Giáo trình thực hành vi sinh vật kỹ thuật môi trường

VỆ SINH CÁ NHÂN VÀ NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC
Khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh học phải tuyệt đối vệ sinh, tôn

1.

trọng tính ngăn nắp và trật tự của phòng thí nghiệm.
Mỗi cá nhân, mỗi nhóm làm thí nghiệm với dụng cụ riêng, không được mượn

2.

dụng cụ của các nhóm khác. Nếu thiếu phải hỏi cán bộ PTN hoặc GVHD, không được tự
động sử dụng dụng cụ của người khác.
3.

Phải mặc áo bluose.

4.

Không nói chuyện, không ăn uống, không hút thuốc lá, không đi lại lộn xộn
trong PTN.
Không để các vật phẩm, canh trường vi sinh vật hoặc môi trường nuôi cấy vi

5.

sinh vật gây bẩn ra bàn ghế, sách vở hoặc quần áo. Trường hợp gây bẩn phải vệ sinh ngay.
Sau khi làm xong, phải vệ sinh nơi làm việc của mình, vệ sinh các dụng cụ,

6.

máy móc thí nghiệm. Rửa tay sạch và lấy cồn sát khuẩn trước khi ra khỏi PTN.
Khi tiến hành thí nghiệm phải có sổ ghi chép các công việc thí nghiệm. Trong

7.

sổ ghi chép các điều kiện liên quan đến bài thí nghiệm. Phải ghi chép đầy đủ, cẩn thận, rõ
ràng.

HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN

MSSV

………………………………………...

……………………


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

BÀI 1: CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ
KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
1. CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM
1.1.

Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc
Phòng thí nghiệm vi sinh phải được vệ sinh trước và sau khi sử dụng.
Dụng cụ thiết bị được khử trùng hay vệ sinh sạch sẽ và sắp sếp ngăn nắp.
Bề mặt làm việc phải được tiệt trùng bằng cồn 700.

1.2.

Máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm:

Dụng cụ bằng thuỷ tinh hoặc kim loại:

-

Các dụng cụ đựng môi trường dinh dưỡng phải được khử khuẩn tuyệt đối trước khi sử dụng.
Sau khi sử dụng xong phải rửa sạch và khử khuẩn lại, sấy khô, bao gói và để vào nơi quy
định.
- Các máy móc, thiết bị cần có độ chính xác cao (cân phân tích, buồng đếm…) càng
cần phải chú ý vệ sinh trong và sau khi tiến hành thí nghiệm
Có hai phương pháp tiệt trùng: nhiệt khô hoặc nhiệt ẩm.
*Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô: Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 170 -1800C
*Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: Được thực hiện trong thiết bị tiệt trùng áp
suất 1atm, 1210C trong thời gian 20-30 phút.
Dụng cụ bằng plastic chịu nhiệt: Tiệt trùng bằng nhiệt ẩm.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Thường được tiệt trùng trong thiết bị tiệt trùng ở
1210C, 20-30 phút.
Đối với những thành phần của môi trường dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao
không thể sử dụng phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt trong thiết bị tiệt trùng. Trong những
trường hợp đó cần sử dụng màng lọc vi khuẩn để tiệt trùng.

2. KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ
duy trì thế oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường.

2


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; Có độ pH thích hợp; Có độ nhớt nhất định; Không

chứa các yếu tố độc hại; Hoàn toàn vô trùng.
Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng
thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.
2.1.

Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinh

dưỡng của từng loại sinh vật.
Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật.
Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật.
2.2.

Pha môi trường
Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự

hướng dẫn trong tài liệu.
+ Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi cho hoà tan vào nước.
+ Môi trường đặc: Cân agar và hoá chất cho vào bình tam giác hay becher rồi hoà
tan trong nước, đun trên bếp hay hấp trong autoclave.
2.3.

Chuẩn bị môi trường
a. Thạch nghiêng
Cho vào ống nghiệm với một lượng môi trường đặc 1/3 đến 1/4 ống nghiệm.
Để ống thạch ở vị trí nghiêng thích hợp cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn.
Vị trí đầu trên của mặt nghiêng không vượt quá 2/3 chiều cao ống nghiệm.
Không để thạch chạm vào nút bông, khi làm nghiêng tốt, mặt thạch nghiêng bằng

phẳng, không bị đứt, chiều dài vừa phải, không ngắn quá, dài quá.
b. Thạch đứng
Cho vào ống nghiệm với một lượng môi trường chiếm 1/2 đến 2/3 ống nghiệm.
Thạch nguội sẽ đông lại và ta sẽ có ống thạch đứng.
Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường chiếm 1/2 - 1/3 bình.
c. Làm thạch hộp petri
Đun thạch chảy lỏng, để nguội đến 50-600C.

3


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

Tay phải cầm bình (hoặc ống) môi trường đã chảy lỏng, giữ hơi nghiêng, dùng tay
trái xoay và rút nút bông ra, vô khuẩn miệng bình (hoặc miệng ống trên đèn cồn).
Dùng tay trái hé mở nắp hộp vừa phải và nhanh tay rót vào hộp một lượng môi
trường thích hợp.
Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp từ từ trên bàn để thạch dàn thành một
lớp đều trên đáy hộp. Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên.
Hé mở nắp hộp và để yên cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn.
Đậy nắp lại, lật ngược hộp cho đáy lên trên.
Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, bằng phẳng, lớp thạch không dày quá hoặc
mỏng quá (thường khoảng 2mm).

Hình 1: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và đĩa petri
Số môi trường chưa dùng đến phải bảo quản ở chỗ mát, nhiệt độ từ 0 - 5 0C, không để
môi trường bị khô, bị tác dụng của ánh sáng.
Dù môi trường mới chuẩn bị hay đã bảo quản lâu, trước khi đem dùng đều phải kiểm
tra sự vô khuẩn. Muốn vậy, ta để môi trường trong tủ ấm có nhiệt độ từ 37 - 38 0C trong 2 –

4


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

3 ngày lấy ra quan sát và loại bỏ những ống (hoặc bình) môi trường có vi sinh vật phát triển
(bị đục hoặc có khuẩn lạc).
2.4.

Điều chỉnh độ pH của môi trường:
Điều chỉnh độ pH của môi trường dùng HCl 10% hay NaCl 10%.
Ngoài ra có một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3...
Lập nhãn môi trường vừa thực hiện:
Tên môi trường: ....................................................
Khử trùng: ngày ......... tháng ........... năm ............

3. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG
3.1.

Dụng cụ
Dụng cụ
Đèn cồn
Đĩa petri
Ống nghiệm
Pipet 1ml
Pipet 10ml
Becher 100ml

3.2.

Số lượng
6
60
60
6
6
12

Hóa chất và môi trường

Agar
Môi trường tổng hợp PCA (plate count agar)
Cồn 960
Nước cất

30g
23.5g
2 lít
5 lít

4. THỰC HÀNH
Pha cồn 700
Đổ môi trường thạch ống nghiệm và đĩa petri
Chuẩn bị môi trường PCA (plate count agar)
Viết báo cáo

5. CHUẨN BỊ
Mẫu nước: sinh hoạt và nước thải
Mẫu đất

5

Đơn vị
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 1
1. Số liệu báo cáo
ỐNG NGHIỆM
………………….

ỐNG NGHIỆM
ỐNG NGHIỆM
…………………….. …………………..

ĐĨA PETRI
………………….

ĐĨA PETRI
ĐĨA PETRI
……………………..
…………………..

ĐĨA PETRI (PCA)
………………….

ĐĨA PETRI (PCA) ĐĨA PETRI (PCA)
…………………….. …………………..

ĐẠT
KHÔNG

ĐẠT
KHÔNG

ĐẠT
KHÔNG
Nhận xét kết quả:
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
2. Câu hỏi ôn bài:
2.1. Tại sao phải vô trùng? Các phương pháp vô trùng và tiệt trùng?
2.2. Tại sao lại mở nắp đĩa petri khi chuẩn bị môi trường thạch? Tại sao phải điều chỉnh độ pH?
2.3. Có mấy dạng môi trường thạch ống nghiệm? Nêu các đặc trưng cho từng loại môi trường?
3. Yêu cầu bài học

- Nắm vững nội dung bài học
- Lập báo cáo kết quả và nhận xét
- Trả lời câu hỏi

6


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ
Xác định hay định lượng vi sinh vật là xác định số lượng cá thể tồn tại trong một đơn
vị vật phẩm hoặc canh trường. Để định lượng, cần phải thao tác đúng quy cách một số vấn
đề như: lấy mẫu, pha loãng mẫu…

1. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU

-

-

-

Để đánh giá chính xác số lượng vi sinh vật, yêu cầu đầu tiên là mẫu phải được lấy và
bảo quả đúng kỹ thuật.
Tùy theo yêu cầu nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu và các chỉ tiêu sinh học cần phân
tích mà khối lượng mẫu cũng như quy cách lấy mẫu (số lượng, vị trí, thời gian…) khác
nhau.Tuy nhiên, việc lấy mẫu cần tuân theo những yêu cầu sau:
Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng: đẩm bảo độ thuần khiết, tránh tạp nhiễm …
đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.
Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải sạch, không độc hại với vi sinh vật, tránh làm chết hoặc

ức chế vi sinh vật trong vận chuyển và bảo quản.
Các yêu cầu về khối lượng và tính đặc thù của mẫu:
+ Đủ khối lượng theo yêu cầu phân tich
+ Đúng nơi quy định và vào thời điểm phù hợp với yêu cầu nghiên cứu
+ Mẫu trung bình và điển hình
Bảo quản: mẫu lấy xong phân tích ngay. Nhiệt độ thường không để mẫu quá 30 phút. Nếu
lấy mẫu xa, cần có thiết bị phân tích hiện trường hoặc bảo quản ở nhiệt độ thấp (0-5 0C), thời
gian bảo quản không quá 24 giờ.
Các yêu cầu khác: mẫu cần được dán nhãn và ghi rõ
+ Mã số của mẫu
+ Loại và mục đích lấy mẫu
+ Tên và chức năng của người lấy mẫu
+Yêu cầu phân tích

2. PHA LOÃNG MẪU
5.1.

Chuẩn bị mẫu
Yêu cầu của việc lấy mẫu:
- Lấy mẫu có tính chất đại diện.
- Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý, hoá, sinh học.

7


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng.
- Lấy mẫu xong phải phân tích ngay và không được để quá 24h.
- Ghi nhật ký của mẫu và nơi thu mẫu.

5.2.

Pha loãng mẫu :
- Chuẩn bị một bình chứa mẫu cần phân tích
- Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng
- Một số pipet vô trùng.
- Pha loãng mẫu cần phải thực hiện trong tủ cấy hoặc phòng vô trùng

a. Mẫu ở trạng thái lỏng :
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân 1/10 (10-1), 1/100 (10-2), 1/1000 (10-3),… 10-n

Hình 2.1: Phương pháp pha loãng mẫu nước theo dãy thập phân
b. Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm)
Môi trường đất nhìn chung rất thuận lợi cho nhiều nhóm vi sinh vật phát triển. Hệ vi
sinh vật đất rất đa dạng gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn… Số lượng vi sinh vật phụ thuộc vào
hàm lượng chất hữu cơ, tính chất cơ lý cũng như độ ẩm của đất, số lượng cá thể thường rất
lớn.
Các bước tiến hành:

8


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

- Lấy mẫu đất: mẫu đất mang phân tích có tính đại diện nên số lượng mẫu tùy theo
yêu cầu nghiên cứu khác nhau. Mẫu đất lấy từ 10-20g cho mỗi vị trí, lấy 4 mẫu của 4 góc
vuông và 1 mẫu ở tâm, độ sâu nhất định và mẫu phải được trộn đều trước khi sử dụng.
- Chuẩn bị dụng cụ:
Một bình tam giác 250 ml chứa 90ml nước cất vô trùng
Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng

Một số pipet vô trùng.
- Pha loãng mẫu: cân 10 g đất (hoặc mẫu) cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất
vô trùng. Lắc 10 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như trạng thái lỏng.
Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít.

Hình 2.2: Phương pháp pha loãng mẫu đặc theo dãy thập phân

9


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

6. KỸ THUẬT TRẢI ĐĨA

Hình 2.3: Minh họa kỹ thuật trải đĩa
Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương
đương với 2 giọt dịch).
Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và khoảng 25-300 CFU (coliform
unit: đơn vị khuẩn lạc).
Sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, que gạt
thuỷ tinh được vô khuẩn bằng cách nhúng vào trong cồn, đốt cháy phần cồn còn lại trên que
cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy bằng cách nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dàn
đều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó.
Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh.
Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 300C và ủ trong 48 giờ.
Kết quả:
Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng
CFU/g = ------------------------------------------------Thể tích mẫu (ml)

7. THỰC HÀNH

7.1.

Dụng cụ
Tên

Số lượng

Đơn vị

10


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

Đèn cồn
Đĩa petri
Pipet 1ml
Pipet 10ml
Becher 100ml
Que trang
Ống nghiệm
Hóa chất và môi trường

7.2.

6
60
6
6
12

6
30

Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái

Môi trường Plate count agar (PCA) tổng hợp 23,5g hay môi trường thành phần
gồm: Trypton, 5.0g; Yeast extract, 2.5g; Glucose, 1.0g; Agar,15g.
Cân chính xác khối lượng môi trường cho vào becher 1,5 lít và thêm vào 1 lít
nước cất. Đun nóng hỗn hợp đến khi tan đều rồi cho vào erlen 1,5 lít đem hấp khử trùng.
Lưu ý, trong khi đun môi trường cần phải khuấy thường xuyên để môi trường không bị
lắng và khét.
Sau đó, hấp khử trùng ở 1210C, 1atm và thời gian 30 phút.
Chuẩn bị:
Cồn 960
Nước cất
NaCl tinh khiết
7.3.

2 lít
5 lít
10g

Thực hành

Pha nước muối sinh lý 0,9%
Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất)
Đổ đĩa.
Trải đĩa
Đọc kết quả và viết báo cáo
-

11


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 2
1. Số liệu báo cáo
Nồng độ pha loãng
ĐẠT
Số khuẩn lạc
KHÔNG

1
…………………..

2
……………………

3
…………………….

Nhận xét kết quả:
..................................................................................................................................................

..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
2. Câu hỏi ôn bài:
2.1. Tại sao phải pha loãng mẫu? Các bước pha loãng mẫu?
2.2. Vi sinh vật hiếu khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi khuẩn
hiếu khí?
2.3. Tại sao phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ: môi trường, dụng cụ, tay… trong quá trình
thao tác? Ý nghĩa việc khử trùng và sát trùng?
3. Yêu cầu bài học
- Nắm vững nội dung bài học
- Lập báo cáo kết quả và nhận xét
- Trả lời câu hỏi

12


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

BÀI 3: XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN KỴ KHÍ
1. KỸ THUẬT ĐỔ MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN KỴ KHÍ
Phân lập các vi sinh vật kị khí trên môi trường đặc ở đĩa petri.
Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí
trong môi trường.
Để nguội môi trường còn 45 - 500C.

Hút 0,1 ml mẫu vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm.
Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa petri và đậy thật nhanh
nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí.
Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri.
Nuôi trong bình yếm khí: sau khi cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí. Thoa
một lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên và đặt vào bình, đậy nắp
lại, hoặc dùng máy hút chân không. Cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường,
dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng phương pháp xác định tổng vi khuẩn kị khí bằng ống
nghiệm đậy nút cao su nhưng môi trường nuôi cấy phải bổ sung đầy đủ glucose, trypticase,
yeast và một số các muối khoáng khác cho vi khuẩn phát triển, đặc biệt phải bổ sung các tác
nhân khử như cystein và Na2S vào môi trường.
Thao tác thực hiện:
Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C. Bổ sung vài giọt
Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môi trường.
Cân 1g mẫu đất và pha loãng mẫu bằng nước cất vô trùng theo dãy thập phân liên
tiếp, tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp sao cho khuẩn lạc mọc trên đĩa khoảng 30 300. Không để mẫu trong nước pha loãng lâu hơn 30 phút.
Hút 1ml mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm vô trùng.
Rót môi trường ở nhiệt độ 40-46 0C vào ống nghiệm có chứa mẫu. Rót môi trường
nhẹ nhàng tránh không tạo bọt khí và không để môi trường tràn ra ngoài.

13


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

Đậy ống nghiệm bằng nút cao su vô trùng. Chờ cho thạch đông cứng lại và đem ủ ở
nhiệt độ phòng.
Sau 3 ngày đếm các khuẩn lạc riêng rẽ quan sát được.

8. THỰC HÀNH
8.1.

Dụng cụ

8.2.

Tên
Số lượng
Đèn cồn
6
Ống nghiệm
60
Pipet 1ml
6
Pipet 10ml
6
Becher 100ml
12
Hóa chất và môi trường

Đơn vị
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái

Thành phần môi trường

NH4NO3

2g

KH2PO4
NaCl
MgSO4.7H20
Glucose
Pepton
Cao men
Agar

1g
10g
3,3g
1g
5g
0,5g
12g

Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút, môi trường có pH 7.0 – 7.2.
Cách pha hỗn hợp Na2S + NaHCO3: Cân 0,75g Na2S và 0,3g NaHCO3 pha trong
30ml nước cất.
Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C. Bổ sung vài
giọt Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môi trường.
-

8.3.

Cồn 960

Nước cất
NaCl tinh khiết

2 lít
5 lít
10g

Thực hành
-

Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất)
Đổ ống nghiệm

14


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

Đọc kết quả và viết báo cáo

9. CHUẨN BỊ
Đổ môi trường PGA

15


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 2
1. Số liệu báo cáo

Nồng độ pha loãng
ĐẠT
Số khuẩn lạc
KHÔNG

1
…………………..

2
……………………

3
…………………….

Nhận xét kết quả:
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
2. Câu hỏi ôn bài:
2.1. Tại sao phải sử dụng dung dịch Na2S + NaHCO3 ?
2.2. Vi sinh vật kỵ khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi khuẩn kỵ
khí?
2.3. Phân biệt sự khác nhau giữa vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí?
2.4. Ý nghĩa việc xác định tổng vi khuẩn kỵ khí trong môi trường?

3. Yêu cầu bài học
- Nắm vững nội dung bài học
- Lập báo cáo kết quả và nhận xét
- Trả lời câu hỏi

16


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

BÀI 4: XÁC

ĐỊNH TỔNG VI NẤM

1. NGUYÊN TẮC
Nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển
trong khoảng 20 – 280C, một số ít là ưa nóng và ưa lạnh. Vi nấm có khả năng sinh trưởng
trong vùng pH từ 2-9, nhưng pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5. Hầu hết vi nấm
đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí.
Mật độ vi nấm trong mẫu được xác định dưới dạng tổng vi nấm bằng kỹ thuật pha
loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường thích hợp.

10. THỰC HÀNH
10.1. Dụng cụ
Tên

Số lượng
6
60
6

6
12

Đèn cồn
Đĩa petri
Pipet 1ml
Pipet 10ml
Becher 100ml

Đơn vị
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái

10.2. Hóa chất và môi trường
Thành phần môi trường:
Khoai tây
Glucose
Agar

300g
20g
15g

Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và
lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh
pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Chuẩn bị:

-

Cồn 700
Cồn 960
Nước muối sinh lý

2 lít
2 lít
1 lít

17


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường
-

Nước cất

5 lít

10.3. Thực hành
Đổ môi trường
Trải đĩa
Đọc kết quảvà viết báo cáo
-

11. CHUẨN BỊ
Chuẩn bị môi trường Lauryl Sulphate broth (LSB)

18

Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 4
1. Số liệu báo cáo
Nồng độ pha loãng

1
…………………..

2
……………………

3
…………………….

ĐẠT
Số khuẩn lạc
KHÔNG
Nhận xét kết quả:
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................

..................................................................................................................................................
2. Câu hỏi ôn bài:
2.1. Vi nấm là gì?
2.2. Phương pháp xác định tổng vi nấm?
2.3. Phân biệt khuẩn lạc vi khuẩn và vi nấm?

3. Yêu cầu bài học
- Nắm vững nội dung bài học
- Lập báo cáo kết quả và nhận xét
- Trả lời câu hỏi

19


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
VÀ PHƯƠNG PHÁP MPN
1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
11.1. Đếm trên lam phết kính
Tiêu bản vi sinh vật đã được nhuộm màu (nhuộm đơn).

Hình 5.1: Diện tích hình vuông phết kính
Sơ đồ: Di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính, để đếm số VSV/1VT
a. Phết kính:
- Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400 mm 2, ở
mặt trên lam. Mục đích không cho vi sinh vật lan ra khỏi diện tích đếm.
- Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên lam.
- Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu ra xung
quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông.

- Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen.
- Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100.
b. Cách đếm
- Đếm số tế bào VSV/ 1VT (VT: vi trường).
- Đếm hết tất cả từ 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính. Theo sơ đồ hình vẽ.
c. Công thức tính

20


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

Trong đó:
X = Số VK đếm được trong một vi trường
400 = diện tích hình vuông phết kính, bằng 400mm2
0.0004 = diện tích của vi trường, πR2 = 0.0004 mm2
Số vi trường có được trong S: 4cm2

V = thể tích giọt VK phết kính
H = hệ số pha loãng mẫu
11.2. Đếm trong buồng đếm:
a. Cấu tạo buồng đếm.
- Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật.
- Giữa là phần lõm phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ. Bên ngoài
có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thông số kỹ thuật như hình trên.

Hình 5.2: Cấu tạo buồng đếm

21

Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

b. Cấu tạo khung đếm.

Hình 5.3 Cấu tạo khung đếm
Cấu tạo một khung đếm có:
- Trường hợp1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.
- Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.
- Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm2.
Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3.
c/ Cách tiến hành.
- Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm.
- Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm
nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lammen.
- Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, hơi
thừa một ít. Nếu bị bọt kẹt lại trong lammen thì phải làm lại.
- Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm.
- Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật
kính x40 để đếm.

22


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

- Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ
trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm
số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải ô.
- Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ).

- Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ).
d. Công thức tính.

Trong đó:

a = số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3)
4.000 = số qui đổi từ 1/4.000 mm3 thành 1 mm3.
1.000 = số qui đổi từ 1 mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3)
H = hệ số pha loãng (ví dụ: H = 10-2)

e. Chú ý:
- Phương pháp này chỉ sử dụng để quan sát những vi sinh vật có kích thước lớn như
bào tử của nấm men và nấm mốc.
- Chỉ đếm được tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống hay đã chết.
- Nên nhuộm màu (methylene blue) để dễ quan sát và đếm chính xác.
- Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10
tế bào.
- Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô.
- Để đạt độ chính xác cao, thì số tế bào trung bình đếm được trong 1 ô nhỏ: 2.5 < a
<10.
11.3. Phương pháp trải đĩa
Tương tự thao tác trải đĩa, số lượng tế bào vi sinh vật được xác định qua khuẩn lạc.
Khuẩn lạc là các cá thể hay tế bào vi sinh vật được nuôi cấy trong các điều kiện môi trường
thích hợp, sau đó phân chia tạo thành nhiều cá thể hay quần thể vi sinh vật mà mắt thường
nhìn thấy được.

23


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

11.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number)
Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất; số tối khả) còn được gọi là
phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ.
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định
trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục …), ghi nhận
số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng.
Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được
trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ
thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng.
Cụ thể là xác định số lượng Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt
hoặc nước thải.
Thao tác:

24


Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường

Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp.
Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi trường
Lauryl Sulphate broth (LSB). Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm.
Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 370C, thời gian 24 - 48 giờ.
Bước 4: Ống dương tính là có bọt khí trong ống durham.
Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp.
Bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1ml tương đương MPN/ml
của mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 dùng phân tích.

Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10
( f độ pha loãng thấp nhất 10n)
Lưu ý: Các ống nghiệm có khả năng hiện diện của coliform là dương tính cả hai môi
trường LSB và BGBL.

12. THỰC HÀNH
12.1. Dụng cụ
Tên
Đèn cồn
Ống nghiệm
Đĩa petri
Pipet 1ml
Pipet 10ml
Becher 100ml
12.2. Hóa chất và môi trường

Số lượng
6
100
20
6
6
12

Đơn vị
Cái
Cái
Cái
Cái
Cái

Cái

Môi trường LSB và BGBL
Cân chính xác khối lượng môi trường tổng hợp hay thành phần của từng môi trường.
đun nóng cho môi trường đồng nhất rồi phân phối vào các ống thí nghiệm có ống durham.
Lưu ý: lượng môi trường trong ống nghiệm phải cao hơn ống durham. Cần loại bỏ
các ống durham có bọt khí sau khi hấp khử trùng.
Hấp khử trùng môi trường ở 1210C, 1atm, 15 phút.
Chuẩn bị:
Cồn 960
Nước cất

2 lít
5 lít

25