TÀI LIỆU THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ

GIỚI THIỆU MỘT SỐ ENZYME
THÔNG DỤNG TRONG SINH HỌC
PHÂN TỬ

Phạm Trần Đăng Thức



MỤC TIÊU

Hiểu được vai trò và ý nghĩa một số loại enzyme thông dụng
trong SHPT
 Biết cách thiết lập 1 phản ứng enzyme

2


CÁC NHÓM ENZYME
• Nuclease
• Ligase
• Polymerase

3


NUCLEASE

4


NUCLEASE – ENZYME CẮT GIỚI HẠN

(RESTRICTION ENZME)
palindromic
5’-GGATCC-3’
Bam H1 site:
3’-CCTAGG-5’

5


ENZYME CẮT GIỚI HẠN (TT)

6


ENZYME CẮT GIỚI HẠN (TT)

Derivation of the EcoRI name
Abbreviation

Meaning

Description

E

Escherichia

genus

co

coli

species

R

RY13

strain

I

First identified

order of identification
in the bacterium

7


ỨNG DUNG CỦA ENZYME CẮT GIỚI HẠN

RFLP

8


ỨNG DUNG CỦA ENZYME CẮT GIỚI HẠN
• TẠO PHÂN TỬ DNA TÁI TỒ HỢP

9


LIGASE

10


POLYMERASE

Taq polymerase – PCR thông thường
Pfu polymerase – PCR thu nhận gene
11


THIẾT LẬP PHẢN ỨNG ENZYME
+ Enzyme là thành phần cho sau cùng.
+ Tổng thể tích enzyme ≤ 1/10 tổng thể tích phản ứng
+ dd mẹ nX cần được pha lõang thành 1X
+ Phản ứng phải được ủ ở nhiệt độ và thời gian phù hợp
+ Rnase họat động không cần đệm
+ Độ tinh sạch của DNA quyết định hiệu quả phản ứng cắt giới hạn

12


THIẾT LẬP PHẢN ỨNG ENZYME

13

BÀI TẬP
Thiết lập phản ứng thủy giải 5 ng DNA plasmid bằng 2 enzyme
BamHI, HindIII. Biết:
- Dung dịch plasmid có OD260 là 0.1
- 1 unit BamHI/HindIII thủy giải được 2.5 ng DNA plasmid
- BamHI/HindIII sử dụng có nồng độ 1u/µl
- dung dịch đệm thích hợp cho 2 enzyme10X

14


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ĐIỆN DI PLASMID

15


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ ĐIỆN DI PLASMID
Xác định kích thước plasmid => cắt mở vòng plasmid

16


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG
CẮT GIỚI HẠN
Nguyên nhân:
Lượng DNA/enzyme
Hoạt tính enzyme suy giảm
Điều kiện thực hiện phản ứng

Complete

Incomplete
17


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG
CẮT GIỚI HẠN

18


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG NỐI

19


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PHẢN ỨNG THỦY
GIẢI NUCLEIC ACID

Rnase+

Rnase-

20


THỰC HÀNH
1. Chuẩn bị dụng cụ hóa chất.

2. Bổ sung đủ và đúng thứ tự các thành phần vào EPPENDORF 0.5 ML

Nước cất
plasmid

enzyme
buffer

1. LY TÂM NGẮN để kéo các thành phần xuống đáy ống
2. Đặt phản ứng vào NHIỆT ĐỘ thích hợp

3. Bổ sung dung dịch nạp mẫu dừng phản ứng
4. Điện di phân tích kết quả


THỰC HÀNH (TT)
Nhóm 1-> 6: Đặt phản ứng cắt plasmid bằng RE
- DNA plasmid (pBS) 4 ul
- DD đệm (buffer) 10X 2 ul
- H2O
13 ul
- RE
1 ul (THÀNH PHẦN CHO VÀO SAU CÙNG)
Ủ 1h ở 37oC
Nhóm 7-8: Đặt phản ứng nối thang lamda HindIII với DNA T4 ligase
-DNA lamda HindIII 1 ul
-DD đệm (buffer) 10X 1 ul
-H2O
7 ul
-DNA T4 ligase

1 ul (THÀNH PHẦN CHO VÀO SAU CÙNG)
Ủ 1h ở 16oC (ĐẶT TRÊN KHAY NƯỚC ĐÁ ĐANG TAN)
Nhóm 9-10: Đặt phản ứng thủy giải RNA bằng RNAse cho hỗn hợp
DNA/RNA
- DNA/RNA
9 ul
- RNAse A
1 ul
Ủ 30 phút ở 37oC

Dùng dd nạp mẫu dừng các phản ứng

22