Báo cáo nghiên cứu phân lập vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides từ cà phê nhân tươi

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KTMT

BÁO CÁO THỰC TẬP

PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẨN
Leuconostoc mensenteroides CÓ KHẢ
NĂNG LÊN MEN CÀ PHÊ

Tp.HCM, 04/ 2016


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập tại ........
Với lòng biết ơn sâu sắc, chúng em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý
Thầy, Cô giáo khoa Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Môi trường Trường Đại học
Công nghiệp Thực phẩm TP. HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức, những kỹ năng
thiết yếu cho chúng em sau này.
Chúng em xin chân thành cảm ơn Công ty TNHH SX TM DV Trí Tuệ Việt đã
hỗ trợ kinh phí và máy móc trang thiết bị để chúng em có thể hoàn thành đề tài
nghiên cứu này.
Chúng em chân thành cảm ơn thầy ..... , thầy đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt
kiến thức, kinh nghiệm và giúp đỡ chúng em trong suốt thời gian thực tập.
Vì thời gian có hạn, cũng như còn hạn chế về mặt kiến thức, chắc chắn rằng bài
báo cáo còn nhiều thiếu sót. Chúng em kính mong nhận được sự góp ý, nhận xét,
cũng như đánh giá từ Quý Thầy Cô.
Nhóm em xin chân thành cảm ơn!
TP.HCM, tháng 04/ 2015.

Sinh viên thực hiện


LỜI CAM ĐOAN

Nhóm em xin cam đoan rằng báo cáo thực tập này là do nhóm thực hiện. Các
số liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ
bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào.

Ngày 29 tháng 04 năm 2016
Sinh viên thực hiện


MỤC LỤC


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Tỷ lệ giữa các thành phần cấu tạo của quả cà phê.................................9
Bảng 2.2: Cấu tạo các loại đường trong vỏ cà phê...............................................13
Bảng 4.1: Kết quả quan sát đại thể, nhuộm Gram................................................34
Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa................................................................36
Bảng 4.3: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme cellulase........................................36
Bảng 4.4: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme pectinase.......................................37
Bảng 4.5: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme amylase.........................................37
Bảng 4.6: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme protease........................................37

5


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cây cà phê chè........................................................................................5
Hình 2.2: Hoa, trái, cây cà phê vối.........................................................................6
Hình 2.3: Cây, trái, lá cây cà phê mít.....................................................................7
Hình 2.4: Hạt cà phê Culi.......................................................................................8
Hình 2.5: Hạt cà phê Moka.....................................................................................9
Hình 2.6: Cấu tạo giải phẫu quả cà phê...............................................................15
Hình 2.7: Vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides..................................................15
Hình 2.8: Sơ đồ quá trình lên men lactic dị hình..................................................17
Hình 3.1: Sơ đồ phân lập và định danh vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides....28
Hình 4.1: Khả năng tăng trưởng của vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides trong môi
trường có bổ sung dịch chiết cà phê
.............................................................................................................................. 38
Hình 4.1: Kết quả thử nghiệm catalase.................................................................39
Hình 4.2: Kết quả thử nghiệm khả năng di động..................................................39
Hình 4.3: Kết quả thử nghiệm sinh acid................................................................40
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm sinh hơi.................................................................40
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm indol......................................................................41
Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm dương tính sinh khả năng sinh enzyme cellulase. .41
Hình 4.6: Kết quả thử nghiệm dương tính sinh khả năng sinh enzyme pectinase..41
Hình 4.7: Kết quả thử nghiệm dương tính sinh khả năng sinh enzyme amylase....42
Hình 4.8: Kết quả thử nghiệm dương tính sinh khả năng sinh enzyme protease...42

6


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD:

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HCM: Hồ Chí Minh
CNSH: Công nghệ Sinh học
PTN: phòng thí nghiệm
TNHH SX TM DV: Trách nhiệm hữu hạn sản xuất thương mại dịch vụ

7


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

LỜI MỞ ĐẦU
Việt nam là một trong những quốc gia có sản lượng xuất khẩu cà phê lớn. Được
xuất khẩu sang nhiều nước trên thế giới, trong đó 14 thị trường đứng đầu đã chiếm đến
80% tổng kim ngạch xuất khẩu cà phê của cả nước. Xuất khẩu cà phê chế biến, cà phê
rang, cà phê hòa tan ngày càng tăng trong vài năm trở lại đây, một số thị trường chính
như là: Trung Quốc, Nga, Hồng Kông, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ.
Cà phê được sử dụng ngày càng nhiều vì trong hạt cà phê chứa 0,8-3% cafeine,
một hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh, giúp tế bào não tăng cường khả năng
làm việc, khả năng tư duy, thúc đẩy hoạt động của hệ tuần hoàn, tăng cường phản ứng

của cơ bắp. Nhu cầu hưởng thụ cuộc sống ngày càng cao của con người đòi hỏi muốn
thưởng thức cà phê thơm ngon hảo hạng hơn thì sự ra cạnh tranh của nhiều loại cà phê
là điều khó tránh khỏi. Hiện nay trên thế giới có hai loại cà phê đắt nhất là “cà phê
phân chồn”, “cà phê phân voi”. Tuy nhiên thì những loại này lại khá hiếm. Bên cạnh
đó, nhiều nghiên cứu cho rằng vi khuẩn lactic, nấm men có khả năng lên men cà phê,
đóng vai trò quyết định đến chất lượng hương vị cà phê sau lên men.
Xuất phát từ nhu cầu muốn cải thiện chất lượng hương vị cà phê nhờ vào vi
sinh vật thay vì sử dụng phương pháp truyền thống. Nhóm chúng em chọn vi khuẩn
Leuconostoc mesenteroides, một loại vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn lactic. Với hy
vọng tìm ra chủng có hoạt tính lên men tốt, tạo ra bước đột phá trong công nghệ chế
biến cà phê. Vì mục đích đó, chúng em chọn đề tài: “Phân lập và sàng lọc vi khuẩn
Leuconostoc mesenteroides có khả năng lên men cà phê nhân tươi”
1. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và sàng lọc vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides có khả năng lên men cà phê
nhân tươi.
2.
─
─
─

Nội dung nghiên cứu
Thu thập và chuẩn bị mẫu cà phê và mẫu kim chi
Tăng sinh vi sinh vật trong môi trường MRS lỏng.
Cấy trải phân lập dịch tăng sinh và thực hiện làm thuần mẫu trên các đĩa petri.
8


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

─ Tiến hành một số thử nghiệm sinh hóa tiêu biểu theo khóa phân loại Bergey để
xác định loài.
─ Sàng lọc đốitượng có khả năng sinh enzyme cellulose, amylase, protease và
peptinase.
3. Tóm tắt kết quả thực tập
Nhóm đã tiến hành thu thập được 4 loại mẫu gồm một mẫu cà phê chín, có
nguồn gốc từ huyện Ngọc Hồi, Gia Lai và ba mẫu kim chi hiện được bán trên thị
trường.
Thực hiện tăng sinh và cấy phân lập từ bốn mẫu thu nhận được 11 dòng khuẩn
lạc khác nhau.
Thử nghiệm sinh hóa và khẳng định được 6 chủng gồm KB2, KC1, KC2, CP5, CP7,
CP8 có khả năng là đối tượng cần tìm.
Những chủng nghi ngờ là Leuconostoc mesenteroides sẽ tiếp tục được sàng lọc khả
năng sinh enzyme, sinh acid và chọn ra được KB2 và KC2 có khả năng sinh enzyme
cellulose cao nhất. Chủng CP7 và KB2 có khả năng sinh enzyme pectinase cao nhất.
Khả năng sinh enzyme amylase và protease cao nhất lần lượt là KC1 và CP7.

9


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ĐƠN VỊ THỰC TẬP
1.1. Công ty TNHH SX TM DV Trí Tuệ Việt
1.1.1.

Giới thiệu chung

Công ty TNHH SX TM DV Trí Tuệ (Vintell) được thành lập vào ngày
24/12/2017. Địa chỉ 49/53 Phạm Văn Bạch, phường 15, quận Tân Bình, thành phố Hồ
Chí Minh. Xưởng thực nghiệm: 137A Đường số 13, phường Bình Hưng Hòa, quận
Bình Tân, thành phố Hồ Chí Minh.
1.1.2.
Cơ cấu tổ chức
Công ty có 3 phòng ban: Phòng kỹ thuật, phòng nghiên cứu và phòng hành
chính.

• Phòng kỹ thuật: 4 nhân viên
• Phòng nghiên cứu: 12 nhân viên
• Phòng hành chính: 2 nhân viên
1.1.3.
Tầm nhìn – sứ mạng
 Tầm nhìn:
- Phát triển một doanh nghiệp khoa học – công nghệ.
 Sứ mạng:
- Phát triển công nghệ thực phẩm và công nghệ lên men.
- Nâng cao đời sống nhân viên.
- Hoạt động bác ái xã hội.
1.1.4.
Lĩnh vực hoạt động, đối tượng khách hàng
 Lĩnh vực hoạt động:
- Sản xuất trang thiết bị chế biến thực phẩm.
- Nghiên cứu và chuyển giao công nghệ thực phẩm, công nghệ vi sinh vật.
- Sản xuất chế phẩm vi sinh vật.và thiết bị ozone công nghiệp.
 Đối tượng khách hàng:
- Đối tượng khách hàng của công ty là các nhà máy chế biến thực phẩm, các
-

trường học và bệnh viện.
Khách hàng thân thuộc: Masan group, Vietfarm, Vĩnh Hảo, Sanmiguel, Maxi

-

Mark, Việt My, Friadaia, Cô Hai Cẩm và các trường mầm non…
Khách hàng tiềm năng: các công ty chế biến thực phẩm khởi nghiệp.

10


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tổng quan về cây cà phê

2.1.

2.1.1. Nguồn gốc
Trên thế giới cây cà phê chè đầu tiên mọc hoang dại ở cao nguyên Etiôpia ( châu
Phi). Sau đó đưa sang A-Rập từ thế kỷ 13 – 14. Thế kỷ 17 được đưa sang Ấn Độ, năm
1658 sang Xrilanca, và từ đó sang đảo Java ( Indonexia). Sau đó người ta phát hiện ra
cà phê chè (C. Aribia) khó trồng ở xứ nóng và ẩm, do đó đã bắt đầu nghiên cứu và
phát hiện ra những loài cà phê khác thay thế cho cà phê như C.canephora, C.liderica
mọc hoang dại ở miền rừng núi ẩm của Châu Phi.
Ở Việt Nam, cây cà phê chè (Aribica) xuất hiện ở Quảng Trị năm 1857. Đến
1870 đã thấy một số cây cà phê chè ở nhà tu thiên giáo (Hà Nam Ninh). Năm 1910,

xuất hiện những đồn cà phê vối (C. robusta) và cà phê mít (C. exselea) (Hoàng Minh
Trang, 1983).
Các loại cà phê đều thuộc giống coffea, gồm 70 loại khác nhau, chỉ có khoảng 10 loại
đáng chú ý về giá trị trồng trọt. Trên thế giới hiện nay có 3 loại chính:
•

Cà phê chè (Coffea arabica L).

•

Cà phê vối (Coffea robusta).

•

Cà phê mít (Coffea exselea chev).

Ngoài ra còn có các loài cà phê như cà phê Moka, cà phê Culi… Nhưng trong đó cà
phê vối (cà phê robusta) được trồng với số lượng lớn ở Việt Nam, mang lại giá trị cao
(Hoàng Minh Trang, 1983).
2.1.2. Các giống cà phê
Trên thế giới, hiện nay có hai loài cà phê có giá trị kinh tế nhất là:
- Coffea Arabica ( cà phê chè)
- Coffea canephora hay Coffea robusta ( cà phê vối)
Ngoài ra, Coffea excels ( cà phê mít) cũng được trồng, tuy nhiên có năng suất và chất
lượng kém hơn hai loài trên (Hoàng Minh Trang, 1983).
2.1.2.1.

Cà phê chè ( Coffea Arabica L)
11
Hình 2.1: Hình ảnh cây cà phê chè

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

Giới: Thực vật
Ngành: Magnoliopsida
Bộ: Gentinales
Họ: Rubiaceae
Chi: Coffea
Loài: Coffea Arabica
(Nguồn:

/>
hoay-tim-huong-go/)
Cà phê arabica có nguồn gốc từ Cao Nguyên nhiệt đới Ethiopia đông Phi Châu.
Arabica cao từ 3 – 7 m tùy điều kiện đất đai, khí hậu, độc thân hoặc nhiều thân, lá nhỏ
hình oval hoặc lưỡi mác, cành nhỏ mảnh khảnh ít phân nhánh, tán nhỏ, quả hình bầu
dục đôi khi hình tròn, quả chín có giống màu đỏ tươi, đường kính 10 – 15 mm, thường
có hai nhân, hiếm khi có ba nhân, cuống quả khi chín rất mềm dễ rụng, nứt khi trời
mưa. Thời gian nuôi quả 6 – 7 tháng, khí hậu lạnh ở miền Bắc, Arabica chín rộ vào
tháng 12 -1 năm sau và muộn hơn 2 -3 tháng so với Tây Nguyên. Khoảng 800 – 1200
quả/kg, cứ 2,5 – 3 kg hạt cho ra 1 kg nhân, nhân có màu xám xanh, xanh lục,xanh
nhạt, … Tùy theo phương thức chế biến lượng caffeine trong nhân khoảng 1 -3%.
Các chủng cà phê arabica: Typica, Bourbon,
Caturra, Mundo Novo, Maragogype, Pacas,
Catimor (Nguyễn Thị Hiền, 2010).
2.1.2.2.

Cà phê vối ( Coffea robusta)

Giới: Thực vật
Ngành: Magnoliopsida
Bộ: Gentinales
Họ: Rubiaceae
Chi: Coffea
12


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

Loài: Coffea canephora
Có nguồn gốc từ khu vực sông Conggô và miền núi thấp xích đạo và nhiệt đới Tây Phi
Châu. Robusta cao 5 – 7 m, độc thân hoặc nhiều thân, cành khá lớn phân nhiều nhánh,
tán rộng, lá trung bình mặt lá gồ ghề. Đặc biệt, hoa robusta không bao giờ ra lại vào
mùa sau tại vị trí cũ, quả chín màu đỏ sẫm, đường kính 10 – 13 mm, hình bầu dục hoặc
tròn có hai nhân đôi khi một nhân, vỏ quả cứng và cuống dai hơn arabica. Cứ khoảng
3 kg quả cho ra 1 kg nhân, nhân hình bầu dụchơi tròn có màu xám xanh, xanh bạc,
vàng mỡ gà,…Tuỳ thuộc vào cách chế biến lượng caffein có khoảng 1,5 – 3%.
Giống như cà phê chè (cà phê arabica), cây cà phê vối 3-4 tuổi có thể bắt đầu thu
hoạch. Cây cho hạt trong khoảng từ 20 đến 30 năm. Cà phê vối ưa sống ở vùng nhiệt
đới, độ cao thích hợp để trồng cây là dưới 1000 m. Nhiệt độ ưa thích của cây khoảng
24-29°C, lượng mưa khoảng trên 1000 mm. Cây cà phê vối cần nhiều ánh sáng mặt
trời hơn so với cây cà phê chè

Hình 2.2 : Hình ảnh hoa, trái cây cà phê vối

(Nguyễn Thị Hiền, 2010).
2.1.2.3.

(Nguồn: />
Cà phê mít ( Coffea exseles

phe)

Chev)
Giới: Thực vật
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Gentianales
Họ: Rubiaceae
Chi: Coffea
Loài: Coffea excels
Có nguồn gốc ở xứ Ubangui Chari
thuộc Biển Hồ gần xa mạc Xahara, du
nhập vào Việt Nam năm 1905, cây lớn
cao 6 – 15 m lá to hình trứng hoặc hình
lưỡi mác, gân lá nổi lên ở mặt dưới,
cành lớn tán rộng. Quả hình bầu dục,
núm to và lồi, tùy điều kiện khí hậu
vùng đất quả sẽ chín sớm hơn hoặc
Hình 2.3 : Cây, quả, lá cây cà phê mít
13 />(Nguồn:


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

cùng lúc với thời điểm cây ra hoa, cà phê mít có đặc điểm ra hoa tại vị trí cũ vào vụ kế
tiếp nên vào vụ thu hoạch (tháng 5 – tháng 7) trên tại một đốt cành có thể có cùng lúc
quả xanh, quả chín, nụ, hoa. Đây là yếu tố bất lợi cho thu hoạch và giảm năng suất
(Nguyễn Thị Hiền, 2010).
Ngoài ra còn có các loại cà phê như:
2.1.2.4. Cà phê Culi
Cà phê Culi trong tiếng Anh là peaberry và tiếng Tây Ban Nha là Caracol, là một
dạng đột biến. Trong hầu hết các trường hợp, một trái cà phê chín sẽ chứa hai hạt cà
phê. Tuy nhiên, khi một trong những noãn của nhân không phát triển, noãn còn lại
không bị áp lực, sẽ phát triển tạo thành một hình dạng tròn không có mặt phẳng và nó
được gọi là hạt cà phê Culi. Nhân cà phê Culi tròn, sau khi qua chế biến, nhân cà phê
sẽ được chọn, tách ra khỏi các hạt cà phê dẹp bình thường và được bán như một dòng
cà phê riêng biệt.
Vị đắng gắt, hàm lượng cafein cao.

Hình 2.4 : Hạt cà phê Culi
( />
2.1.2.5. Cà phê Moka
Cà phê Moka là một loài cà phê thuộc chi Arabica, được người Pháp di thực từ
những năm 30 của những thế kỉ. Tại Việt nam thôi, thì loại cà phê này hiện còn rất ít
14


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

tại Đà Lạt, nguyên nhân chính dẫn đến điều này là vì năng suất của cây Moka rất thấp,

sức chống chọi với sâu bệnh kém, cành lá thì xác xơ so với loại Catimor cũng được
cho là một chủng thuộc Arabica, nhưng to khỏe cho trái nhiều.
Cà phê Moka có mùi thơm quyến rũ, ngào ngạt, vị nhẹ, sản lượng rất thấp nên giá
thành rất cao, gấp 2 -3 lần cà phê robusta.
2.1.3. Tổng quan về quả cà phê Robusta
2.1.3.1. Cấu tạo
Quả cà phê bao gồm các phần như sau: Lớp vỏ quả, lớp nhớt, lớp vỏ trấu, lớp vỏ lụa,
nhân.
Bảng 2.1: Tỉ lệ giữa các thành phần cấu tạo của quả cà phê: (tính theo % quả tươi)
Thành phần
Cà phê chè (arabica)
Cà phê vối (canephora)
Vỏ quả
43 – 45
42
Lớp nhớt
20 – 23
23
Vỏ trấu
6–8
6-8
Nhân và vỏ lụa
26 – 30
29
Hình 2.5 : Hạt cà phê Moka
(Hoàng Minh Trang, 1983).
(Nguồn: />
Hình 2.6 : Cấu tạo giải phẩu quả cà phê
(Nguồn: />2.1.3.2.

Thành phần hóa học của quả cà phê
Phần nhiều là các chất đường (bột) chất béo, nước, acid béo thực vật, alkaloid

như caffeine và các chất khoáng cũng như chất hương liệu.
Vỏ quả: Vỏ quả khi chín có màu đỏ, là chất antoxian, trong đó có vết của alcaloid,
tanin, cafein, và các loại enzim. Trong vỏ quả có từ 21,5 – 30% chất khô.
15


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

Vỏ thịt: Phía dưới vỏ quả là lớp nhớt, nó gồm những tế bào mềm không có cafein,
tanin, có nhiều đường và pectin. Độ pH của lớp thịt phụ thuộc vào độ chín của quả,
hường từ 5,6 – 5,7, đôi khi lên đến 6,4. Trong lớp nhớt có enzim pectinase phân giải
pectin trong quá trình lên men
Vỏ trấu: Vỏ trấu chứa cellulose là chủ yếu. Trong vỏ trấu có một ít cafein, khoảng
0,4% do từ nhân khuếch tán ra lúc lên men hoặc lúc phơi khô. Vỏ trấu dùng làm chất
đốt, dễ cháy
Nhân cà phê: Trong nhân cà phê nước chiếm 10 – 12%, protein chiếm 9 – 11%, lipit
chiếm 10 – 13%, các loại đường chiếm 5 – 10%, tinh bột chiếm 3 – 5%. Ngoài ra
trong nhân còn chứa các chất thơm, các alkaloid. Thành phần hoá học trong nhân cà
phê biến đổi phụ thuộc vào chủng loại, độ chín, điều kiện canh tác, phương pháp chế
biến và bảo quản.
Nước: Trong nhân cà phê đã sấy khô, nước còn lại 10 – 12% ở dạng liên kết. Khi hàm
lượng nước cao hơn, các loại nấm mốc phát triển mạnh làm hỏng hạt . Mặt khác, hàm
lượng nước cao sẽ làm tăng thể tích bảo quản kho, khó khăn trong quá trình rang, tốn
nhiều nhiên liệu và nhất là làm tổn thất hương cà phê. Hàm lượng nước trong cà phê
sau khi rang còn 2,7%.

Chất khoáng: Hàm lượng chất khoáng trong cà phê khoảng 3 – 5%, chủ yếu là Kali,
Nitơ, Magie, Photpho, Clo. Ngoài ra còn thấy nhôm, sắt, đồng, iod, lưu huỳnh…
những chất này ảnh hưởng không tốt đến mùi cà phê. Chất lượng cà phê cao khi hàm
lượng chất khoáng càng thấp và ngược lại.
Glucid: Chiếm khoảng ½ tổng số chất khô, đại bộ phận không tham gia vào thành
phần nước uống mà chỉ cho màu và vị caramen. Đường có trong cà phê do trong quá
trình thuỷ phân dưới tác dụng của axit hữu cơ và enzim thuỷ phân. Hàm lượng
saccharose có trong cà phê phụ thuộc vào mức độ chín: Quả càng chín thì hàm lượng
saccharose càng cao. Saccharose bị caramen hoá trong quá trình rang nên sẽ tạo hương
vị cho nước cà phê. Hạt cà phê còn chứa nhiều polysaccarit nhưng phần lớn bị loại ra
ngoài bã cà phê sau quá trình trích ly.
Protein: Hàm lượng protein trong cà phê không cao nhưng nó đóng vai trò quan trọng
trong việc hình thành hương vị của sản phẩm. Bằng phương pháp thuỷ phân, người ta
thấy trong thành phần protein của cà phê có những axit amin sau: cysteine, alanie,
phenylalanine, histidine, leucine, lysine, derine… Các axit amin này ít thấy ở trạng
thái tự do, chúng thường ở dạng liên kết. Khi gia nhiệt, các mạch polypeptit bị phân
16


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

cắt, các axít amin được giải phóng ra tác dụng với nhau hoặc tác dụng với những chất
tạo mùi và vị cho cà phê rang. Trong số các axit amin kể trên đáng chú ý nhất là những
axít amin có chứa lưu huỳnh như cystein, methionine và proline, chúng góp phần tạo
nên hương đặc trưng của cà phê sau khi rang. Đặc biệt, methionine và proline có tác
dụng làm giảm tốc độ oxi hoá các chất thơm, làm cho cà phê rang giữ được mùi vị khi
bảo quản. Trong quá trình chế biến chỉ có một phần protein bị phân giải thành axit
amin, còn phần lớn bị biến thành hợp chất không tan.

Lipid: Lipid trong cà phê gồm chủ yếu dầu và sáp. Trong đó sáp chiếm 7 – 8% tổng
lượng lipid, còn dầu chiếm 90%. Trong quá trình chế biến, lipid bị biến đổi, song một
phần axit béo tham gia phản ứng dưới tác dụng của nhiệt độ cao tạo nên hương thơm
cho sản phẩm, lượng lipid không bị biến đổi là dung môi tốt hoà tan các chất thơm.
Khi pha cà phê thì chỉ một lượng nhỏ lipid đi vào nước còn phần lớn lưu lại trên bã.
Các alcaloid: Trong cà phê có các alcaloid như cafein, trigonulin, colin. Trong đó quan
trọng và được nghiên cứu nhiều hơn cả là cafein và trigonellin
Cafein: Chiếm từ 1 – 3% phụ thuộc vào chủng loại, điều kiện khí hậu, điều kiện canh
tác. Hàm lượng cafein thấp hơn trong chè nhưng nó kích thích hệ thần kinh với thời
gian dài hơn vì khi uống cà phê tốc độ lưu thông của máu không tăng lên nên cafein
thải ra ngoài chậm, mặt khác khi pha cà phê trong nước, cafein được giải phóng hoàn
toàn ở trạng thái tự do, không hình thành những chất có khả năng kết tủa hoặc những
chất không có hoạt tính của ancaloit
Trigonellin (acid metyl betanicotic:C7H7NO2): Là ancaloid không có hoạt tính sinh lý,
ít tan trong rượu etylic, không tan trong clorofoc và ete, tan nhiều trong nước nóng,
nhiệt độ nóng chảy là 218oC. Tính chất đáng quý của trigonellin là dưới tác dụng của
nhiệt độ cao nó bị thủy phân tạo thành acid nicotic (tiền vitamin PP). Nhiều kết quả
nghiên cứu cho thấy trong cà phê nhân không có acid nicotic nhưng nó được hình
thành trong quá trình gia nhiệt trong đó sự nhiệt phân trigonellin giữ vị trí quan trọng.
Chất thơm: Trong cà phê hàm lượng chất thơm nhỏ, nó được hình thành và tích lũy
trong hạt. Sự tích lũy chịu nhiều yếu tố như đất đai, khí hậu và nhất là chủng loại cà
phê. Mặt khác nó được hình thành trong quá trình chế biến, đặc biệt trong quá trình
rang. Chất thơm bao gồm nhiều cấu tử khác nhau: acid, aldehid, ceton, rượu, phnol,
este. Trong quá trình rang, các chất thơm thoát ra ban đầu có mùi hắc sau chuyển
thành mùi thơm. Các chất thơm của cà phê dễ bị bay hơi, biến đổi và dẫn đến hiện
tượng cà phê bị mất mùi thơm nên cần đựng trong bao bì kín và tiêu thụ nhanh.
17


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

Với thành phần khoảng 0,1% chất hương liệu dễ bay hơi, cà phê là một loại
“lương thực” có hương liệu cao nhất. Các loại hương liệu này được thành hình trong
quá trình rang và không tìm thấy trong hột cà phê sống (chưa rang). Các chất mùi, vị
hỗn hợp lại sẽ tạo ra mùi thơm và làm cà phê trở thành một loại có một không hai. Các
hương vị của cà phê đều có trong nhiều loại thực vật khác, nếu không tính đến caffeine
(Hoàng Minh Trang, 1983).
2.1.3.3. Các loại đường có trong vỏ cà phê
Bảng 2.2: Các loại đường có trong vỏ cà phê
Loại đường
fructose
sucrose
galactose

Thành phần
10 – 15%
2,8 – 3,2%
1,9 – 2,4%

(Pushpa S. Murthy and M. Madhava Naidu, 2011).
2.2. Tổng quan về vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Leuconostocaceae
Giống: Leuconostoc
Loài: L.mensenteroides

 Đặc điểm:
Vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides thuộc vi khuẩn lactic. Gram dương, không
di động, không sinh bào tử. Hầu hết sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ tối ưu từ 2530oC, pH= 4,1. Khi phân chia chúng tạo thành cặp hoặc chuỗi. Những cầu khuẩn lên
men lactic dị hình ở đây được chia thành 4 nhóm theo phương pháp lai DNA-DNA.
Những loài thường thấy trong lên men lactic dị hình và lên men malo lactic là: L.
mensenteroides subsp,

L. mensenteroides subsp dextranicum, L. lactics, L.

paramesenteroides, L. oenos…
 Một số đặc tính sinh hóa tiêu biểu (Theo khóa phân loại Bergey)
Khả năng sinh hơi: (+)
Catalase: (-)
18


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

Oxidase: (-)
Khử xanh methylene: (+)
Khử nitrate: (-)
Khả năng sinh indol: (-)
Voges- Proskauer (Barrett’s method): (-)
Không có khả năng sử dụng acetate, lactate, tartrate, succinate và citrate làm nguồn
cacbon.
Chú thích: (+): dương tính (-): âm tính. (Paul De Vos, George M. Garrity, 2009).
 Đặc điểm hình thái:
Có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5-0,8µm và chiều dài

khoảng 1,6µm. trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng
1-3 µm. Thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt đến dạng khuẩn
lạc. Nuôi cấy ở 20-25oC trong môi trường có sucrose hoặc đường thô có agar thì hình
dáng hầu như không có gì thay đổi trong những nhóm khác nhau. Nhưng ở 37 oC các
kiểu khuẩn lạc nhỏ hơn so với bình thường. Leuconostoc mesenteroides phát triển trên
môi trường rắn có hình que, trong môi trường lỏng thì lại có hình cầu. Những cầu
khuẩn có thể xuất hiện từng cặp, hoặc liên kết với nhau thành những chuỗi dài.
Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung.
Trong số đó, Leuconostoc mensenteroides cùng với một số vi khuẩn lactic đồng hình
khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến rau muối chua.

Hình 2.7 : vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides
 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa:
(Nguồn: />19


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

Khả năng sinh tổng hợp của vi khuẩn L. mesenteroides thuộc loại yếu phần lớn
lên men lactic dị hình theo con đường hexoso- monophosphate, chúng có nhu cầu cao
về mặt dinh dưỡng. Không thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết
chứa glucose và các muối amoni NH +4. Đa số cần hàng loạt các vitamin như axit
pantothenic, biotin. Để sinh trưởng bình thường, ngoài một nguồn cacbon, ni tơ,một
phầndưới dạng các axit amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất
khoáng…

2.3.

Quá trình lên men lactic dị hình
Là quá trình lên men mà ngoài axit lactic tạo thành còn có hàng loạt các sản

phẩm khác nhau chiếm tỷ lệ khá giá cao như: axit acetic, glycerin, ethanol, CO 2,..Sở
dĩ như vậy vì vi khuẩn lactic dị hình không có hai enzyme cơ bản của sơ đồ EMP là
aldolase và triosaphosphate isomerase.
 Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:
C6H12O6CH3CHOHCOOH+CH3CH2OH+COOHCH2CH2COOH+CH3COOH+CO2+
H2
Trong đó, axit lactic chiếm khoảng 40%, axit xucxinic khoảng 20%, rượu etylic
và axit acetic 10% các loại khí 20%... Đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự
tích lũy một lượng ít axit formic. Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo
thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn
so với lên men lactic đồng hình.
Trong vi khuẩn lên men lactic dị hình không có các enzyme cơ bản của sơ đồ
Embden-marehoff là aldolase triozophotphatizomerase bước đầu phân giải đường
glucose ở những vi khuẩn này theo con đường pentozophotphat, tức là thông qua
glucose-6photphat, 6-photphatgluconat và ribulose-5-photphat chuyển thành xilulose5-photphat, hợp chất này tiếp tục biến đổi thành photphoglyceraldehyde và
acetylphotphat dưới tác dụng của enzim pentozophotpho xelolase. Những vi khuẩn dị
hình thành axit acetic kèm theo sự tổng hợp ATP. Acetylphotphat được khử thành
etanol thông qua acetyldehytphotphoglyceraldehyde thông qua axit pynivic mà tạo
thành axit lactic (Lương Đức Phẩm, 2010) .

20
Hình 2.8 : Sơ đồ quá trình lên men lactic dị hình


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

2.4.

GVHD

Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật

 Các phương pháp định danh cổ điển đối với vi sinh vật
Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình
thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động,
nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành
v.v.. và dựa theo khoá phân loại của Bergey để xác định chủng vi khuẩn vừa phân lập
có phải thuộc họ mình cần tìm hay không.
2.4.1. Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái
─ Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến).
─ Kiểm tra khả năng di động: Nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi
trường thạch mềm.
─ Nhuộm bào tử: Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) Nhuộm
Carbolic Fuchsin.
─ Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ
Congo, phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
─ Nhuộm thành tế bào
─ Nhuộm hạt dị nhiễm
─ Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid)
─ Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis)
─ Nhuộm vi khuẩn kháng acid
2.4.2. Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý
21


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

─ Hình thái khuẩn lạc
─ Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt
─ Nhu cầu oxygen.
2.4.3. Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa
Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định
danh cho phù hợp như: Khả năng đồng hóa các nguồn carbon, Khả năng đồng hóa các
nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng
khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu
muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza,
xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza,
fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng
M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red), phản ứng V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPGaza. ...
2.4.4. Các phương pháp định danh vi sinh vật dựa theo kỹ thuật sinh học phân
tử
Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu
hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương pháp
truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học
phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật.
Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu là:
─
─
─
─

2.5.

Phân tích acid nucleic.
Phân tích protein

Phân tích polysaccharid.
Hóa phân loại học.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài

 Nghiên cứu trong nước
Nhằm mục đích để sản phẩm có chất lượng tốt, sản phẩm có vị thơm đậm, sau
khi uống vào có vị ngọt hậu, càng để lâu càng ngon, các thành phần có trong hạt cà
phê được hòa tan gần như hoàn toàn khi pha chế. Chính vì những lý do đó, ngày nay
càng có nhiều công trình nghiên cứu về lên men cà phê. Tuy có giá trị kinh tế cao
nhưng công nghệ này đòi hỏi thiết bị phức tạp, làm việc thiếu ổn định, đặc biệt dễ gây
22


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

ô nhiễm môi trường nên chỉ mới được áp dụng ở một số cơ sở sản xuất, chế biến quy
mô vừa có mức độ khiêm tốn, chiếm khoảng 5% tổng lượng cà phê sản xuất ở nước ta.
Nghiên cứu vai trò vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tạo hương cà phê lạc
tươi của Hoàng Thị Hồng Ánh, ĐH Đà Nẵng.
Nghiên cứu của Bộ môn công nghệ sinh học, trường ĐH Bách khoa TP.HCM, do
PGS TS Nguyễn Đức Lượng làm chủ nhiệm đề tài. Nhóm nghiên cứu đã chế tạo ra
được một loại chế phẩm sinh học từ nấm mốc Aspergillus niger, tên thương phẩm là
Biona-9. Sản phẩm này được sản xuất bằng men sinh học càng để lâu càng ngon, vệ
sinh an toàn thực phẩm hoàn toàn được bảo đảm. Hiện nay, loại cà phê này đã được
bán trên thị trường.
 Nghiên cứu nước ngoài
Ngoài ra còn có rất nhiều nghiên cứu khác về lên men cà phê được ác nhà khoa

học ở các nước trên thế giới nghiên cứu như:
Đề tài nghiên cứu của Pushpa S. Murthy và M. Madhava Naidu về cải thiện chất
lượng của cà phê robusta lên men bằng enzyme từ vi sinh vật.
Nghiên cứu vi sinh vật và sinh hóa trong quá trình lên men cà phê của các tác giả
Avallone S, Guyot B, Brillouet JM, Olguin E, Guiraud JP.
Nghiên cứu sự sinh trưởng của nấm và vi khuẩn trong quá trình lên men tự nhiên
cà phê arabica của Silva CF, Batista LR, Abreu LM, Dias ES, Schwan RF.
Nghiên cứu sự hiện diện của các vi sinh vật trong cà phê của tiến sĩ giáo dục
Christine L. Case.
Công trình nghiên cứu vi khuẩn lactic trong cà phê và cacao lên men của R. O.
Arunga.

23


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.

Thời gian và địa điểm thực hiện

 Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và trung tâm
thí nghiệm thực hành thuộc trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm thành phố Hồ
Chí Minh.
 Thời gian thực hiện
3.2. Nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ

3.2.1. Nguyên vật liệu
 Nguyên liệu:
─ Qủa cà phê thu mua từ Gia Lai, sau đó làm dập và ủ từ 36 – 48 giờ.
─ 3 mẫu kim chi
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
 Thiết bị
•

Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave):

Nồi hấp tiệt trùng là một thiết bị bắt buộc phải có của một phòng thí nghiệm vi
sinh cho phép tiêu diệt tất cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật. Nồi hấp
tiệt trùng có cấu tạo 2 vỏ và có khả năng giữ áp suất cao. Phía trong của nồi là
buồng khử trùng, nơi đặt các vật liệu cần khử trùng. Buồng khử trùng có lắp van
thoát không khí, áp kế để xác định áp suất và van bảo hiểm để xì hơi khi áp suất
vượt quá mức yêu cầu và đảm bảo an toàn. Khoảng trống giữa hai lớp vỏ là nơi
chứa hơi nước. Nước cần được bổ sung đến mức quy định. Tùy vào từng mục đích
hấp khử trùng mà ta điều chỉnh nhiệt độ và thời gian thích hợp.
•

Tủ sấy dụng cụ:

Dùng để sấy khô và khử trùng các dụng cụ trong phòng thí nghiệm bằng phương
pháp nhiệt khô. Tủ sấy thường được đốt nóng bằng điện trở.Thiết bị này được làm

24


Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GVHD

bằng kim loại chịu nhiệt. Phía bên trên tủ có nút điều chỉnh nhiệt độ tùy theo yêu
cầu sử dụng.
•

Tủ cấy vô trùng:

Tủ cấy vô trùng là thiết bị có cấu trúc dạng hộp, bằng kính, có khả năng vô trùng
nhờ hệ thống đèn tử ngoại hoặc bộ phận thổi khí vô trùng. Tủ cấy vô trùng được
dùng để đảm bảo tính vô trùng cao khi thao tác với vi sinh vật. Không khí trong tủ
cấy vô trùng được bơm khử trùng qua màng lọc vô trùng. Đèn tử ngoại có tác
dụng khử trùng bề mặt bàn thao tác trong tủ cấy và bề mặt các dụng cụ thiết bị
khác. Trước khi sử dụng tủ cấy vô trùng cần bật đèn tử ngoại 30 – 60 phút. Khi bắt
đầu thao tác, tắt UV và bật bơm lọc vô trùng không khí.
•

Kính hiển vi:

Kính hiển vi dùng để phóng đại, quan sát vi sinh vật. Kính hiển vi cần được đặt tại
nơi tránh được bụi và chấn động. Sau khi dùng kính với dầu soi, dùng giấy lau kính
chuyên dụng thấm xylol lau vật kính 100X, sau đó lau lại bằng giấy lau kính khô.
Khi không dùng phải đậy kính lại. Kính hiển vi cho phép ta quan sát, nghiên cứu
các đặc điểm hình thái, sinh lý tế bào nhờ khả năng phóng đại từ hàng chục đến
hàng vạn lần hình ảnh của mẫu vật quan sát.
•

Tủ lạnh:

Sử dụng tủ lạnh có nhiệt độ từ 4 – 10 oC để lưu giữ mẫu, môi trường, hóa

chất,…Ngăn tủ đông để giữ giống hoặc các hóa chất cần để lạnh sâu. Không giữ
thực phẩm, thức uống chung với tủ lạnh dành cho vi sinh vật.
•

Cân:

Loại cân thông dụng nhất là loại một đĩa có mức phân biệt tối thiểu 0,01g và mức
tối đa 200g. Sử dụng cân phân tích có mức phân biệt tối thiểu 0,1mg để cân
những lượng nhỏ dưới 2g. Cân cần được đặt trên bề mặt phẳng, không bị rung,
tránh gió lùa.
•

Máy đo pH:
25