sử dụng vi tảo có kích thớc nhỏ nh Nanochloropsis (2-3
àm) làm thức ăn(Lê Trung Kì, Viện nghiên cứu thuỷ sản III, 2004).
Vi tảo Nannochloropsis có hàm lợng lipid các axít béo không no cao,
đặc biệt là các axít béo cần thiết cho sự phát triển của ấu trùng động vật
biển. Lipid và các axít béo không no (polyunsaturated fatty acids) nh omega3, omega-6... là những chất thiết yếu không thể thiếu đợc trong cơ thể sống
và chỉ đợc bổ sung vào cơ thể sống qua con đờng thức ăn. Do đó chúng đợc

ứng dụng nhiều trong nuôi trồng con giống động vật biển.
II.2. Các phơng pháp nghiên cứu.
II.2.1. Các phơng pháp phân lập vi tảo.
Việc phân lập vi tảo có thể tiến hành bằng nhiều cách nh kỹ thuật dùng
micropipet, kỹ thuật phun, kỹ thuật thay đổi áp suất thẩm thấu, dùng thạch
nghiêng
Trong điều kiện phòng thí nghiệm chủ yếu dùng phơng pháp thạch
nghiêng: Dùng pipet lấy khoảng 0,1-0,5ml dịch tảo rót lên bề mặt thạch đã
cứng,dùng chang thuỷ tinh dàn đều lên bề mặt thạch, sau 3-5 ngày có thể
thu đợc tập hợp các tế bào tảo đồng nhất.
II.2.2. Làm sạch vi tảo.
Có các phơng pháp nh: phơng pháp li tâm, phơng pháp dùng tia cực
tím, phơng pháp sử dụng kháng sinh, phơng pháp lọc.
Trong đó ngời ta thờng hay dùng phơng pháp lọc. Phơng pháp lọc
dùng để lọc tảo sợi khỏi vi khuẩn hoặc lọc tảo có kích thớc nhỏ nh tảo
Nannochloropsis (2-4 micromet) khỏi những tạp nhiễm có kích thớc lớn. Các
loại lới lọc thờng sử dụng là 10-30-100 micromet.
II.2.3. Bảo quản giống tảo.
Sau khi thu nhận đợc tảo sạch từ tự nhiên hoặc từ các tập đoàn giống
khác, giống tảo cần phải đợc bảo quản để có thể xây dựng đợc một tập đoàn
giống. Việc bảo quản giống bao gồm các thao tác sau:
-Khử trùng:
Khử trùng dụng cụ và môi trờng bảo quản bằng phơng pháp thích hợp.
Có thể khử trùng bằng nồi áp suất hoặc bằng màng lọc để tránh làm kết tủa
các muối trong môi trờng nớc biển đối với tảo nớc mặn.
17


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

-Chiếu sáng và nhiệt độ:
Để duy trì và giữ giống tảo thông thờng ngời ta chọn phơng án dùng
ánh sáng yếu và nhiệt độ từ 15 - 200C.
-Cấy truyền:
Tần số cấy truyền phụ thuộc vào điều kiện giữ giống và loài tảo. Các
loài tảo đơn bào hay đa bào không chuyển động có tần số cấy chuyển tha
hơn so với các loài có roi.
-Môi trờng dinh dỡng:
Tuỳ từng loài tảo mà có môi trờng dinh dỡng thích hợp riêng bao gồm
các thành phần là: các muối khoáng đa lợng, vi lợng, các vitamin cần thiết.
II.2.4. Các phơng pháp đánh giá sinh trởng tế bào vi tảo.
Có nhiều phơng pháp đánh giá sinh trởng tế bào vi tảo trong đó phơng
pháp cảm quan là nhanh nhất, có thể xác định khi có sự chênh lệch lớn về
tốc độ sinh trởng. Tảo lục phát triển tốt có màu xanh thẫm, độ đục cao, tảo
kém phát triển nhiễm tạp có thể xanh vàng, độ đục không cao thậm chí tảo
chết làm môi trờng trở nên trong.
Các phơng pháp đánh giá sinh trởng tế bào gồm:
Phơng pháp đo mật độ quang.
Lấy mẫu từ các môi trờng tảo cần so sánh đem đo mật độ quang. Hiện
tại đang sử dụng phơng pháp này là chủ yếu do thời gian nhanh, thao tác
đơn giản, cho biết khả năng tăng sinh khối chứ không trực tiếp xác định đợc
số lợng tế bào.
Việc đo OD đợc tiến hành ở kính lọc 680nm (là bớc sóng mà môi trờng
cần đo hấp thụ ánh sáng mạnh nhất). Môi trờng đối chứng là môi trờng nuôi
không chứa vi tảo.
Đếm tế bào.
Có thể đếm trực tiếp bằng kính hiển vi hoặc bằng buồng đếm hồng
cầu. Môi trờng cần xác định mật độ tế bào nếu đợc dự đoán có mật độ tế
bào rất lớn thì cần đợc pha loãng 101,102,103...lần rồi đem đếm. Việc xác
định chính xác mật độ tế bào tảo có thể cho ta kết luận chính xác hơn về sự

so sánh giữa các môi trờng vi tảo nuôi ở những điều kiện khác nhau, ở các
thời điểm khác nhau.
* Thiết lập đờng chuẩn giữa mật độ quang và mật độ tế bào.
Thông thờng để xác định mật độ tế bào của vi sinh vật trong dung
dịch lỏng, ngời ta phải tiến hành đếm trên buồng đếm hồng cầu nhng biện
pháp này phức tạp, thời gian lâu. Do đó ngời ta thực hiện đo độ đục tế bào
bằng máy so màu quang điện ở bớc sóng 680 nm rồi từ đờng chuẩn OD-mật
độ tế bào xác định đợc mật độ tế bào. Việc thiết lập đờng chuẩn đợc tiến
hành nh sau:
Chọn mẫu môi trờng nuôi tảo có chất lợng tốt, có độ đồng đều cao, ít
bị kết lắng, có độ sánh, đem pha loãng 1 ; 2 ; 4 ;.. lần. Đo mật độ quang ở bớc sóng 680nm. Sau đó tiến hành đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu
để xác định mật độ tế bào tảo trên 1ml môi trờng nuôi ở các mẫu pha loãng
tơng ứng. Tiến hành nh vậy với 2 mẫu tảo .Ta lập bảng tơng ứng giữa mật độ
quang và mật độ tế bào tảo đo đợc và thiết lập đờng chuẩn thể hiện mối
quan hệ giữa mật độ quang và mật độ tế bào. Do mật độ tế bào tỷ lệ thuận
với độ đục của môi trờng hay tỷ lệ với mật độ quang của mẫu đó ,do đó đờng

18


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

chuẩn phải có dạng đờng thẳng và đi qua gốc toạ độ. Môi trờng so sánh khi
đo mật độ quang là môi trờng pha nuôi tảo.
Đờng chuẩn có dạng đờng thẳng:
y = ax + R2
Với : a là hệ số góc.
R2 là sai số khi đo.
Kết quả đo thu đợc theo bảng sau:
Mật độ quang

0.000

0.180

0.278

0.365

0.557

0.741

Mật độ tế
bào(x107TB/ml)

0.000

0.281

0.450

0.623

0.897

1.178

Bảng 4: Các giá trị xây dựng đờng chuẩn.
Đờng chuẩn thu đợc nh hình dới:

OD(680nm)

tế bào/ml(x107)
Hình 3: đờng chuẩn tơng quan giữa mật độ quang và mật độ tế bào.
Nh vậy từ đờng chuẩn trên ta có thể xác định đợc mật độ tế bào bằng
cách xác định mật độ quang ,từ đó một cách tơng đối có thể xác định mật độ
tế bào bằng đờng chuẩn.
Phơng pháp xác định trọng lợng khô.
Phơng pháp dùng đánh giá tăng trởng tế bào. Phơng pháp gồm các bớc sau: thu mẫu, ly tâm thu sinh khối, sấy và cân trọng lợng khô.
Phơng pháp xác định hàm lợng chlorophyl.
Là một trong phơng pháp hoá học để xác định nhanh tăng trởng của vi
tảo. Phơng pháp gồm các bớc:
Tách tế bào, chiết rút chlorophyll, đo độ hấp thụ (A) ở các bớc sóng
19


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

630nm, 665nm, 645nm, và tính hàm lợng chlorophyll theo công thức:
Chl a = 15,6 x A665 - 2,0 x A645 - 0,8 x A630.
Chl b = 25,4 x A645 - 4,4 x A665 -10,3 x A630.
Chl c = 109 x A630 - 12,5 x A665 - 28,7 x A645.
Tuy nhiên ở vi tảo Nannochloropsis thiếu chlorophyl b,c nên chỉ xác
định đợc chlorophyl a.
II.2.5. Phơng pháp đo cờng độ quang hợp.
Dùng điện cực oxi nh một loại tế bào điện hoá để đo tốc độ thải oxi
của tảo trong quá trình quang hợp. Tốc độ thải oxi là một thông số quan
trọng cho thấy hoạt tính trao đổi chất của vi tảo.

C

Ct2

Ct1

0

t1

t2

t

Hình 4:Tốc độ tăng oxi biểu kiến theo thời gian.
* Kĩ thuật xác định cờng độ quang hợp nh sau:
-Mẫu cần đo ban đầu đợc đặt trong buồng tối để nồng độ oxi giảm
đến mức tối thiểu.
-Đậy kín, đặt mẫu cần đo vào vị trí đo, bật đèn halogen tức thời.
-Đo nồng độ oxi tại thời điểm t1 bằng điện cực oxi (Ct1).
-Đo nồng độ oxi tại thời điểm t2 bằng điện cực oxi (Ct2).
-Đo hàm lợng chlorophyll có trong mẫu đo (m)
-Tính toán cờng độ quang hợp.
Cờng độ quang hợp tính bởi công thức:

Ct 2 Ct1

Iqh =
(mg O2/mg chl.h).
Trong phơng pháp (này
đơn giản hoá, pha loãng các mẫu cần đo sao
t 2 để

t1)m
cho có mật độ quang đo ở bớc sóng 600 nm (đo hàm lợng chlorophyll)
bằng nhau và bằng giá trị thống nhất là 2 (trong nghiên cứu của chúng
20


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

tôi) rồi tiến hành đo cờng độ quang hợp. Các mẫu đo cờng độ quang hợp
lúc này có m nh nhau, có khoảng thời gian delta t = t 2-t1 nh nhau.Nồng độ
oxi ban đầu thờng gần bằng nhau, thấp hơn một chút so với nồng độ oxi
trong nớc( 5,1- 5,8 mg/l) nh vậy chỉ cần dựa vào nồng độ oxi đo đợc sau
thời gian t(khoảng 5 phút) Ct là có thể so sánh đợc cờng độ quang hợp
của các mẫu thí nghiệm. Đem các mẫu đó nuôi trong cùng điều kiện ,môi
trờng để so sánh khả năng sinh trởng của chúng.
II.3. Dụng cụ, thiết bị, môi trờng, hoá chất sử dụng trong
nghiên cứu.
II.3.1. Dụng cụ, thiết bị.
* Các dụng cụ: ống đong, cốc đong, pipet, đầu côn, nhiệt kế thuỷ ngân.
* Các thiết bị nuôi vi tảo trong thí nghiệm đều là các thiết bị bằng thuỷ
tinh hoặc bình nhựa trong suốt để ánh sáng có thể chiếu xuyên qua
dễ dàng.Các thiết bị bao gồm:
-Thiết bị bảo quản giống : ống nghiệm 50ml, 100ml, đĩa petri.
-Thiết bị nhân giống sơ cấp: bình tam giác 150 ml, 250 ml, 500 ml,
1000 ml.
-Thiết bị nhân giống lớn: thẩu2l, bình 5l, bình 25l hoặc lớn hơn nữa là
thùng 50l.
-Bể xi măng nuôi sinh khối 300 lit.
Các thiết bị này đều có thể nhập nội hoặc tự đặt mua.
* Thiết bị khử trùng khô.

Dựa trên nguyên tắc khử trùng bằng không khí nóng, nhiệt độ từ 1651800C trong 2 giờ.
* Thiết bị khử trùng ớt.
Thiết bị hoạt động trên nguyên tắc tiêu diệt vi sinh vật và bào tử ở
nhiệt độ cao của hơi bão hoà. Đối với môi trờng cần khử trùng ở 0,080,1at trong vòng 30 phút.
* Máy khử trùng Ozon.
* Buồng cấy vô trùng.
* Máy lắc.
Hiệu Gerharadt.Tốc độ 120 nhịp/phút.
* Hệ thống sục khí.
Hệ thống bao gồm: bình chứa CO2, máy nén khí, hệ thống ống dẫn,
hệ thống lọc khí, thiết bị khử trùng bằng đèn cực tím.
Sử dụng máy nén hiệu RESUN có nhiều loại khác nhau,có công suất
thay đổi từ 35W hoặc lớn hơn,tạo áp suất P=0.03Mpa,năng suất
60lít/phút.Thiết bị nhập ngoại của Trung Quốc.
* Bơm chìm.
Hiệu Lifetech AP 1300,công suất 8,5W.Có thể dùng loại công suất
lớn hơn đến AP 3500 (25W).Thiết bị nhập từ Trung Quốc.
* Kính hiển vi quang học.
Nhãn hiệu: Laboval-4.Với các độ phóng đại:3,2-10-40-100 lần.
Nguyên tắc hoạt động: dựa trên nguyên tắc về sự tạo ảnh qua hai
thấu kính .
* Buồng đếm hồng cầu: Bukne,do Liên Xô cũ sản xuất.
* Thiết bị đo oxy hoá khử.
Nhãn hiệu:IMS-DOT 01.Nhập nội,do Viện Công Nghệ Vật Liệu thiết kế
và sản xuất.

21


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

Nguyên tắc: đo điện trên thế điện kế căn cứ vào sự sai khác điện thế
giữa hai điện cực: điện cực cần đo và điện cực so sánh Ag/Pb.
* Thiết bị so màu quang điên.
Nhãn hiệu Pharmacia Biotech.
Nguyên tắc hoạt động: Dựa trên sai khác giữa khả năng hấp thụ (hay
phát xạ) ánh sáng của môi trờng nuôi tảo và môi trờng so sánh thông
qua tế bào quang điện.
* Cân điện tử.
Nhãn hiệu Mettler toledo.
Max 210g
Sai số e =1mg.
Min 10g
d =0,1mg.
II.3.2. Môi trờng, hoá chất sử dụng trong thí nghiệm.
* Môi trờng sử dụng trong phân lập và bảo quản giống vi tảo là môi trờng
Walne - aga.
Cách pha môi trờng Walne nh sau:
- Pha môi trờng A:(Pha trong 1lít nớc cất)
NaNO3:
100g.
Na2EDTA,NaH2PO4:
20g.
H3BO3:
33,6g.
MnCl2.4H2O:
0,4g.
FeCl3:
0,8g.
1ml dung dịch B.

- Pha môi trờng B:(pha trong 100ml nớc cất,đun nóng ,hoà tan)
ZnCl2:
2,1g.
CoCl2:
2,0g.
(NH4)6Mo7O24.4H2O:
0.9g.
CuSO4:
2,0g.
Dùng 1ml môi trờng A pha cho 1lít môi trờng nuôi.
Các loại hoá chất chủ yếu nhập ngoại từ Trung Quốc.
* Môi trờng trong nhân giống sơ cấp là môi trờng Walne cải tiến, có bổ
sung vitamin các loại: Vitamin B1, B12, H.
* Môi trờng trong nhân giống thứ cấp và thử nghiệm nuôi sinh khối là môi
trờng phân bón :phân đạm, phân lân,nhập nội, hoá chất ure, axit citric
nhập ngoại từ Trung Quốc.

22


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

chơng iii kết qủa và bàn luận.
III.1. Nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm.
III.1.1. Phân lập lại và bảo quản giống.
Vì đối tợng nghiên cứu do nhà cấp giống cung cấp dới dạng chủng
sản xuất nên chúng tôi phải tiến hành phân lập lại để thu đợc giống thuần
chủng phục vụ cho nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng môi trờng Walne - aga
(aga-aga 4g/lit) phân lập lại và bảo quản vi tảo.
* Phân lập lại:

Chúng tôi sử dụng phơng pháp cấy chuyển trên môi trờng thạch đĩa.
Dịch chứa vi tảo đợc trải đều trên bế mặt môi trờng thạch đĩa sau đó đem
bảo quản nơi thoáng mát, sạch sẽ, sử dụng ánh sáng đèn neon (2 bóng
40W). Đảm bảo điều kiện vi hiếu khí. Sau 25 ngày thu đợc kết quả vi tảo
phát triển tốt trên môi trờng thạch đĩa.
* Bảo quản: Sau khi vi tảo trên môi trờng thạch đĩa đã phát triển tốt
(20 - 30 ngày), các phần tảo phát triển tốt mọc lan ra tách biệt khỏi các tạp
nhiễm đợc cấy chuyển sang môi trờng thạch nghiêng trong ống nghiệm để
giữ giống thuần khiết và tạo nguồn giống cho nhân giống sơ cấp. Giống
trong môi trờng thạch nghiêng đợc bảo quản giống nh điều kiện bảo quản
giống trên môi trờng thạch đĩa.
Kết quả bảo quản giống trong môi trờng thạch nghiêng sau 25 - 30
ngày nh hình 4.
iii.1.2. Nhân giống sơ cấp.
Sau khi thu đợc giống vi tảo thuần chủng trong môi trờng thạch
nghiêng, chúng tôi tiến hành nhân giống sơ cấp trong các bình tam giác theo
thứ tự lần lợt từ ống nghiệm sang bình tam giác 100ml, 250ml, 500ml,
1000ml. Sử dụng môi trờng Walne. Nuôi cấy trong điều kiện phòng thí
nghiệm, môi trờng và dụng cụ đợc khử trùng ớt trong điều kiện 0,1 at trong
30 phút. Nhiệt độ nuôi cấy 200C -250C, ánh sáng 3000 - 4000 lux, điều kiện
hiếu khí lỏng lắc.
Kết quả nhân giống sơ cấp trong điều kiện phòng thí nghiệm sau 8-10
ngày thu đợc nh hình 6.

23


NguyÔn V¨n Nho Líp CNSH-K45

H×nh 5 :b¶o qu¶n vi t¶o trong m«i trêng th¹ch nghiªng.

H×nh 6: Nh©n gièng s¬ cÊp vµ thø cÊp trong phßng thÝ nghiÖm.
III.1.3 Nh©n gièng thø cÊp.

24


Nguyễn Văn Nho Lớp CNSH-K45

Giống sạch từ nhân giống sơ cấp đợc nhân giống thứ cấp trong điều
kiện phòng thí nghiệm. Sử dụng môi trờng Walne, nuôi trong bình thuỷ tinh 2
lít, chế độ khử trùng nhiệt. Điều kiện nhiệt độ 20-250C, ánh sáng 5000 - 6000
lux, sục khí vô trùng.
Kết quả nhân giống thứ cấp trong điều kiện phòng thí nghiệm nh hình
6. Sau 7 ngày thu đợc OD = 5,36 tơng đơng 9,5 triệu tế bào/ml.
III.1.4 Nghiên cứu ảnh hởng của các yếu tố môi trờng.
III.1.4.1. Xác định phơng pháp khử trùng phù hợp với điều kiện nuôi vi
tảo trong thí nghiệm cũng nh khi ứng dụng vào sản xuất.
Đối với việc bảo quản giống và nhân giống nhỏ thì việc khử trùng
bằng phơng pháp khử trùng ớt (0,1 at) là cần thiết để đảm bảo độ vô trùng
cao. Tuy nhiên trong nhân giống lớn cũng nh khi ứng dụng vào sản xuất,
việc khử trùng môi trờng nuôi bằng phơng pháp nhiệt có những hạn chế của
nó. Việc khử trùng dụng cụ nuôi nhân giống lớn bằng nớc zaven 10%, cồn
cũng tỏ ra không hiệu quả, đó là do:
Giá thành cao.
Thao tác khó khăn.
Thời gian lâu.
Việc khử trùng nhiệt có thể làm tủa một số muối khoáng có trong
nớc biển và muối khoáng bổ sung vào môi trờng nuôi, làm thay
đổi thành phần của môi trờng nuôi ,ảnh hởng tới sự phát triển của

vi tảo.
Đặc biệt khi đa ra sản xuất với việc khử trùng môi trờng cho 1 mẻ từ
nửa khối tới vài khối thì việc khử trùng nhiệt và việc khử trùng dụng cụ là
không kinh tế .
Hiện nay có một phơng pháp khử trùng khá là hiệu quả cả về mặt kinh
tế lẫn thao tác mà đang đợc sử dụng đó là phơng pháp khử trùng bằng
Ozon. Tuy nhiên việc khử trùng bằng chất oxi hoá mạnh là ozon có thể tiêu
diệt đợc vi sinh vật cùng bào tử của chúng nhng cũng có thể làm oxi hoá các
chất cần thiết cho sinh trởng và phát triển của vi tảo. Do đó cần phải đánh
giá sự phát triển của vi tảo trong môi trờng và dụng cụ khử trùng bằng phơng
pháp ozon.
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu nh sau : Ba mẫu tiến
hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhiệt độ 20-28 0C ,sử dụng môi trờng
cơ bản Walne làm môi trờng nuôi vi tảo, ánh sáng đèn Neon (4 đèn) , nuôi
trong bình thuỷ tinh 2 lít, có sục khí vô trùng. Chỉ khác nhau về chế độ khử
trùng nh sau:
Mẫu 1 : (Mẫu đối chứng ĐC ) Dụng cụ đợc khử trùng bằng cồn 90 độ,
môi trờng đợc khử trùng bằng đun sôi trong 30 phút.
Mẫu 2 : Dụng cụ cùng môi trờng nuôi đợc khử trùng bằng ozon.
Môi trờng gốc đợc bổ sung sau khi tiến hành khử trùng (OZON1).
Mẫu 3 : Dụng cụ cùng môi trờng nuôi đợc khử trùng bằng ozon. Môi trờng gốc đợc bổ sung trớc khi tiến hành khử trùng (OZON2)
Bổ sung lợng giống nh nhau, cùng 1 nguồn giống. Sử dụng phơng
pháp đo mật độ quang để so sánh khả năng phát triển của vi tảo.
Kết quả đo OD tại các thời điểm khác nhau đối với các các mẫu thí
nghiệm về điều kiện khử trùng nh sau:
25