Nghiên cứu nhân giống cây ba kích Tím bằng phương pháp In Vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

TRẦN VĂN PHÚ

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012 – 2016

Thái Nguyên - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

TRẦN VĂN PHÚ
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Lớp

: 44-CNSH

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn

: ThS. Nguyễn Thị Tình
ThS. Nguyễn Xuân Vũ

Thái Nguyên - 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em đã
tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây ba kích Tím bằng
phương pháp In Vitro”.
Kết thúc thời gian thực tập tại Phòng Thí nghiệm trung tâm lâm nghiệp, đến
nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay, em
xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm cùng
các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian
thực tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo Nguyễn Thị Tình và các kỹ
sư trong trung tâm lâm nghiệp của trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận
tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể
và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập và mình cũng cảm ơn
bạn bè đã giúp đỡ mình trong thời gian vừa qua xin chân thành cám ơn.
Trong thời gian thực tập vừa qua em đã có sự cố gắng rất nhiều nhưng vì thời
gian có hạn lên em vẫn còn nhiều thiếu sót trong bài khóa luận của em, em rất mong
nhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn
thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Trần Văn Phú


ii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BA

: 6-Benzylaminopurine

MS

: Murashige & Skoog (1962)

CS

: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

Đ/c

: Đối chứng

LSD

: Least Singnificant Difference Test

MS

: Murashige & Skoog (1962)

MT

: Môi trường

NAA

: α-Naphthalene acetic acid

WHO

: World Health Organization


1

PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Cây Ba kích tím ( Morinda officinalis How ) là một cây thuốc quý trong y
học cổ truyền. Củ của cây ba kích được sử dụng như một loại dược liệu có tác
dụng bổ thận âm, bổ thận dương tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng sức dẻo
dai và trừ phong thấp. Dịch chiết của củ cây ba kích có tác dụng giảm huyết áp
tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon.
Do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây
nên cây Ba Kích Tím bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên
cạn kiệt . Mặt khác, vùng phân bố của ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến
loài cây này rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ
Việt Nam cần phải được bảo vệ (nghị định số 48/2002/NĐ-CP).
Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống ba kích có chất
lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách. Nguồn cung cấp cây giống ba kích
hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm cành, nhưng hệ số nhân rất thấp
(chỉ đạt 0,61/năm); chất lượng giống lại không cao.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì việc ứng dụng
nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) trong nhân giống đã trở nên phổ biến.
Nuôi cấy in vitro tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều
cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn. Giải quyết được phần nào khó khăn
trong nhân giống hữu tính cho đối tượng cây trồng này, góp phần bảo tồn và phát
triển giống cung cấp nguyên liệu cho thị trường tiêu thụ và ngành y dược.
1.2. Mục đích và yên cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích của đề tài
- Đề tài nhằm nghiên cứu xây dựng cải tiến quy trình nhân giống cây ba
kích tím bằng phương pháp in vtiro có hệ số nhân giống cao và dễ ứng dụng
sản xuất.


2

1.2.2. Yêu cầu của đề tài

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng
HgCl2 0.1mg/l đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vtiro.
- Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng
auxin và cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Ba kích tím (Morinda
officinalis How )
- Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng
auxin và cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Ba kích tím
(Morinda officinalis How )
- Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng auxin
và cytokinin đến khả năng ra rễ cây Ba kích tím (Morinda officinalis How )
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh
hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
giống cây ba kích tím bằng phương pháp in vitro.
- Là tài liệu tham khảo thêm cho việc nghiên cứu và sản xuất tại các cơ sở.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Góp phần nhân nhanh tạo số lượng lớn cây giống phục vụ mục tiêu bảo
tồn loài dược liệu quý theo Nghị định số 48/2002/NĐ-CP, đảm bảo chất
lượng cung cấp nguyên liệu cho việc phục hồi và phái triển lại cây ba kích tím


3

PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố
Cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) thuộc họ cà phê Rubioceae.
Ba kích tím hình thái cây Ba kich tím Cây thường xanh sống lâu năm, leo
cuốn vào cây khác hoặc tự cuốn tạo thành bụi lớn.

Cây ba kích có lá mọc đối, khi non màu xanh hoặc màu tím, khi già
màu xanh, cuống lá dài từ 4 - 8mm. Lá kèm màu nâu dạng mo, ôm thân.
Phiến lá thường hình mác thuôn nhọn, hình ellip thuôn dài nhọn hoặc hình
mác ngược hay hình trứng. Hiếm khi thấy hình mác hẹp dài phiến lá dài 3 16cm, rộng 1,9 - 6,5 cm đầu lá thuôn nhọn hay nhọn sắc, gốc lá nhọn hình
nêm, tròn hay gần bằng, có khi hơi lõm dạng tim. Rễ dạng trụ tròn phân
nhánh nhiều cấp thành bộ phận rễ, phân bố tỏa tròn xung quanh gốc, nhìn
ngoài có vết thắt từng đoạn, thịt củ dày, nạc, màu tím hoặc trắng ngà. Rễ
cây Ba kích - Cành non dạng bốn cạnh, màu tím hoặc xanh, có lông, khi
già tròn không lông. - Cụm hoa chủ yếu là xim tán kép, ít khi là cụm hoa
tán đơn. Ở cụm sim tán kép, hoa hầu như không cuống, cụm tán đơn hoa có
cuống rõ ràng.
Hoa của cây nhỏ ống đài dạng chén, có 3 - 4 răng nhỏ không đều. Tràng màu trắng, ống tràng dài 2 - 3mm, họng có lông, ở đầu có 3 - 4 cánh
tràng dạng tam giác nhỏ. - Nhị 3 - 4 bao phấn nhọn đầu, hai ô, đính lưng, chỉ
nhị cực ngắn. Vòi nhụy ngắn, đầu nhụy hai thùy. Hoa Ba Kích - Cụm quả kép
do nhiều quả dính liền với nhau đính trên các cuống xim nhỏ tạo thành. - Ở
cụm quả đơn, quả có cuống rõ ràng. Mỗi quả có 4 hạt. - Hạt có lông màu
hồng, khi khô màu trắng.


4

Mùa hoa tháng 4 - 5, quả chín tháng 10 - 11, cá biệt có thể quả chín từ
tháng 9 hoặc kéo dài tới đầu tháng 12-1 hay 3. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có khả
năng chịu bóng, nhất là khi còn nhỏ. Ba Kích thường mọc tự nhiên trong các
kiểu rừng thường xanh nhưng đã trở nên thứ sinh, bao gồm cả rừng xen tre
nứa và rừng non phục hồi sau nương rẫy. Độ cao dưới 400m, cá biệt có thể tới
1000m. Đất ở nơi có Ba kích thường còn tương đối mầu mỡ, tơi xốp, trung
tính hoặc hơi chua.
Cây sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới gió mùa nóng và
ẩm, ra hoa quả hàng năm.

Tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt hoặc mọc cụm chồi từ các phần còn
lại sau khi chặt, phần rễ còn sót lại khi khai thác cũng có thể nảy mầm thành
cây mới.
Yêu cầu về nhiệt độ trung bình năm 22,5oC - 23,1oC. Độ ẩm không khí
trung bình năm từ 82 - 89%. Ba kích mọc tự nhiên trên các loại đất feralit đỏ vàng hay vàng - đỏ, tầng đất thịt ở trên tương đối dày, có kết cấu tượng hạt và
kết vón nhưng không có đá ong chặt. Đất luôn ẩm hơi chua, pH từ 3,6 đến
4,1, hàm lượng mùn 3,78 - 5,91%. Hàm lượng tổng số các chất trong 100g đất
lần lượt là: nitơ 0,24 - 0,34mg, lân 0,7 - 1,5mg và kali 7mg.
Ngoài ra, Ba Kích có thể sống trên đất feralit đỏ sẫm. Tầng đất mặt ở
đây tương đối dày (tới 1m), thành phần cơ giới nặng, cấu tạo hạt chắc và tơi
xốp, pH hơi chua đến trung tính 4,5 - 6, hàm lượng mùn ở mức trung bình 3 4%. Tại Hoành Bồ - Quảng Ninh và Sơn Động - Bắc Giang còn thấy Ba kích
mọc trên đất bồi tụ, pha cát ở chân núi. Loại đất này thường nghèo dinh
dưỡng hơn so với loại đất trên.
Chú ý: Ba Kích không thích hợp với đất phù sa và các loại đất khác ở
đồng bằng.


5

Ánh sáng: ánh sáng là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp tới
sinh trưởng và phát triển của Ba Kích. Trong tự nhiên cây mọc xen lẫn với
các loài cây khác dưới tán rừng, độ che tán 20 - 60%. Tuy nhiên để sinh
trưởng phát triển được, cây thường leo lên các cây bụi hay cây gỗ nhỏ để tiếp
cận với ánh sáng. Cây được chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả nhiều hơn và nhiều
hạt chắc hơn cây bị che bóng.
Ba Kích mọc hoang ở vùng rừng thứ sinh, trung du và miền núi các tỉnh
phía Bắc, dưới tán một số kiểu rừng nhiệt đới ẩm lá rộng thường xanh, nay trở
nên thứ sinh gồm cây bụi và dây leo chằng chịt hoặc ở bờ nương rẫy. Độ cao
phân bố khoảng 100m so với mặt biển. Càng lên cao cây càng thưa dần, đến
độ cao khoảng 100m thì hầu như hiếm gặp. Có nhiều nhất ở các tỉnh Quảng

Ninh, Phú Thọ, Hoà Bình, Hà Giang, Lạng Sơn.
2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học lịch sử của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình
nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho
việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các
bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ .
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy
mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các
phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích
khác nhau .
2.2.2. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Haberland (1902)là người đầu tiên đề xuất ra phương pháp nuôi cấy mô
tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông
mỗi tế bào bất kỳ cơ thế sống đều mang toàn bộ thông tin di truyền của loài


6

đó. Vì vậy ghặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào sẽ phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh. Ông đã thí nghiệm với tế bào khỉ khổng và thành công. Điều này
đã làm cho những nhà hoa học thời bấy giờ mất hy vọng về việc sây dựng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong 1 thời gian dài. Tuy nhiên sau đó
Garrison(1904-1907) đã nuôi được tế bào thần kinh của ếch trong huyết tương
chưng minh khả năng nuôi cấy mô tế bào động vật nhân tạo. Trên cơ sở thành
công của các nhà khoa học nuôi cấy mô tế bào động vật các nhà khoa học
nuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi trường dinh dưỡng tự nhiên nhưng
khong thành công. Năm 1922 Robins và Kotte đã thành công nuôi cấy đầu rễ
trong vòng 12 ngày. Từ nhưng năm 30 của thế kỉ 20 phương phái nuôi cấy tế

bào đã mang nhưng nét của nuôi cấy mô tế bào hiện đại với kỹ thuật ko khác
với hiện nay nhiều lắm. Trong thời gian này White nhà bác học người Mỹ và
Ghautheret (Pháp) đã có nhiều đóng ghóp trong việc nghiên cứu môi trường
nuôi cấy, nhiều môi trường đến nay vẫn được sử dụng.
Từ năm 1931 phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật được coi chính
thức bắt đầu bằng công trình nghiên cứu của White với việc nuôi cấy rễ cây
cà chua và ông là người đầu tiên chỉ ra rằng mô phân sinh trưởng trong thời
gian dài nêu được cáy chuyển trong môi trường dinh dưỡng mới. Trong cùng
thời gian Ghautheret cũng đã thành công trong việc nuôi cấy mô tượng tầng
và tìm được môi trường dinh dưỡng thích hợp. Sau đó Miller và Skoog trong
khi nuôi cấy nõi cây thước lá đã xác định được vài trò của Kinetin trong sự
kích thích phát triển của mô.
Những thí nghiêm về môi trường dinh dưỡng đã chỉ ra răng môi trường
dinh dưỡng tính chất vật lý tính chất hóa học là những điều quan trọng quyết
định đến thành công trong nuôi cấy mô, cơ quan và tế bào. Những thành
phần băt buộc của môi trường bao gồm chất khoáng từ các muối khác nhau
của các nguyên tố đa lượng và vi lượng, thành phần hydrocacbon trong đường


7

và chât điều hóa sinh trưởng. Cũng rừ những năm 30 nuôi cấy mô tế bào đã
phát triển theo một số hương như nuôi cấy phôi nuôi cấy cơ quan tách rời.
Từ những năm 60 của thế kỷ thứ 20 trở lại đây, ngoài các hướng như
nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần (protolast)
được phát triển mạnh.
Từ những năm 70 trở lại đây các kỹ thuật lại Xoma bằng dung hợp tế
bào trần và chuyển gen biến nạp đàu tiên được tát sinh từ mô lá và được đưa
vào trồng thử ngoài đồng ruông đã trở thành cơ sở không thể thiếu của công
nghệ sinh học thực vật là công cụ quan trọng trong công tác phục tráng và

nhân giống.
2.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1. Tính toàn năng (Totipotenc) của tế bào
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là
tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt
lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa
bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi
tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết
và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có
thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào
2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào
chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi
sinh để thực hiện chức năng phân chia.


8

Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng.
2.4. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro
Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn:
2.4.1 Giai đoạn 1: Chuẩn bị vật liệu
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro.
Mục đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Có thể vô
trùng mẫu nuôi cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: CaOCl2, NaOCl,
HgCl2,...
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống

cao; tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào
cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được
chọn và đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân…
Sharma G.J. (2005) đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ
cây địa liền và cây ngải máu. Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2%
trong 15 phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu. Dương Tấn Nhựt và
cs (2011) tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng cồn 70% trong
30 giây và HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao.
2.4.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này
cần đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh
trưởng tốt. Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự
phát triển của mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng
các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường
nuôi cấy. Nayak S. và cs (2011) nghiên cứu nhân giống cây riềng in vitro
cho thấy: Khi thử nồng độ BA từ 1 - 3 mg/l đến khả năng bật chồi thì cho
thấy ở nồng độ BA 3mg/l cho kết quả tốt nhất. Behera K.K. và cs (2010) sử


9

dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ vàng. Tuy
nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy.
Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô
đã chuyển hoá.
2.4.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số
lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và
tạo phôi vô tính. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chính vì
thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy. Để

tăng hệ số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa
sinh trưởng (auxin, cytokinin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa,
dịch chiết nấm mem,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích
hợp. Chế độ nuôi cấy thường là 23-27ºC, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường
độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta
có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân
cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua
việc tạo thành cây từ phôi vô tính. Jala A. và cs (2012) nghiên cứu trên cây
Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp BA1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số
nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy.
2.4.4. Giai đoạn ra rễ cho mẫu.
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi
trường ra rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở
thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường
nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, nhóm hormon
thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm
này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều
nhất để tạo rễ cho chồi. Nguyễn Thị Liễu và cs (2011) đã nghiên cứu ảnh


10

hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh cho thấy
nồng độ tốt nhất cho sự hình thành rễ bất định sâm Ngọc Linh là 2,4-D 1,0
mg/l trong môi trường MS bổ sung sucrose 50 mg/l.
2.4.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng
ứng dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Là giai
đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn
toàn. Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể

đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất. Sen A.
và cs (2010) khi chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và cát với tỷ lệ 1:1
cho kết quả 93% cây vi giống sinh trưởng và phát triển bình thường trong
môi trường tự nhiên. Shahinozzaman M. (2013) chuyển cây con tái sinh in
vitro sang chậu nhựa có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và
được làm thích nghi. Kết quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao.
Theo Goer (1993) để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ
sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định
(số lá, số rễ, chiều cao cây).
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm
cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
2.5. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.5.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào
thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các
cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc
của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) .


11

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau
trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì
vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của
mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng
nuôi cấy .
Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương
pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có

khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải
đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít
độc đối với mẫu. Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả
năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất. Một số hóa chất thường
được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2 - hypoclorit canxi,
NaOCl - hypoclorit natri, oxy già, HgCl2 - thủy ngân clorua, chất kháng sinh
(gentamicin, ampixilin…) .
2.5.2. Điều kiện nuôi cấy
- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật, các thao tác
với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Buồng cấy có hệ thống
màng lọc giúp lọc vi sinh vật đồng thời có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu
diệt vi sinh vật trong không khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy.
Để khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy có thể sử dụng các phương
pháp: khử trùng khô (bằng nhiệt), khử trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc .
- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn
định về ánh sáng và nhiệt độ .
2.5.3. Môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh
trưởng và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi
cấy. Thành phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng
tùy thuộc loại mẫu và mục đích nuôi cấy.


12

2.5.4. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định
cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.5.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Điều kiện vô trùng:

+ Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm
bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị
nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô
in vitro.
+ Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng
các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
+ Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa
quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử
trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông
thường hay sử dụng một số hoá chất như: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2, HgCl2
0,1% … để khử trùng.
- Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH:
+ Ánh sáng
 Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu
tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng.
Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy.
Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày .
 Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi
cấy.
 Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh
trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo
chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là


13

1000 - 7000 Lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới
sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro.
 Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng
trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng

lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các
phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ
2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi
cấy từ 35 – 40 cm.
+ Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng
ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ
thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp.
Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây
là 25±20C .
+ pH
pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi
trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trường
được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar
khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng .
2.5.4.2.Thành phần nuôi cấy mô tế bào thực vật.
- Nước: cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến
95% môi trường dinh dưỡng. Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí
nghiệm nghiên cứu. Nếu môi trường chuẩn bị nuôi cấy protoplast, tế bào
hay meristem thì nên dùng nước cất 2 lần. Hoàn toàn không nên sử dụng
nước máy trong nuôi cấy mô. Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên
sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm
hữu cơ và các loài vi khuẩn.


14

- Dinh dưỡng vô cơ:
+ Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh
dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng.

+ Theo thống nhất của Hội sinh lí học thực vật quốc tế (IAPP),
nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn 0,5 mmol/l gọi là
nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần có nồng độ nhỏ hơn
0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng. Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất
cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật.
+ Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali
(K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S).
+ Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan
(Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo).
+ Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là
các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật.
- Dinh dưỡng hữu cơ tự nhiên
+ Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid,
đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin…
+ Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid.
+ Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B.
+ Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh.
- Đường:
+ Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh
dưỡng nuôi cấy mô thực vật. Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát
triển vì quá trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự
sinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang
hợp hay thậm chí hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối).


15

+ Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường
saccharose ở nồng độ 1-5%. Đường saccharose là dạng đường được tổng
hợp và vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi

cấy. Cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô
thực vật. Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi mẫu cấy.
- Vitamin
+ Vitamin là thành phần cũng rất quan trọng để cây có thể duy chì
các hoạt động sống và phát triển bình thường.
+ Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi
trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp
amino acid.
+ Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản
ứng trao đổi chất [26].
+ Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp.
+ Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế
bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi
hydratcacbon .
- Agar
+ Agar là một loại polysacharit của tảo. Agar là chất keo đông
thường được sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là
một phức chất polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành.
+ Nồng độ của thạch dùng trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ
tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 612 g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh
dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy. Ở 800C thì ngậm nước
chuyển sang trạng thái sol còn ở 400C thì trở về trạng thái gel.


16

+ Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12 gam/lít nước. Thạch
ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng .
- Chất điều hoà sinh trưởng
+ Auxin: Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi

trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng
cường các quá trình sinh tổng hợp, trao đổi chất, kích thích hình thành rễ
và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính. Tùy loại auxin, hàm lượng
sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động kích thích sinh trưởng của mô,
hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo (callus). Nồng độ auxin
thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1- 2mg/l tùy từng chất
và đối tượng nuôi cấy.
+ Cytokinin: Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin
(BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP)
và Zeatin (cytokinin tự nhiên). Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin
được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt. Zeatin làmột
loại cytokinin tự nhiên có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường
hợp đặc biệt do rất đắt. Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một
số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó
TDZ là một cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân
nhanh cây thân gỗ.
+ Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các
nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng
hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển.
Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh
lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích
thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất .


17

- Than hoạt tính
Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc.
Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất
phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu

nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi
trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh
trưởng của rễ. Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa
tốt. Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các
chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen
môi trường.
2.6. Ứng dụng nhân giống phƣơng pháp Invitro
2.6.1. Tạo cây sạch bệnh
Hàng năm sản xuất nông nghiệp chịu thiệt hại rất lớn do các nguồn
bệnh nói chung: nâm, vi khuẩn, tuyến trùng ... và virus nói riêng. Năm 1971
virus Tungro đã cướp đi 20- 30% sản lượng lúa mì, đại mạch ở các nước
Châu Âu. Virus ko thề phòng chống dễ dàng như sâu bệnh, nấm, vi khuẩn.
Cách duy nhất là tạo ra giống cây sạch bệnh mà phương pháp in vitro là hữu
hiệu nhất.
Từ những năm 1940 nuôi cấy mô được sử dụnh làm cải thiện giống cây
trồng. Từ khi Kassanis(1957)quan sát thấy đỉnh chồi hoặc rễ ko hay có rất ít
virus, đỉnh sinh trưởng (meristem) đã được sử dụng để nuôi cấy tạo cây sạch
bệnh. Đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 5-10mm nhưng với mục đích loại trừ
virus mẫu chỉ cần 0.1mm. Phương pháp nuôi cấy này có thế ứng dụng ở cây
hai lá mầm như: khoai tây, thuốc lá, cam, chanh hay ở cây một lá mầm như
dứa sợi...
Nhưng nuối cấy đỉnh sinh trưởng vẫn không thể loại bỏ hoàn toàn virus
để tạo giống cây sạch bệnh theo đúng nghĩa Kowski và Shmelze (1974) đã kết


18

hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và liệu pháp nhiệt. Xử lý nhiệt ở điểu kiện 3238 0C trong 7 ngày có thể loại bỏ hoàn toàn virus ở đỉnh sinh trưởng. Hàng
loại các loại cây trồng làm thức ăn cho gia súc, cây rau, cây ăn quả,...đã được
làm sạch bằng phương pháp này.

Để tạo cây sạch bệnh, hóa chất cũng được hóa chất cũng được sử dụng
và cho hiệu quả rất tốt. Kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Kết hợp nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng và sử lý hóa chất giúp việc loại bỏ virus hiệu quả hơn. Các
đông phân của purine và pirimidine, amino acid, hormon sinh trưởng thực vật
và các kháng sinh là các chất thường dược sử dụng. Nó có tác dụng kìm hãm
sự hoạt đọng của virus. Gần đây người ta còn sử dụng một nhóm các chất
khác nhau như arabinoside hoặc vidarabine để làm sạch virus để làm sạch
virus trong quá trình nuôi cấy mô phân sinh ở khoai lang cũng cho kết quả tốt.
Từ năm 1952 các nhà nghiên cứu sinh ở Morel (nhà khoa học Mỹ) đã
cho thấy kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) rất có hiệu quả trong
việc làm sạch virus. Bằng kỹ thật này đã làm sạch bệnh cho 55 loài cây trồng,
23 loài cây cảnh, 11 loài cây ăn quả, 8 loài cây có củ và 7 loài cây công
nghiêp..
Như vậy việc kết hợp giữa biên pháp nhiệt, hóa chất và nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng đã tạo ra rất nhiều giống cây sạch bệnh, giảm thiểu thiệt hại cho
các nguồn bênh nói chung và virus nói riêng cho cây trồng.
Trung quốc là nước tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy mô rất sớm(từ
thập kỷ 40-50). Năm 1970 Tsui sử dujnh nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi làm
sạch virus. Bằng các kĩ thuật vi nhân giống đến nay đã được hơn 700 loài.
Hàng năm nhân giống được khoảng 220 triệu cây trồng trên diện tích 1 triệu
ha bao gồm: khoai tây, chuối, táo, nho, cây cảnh, cây lâm nghiệp,...


19

2.6.2. Nhân nhanh số lượng cây Invitro
Phương pháp in vitro là phương pháp nhân giống vô tính có khả năng
tạo nhanh một quần thể có độ đồng đều cao, sạch bệnh. Quần thể vô tính này
tránh được sự thoát ly, thoát hóa hay ghặp trong quần thế cây trồng từ hat
đông thời sử dụng đầy đủ tiềm năng đi truyền của bố và mẹ

Nhân giống in vitro hay vi nhân giống hay vi nhân giống thực chất là
nhân bản thực vật nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, băng việc nuôi
cấy mô tế bào thực vật trong thời gian ngắn đã cho số lượng lớn cây giống đủ
phẩm chất để đem đi sản xuất.
Trong nhân giống in vitro, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một phương
thức rất hữu hiệu để cho ra nhanh những giống cây trồng sạch bệnh. Nó đã
được ấp dựng cho việc phục tráng ở các loài hoa, cây cảnh, rau...Đỗi với các
loài thân gỗ, do việc tái tạo lại cơ thể hoàn chỉnh bằng nuôi cấy mô là rất khó
khăn nên tới năm 1968 Winton mới lần đầu tiên tạo ra một cây hoàn chỉnh
bằng kỹ thuật in vitro đó là cây populus tremiloids. Kể từ đó kỹ thuật in vitro
đã được ứng dụng để nhân giống nhiều loại cây. Một số nước như Ấn Độ,
Trung Quốc đã sử dụng phương pháp nhân giống in vitro vào nhân giống
bạch đàn. Hiện nay đã nhân giống thành công trên 20 loại bạch đàn và Trung
Quốc là nước sớm ứng dụng nuôi cấy mô vào trồng trên diện tích rộng.
Kỹ thuật nuôi cấy mô được trên 600 công ty trên thế giới áp dụng để
nhân khoảng 500 triệu giống cây trong nhiều năm ở các giống cây trồng khác
nhau. Dự kiến thị trường cây nhân giống bằng nuôi cấy mô vào khoảng 15 tỷ
USD/nawmvaf tốc độ tăng trưởng của thị trường này là rất lớn khoảng 15%
mỗi năm.
Công nghệ nuôi cấy mô phục vẹ nhân giống cây trồng ở nước ta đã
được triern khai trên 20 năm. Nhân giống thương mại quy mô lớn đã dduojc
thực hiện ở một số giống cây trồng như nhân nhanh giống chuối, giống khoai


20

tây sạch bệnh, các giống mới nhập nội, các dòng bạch đàn, keo lai đại công
suất khoảng 3 triệu cây trên 1 năm. Quy trình công nghệ nhân giống đã được
nhiều viện, trường nghiên cứu hoàn thiện ở nhiều cây trồng khác nhau như
cây có múi, đu đủ, các loài lan, các loài thuốc quý... Việc thương mại hóa các

công trình đó là chìa khóa cho sự mở rộng phạm vi giống cây trồng công
nghiệp in vitro ở nước ta trong những năm tới đây.
2.7. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới.
2.7.1. Tình hình trong nước.
Phòng cấy mô của Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang đã
thành công nuôi cấy mô cây Ba Kích Tím và chuẩn bị đưa ra trồng thử
nghiệm để theo dõi các chỉ tiêu cần thiết, nhất là các thông số các dược liệu
trước khi phát triển nhân rộng ra toàn tỉnh.
Quảng Ninh đã có những nghiên cứu đáng kể về Ba Kích ,nuôi cấy mô
Ba Kích để tăng số lượng cây để lấy thành phẩm để đáp ứng cho các cơ sở sản
xuất rượu Ba Kích. Mà tên tuổi của rượu đã có nổi tiếng khắp cả nước.
Về y học thì viện y học cổ truyền đã nghiên cứu các thành phần có
trong Ba Kích. Ba kích tím có vị cay, ngọt, tính hơi ôn, không độc, một loại
dược liệu quý có nhiều công dụng như bổ thần kinh, bổ gân cốt, khử phong
thấp, giảm xơ cứng động mạch, tăng cường khả năng sinh lý nam giới... Do
vậy, Ba Kích dùng để chữa dương ủy, phong thấp cước khí, gân cốt yếu,
mềm, lưng gối mỏi đau.
2.7.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước.
Cây Ba Kích của nước ta được các nước bạn biết tới với công dụng
tăng cường sức khỏe tốt cho hoạt động sinh lý.
Cây Ba Kích tím của nước ta được nước bạn Trung Quốc tìm hiểu và
nhân giống .


21

PHẦN III
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Cây Ba kích tím ( Morinda officinalis How)
- Vật liệu nghiên cứu: Đoạn thân non, bánh tẻ cây Ba Kích Tím
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2
0,1mg/l đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả
năng tái sinh, nhân nhanh chồi, ra rễ của cây Ba Kích Tím.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Tế bào Thực vật, Viện nghiên
cứu và phát triển Lâm nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian: 12/2015 – 5/2016
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị

Nồi hấp vô trùng
Tủ sấy
Hệ thống giàn đèn

Hóa chất
Chất khử trùng (cồn 70o,
Pank
HgCl2)
Dao, Kéo
Môi trường MS cơ bản
Đèn cồn
Nhóm Auxin (IBA, NAA)
Nhóm Cytokinine
Cốc đong, ống đong
(BA,NAA,…)

Bình tam giác
Nhóm Gibbererllin (GA3)
Đĩa (hạt đậu, petri) Đường Sacharose
Chun nịt
Agar

Máy cất nước

Túi nilon

Chất hữu cơ

Box cấy vô trùng

Giấy thấm

Than hoạt tính

Cân phân tích
Máy khuấy từ
Máy đo PH
Lò vi sóng

Dụng cụ