NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH

Mã số: CH. 1001190

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS. TS. NGUYỄN VĂN TUYẾN

Hà Nội - năm 2012


Lời cảm ơn!
Để hoàn thành ch-ơng trình cao học và viết luận văn này, tôi đã nhận đ-ợc
sự h-ớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô tr-ờng Đại học Khoa
học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội và Viện hóa học - Viện Khoa học và Công
nghệ Việt nam.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Phó Giáo s- - Tiến sĩ Nguyễn Văn Tuyến
- Viện tr-ởng - Tr-ởng phòng Hóa d-ợc - Viện hóa học - Viện Khoa học và Công
nghệ Việt nam đã giành rất nhiều thời gian và tâm huyết h-ớng dẫn nghiên cứu và
giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú và anh chị tập thể phòng Hóa d-ợc,
Phòng thí nghiệm Khối phổ - Viện hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt
nam đã tạo mọi điều kiện để tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn này.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Hóa học Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội, ng-ời thân và bạn
bè vì sự giúp đỡ quý báu, tận tình trong quá trình tôi học tập và nghiên cứu tại
Khoa hóa học - Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của đề tài cơ bản thuộc ch-ơng trình hợp
tác FWO-NAFOSTED (mã số: 01/2010) đã hỗ trợ kinh phí để hoàn thành luận
văn này.
Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình
và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong

nhận đ-ợc những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.
Hà nội ngày 12 tháng 12 năm 2012
Học viên

Nguyễn Tiến Dũng


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH ................................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ........................................................................................................ 2
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................... 5
1.1. BETA LACTAM ............................................................................................................. 5
1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM ........................................................................................ 6
1.2.1. Phản ứng Staudinger ................................................................................................. 6
1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể ................................................. 7
1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ......................................................... 10
1.3.1. Phƣơng pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym ...................................... 10
1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ .................................. 11
1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại ........................ 11
1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phƣơng pháp NMR ................................................... 12
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) .............................................................. 20
1.4.1. Khái niệm ............................................................................................................... 20
1.4.2. Phân loại ................................................................................................................. 20
1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................................. 20
1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo ............................................................................... 21
1.4.5. DETECTOR DAD.................................................................................................. 22
1.4.6. DETECTOR MS .................................................................................................... 23
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................................................ 25
2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu và trang thiết bị. ................................................................... 25

2.1.1. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ......................................................................... 25
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất. .............................................................................................. 25
2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng. 26
2.1.4. Các phƣơng pháp phân tích cấu trúc. ..................................................................... 26


2.2 Tổng hợp các hợp chất β-lactam..................................................................................... 28
2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic .......................................................... 28
2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine ........................................................................................ 29
2.2.3. Tổng hợp các dẫn xuất β- lactam........................................................................... 30
2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và 13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f........ 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 34
3.1. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT β-LACTAM ................................................................ 34
3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤTcis-β-LACTAM .............................................. 35
3.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9a ................................................................ 35
3.2.2. Phân tích phổ 1H –NMR của hợp chất 9b .............................................................. 36
3.2.3. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9c ................................................................ 36
3.2.4. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9d ................................................................ 37
3.2.5. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e ................................................................ 38
3.2.6. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e ................................................................ 38
3.3. XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỒNG PHÂN LẬP THỂ BẰNG HPLC-MS ....................... 40
3.3.1. Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ đối với các chất nghiên cứu ...................................... 40
3.3.2. Khảo sát phổ MS .................................................................................................... 43
3.3.3. Khảo sát chƣơng trình dung môi cho quá trình sắc ký ........................................... 44
3.4.4. Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký. .................................................... 46
KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 52
PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 54

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam .............................................................................. 3
Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1phenylbutan-1-ol............................................................................................ 10
Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1phenylbutan-1-ol............................................................................................ 10
Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA ........... 12
Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trƣờng hợp .............................. 13
Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel.................................................................................... 14
Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phƣơng pháp X-Ray ..... 14
Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B .................................................................... 16
Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS ............................................................................... 18
Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang ............................................................... 19
Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell). .... 20
Hình 3.1. Phổ 1H của hợp chất 9a ............................................................................ 32
Hình 3.2. Phổ 1H của hợp chất 9b ............................................................................ 33
Hình 3.3. Phổ 1H của hợp chất 9c............................................................................. 33
Hình 3.4. Phổ 1H của hợp chất 9d ............................................................................ 34
Hình 3.5. Phổ 1H của hợp chất 9e............................................................................. 35
Hình 3.6. Phổ 1H của hợp chất 9f ............................................................................. 35
Hình 3.7. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9a ....................................................... 37
Hình 3.8. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9b ...................................................... 38
Hình 3.9. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9c ....................................................... 38
Hình 3.10. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9d .................................................... 38
Hình 3.11. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Positive..................................... 40
Hình 3.12. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Negative ................................... 40
Hình 3.13. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1 ............... 42
Hình 3.14. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2 ............... 42
Hình 3.15. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3 ............... 42
Hình 3.16. Sắc ký đồ của hợp chất 9a ...................................................................... 43

Hình 3.17. Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a) .................................................... 44

Hình 3.18. Phổ MS của pic 2 (hợp chất 9a) .................................................... 44
Hình 3.19. Sắc ký đồ của hợp chất 9b ...................................................................... 45
Hình 3.20. Sắc ký đồ của hợp chất 9c ...................................................................... 46
Hình 3.21. Sắc ký đồ của hợp chất 9d ...................................................................... 47

1


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger ................................................................................. 3
Sơ đồ 1.2. Cơ chế phản ứng Staudinger ..................................................................... 4
Sơ đồ 1.3. Con đƣờng hình thành β –lactam .............................................................. 5
Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối (12) tổng hợp β-lactam ...................................................... 6
Sơ đồ 1.5. Sorbyl clorua (16) tổng hợp β-lactam ....................................................... 6
Sơ đồ 1.6. Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene ............................................. 7
Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ........................................... 26
Sơ đồ 2.2. Tổng hợp dẫn xuất imin .......................................................................... 26
Sơ đồ 2.3. Tổng hợp dẫn xuất cis-β-lactam ............................................................. 27
Sơ đồ 3.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ........................................... 31
Sơ đồ 3.2. Cơ chế hình thành chất 5a,b .................................................................... 32

2


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Ký hiệu

Chú thích

1

SKPB

Sắc ký phân bố

2

SKPD

Sắc ký pha đảo

3

SKPT

Sắc ký pha thuận

4

HPLC

High-performance liquid chromatography

5

MS

Mass spectrometry

6

NMR

Nuclear magnetic resonance

3


MỞ ĐẦU
Với sự biến đổi không ngừng của vi khuẩn, hàng loạt thuốc kháng sinh
không còn sử dụng đƣợc hoặc phổ tác dụng hẹp lại do khả năng kháng thuốc của
vi khuẩn. Làm giảm hiệu quả điều trị bệnh và gây ra những biến chứng không
mong muốn cho ngƣời bệnh.
Azetidin-2-ones (β-lactams) đại diện cho nhóm thuốc kháng sinh quan
trọng [9] và ứng dụng làm các synthon trong tổng hợp hữu cơ [13]. Để tạo ra
những loại thuốc mới, có hiệu lực điều trị cao và chƣa bị vi khuẩn kháng lại, thì
việc tổng hợp và bán tổng hợp β-lactam mới là một việc làm rất quan trọng.
Mặt khác, nhƣ ta đã biết hoạt tính sinh học của các đồng phân quang học
(đồng phân đối quang hoặc đồng phân lập thể không đối quang) là rất khác nhau
và việc tách các đồng phân đó thì rất tốn kém, tốn rất nhiều thời gian. Vì vậy
việc tổng hợp chọn lọc lập thể các đồng phân quang học là rất quang trọng, làm
giảm chi phí cho thực hiện quá trình tách, tăng hiệu quả điều trị.
Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc
và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất β-lactams, thu đƣợc từ phản
ứng tổng hợp theo phƣơng pháp Staudinger, bằng các phƣơng pháp hiện đại nhƣ
HPLC-MS và NMR.

4


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. BETA LACTAM
β-lactam đƣợc phân loại dựa theo cấu trúc vòng cơ sở và đƣợc chia thành
4 nhóm:








β-lactam kết hợp với vòng 5 cạnh bão hòa.
o

β-lactam có chứa vòng thiazolidine đƣợc gọi tên là penams (A)

o

β-lactam có chứa vòng pyrrolidine đƣợc gọi tên là carbapenams (B)

o

β-lactam hợp nhất để oxazolidine vòng đƣợc gọi tên là oxapenams
hoặc clavams (C)

β-lactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa:

o

β-lactam có chứa vòng thiazol 2,3-dihydro đƣợc gọi tên là penems
(D)

o

β-lactam có chứa vòng 2,3-dihydro-1H-pyrrole đƣợc gọi tên là
carbapenems (E)

β-lactam kết hợp với vòng 6 cạnh chƣa bão hòa:
o

β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-thiazine đƣợc gọi tên là
cephems (G)

o

β-lactam có chứa vòng 1,2,3,4-tetrahydro pyridin đƣợc gọi tên là
carbacephems (H)

o

β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-oxazine đƣợc gọi tên là
oxacephems (I)

β-lactam không kết hợp với bất kỳ một vòng nào đƣợc gọi tên là
monobactams

5

Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam
Hợp chất chứa vòng β-lactam đƣợc ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm
thuốc kháng sinh.
1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM
Azetidin-2-ones(β-lactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quan
trọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung gian
trong tổng hợp hữu cơ [13]. Nhiều phƣơng pháp tổng hợp β-lactam đã đƣợc phát
triển nhƣ: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắn thêm
carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14],[9].
1.2.1. Phản ứng Staudinger
Phản ứng Staudinger, phản ứng của ketene với các hợp chất chứa chức
imine, là phƣơng pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế β–lactam. Kể từ khi
đƣợc phát hiện ra bởi Staudinger [15], phản ứng này từ lâu đã đƣợc nghiên cứu
thực nghiệm và lý thuyết để hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập
thể. Nó đƣợc áp dụng để tổng hợp một loạt các cấu trúc β-lactam (Sơ đồ 1.1).
Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phƣơng pháp tốt nhất cho quá
trình tổng hợp β –lactam [14].

Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger
6


1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể
Cơ chế của phản ứng Staudinger đƣợc đƣa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tả
tốt nhất [15]. Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống
(LUMO) của nhóm đồng phẳng carbonyl ketene tạo ketene thế. Quá trình tấn
công xảy ra ở bên phía ít cản trở (cách tiếp cận exo), với mặt phẳng của imine
vuông góc với ketene, tạo ra các trung gian zwitterion (5) (sơ đồ 1.2).

Sơ đồ 1.2. Cơ chế phản ứng Staudinger
Hợp chất trung gian này đã đƣợc phát hiện và đặc trƣng bởi quang phổ IR
[22]. Chuyển động quay của các imine đi vào mặt phẳng của ketene xảy ra đồng
thời với việc đóng vòng conrotatory tạo ra sản phẩm β –lactam (6) trong đó
nhóm imine R1 và nhóm L của ketene là cis. Khi nhóm thế trên carbon sp2 của
imine (R1 trong sơ đồ) ổn định điện tích dƣơng, hợp chất trung gian zwitterioncó
thể bị đồng phân hóa tạo thành dạng cis của liên kết iminium vàtạo ra sản phẩm
trans-β-lactam (9). Tỷ lệ tƣơng đối của các quá trình sẽ xác định sản phẩm hóa
học lập thể của phản ứng ketene/imine.
Tính toán ab initio xác định sự có mặt của hợp chất trung gian zwitterion
và đóng vòng conrotatory [25]. Nghiên cứu tiếp theo [9] khẳng định bản chất
hai bƣớc của quá trình và chứng minh một số điểm tƣơng đồng với mô hình đề
xuất bởi Houk cho phản ứng conrotatory của cyclobutenes [18].
Gần đây, nghiên cứu mới của nhóm Xu [9] đề xuất một cơ sởđể giải thích
kết quả lập thể của phản ứng, xem xét lại mô hình đƣợc mô tả bởi Hegedus và
chỉ ra nguồn gốc động học của tỷ lệ cis/trans của sản phẩm β –lactam. Con

7


đƣờng đƣợc đề xuất cho sự hình thành β –lactam đƣợc mô tả dƣới đây (Sơ đồ
1.3).

Sơ đồ 1.3. Con đƣờng hình thành β –lactam
Khi sử dụng ketene dẫn xuất một lần thế thƣờng cho tấn công exo là ƣu
thế. Sản phẩm hóa học lập thể cuối cùng chịu ảnh hƣởng bởi bản chất của các
ketene và các hợp chất chức imine, vì nó là kết quả của sự cạnh tranh phản ứng
đóng vòng (k1) và phản ứng đồng phân hóa imine (k2). Tỷ lệ k1/k2 xác định tỷ lệ
cis/trans của sản phẩm β –lactam. Các tác giả đề xuất [9], bƣớc đóng vòng có

thể xảy ra dễ dàng hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolate
nhóm chức của imine hơn là quá trình electrocyclic. Tăng mật độ điện tử cho
ketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng
(tăng k1), dẫn đến hình thành chủ yếu cis- β –lactam. Mặt khác, làm giảm mật độ
electron của ketene thế và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị k1
và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans- β –
lactam. Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thế trên đồng phân là một yếu tố nhỏ
trong chọn lọc lập thể. Cuối cùng, sau khi so sánh các phản ứng tƣơng tự thực
hiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không có
ảnh hƣởng của sóng viba [15] hoặc ánh sáng trong độ chọn lọc lập thể của phản
ứng Staudinge [21].
Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hƣởng bởi tính chất của dung môi, các
dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis- β –lactam, trong khi
dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans. Ngoài ra, cách ketene
8


đƣợc hình thành và thứ tự của bổ sung các tác nhân, cũng ảnh hƣởng đến độ
chọn lọc lập thể của sản phẩm [27]. Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữa
ketene và tác nhân imine ảnh hƣởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm tƣơng
tự nhƣ nhiệt độ [19].
Một phƣơng pháp rất hiệu quả để thu đƣợc trans- β -lactam đƣợc phát
triển bởi Lectka và đồng nghiệp bằng cách sử dụng muối (12) nhƣ một anion
xúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4). Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acyl
clorua béo [28].

Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối 12 tổng hợp β-lactam
Việc sử dụng sorbyl clorua (16) nhƣ một một tiền chất của
butadienylketene thu đƣợc một số kết quả thú vị liên quan đến đồng phân lập thể
không đối quang. Khi phản ứng Staudinger đƣợc thực hiện với N-aryl imine, thu

đƣợc chủ yếu là sản phẩm trans, trong khi sử dụng N-akyl imine thu đƣợc chủ
yếu là cis- β –lactam (Sơ đồ 1.5)[24].

Sơ đồ 1.5. Sorbyl clorua (16)tổng hợp β-lactam

9


Việc chọn lọc trans cũng thu đƣợc trong phản ứng Staudinger giữa imine
và vinylketene chứa một γ – heteroatom. Cấu hình Z của nhánh vinyl của đồng
đồng phân lập thể có tác dụng ổn định vinylketene và sản phẩm chính là trans-3vinyl - β –lactam (Sơ đồ 1.6) [23].

Sơ đồ 1.6. Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene
1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
Phân tích các đồng phân đối quang là tách một hỗn hợp raxemic bằng các
phƣơng pháp vật lý và hóa học. Thông thƣờng, sự tách đƣợc thực hiện sau khi
chuyển từ đồng phân đối quang sang đồng phân “dia”; do các đồng phân đối
quang có các tính chất vật lý và hóa học giống nhau nên chúng không thể tách
bằng cách trực tiếp. Trong khi đó, các đồng phân “dia” có thể tách đƣợc bằng
các phƣơng pháp kết tinh chọn lọc, phƣơng pháp sắc ký hoặc phƣơng pháp
NMR.
1.3.1. Phƣơng pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym
Hầu hết các enzym có tính đặc hiệu với một loại cơ chất nhất định. Dựa
vào tính chất này, ngƣời ta đã sử dụng các enzym để chuyển hóa chọn lọc một
trong hai đối quang trong hỗn hợp. Ví dụ phản ứng thủy phân hỗn hợp raxemic
của este bằng enzym pig liver estease. Dƣới tác dụng của enzym này, chỉ có
đồng phân S đƣợc thủy phân. Nhờ đó mà ngƣời ta tách đƣợc hai đồng phân này
ra khỏi nhau.

10

1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ
Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có một
tâm bất đối thƣờng không thể tách ra khỏi nhau. Tuy nhiên, khi tham gia phản
ứng với các chất bổ trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bất đối, tạo thành sản
phẩm có từ hai tâm bất đối trở lên, có thể tách đƣợc bằng các phƣơng pháp hóa
lý khác nhau. Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách đƣợc
đôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp hai
đối quang với (+)-cinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau
bằng phƣơng pháp kết tinh. Phƣơng pháp này vẫn đƣợc sử dụng hiệu quả để
tách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau.

Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm
bất đối thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bất đối bổ trợ
khác. Các đồng phân “dia” nhận đƣợc có thể tách ra bằng các phƣơng pháp hóa
lý khác nhau. Cuối cùng các tác nhân bất đối bổ trợ đƣợc loại bỏ, thu đƣợc các
đồng phân đối quang tinh khiết.

1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại
Các đối quang có thể đƣợc tách nhờ các phƣơng pháp sắc ký khí (GC),
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral. Bản chất của các
phƣơng pháp này là các hỗn hợp đối quang tƣơng tác với pha tĩnh (tâm bất đối
trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tƣơng tác mạnh hơn với
11


tâm bất đối của cột. Đối quang có tƣơng tác yếu sẽ đƣợc rửa giải nhanh nhờ pha
động, kết quả là hai đối quang đƣợc tách ra khỏi nhau. Phƣơng pháp này thƣờng
đƣợc sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng. Nếu

phản ứng nhận đƣợc hỗn hợp có hai đồng phân đối quang A và B
(ee=enantiomer excess, de=diasteroisomer excess), độ chọn lọc đối quang đƣợc
xác định theo công thức:
ee 
de 

%enantiomerA  %enantiomerB
%enantiomerA  %enantiomerB

%diasteroisomerA  %diasteroisomerB
%diasteroisomerA  %diasteroisomerB

1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phƣơng pháp NMR
Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp
khác nhau, nhƣng phổ NMR là một phƣơng pháp hữu ích và phổ biến, vì nó
không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lƣợng nhỏ
hỗn hợp hai đồng phân đối quang. Các đồng phân khác nhau đƣợc xác định nhờ
độ dịch chuyển hóa học và hằng số tƣơng tác spin-spin của những nguyên tử
hydro trong từ trƣờng.
Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và 13C của hai đồng phân
“dia” sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau. Tỉ lệ của các đồng phân có
mặt trong hỗn hợp có thể tính toán đƣợc bằng sự phân tích các tín hiệu này. Nếu
trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng
phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ
nhỏ.
a). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher
Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai cấu hình của chúng sẽ
không phân biệt đƣợc bằng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, do tín
hiệu của chúng không đƣợc phân tách trong từ trƣờng. Để phân biệt đƣợc hai
cấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, ngƣời ta phải chuyển hợp chất

nghiên cứu thành đồng phân dia. Cơ sở của phƣơng pháp Mosher là chuyển hợp
chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của
hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit… Sau
đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đƣa ra đƣợc cấu hình của
chất ban đầu. Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan12


1-ol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để
tạo ra hai đồng phân dia nhƣ mô tả trong sơ đồ dƣới đây.

Hai đồng phân dia này sẽ đƣợc phân biệt rõ trên phổ cộng hƣởng từ hạt
nhân proton. Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este
Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trƣờng cao, trong khi
tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ
dịch chuyển về phía trƣờng thấp. Nhƣ vậy, ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu
hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu.

Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và
(R)-1-phenylbutan-1-ol

Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1phenylbutan-1-ol
13


Ngoài axit R-Mosher, hiện nay ngƣời ta đang nghiên cứu sử dụng một số
tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol,
amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ nhƣ các tác nhân bổ trợ sau.

b). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA)
Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tác nhân

hữu dụng nhất, cho ph p xác định nhanh tỷ lệ của các đồng phân lập thể. Khi có
mặt của chất này, các đối quang của lacton, amin và ancol trong từ trƣờng tạo ra
phổ không tƣơng đƣơng. Có thể là do cả hydroxyl và các hydro cacbinyl của
chất CSA tạo ra các tƣơng tác với các tâm bazơ. Ƣu điểm của của phƣơng pháp
này là không cần phải thực hiện các phản ứng chuyển hóa thành các dẫn xuất
với tác nhân bổ trợ nên hạn chế đƣợc quá trình raxemat hóa, đặc biệt là có thể sử
dụng để xác định cấu hình của các chất có hàm lƣợng nhỏ.

Ví dụ, để nghiên cứu cấu hình của hai đối quang oxaziridin nhờ tác nhân
bổ trợ CSA, kết quả do tƣơng tác cầu hydro của oxazirindin với CSA tạo thành
phức dia, dẫn đến một số tín hiệu của hai đối quang đƣợc tách biệt trong từ
trƣờng. Nghiên cứu của phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đồng phân (-)-oxaziridin
khi không có tác nhân chuyển dịch CSA thì các tín hiệu proton không phân biệt
đƣợc trong từ trƣờng, nhƣng khi cho kết hợp với (S)-(+)-CSA thì các tín hiệu
của metyl, metin đƣợc tách ra. Dựa vào phổ này, ngƣời ta có thể xác định đƣợc
tỷ lệ hai đồng phân đối quang của oxaziridin.

14


Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA
c). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3)
Tác nhân Eu(hfc)3 là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm
bất đối. Khi tác nhân Eu(hfc)3 kết hợp với nhóm chức (NH2, OH, SH …) trong
phân tử có một trung tâm bất đối sẽ tạo thành đồng phân “dia”. Phức dia tạo
thành có một số proton đƣợc tách ra trong từ trƣờng và chuyển về trƣờng thấp.
Sự tách biệt và độ chuyển dịch về phía trƣờng thấp của một số proton phụ thuộc
vào nồng độ của tác nhân phức Eu(hfc)3.

Ví dụ, nghiên cứu phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đối quang (R,S)-1axetyl-1-phenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệt

đƣợc trong từ trƣờng. Tuy nhiên, khi đƣợc tạo phức với tác nhân chuyển dịch
Eu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu. Nhóm metyl (triplet) đƣợc tách thành hai triplet
có cƣờng độ tƣơng đƣơng nhau. Sự tách tín hiệu của proton trong từ trƣờng phụ
thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch.
Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp (R,S)-1axetyl-1-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều đƣợc tách ra và có độ
15


chuyển dịch hóa học chuyển về phía trƣờng thấp. Sự tách tín hiệu và độ chuyển
dịch hóa học proton ở nhóm CH3 của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng. Đối
với (R)-1-axetyl-1-phenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH3 đƣợc chuyển
dịch về phía trƣờng cao so với (S)-1-axetyl-1-phenylbutan. Nhƣ vậy, có thể phân
biệt và xác định đƣợc tỷ lệ hai đồng phân (R)-1-axetyl-1-phenylbutan và (S)-1axetyl-1-phenylbutan nhờ 1H-NMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyển
dịch Eu(hfc)3 (xem hình 5).

Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trƣờng hợp
1.3.5. X-ray tinh thể
a. Giới thiệu chung
Phƣơng pháp X-ray phân tử là phƣơng pháp hiện đại nhất để xác định cấu
trúc phân tử của một hợp chất hữu cơ. Từ phƣơng trình Bragg, ngƣời ta tính toán
độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục
tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lƣợng phân tử (n) xây
dựng nên tế bào cơ sở.
Phƣơng trình Bragg: 2d.sin(θ) = nλ
Thể tích tế bào cơ sở: V = abc(1-cos2α-cos2β-cos2γ+2cosαcosβcosγ)1/2
Số lƣợng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.1023 (d: tỷ trọng
g/cm3)
Mặt khác, khi chiếu bức xạ tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kết sẽ
phát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xạ theo hai hƣớng (h,k,l) và hƣớng ngƣợc
lại (-h,-k,-l). Cƣờng độ của tín hiệu Friedel (Fhkl, F-h,-k-l) đƣợc tính toán nhờ

cƣờng độ của tín hiệu nhiễu xạ (Ihkl) (|Fhkl| = (Ihkl)1/2).
16


H,K,L

-H,-K,-L

Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel
Mật độ electron tại một điểm trong tế bào cơ bản sẽ đƣợc tính toán bằng
công thức:
ρ(x,y,z) = [ Σhkl Fhkl exp{-2p(hx + ky + lz)}] / V
Bằng cách đo cƣờng độ của tất cả các tín hiệu nhiễu xạ Ihkl theo mặt h,k,l
khi đã biết đƣợc các thông số cơ bản của tế bào cơ sở theo phƣơng trình Bragg ở
trên, ngƣời ta sẽ tính toán đƣợc mật độ electron tại mọi điểm trong không gian
của tế bào cơ sở, từ đó có thể xây dựng đƣợc bản đồ mật độ điện tích của phân
tử.Từ dữ liệu bản đồ mật độ electron, chƣơng trình máy tính sẽ dựng đƣợc cấu
trúc không gian ba chiều của phân tử. Quá trình xác định cấu trúc của hợp chất
hữu cơ bằng phƣơng pháp X-ray phân tử có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phƣơng pháp X-Ray
b. Xác định cấu hình tuyệt đối
Phƣơng pháp X-ray tinh thể có khả năng xác định chính xác cấu hình
tuyệt đối của một phân tử, nếu trong phân tử có nguyên tử có tán xạ tia X bất
thƣờng. Để xác định cấu hình tuyệt đối của phân tử bằng phƣơng pháp X-ray
tinh thể ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp của Bijvoet và phƣơng pháp so sánh chỉ
số R.
17

Phƣơng pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi đƣợc chiếu bức xạ tia
X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thƣờng Friedel, lợi dụng nguyên tắc này
Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu của
cặp bức xạ Friedel ở trung tâm bất đối phản xạ theo hƣớng (h,k,l) và hƣớng
ngƣợc lại (-h,-k,-l), để xác định cấu hình tuyệt đối.
Phƣơng pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R đƣợc xây dựng trên cơ sở hàm
thống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và đƣợc
so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang. Nếu giá
trị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá lại các giá
trị này bằng phƣơng pháp thống kê.
Nhƣ vậy, cả hai phƣơng pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt có
cƣờng độ cao do ảnh hƣởng của cấu trúc ở những trung tâm bất đối của phân tử
mà chƣa so sánh đƣợc những tia tán xạ yếu. Những yếu tố tán xạ yếu chỉ đƣợc
sử dụng khi dữ liệu X-ray có số lƣợng lớn. Phƣơng pháp X-ray tinh có thể sử
dụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi.
Với những chất quang hoạt không tồn tại ở dạng đơn tinh thể, ngƣời ta có
thể xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng với
một chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bất đối đã biết cấu hình tuyệt
đối. Các hợp chất có cấu hình tuyệt đối đã biết đƣợc chọn để nghiên cứu trong
phƣơng pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận đƣợc dạng đơn
tinh thể. Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bằng
phân tích X-ray đƣợc thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kết
với chất nghiên cứu. Ngoài ra, việc đƣa nhóm nguyên tử nặng nhƣ halogen (Cl,
Br, I) vào phân tử hợp chất quang hoạt cũng cho ph p xác định cấu hình tuyệt
đối của chất đó nhờ phƣơng pháp Bijvoet ở trên.

Ví dụ hidroxy lacton chƣa biết cấu hình tuyệt đối đƣợc chuyển thành este
với axit Mosher để tạo thành đồng phân dia. Trong trƣờng hợp chất tạo thành
thu đƣợc dƣới dạng đơn tinh thể, cấu hình tuyệt đối của hydroxy lacton đƣợc
18

xác định thông qua cấu hình tuyệt đối đã biết của phần tác nhân Mosher thông
qua phân tích phổ X-ray.
1.3.6. Phổ CD
Phƣơng pháp phổ CD cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản của hiệu ứng
Cotton, cơ sở của phƣơng pháp này là nghiên cứu bƣớc chuyển ở trung tâm bất
đối (circular dichroism) hay còn gọi là phổ nhị sắc tròn. Việc xác định phổ CD
rất phức tạp, vì nó phụ thuộc vào bản chất của hợp chất nghiên cứu, chỉ có
những hợp chất có bƣớc chuyển n---->π* và π---->π* (có nhóm mang màu) mới
đo đƣợc hiệu ứng Cotton. Trong trƣờng hợp chất cần nghiên cứu không có bƣớc
chuyển n---->π* và π---->π* cần phải gắn thêm một nhóm mang màu vào phân
tử. Xác định cấu hình tuyệt đối của một hợp chất hữu cơ đƣợc thực hiện nhờ so
sánh hiệu ứng Cotton của nó với hiệu ứng Cotton của chất có cấu trúc tƣơng tự
đã biết về cấu hình tuyệt đối. Nhƣ vậy, cần phải có nhiều hợp chất có cấu trúc
tƣơng đồng đã biết để so sánh và xác định cấu hình tuyệt đối của chất cần
nghiên cứu.
Ví dụ, khi muốn xác định cấu hình của flavan mới, ngƣời ta phải so sánh
hiệu ứng Cotton của hợp chất cần nghiên cứu với hiệu ứng Cotton flavan đã biết
trƣớc cấu hình tuyệt đối. Hợp chất flavan B đã biết cấu hình tuyệt đối, hợp chất
flavan A chƣa biết cấu hình tuyệt đối, hiệu ứng Cotton của A và B trên phổ CD
là tƣơng tự nhau nhƣng có chiều ngƣợc nhau, nên cấu hình tuyệt đối của A là
ngƣợc so với B.

Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B
Ngoài ra, với các phân tử hữu cơ quang hoạt có chứa các phần mang màu
đã biết việc phân tích phổ CD cho ph p xác định đƣợc cấu hình tuyệt đối của
cacbon bất đối trong phần mang màu này.

19

1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
1.4.1. Khái niệm
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một
phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột
là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên
một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên kết hóa học với
các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và
phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lƣợng tốt, thích hợp tách
các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng, nhƣ phân tích các
hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh
vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng…
1.4.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời ta
chia HPLC thành 4 loại:


Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).



Sắc ký phân bố (partition chromatography).



Sắc ký ion (ion chromatography).



Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Riêng SKPB đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa
pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thƣờng – SKPT (normal phase
chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong đó, sắc ký pha đảođƣợc sử dụng nhiều hơn cả.
1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ đƣợc
gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:


Pha tĩnh đƣợc giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý →
sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).

20