Các phương pháp hóa lý trong kiểm nghiệm thuốc.

ĐỀ TÀI
Các phương pháp
hóa lý trong kiểm
nghiệm thuốc
L/O/G/O

1
www.trungtamtinhoc.edu.vn


CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC

Phần 1

Phần 2

PHƯƠNG
PHÁP
QUANG PHỔ
PHÂN TỬ

PHƯƠNG
PHÁP SẮC
KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG
CAO.
2
www.trungtamtinhoc.edu.vn


PHẦN 1 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

PHÂN TỬ
I

Quang phổ hấp thụ UV-VIS

II

Quang phổ hồng ngoại (IR)

III

Quang phổ huỳnh quang

3


I. QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS
1. Độ hấp thụ
– Độ hấp thụ tuân theo định luật Lambert – Beer và được biểu diễn
bằng phương trình sau:
A=

𝟏
𝐋𝐠
𝐓

=

𝐈𝟎
𝐥𝐠

𝐈

= 𝐊𝐂𝐋

Trong đó:
T : Độ truyền qua.
I0 : cường độ ánh sáng đơn sắc tới.
I : cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch.
K : hệ số hấp thụ phụ thuộc λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ.
L : là chiều dài của lớp dung dịch.
C : nồng độ chất tan trong dung dịch.
4
www.trungtamtinhoc.edu.vn


2.

ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG:

1

Ánh sáng
phải đơn
sắc

2

Khoảng nồng
độ phải thích
hợp: định luật

Lambert- beer
chỉ đúng trong
một giới hạn
nhất định của
nồng độ.

3

Dung dịch
phải trong
suốt

4

Chất thử phải
bền trong dung
dịch và bề dưới
tác dụng của
ánh sáng UV VIS

5
www.trungtamtinhoc.edu.vn


3.

MÁY QUANG PHỔ

Máy quang phổ thích hợp cho việc đo phổ ở vùng

tử ngoại và khả kiến gồm một hệ quang học có
khả năng tạo ánh sáng đơn sắc trong vùng từ 200
đến 800nm và một thiếp bị thích hợp để đo độ hấp
thụ.

6
www.trungtamtinhoc.edu.vn


4.

HIỆU CHỈNH MÁY QUANG PHỔ
Kiểm tra thanh độ dài sóng.

HIỆU
CHỈNH

Kiểm tra độ hấp thụ.
Giới hạn ánh sáng lạc

Độ phân giải
Độ rộng giải phổ nguồn.
Cuvet.
7
www.trungtamtinhoc.edu.vn


5. ỨNG DỤNG CỦA PHỔ UV-VIS TRONG KIỂM
NGHIỆM THUỐC
 Định tính và khử tinh khiết: các cực đại hấp thụ là đặc trưng định

tính của các chất.
 Định lượng: chọn điều kiện xây dựng quy trình định lượng.
1

Chọn bước sóng hoặc kính lọc

2

Chọn khoảng nồng độ thích hợp

3

Chọn các điều kiện khác: loại trừ ảnh hưởng của chất lạ,
chọn pH và dung môi thích hợp, thực hiện phản ứng
màu,..
8
www.trungtamtinhoc.edu.vn


Các phương pháp định lượng:
Phương pháp đo phổ trực tiếp:
− Đo phổ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào giá trị độ hấp
thụ riêng:

A = E1%1cm .L.C

L = 1cm  C =

𝐴

𝐸1%1𝑐𝑚

 Để áp dụng phương pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ cả về
bước sóng lẫn độ hấp thụ.
 Phương pháp gián tiếp: phương pháp đường chuẩn, so sánh thêm chuẩn.

Đặc điểm của phương pháp gián tiếp:
 Phải có chất chuẩn để so sánh.
 Có thể không cần phải chuẩn máy.

9
www.trungtamtinhoc.edu.vn


 Phương pháp so sánh: theo định luật Lambert- beer suy ra:

Cx =

𝐴𝑋
Cs
𝐴𝑠

Trong đó:
Ax là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử có nồng độ Cx.
As là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn có nồng độ Cs.
 Chú ý: các nồng độ của dung dịch thử Cx và Cs không chênh
lệch nhau quá nhiều.
10
www.trungtamtinhoc.edu.vn

 Phương pháp thêm chuẩn so sánh:
𝐴𝑥
𝐶𝑥

𝐴′𝑥

=

𝐶𝑠 + 𝐶𝑥

 Trong đó:
𝐴𝑥 ∶ độ hấp thụ của dung dịch thử.
𝐴′𝑥 : độ hấp thụ của dung dịch chuẩn đã thêm chuẩn.

𝐶𝑠 : nồng độ của dung dịch chuẩn.
 Phương pháp đường chuẩn:

Đồ thị của phương pháp đường chuẩn A= f (C)

11

www.trungtamtinhoc.edu.vn


II. Quang phổ hồng ngoại
1. MỞ ĐẦU
− Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại

(IR) khi nó đi qua một lớp chất cần thử, ở các số sóng khác nhau.

− Vùng bức xạ hồng ngoại sử dụng trong các máy quang phổ IR

thường là 600 – 4000cm-1.

12
www.trungtamtinhoc.edu.vn


2. Máy quang phổ hấp thụ IR
Máy quang phổ ghi phổ trong vùng hồng ngoại bao gồm một hệ
quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong giải phổ từ
4000cm-1 - 670cm-1 và một phương tiện đo tỉ số giữa cường độ ánh sáng
truyền qua và ánh sáng tới.

Máy quang phổ hấp thụ IR

13
www.trungtamtinhoc.edu.vn


3.

Ứng dụng phổ hồng ngoại trong định tính
 Hầu hết các dược điển trên thế giới đều dựa trên 2 nguyên tắc:

− So sánh sự phù hợp giữa chất thử với phổ chuẩn cho sẵn trong
sách tra cứu hoặc trong thư viện phổ lưu giữ trong máy tính.
− So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ của hóa chất
chuẩn được ghi trong cùng điều kiện.
• Định tính sử dụng chất chuẩn so sánh:

• Định tính sử dụng phổ chuẩn trong atlas hoặc thư viện phổ:
 Chuẩn hóa độ phân giải.
 Chuẩn hóa thang số sóng.

14
www.trungtamtinhoc.edu.vn


III. QUANG PHỔ HUỲNH QUANG (FLUOROMETRY)

1. MỞ ĐẦU
Khái niệm: phổ huỳnh quang là phương pháp phổ phát xạ phân tử. Sau khi hấp thụ năng
lượng của bức xạ tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác (bức xạ kích thích), phân tử bị kích
thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng năng lượng dưới dạng bức xạ, được gọi là bức xạ huỳnh
quang.
F = K.I0.𝜀.∅.C.L
Ở đây:
K : Hằng số
I0 : Cường độ của bức xạ kích thích
∅ : Hiệu xuất huỳnh quang
∅=

𝑆ố 𝑝ℎ𝑜𝑡𝑜𝑛 𝑝ℎá𝑡 𝑥ạ
𝑆ố 𝑝ℎ𝑜𝑡𝑜𝑛 ℎấ𝑝 𝑡ℎụ

(0< ∅<1)

𝜀 : hệ số hấp thụ mol của chất ở bước sóng kích thích.
Rút gọn lại ta có : F = K’ . C
Ở đây K’ = K.I0.𝜀.L.∅

15


III. Quang phổ huỳnh quang (Fluorometry)
Nguồn
sáng

2. MÁY

Bộ đơn sắc

Cuvet

Thường dùng đèn
xenon,laser.

Dùng cách tử
Thường dùng thạch anh
(1x1 cm) có 4 mặt trong
suốt

16
www.trungtamtinhoc.edu.vn


3. CHUẨN HÓA MÁY
Máy quang phổ huỳnh quang phải được chuẩn hóa thường xuyên với
chất chuẩn.
4. PHƯƠNG PHÁP ĐO

Kiểm tra vùng
tuyến tính của
Mẫu thử luôn cường độ huỳnh
được đo so quang và điều chỉnh
sánh với mẫu độ nhạy của thiết bị
với độ pha loãng
chuẩn.
thích hợp của dung
dịch chuẩn.

Ghi cường độ
huỳnh
quang
của dung dịch
thử, dung dịch
chuẩn và các
mẫu trắng tướng
ứng của chúng.

17
www.trungtamtinhoc.edu.vn


4. PHƯƠNG PHÁP ĐO
Tính toán nồng độ của dung dịch thử:

Cx =

𝐼𝑋 −𝐼𝑂𝑋
Cs

𝐼𝑠 −𝐼𝑜𝑠

Ở đây:
Cx : nồng độ của dung dịch thử
Cs : nồng độ của dung dịch chuẩn
Ix : trị số đo được của dung dịch thử
Is : trị số đo được của dung dịch chuẩn
Iox và Ios : trị số đo được của các mẫu trắng tương ứng.
Trong đó 𝐼𝑋 − 𝐼𝑂𝑋 - (𝐼𝑠 − 𝐼𝑜𝑠) phải không được < 0,5 và không > 2.
18
www.trungtamtinhoc.edu.vn


PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Định nghĩa: Là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột. Nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.
Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc
vào loại pha tĩnh sử dụng.
1. CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ
 Hệ số dung lượng k’

k’ =

𝑉𝑠
K
𝑉𝑚

=

𝑄𝑠

𝑄𝑚

=

𝑡 ′𝑅
𝑡0

Trong đó:
K : hệ số phân bố
tR: thời gian lưu
t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh
t0: thời gian chết

=

𝑡𝑅 −𝑡0
𝑡0

Qm: lượng chất trong pha động
vs: thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh
19
www.trungtamtinhoc.edu.vn


 Hệ số chọn lọc 𝜶:
Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
𝛼=

𝑘′𝐵
𝑘′𝐴

=

𝑡𝑅𝐵
𝑡𝑅𝐴

Quy ước ở đây B là chất bị giữ mạnh hơn A nên 𝛼 > 1.
Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 ≤ 𝛼 ≤2.
 Hệ số đối xứng của pic F:
F=

𝑊
2𝑎

Ở đây:

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ
đỉnh pic đến mép đường cong phía trước
tại vị trí 1/20 chiều cao pic

20
www.trungtamtinhoc.edu.vn


Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N:
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột
N=

𝑡2𝑅
16 2
𝑊

Ở đây:

=

𝑡2𝑅
5,54 2
𝑊12
/

W: chiều rộng đo ở đáy pic
W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Độ phân giải Rs:
Rs =

2(𝑡𝑅𝐵 −𝑡𝑅𝐴)
𝑊𝐵+𝑊𝐴

Với:
tRB, tRA,: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)
WB,WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic
21
www.trungtamtinhoc.edu.vn


2. MÁY HPLC

Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC
22


3. CÁC KỸ THUẬT HPLC
Sắc ký
phân bố

Hấp phụ

Trao đổi ion
Các kỹ
thuật
HPLC

Sắc ký loại

cỡ
(rây phân tử)

23
www.trungtamtinhoc.edu.vn


 Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Partition Chromatography)
 Pha tĩnh
Pha tĩnh trong sắc ký phân bố bao gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt
của các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác.
Hệ bao gồm pha tĩnh

phân cực và pha động
không phân cực được
gọi là sắc ký pha thuận
và ngược lại.

Khi sử dụng
silica,nhôm oxyd
hoặc polyme xốp
thì các chất được
phân tách theo cơ
chế hấp phụ nên
được gọi là sắc
ký hấp phụ.

Nếu pha tĩnh là
nhựa trao đổi ion
thì gọi là sắc ký
trao đổi ion.

Nếu pha tĩnh là
polyme xốp như
dextran...,ta có sắc
ký loại cỡ

24
www.trungtamtinhoc.edu.vn


 Pha động
 Ái lực của một thành phần đối với pha tĩnh hay nói một cách khác,thời gian lưu giữ

của nó ở trên cột được điều khiển bằng cách thay đổi bộ phân cực của pha động.
 Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của 2,3 hay 4 thành phần.
Tùy thuộc vào sử dụng pha động và pha tĩnh người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại:

1

Sắc ký pha thuận

2

Sắc kí pha đảo

25
www.trungtamtinhoc.edu.vn