Nghiên cứu khả năng tái sinh cây In Vitro của một số giống đậu tương

PHẦN MỘT:

MỞ ĐẦU
I.1. Đặt vấn đề
Cây Đậu Tương (Glycine max(L)Merrill) đã được biết đến và trồng từ rất lâu
đời. Năm 1994 diện tích đậu tương trên thế giới khoảng 61571000 ha với năng suất
bình quân đạt 2078 kg/ha. Sản lượng đạt trên 10 triệu tấn/năm. Điều đó khẳng định
cây đậu tương là một trong những cây trồng quan trọng trong nền nông nghiệp.[2]
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành là loại cây họ Ðậu (Fabaceae), đặc điểm của
hạt đậu tương chứa hàm lượng protein cao, giầu giá dinh dưỡng chính vì vậy là cây
thực phẩm có vai trò quan trọng cho con người và gia súc. Từ hạt đậu tương có thể chế
biến được nhiều các sản phẩm khác nhau như: sản xuất dầu thực vật, sản xuất dầu ăn,
đậu phụ, tào phớ, sữa đậu nành,… là những sản phẩm công nghiệp được chế biến từ
đậu tương rất có lợi cho sức khoẻ con người, góp phần chống suy dinh dưỡngvà các
bệnh thần kinh, tim mạch. Ngoài việc cung cấp 40-50% lượng protein thì trong hạt đậu
tương có chứa hàm lượng lớn lipit cụ thể là 12-24%. Bên cạnh đó, do có khả năng cố
định đạm tự do nhờ cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium Japonicum mà đậu tương là cây
trồng bảo vệ đất chống xói mòn. Cuối cùng cây đậu tương còn góp phần giải quyết
công ăn việc làm, tăng thu nhập cho người nông dân [2].
Nền nông nghiệp nước ta đã phát triển cùng với nền văn minh lúa nước, tất
nhiên không vì thế mà cây đậu tương mất đi chỗ đứng của nó. Đậu tương nằm trong
những cây trồng quan trọng và việc phát triển đậu tương cũng đã được chú trọng . Tuy
nhiên, năng suất của cây đậu tương thường rất thấp bởi đang bị ảnh hưởng của hạn hán
và dịch bệnh. Tình trạng thiếu nước ảnh hưởng xấu tới sự sinh trưởng và năng suất của
cây đậu tương. Bên cạnh đó còn có sự phá hoại của năm loại dịch bệnh phổ biến tấn
công đậu tương, đó là bệnh: nấm, thối thân, hội chứng đột tử, tàn lụi vi khuẩn, đốm lá
[1, 3]. Các loại bệnh hại này và hạn hán đã gây tổn thất không nhỏ đối với năng suất
đậu tương. Nếu sử dụng thuốc trừ sâu hoá học thì chi phí sản xuất cao và gây ảnh
hưởng đến môi trường.
Rõ ràng, đậu tương là cây thực phẩm thiết yếu, nhưng năng suất của các giống
đậu tương hiện nay lại đang bị ảnh hưởng bởi hạn hán và sâu bệnh hại. Chính vì lẽ đó

1


cần có biện pháp cải tạo các giống hiện nay nhằm đem lại hiệu quả cao trong nông
nghiệp. Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học, đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ
sinh học thì có lẽ phương pháp chuyển gene là lựa chọn tối ưu và phù hợp với tình
hình hiện nay. Có nhiều phương pháp chuyển gene vào thực vật, trong đó phương pháp
chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mô in vitro nhằm tạo
cây trồng biến đổi gene đem lại tỷ lệ thành công cao nhất.
Tuy nhiên, đậu tương (glycine max L) là cây rất khó tái sinh trong nuôi cấy
invitro, đặc biệt là việc tái sinh các callus có nguồn gốc từ chồi, lá mầm và phôi… Đã
có nhiều nghiên cứu về việc tái sinh đậu tương thông qua các cơ quan như: lá mầm,
mắt lá thật đầu tiên (Barwale và Cs 1986, Kim và Cs 1990), lá thật đầu tiên của cây
non (Wright và Cs 1987), phôi soma (Lazzeri và Cs 1985, Rouch và Cs, 1985) [3]…
Để phục vụ cho công tác nhân invitro và bảo tồn nguồn gen đặc biệt là chọn
giống thông qua chuyển gen, tạo ra giống mới có khả năng kháng sâu, kháng thuốc trừ
cỏ… Chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro

của một số giống đậu tương”.
I.2. Mục đích, ý nghĩa, yêu cầu
I.2.1. Mục đích
Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống đậu tương bằng kỹ thuật nuôi cấy in
vitro với 2 công đoạn chính: nuôi cấy, tái sinh cây để phục vụ các nghiên cứu về
chuyển gen, nhân giống, bảo tồn in vitro…
I.2.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: Đề tài nghiên cứu nhằm tìm ra các môi trường phù hợp để
tái sinh cây đậu tương in vitro nuôi cấy mô một số giống đậu tương. Từ đó xây dựng
được quy trình nuôi cấy mô cây đậu tương từ đỉnh sinh trưởng của hai giống đậu
tương DT84 và DT2001.

- Ý nghĩa thực tiễn: Tạo cây đậu tương nuôi cấy mô thành công sẽ ứng dụng
trong việc nhân giống đậu tương sạch bệnh và tạo cây đậu tương biến đổi gen, góp
phần vào sự phát triển của nền Nông nghiệp bền vững.

2


I.2.3. Yêu cầu
(1) Xác định quy trình khử trùng mẫu để tạo mẫu sạch và môi trường nuôi cấy
thích hợp.
(2) Xác định nồng độ của BAP lên khả năng tạo thể protocorm ở mỗi giống là
cao nhất.
(3) Xác định nồng độ của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm của
hai giống là lớn nhất.
I.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
I.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các giống đậu tương DT84, DT2001
I.3.2. Phạm vi nghiên cứu
* Địa điểm: Bộ môn Kỹ thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp (Km 2 Đường
Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội)
* Thời gian: từ 23/2/2011 đến 22/5/2011.
* Điều kiện nghiên cứu:
- Phòng nuôi cấy:
. Nhiệt độ: 250C.
. Cường độ ánh sáng 2000 lux
- Thời gian chiếu sáng: 10giờ/ ngày.
- Các dụng cụ, buồng cấy được khử trùng bằng cồn và nhiệt.
* Các hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy.
- Các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin B5, phytagel, MES, các chất điều hòa
sinh trưởng: BAP, Zeatin, GA3, Glutamin, Asparagin. Nguồn cacbon: Đường

saccaroza.

3


PHẦN HAI:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

II.1. Lịch sử phát triển, cơ sở khoa học và kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
II.1.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình
nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái
niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ
quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng (15, 22, 29)..
II.1.2. Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật
II.1.2.1. Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Năm 1965, Robert Hooke quan sát trên kính hiển vi lát cát của miếng lạc thấy
phần mô thực vật được cấu tạo bởi nhiều tập hợp và đưa ra khái niệm “tế bào – cell”.
Anten Vanleuwen Hock (1632 – 1723) thiết kế kính hiển vi khuếch đại được 270
lần, lần đầu đưa vào quan sát thấy vi khuẩn, tế bào dịch người hay động vật. Năm
1965, phát hiện thấy tế bào động vật gồm nhiều tế bào động
Năm 1838 - 1839 Natthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học
thuyết cơ bản của sinh học gọi là học thuyết tế bào, khẳng định:
+ Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi 1 hoặc nhiều tế bào.
+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức
nhỏ nhất của sự sống.
+ Tế bào chỉ được cấu tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó (và mang đầy đủ thông
tin di truyền từ tế bào sinh ra nó).
Năm 1875 Oscar Hertw’g bằng quan sát trên kính hiển vi cho rằng sự thụ thai là

sự hợp nhất tinh trùng và trứng. Sau đó Hermann P, Butschili và Schneider FA đã mô
tả chính xác quá trình phân chia tế bào
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thu.yết về tính toàn thế của
tế bào vào thực nghiệm. Theo ông, tất cả tế bào thực vật có tính toàn năng, mỗi tế bào
đều mang một lượng thông tin di truyền đầy đủ của cơ thể và gặp điều kiện thuận lợi
thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Năm 1922, Kotte người Mỹ học trò của Haberlandt và Robbins lặp lại thực
nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo. Trong

4


môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng mạnh, tạo nên
một hệ thống có rễ phụ. Giai đoạn này làm cơ sở cho việc chọn mẫu cấy và những
nghiên cứu về thành phần môi trường ở các giai đoạn sau.
Năm 1929 - 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành công
trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh.
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi
White (Hoa Kỳ) nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum)
trong thời gian dài bằng muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó, nước
chiết nấm men được thay thế bằng 3 loại vitamin nhóm B: thiamin (B1), pyridoxine
(B6) và nicotinic acid. Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn được tiến
hành ở nhiều cây khác nhau.
Cũng trong năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA (Indol
Acetic Acid), một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích
sự tăng trưởng và phân chia tế bào.
Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi
cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và
thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục.
Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và

tổng hợp thành công, như Napthyl Acetic Acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid
(2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D giúp tạo mô sẹo,
gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi
cấy.
Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của
kinetin – một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô
nuôi cấy.
Năm 1957, Skoog và Miler công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nồng
độ các chất auxin/ cytokinin trong môi trường phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) của mô
sẹo ở thuốc lá. Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin như: IAA/ kinetin < 1 thì mô có xu hướng
hình thành chồi. Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin > 1 mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ.
Tỷ lệ auxin/ cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn
chỉnh.

5


Từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển.
Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng
cách sử dụng máy lắc.
Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công
nghiệp vi nhân giống thực vật. Cũng trong năm này, Bergman công bố có thể dùng
phương pháp lọc đơn giản để thu được hầu hết tế bào đơn mà không dính cụm. Cùng
với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo cây
hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh được tính toàn năng của tế bào.
Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn
bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt.
Đầu những năm 1970, Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho
các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên quần thể tế

bào trong môi trường lỏng.
Năm 1972 Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các
loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N
langsdorfi
Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo được cây lai soma cà chua – thuốc lá
bằng dung hợp tế bào trần.
Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào tế
bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium.
Từ năm 1980 đến 1992, nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực
vật được công bố, hàng loạt các công trình chuyển gen ngoại lai vào nhiều họ thực vật.
Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong những
ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật. Morel (1960) đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của
các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia
cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới. Khi nuôi trong các
điều kiện nhất định protocorm có thể phát triển thành cây lan con, tạo ra các dòng vô
tính không bị nhiễm virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với các cây như: khoai
tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác.

6


Năm 1993, Kranz và Lorz thực hiện thụ tinh invitro tạo ra và nuôi cấy phôi hợp
tử ở ngô. Các quá trình phát triển và phân hoá của phôi sau đó đã được quan sát dưới
kính hiển vi và phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định các gen tham gia trong từng
giai đoạn phát triển của phôi.
Hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ trong việc nhân giống,
chọn tạo giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận
di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô thực vật đã được đưa vào các chương trình
chọn giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993) [8].
II..1.2.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam

Tại Việt Nam, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật bắt đầu từ năm 1975. Phòng
nuôi cấy mô đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện khoa học Việt Nam do
Tiến Sĩ Lê Thị Muội đứng đầu.
Nhận thức được triển vọng to lớn của nuôi cấy mô trong chọn giống và nhân
giống cây trồng nông nghiệp, các cơ sở thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học tự
nhiên và Công nghệ Quốc gia Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu
thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Lâm nghiệp, Bộ Y tế, Viện nghiên
cứu Hạt Nhân đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm
lực khoa học và đào tạo cán bộ nghiên cứu vào ngành này (Trần Văn Minh, 1999) [7].
Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993 nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt
Nam đã đạt một số thành tựu như sau [8]:
- Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L..) tại Viện Công Nghệ Sinh học.
- Nhân giống vô tính cà Phê (họRubiaceae) Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn
Uyển).
- Nhân giống chuối (Mus a spp)
- Nhân giống cây bắt ruồi ( Nepenthes madagascariens ) Đoàn Thị Ái
Thuyền.
- Nhân giống dứa Cayen và Queen Long An.
- Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống mía đường (Sacharum offciarum),
nhân giống cây Vani (Vanilla sp) bằng nuôi cấy mô (Vũ Mỹ Liên)

7


II.1.3. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân
tạo trong điều kiện vô trùng [6].
Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:
- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.

- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
- Nuôi cấy mô sẹo(callus).
- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
- Nuôi cấy prôtplast: nuôi cấy tế bào trần.
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa vào tính toàn
năng của tế bào và dựa vào khả năng phân hoá – phản phân hoá của tế bào.
II.1.3.1. Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, Haberlandt đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cở thể
sinhvật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang
toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện
thích hợp, mỗi tế bào đều phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tính toàn năng
của tế bào [6].
Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được
biệt hoá (trừ một số tế bào đã được biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn) có khả năng
thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh
mới.
II.1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử).
Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh

8


chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này
chúng tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hoá đặc biệt cho các mô, cơ quan có
chức năng khác nhau.

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang
hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, mô dự trữ làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức
năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng
không hoàn toàn mất đi khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở
điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh
mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào.
Qúa trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào được biểu diễn dưới sơ đồ sau:
Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào
Trong đó:
+ Tế bào hợp tử là tế bào ban đầu.
+ Tế bào phôi sinh là tế bào chưa có chức năng riêng biệt.
+Tế bào chuyên hóa là các tế bào đã mang chức năng riêng biệt [15].
Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế
các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gene
được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số gene
khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này theo một chương trình đã được mã hoá trong
cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ
thể thực vật luôn được hài hoà.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể bình thường bị ức chế
bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của từng

khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào.

9


Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết
quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho đến
cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy
tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân
hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều
khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường
nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin.
* Các giai đoạn trong quá trình nhân giống in vitro
+Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị tạo cây mẹ sạch bệnh và nuôi cấy khởi động.
+ Giai đoạn 2: Chọn mẫu cấy phù hợp cho việc tái sinh nhân nhanh cây. Khử
mô nuôi cấy sau khi đã xác định được mẫu cấy bằng (HgCl 2, NaOCl, H2O2). Lựa chọn
môi trường nuôi cấy phù hợp để mẫu phát sinh chồi bất định hoặc phôi vô tính.
+ Giai đoạn 3: Nhân nhanh.
+ Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh.
+ Giai đoạn 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm.
II.1.4. Các kỹ thuâtâ nuôi cấy mô tế bào thực vâtâ invitro
* Nuôi cấy phôi
Năm 1921 Dieterich đã đưa ra kết luận là phôi nuôi cấy invitro hoàn toàn có thể
nảy mầm không qua giai đoạn ngủ nghỉ dựa trên cơ sở các nghiên cứu của mình.
Nhưng môi trường dinh dưỡng cho sự tạo cây ở phôi trưởng thành và phôi non
là khác nhau, phôi non cần môi trường giàu dinh dưỡng hơn.
* Nuôi cấy mô trong cơ quan tách rời
Năm 1946 Wetmare đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi
gặp điều kiện thuận lợi.
Với các bộ phận khác nhau trên cây thì nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy cũng

rất khác nhau. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển mô của cơ quan nuôi cấy thì sau
một khoảng thời gian nhất định ta phải cấy chuyển sang môi trường mới.
Ứng dụng: Nghiên cứu các môi trường dinh dưỡng phù hợp với các bộ phận
khác nhau của cây, tạo mô sẹo nhân cây in vitro.
* Kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh
Thường sử dụng là các mô đỉnh chồi và đỉnh cành có kích thước từ 0,1 mm đến
1,0 mm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi
mới hình thành và các cành non.
Khi sử dụng các mô phân sinh cần phải cân bằng giữa các chất điều hòa sinh
trưởng.

10


Ứng dụng: Tạo cây sạch virus, nhân giống in vitro tạo cây đa bội thông qua xử
lý Conxixin [16].
* Nuôi cấy bao phấn
Đã có rất nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển
thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo
phôi trực tiếp và gián tiếp trung gian qua mô sẹo và tạo cơ quan.
Ứng dụng: Tạo các dòng thuần, biểu hiện các gen lặn, cây đơn bội thu được từ
nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là nguồn nguyên liệu cho chọn dòng đột biến.
* Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần
Năm 1960 Cooking sử dụng enzim phân giải tế bào và đã tạo ra một số lượng
lớn tế bào trần. Khi tách khỏi mô hoặc quần thể tế bào chúng được nuôi riêng rẽ.
Ứng dụng: Là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu những biến đổi di truyền ở
thực vật bằng phương pháp dung hợp 2 loại tế bào trần để tạo các cây lai soma.
* Nuôi cấy mô sẹo
Các mô đã biệt hóa được tách ra dưới điều kiện thích hợp sẽ phản biệt hóa tạo
thành mô sẹo.

Có thể sử dụng bất kỳ bộ phận dinh dưỡng nào của cây: Mảnh lá, thân, rễ làm
vật liệu nuôi cấy tạo mô sẹo hoặc có thể sử dụng hạt gieo trên môi trường thích hợp
đến khi phát triển thân mầm, tiếp tục cắt thân thành những đọan nhỏ và đưa vào môi
trường tạo mô sẹo (cà chua).
Nên sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất bởi vì
tế bào mô sau khi cấy chuyển nhiều lần dễ phát sinh đột biến.
* Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dung dịch lỏng (suspension culture).
Từ những năm 1959 Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô
thực vật ở qui mô lớn (134 l) bằng nuôi cấy chìm.
Các nhà khoa học đã nuôi tế bào ở qui mô công nghiệp phục vụ sản xuất
sikonin chọn tạo các dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp stukonin cao
hơn.
Công nghệ nuôi cấy tế bào trong các bioreactor dung tích lớn sản xuất sinh
dược, thương mại hóa.
* Công nghệ tế bào ứng dụng trong chuyển gen vào cây trồng
Đưa những gen cần chuyển vào thực vật tạo cây mang những đặc tính mong
muốn có thể chưa từng xuất hiện ở loài cây đó, thậm chí trong toàn bộ dòng họ. Những

11


gen chuyển vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy tái sinh tế bào
thành cây invitro sau chuyển gen.
Tạo những biến đổi sâu sắc có định hướng trong các tính trạng của cây thông
qua biến đổi các protein chủ chốt của tế bào, điều khó đạt được trong phương pháp cổ
điển.
- Gen cần chuyển phải được di truyền cho thế hệ sau.
- Gen cần chuyển phải được thể hiện đúng lúc đúng chỗ.
1.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy phải cung cấp các nguyên tố quan trọng và các chất dinh

dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây invitro. Sự lựa chọn hay phát triển môi
trường nuôi cấy là một bước quan trọng trong bất cứ đề tài nuôi cấy mô tế bào nào.
Thành phần môi trường sử dụng bao gồm các yếu tố sau:
+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
+ Vitamin.
+ Nguồn cacbon.
+ Chất hữu cơ.
+ Các chất điều hòa sinh trưởng (nhóm Auxin, Cytokinin).
+ Tác nhân làm đông (nếu môi trường nuôi cấy ở thể rắn).
* Nguồn Cacbon
Khi được nuôi cấy invitro thường thì các tế bào thực vật không có khả năng
quang hợp. Do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn Cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng
của tế bào.
Nguồn Cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là sucrose, một số
trường hợp sử dụng Glucose và fuctozose thay thế cho Sucrose nhưng chúng thường
nghèo hydrat cacbon đối với cây.
Khi khử trùng chú ý không nên để quá lâu để tránh hiện tượng caramen hóa xảy
ra làm cho môi trường chuyển sang màu vàng ức chế sự phát triển của tế bào.
* Các muối khoáng đa và vi lượng.
Với cây trồng thì các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng.
Nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, Mg, S và Ca. Các nguyên tố đa lượng này
thường tồn tại ở dạng muối và tồn tại trong dung dịch. Đây là nguyên liệu để những tế
bào hình thành nên cấu trúc của mình.

12


Nguyên tố vi lượng điển hình thường sử dụng như các nguyên tố Fe, Cu, Zn,
Mn, Bo, I, Co. Nhờ các nguyên tố vi lượng này mà cây mới sinh trưởng và phát triển
bình thường. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào thành phần của enzym xúc tác cho

phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào.
* Các vitamin
Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy invitro ở các
loài khác nhau là khác nhau.
Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ
bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh trưởng tốt nhất phải bổ
sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và aminoacid. Trong các loại
vitamin, B1 được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B 3)
và pyridoxune (B6) cũng có thể được bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy tăng
cường sức sinh trưởng của mô.
* Các chất bổ sung
- Glutamin:
- Asparagin:
* Phytagel:
1.1.6. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng
Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính: auxin và Cytokinin, ngoài
ra còn có nhóm gibberlin và etylen là nhóm chất điều tiết kích thích sự sinh trưởng
phát triển, phân hóa cơ quan.
* Nhóm Auxin
Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm( IAA, NAA,
2,4D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ nhưng nếu sử
dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến. Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc
NaOH pha loãng [15].
Vai trò:
- Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào.
- IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng chồi
đỉnh.
- IAA (3- irdole aceticacid) đóng vai trò kích thích sự phân hóa của các mô dẫn
(xylem và phloem). IAA, IBA, NAA thường được sử dụng cho phát sinh rễ.

13


- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành dâm và phát sinh chồi phụ có ảnh hưởng khác
nhau với sự rụng lá, sự ra hoa đậu quả, sự phát triển và chín của quả.
- 2,4D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo.
- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus).
- Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp.
IAA là Auxin tổng hợp dễ bị phân hủy sau vài ngày khi để ngoài ánh sáng, do
đó nên pha dung dịch IAA sau mỗi tuần.
* Nhóm Cytokinin
- Các Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và phân hóa chồi. Trong
môi trường nuôi cấy tỷ lệ Auxin/ Cytokinin quyết định sự phân chia tế bào, phân hóa
chồi từ mô sẹo, tạo phôi vô tính.
- Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, 2iP.
+ Kinetin (6 - fafurolaminoprrine) hình thành và phát triển trong điều kiện
nhiệt độ cao từ chế phẩm ADN có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi.
+ Zeatin (6 – hydoxy - 3 - methylbut - 2 enl amino purin) thực chất là một dẫn
xuất của adenin có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá quá đắt nên ít sử dụng.
+ BAP (6 - benzyl amino purine) có hoạt tính cao hơn kenitin và bền với nhiệt
độ cao, hơn zeatin.
+ 2ip (Isopentenil- adenine)
Chức năng chủ yếu của Cytokinin trong quá trình phân bào là kích thích sự
phân chia tế bào, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy, tăng diện tích phiến lá, tạo
chồi bất định (nồng độ cao) ức chế quá trình già hóa, kích thích tạo diệp lục, ức chế sự
kéo dài chồi, ức chế sự hình thành rễ, có thể làm tăng sự phát triển mật độ khí khổng ở
một số loài [17]. Cytokinin được pha bằng dung dịch HCl loãng.
* Gibberilin (GA3): là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong nhóm gibberilin có
hơn 20 chất.
Thường ít thấy sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật bởi nó ức chế sự

phát triển mô sẹo và hình thành rễ bất định, do hoạt động của mô sẹo chúng được sử
dụng trong nghiên cứu về sự tạo hình.
GA3 tan được trong nước nhưng trong môi trường axit, nhiệt độ cao thì GA 3
mất họat tính sinh học.
Trong môi trường kiềm, GA3 chuyển thành dạng điện phân không hoạt động.

14


* Axit absisic (ABA)
Tác dụng: Tạo phôi, kích thích sự chín phôi, kích thích sự phát chồi ở nhiều
loài thực vật.
Phát huy khả năng chống chọi của tế bào với ngoại cảnh bất thuận ( gây ra
đóng khí khổng) sản sinh các yếu tố ức chế mất nước, nhiệt độ thấp.
Dung dịch mẹ pha cao gấp 1000 lần (NaOH 1N), ABA khá ổn định với nhiệt độ
nhưng rất nhạy với ánh sáng, được pha loãng bằng dung môi nước.
* Ethylen
Là chất ức chế sinh trưởng gây sự già hóa, rụng lá, quả, làm chín, kích thích nở
hoa, sự lão hóa của hoa và lá.
Với cây trồng thì các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng .
II.2. Lịch sử nghiên cứu cây đậu tương
II.2.1. Nguồn gốc lịch sử và phân bố cây đậu tương
Cây đậu tương (đậu nành - Glycine max L) có nguồn
gốc xa xưa từ Trung Quốc và được sử dụng làm cây thực
phẩm phục vụ đời sống con người từ hơn 4000 năm trước.
Vào thế kỷ thứ 11 trước công nguyên, người Trung Quốc đã
bắt đầu sử dụng đậu tương.
Hàng trăm năm sau khi Trung Quốc phát hiện ra những ứng dụng của đậu tương
và thuần hóa chúng, các nước khác cũng đua nhau sử dụng đậu tương. Sau đó, khoảng
thế kỷ thứ VIII người Nhật Bản đen về trồng trên đất nước mặt trời mọc, rồi tiếp tục

được trồng ở một số nước châu Á như: Thái Lan, Malalysia, Hàn Quốc, Việt Nam,
Indonesia, Philippines, Việt Nam, Malaysia, Miến Điện, Nepal và miền Bắc Ấn Độ đã
bắt đầu sử dụng đậu tương. Đậu nành được sử dụng làm đậu phụ, tào phớ, ép lấy dầu...
Trong khi đó, các nước châu Âu khác vẫn chưa biết đến việc sử dụng đậu nành.
Cuối cùng, mãi đến thế kỷ thứ XVII, XVIII , đậu nành mới được trồng ở các
nước châu Âu và Bắc Mỹ. Và lâu hơn nữa thì hạt đậu tương mới chạm được đến đất
Mỹ. Ngày nay, quốc gia đứng đầu về đậu tương với 50% sản lượng toàn thế giới là
Hoa Kỳ [4].
II.2.2. Vị trí trong phân loại thực vật [9]

15


Giới (Kingdom)

: Plantae

Nghành (Phylum)

: Magnoliophyta

Lớp (Classis)

: Magnoliopsida

Bộ (Ordo)

: Fabales

Họ (Familia)

: Fabaceae

Phân họ (Subfamilia)

: Paboideae

Chi (Genus)

: Glycine

Loài (Species)

: G. max

II.2.3. Vai trò của cây đậu đậu tương
Cùng với thời gian, ngày nay cây đậu tương (Glycine Max (L) Merrill) còn gọi
là đậu nành càng thể hiện được vai trò vô cùng quan trọng trên nhiều lĩnh vực. Khó có
thể tìm thấy một loại cây trông nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương. Là cây
trồng đã biết đến từ rất lâu, sản phẩm của nó làm thức ăn cho con người, thức ăn cho
gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Bởi vậy
nó được ví là loại "cây kỳ lạ", "vàng mọc từ đất", "cây thần diệu", "cây đỗ thần", "cây
thay thịt" hay còn được gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu"… [5]
Quả là đúng khi đánh giá về tầm quan trọng của đậu tương như vậy. Bởi những
giá trị toàn diện mà cây đậu tương mang lại. Mà những giá trị kinh tế đó chủ yếu được
quyết định bởi các thành phần chứa trong hạt. Hạt đậu tương gồm có protein, lipit,
hydrat cacbon, các chất khoáng... Trong đó protein và lipit là hai thành phần quan
trọng nhất chiếm khoảng 60% trọng lượng hạt.
Theo giáo trình Cây công nghiệp thì trong hạt đậu tương hàm lượng protein
chiếm khoảng 40-50% và lipit biến động từ 12-24% tuỳ theo giống và điều kiện khí

hậu. Điều này thực sự cho thấy đây là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánh
giá đồng thời cả protein và lipit mà phải nói rằng so với một số thực phẩm, thịt hay
một số loại hạt đậu đỗ khác thì hàm lượng protein rõ ràng là cao hơn hẳn.
Bên cạnh hàm lượng lớn về protein và lipit, hạt đậu tương còn giàu nguồn sinh tố và
muối khoáng và chứa nhiều loại axit amin trong đó có 8 axit amin không thay thế như:
Arginin, Histidin, Lysin, Triptophan...Hàm lượng của các axit amin có chứa lưu huỳnh
như Methionin, Sistein, Sixtin...trong đỗ tương rất gần với hàm lượng của các chất này
ở trứng. Hàm lượng của Cazein, đặc biệt là của Lysin rất cao, gấp rưỡi của trứng. Điều
này cho thấy đây là loại hạt mà có đầy đủ và cần đến của các loại axit amin cần thiết.
Hơn nữa protein của đậu tương dễ tiêu hoá hơn thịt và không có Colesteron. Ngày nay,

16


qua các thí nghiệm mới người ta còn biết thêm nó chứa chất Lexithin có tác dụng làm
cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm trí nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương
và tăng sức đề kháng của cơ thể.
Trong thời đại ngày nay khi chúng ta đang tìm nguồn dầu thực vật để thay
thế việc phải dùng mỡ động vật thì có thể thấy rằng với hàm lượng lipit như đã nói
ở trên có thể đủ cung cấp một lượng dầu thực vật khá lớn. Cho nên so với các loại
đậu đỗ khác cây đậu tương được coi là cây lấy dầu thực vật quan trọng. Lipit của
đậu tương chứa một tỷ lệ các axit béo chưa no có hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơm
ngon như: axit oleic (30-35%), axit lioleic (45-55%) và linonic (5-10%). Dùng dầu
đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ mỡ động mạch và có tác dụng tốt
đối với sức khoẻ con người.
Thành phần khá quan trọng trong hạt đậu tương nữa là các Vitamin. Hạt đậu
tương chứa khá nhiều các loại Vitamin mà đặc biệt phải kể đến hàm lượng của các
Vitamin B1, B2, ngoài ra là các loại Vitamin PP, A, E, K, D, C...và các loại muối
khoáng khác.
Theo tác giả Nguyễn Danh Đông, trong 100g hạt đậu tương có hàm lượng

Vitamin B1 có thể cung cấp cho một nửa nhu cầu B1 của cơ thể trong một ngày. Đặc
biệt hạt đậu tương ngâm hàm lượng Vitamin C tăng từ 8,7-354mg trong 100g hạt đậu
tương. Nhân dân một số vùng như Cao Bằng, Bắc Kạn… đã dùng hạt đậu tương nảy
mầm làm rau giá, đó là món ăn tốt và giàu Vitamin, protein. Ngoài ra đậu tương còn
chữa được nhiều bệnh như đái đường, thần kinh suy nhược, suy dinh dưỡng.
Bởi những thành phần như vậy mà từ lâu con người đã biết sử dụng hạt đậu tương vào
việc chế biến thành thức ăn, thành các dạng thực phẩm khác nhau. Cho đến nay, người
ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn
bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên
men...như giá đỗ, bột đậu tương, tương đậu phụ, đậu hũ, chao, tào phớ, sữa đậu nành,
xì dầu...đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương, socola đậu tương, bánh
kẹo, pate, thịt, nhân tạo... được mệnh danh là “người đầu bếp của thế kỷ”. Đối với
nhân dân ta có lẽ không ai biết rõ từ khi nào đậu tương đã được sử dụng làm thức ăn
cung cấp một phần nhu cầu chất đạm cho con người và gia súc dưới dạng các món ăn
cổ truyền [10 ].

17


Đối với con người, đậu tương còn là một vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là
đậu tương hạt đen có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột. Đặc biệt đối
với người mắc bệnh đái đường, thấp khớp, mới ốm dậy, lao động quá sức thì quả là
loại thức ăn tốt.
Ngày nay, bên cạnh việc sử dụng hạt đậu tương chín để làm thức ăn thì con
người lại có xu hướng sử dụng đậu tương như một loại rau. Thực ra điều này cũng đã
được con người chú ý đến. Ở nước ta các vùng nông thôn vẫn hay thu hoạch đậu tương
sớm và luộc ăn nhưng chưa được xem như là một loại rau như những năm gần đây.
Hạt đậu tương không những là thức ăn cho người mà nó còn góp phần cung cấp thức
ăn cho chăn nuôi gia súc, gia cầm. Trong khi nhà nước ta đang có những biện pháp để
tăng sự phát triển của ngành chăn nuôi thì đối với việc dùng đậu tương làm thức ăn

cho gia súc đã giải quyết được một khâu quan trọng trong vấn đề tìm nguồn thức ăn.
Để sử dụng đậu tương làm thức ăn cho gia súc có thể sử dụng trực tiếp hạt hay bã đậu
tức là bột đậu tương sau khi ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh
hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp. Thân lá cây đậu
tương có thể dùng làm thức ăn gia súc, gia cầm rất tốt.
Trong công nghiệp, dầu đậu tương còn được sử dụng làm xi, sơn, mực in, xà
phòng, chất dẻo, cao su nhân tạo, len nhân tạo, thuốc trừ sâu...
Thực sự trong giai đoạn hiện nay phát triển nền nông nghiệp bền vững là điều
mà mỗi một quốc gia đều mong muốn. Chính vì vậy mà với chủ trương phát triển nền
nông nghiệp bền vững thì vai trò của cây đậu tương trong hệ thống nông nghiệp là vô
cùng quan trọng.
Một điều khá đặc biệt đối với những cây thuộc họ đậu là chúng có khả năng
tích luỹ đạm tự do trong không khí để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vào sự cộng
sinh với vi khuẩn nốt sần Rhizobium Japonicum ở bộ rễ và trong điều kiện thuận lợi
các vi khuẩn nốt sần này có thể tích lũy được một lượng đạm tương đương với 2025kg ure/ha. Rễ ăn sâu phân nhánh nhiều làm đất tơi xốp, thân lá được dùng làm phân
xanh rất hiệu quả. Bởi vậy nên trồng đậu tương không những tốn ít phân đạm mà còn
làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo và bồi dưỡng đất.
Mặt khác, đậu tương là cây trồng ngắn ngày, các giống đậu tương ngắn ngày thì thời
gian sinh trưởng chỉ có 70-75 ngày và với khả năng thích nghi trên nhiều loại đất khác

18


nhau, ở nhiều vụ trong năm nên là cây trồng tốt trong việc luân canh, xen canh, gối vụ
với nhiều loại cây trồng khác nhau.
Do đó, trong điều kiện nhiệt đới ẩm của nước ta, đậu tương là cây trồng dễ đưa
vào hệ thống luân canh tăng vụ hoặc trồng xen, vừa đem lại hiệu quả kinh tế, vừa tốt
cho sự sinh trưởng phát triển của các cây trồng khác. Vì vậy chúng được xem là cây
trồng quan trọng của Nông nghiệp Việt Nam.
II.2.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

II.2.4.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới,
đứng hang thứ 4 sau lúa mì, lúa nước và ngô. Do khả năng thích ứng rộng nên nó
đã được tròng ở khắp năm châu lục, nhưng tập chung nhiều nhất ở châu Mỹ, tiếp đó
là châu Á. Tình hình sản xuất đậu tương trong những năm gần đây được thể hiện ở
bảng sau
Bảng 1:

Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới từ năm 2001 đến năm 2005
Diện tích

Năng suất

Sản lượng

(triệu ha)

(tạ/ ha)

(triệu tấn)

2001

76,077

23,20

176,761

2002

79,167

22,73

108,907

2003

83,600

23,40

188,929

2004

91,440

22,34

204,266

2005

91,386

23,00

209,532

Năm

(Nguồn: FAOSTAT Database, 2006) [5].
Số liệu ở bảng 1 cho thấy diện tích gieo trồng và sản lượng trên thế giới tăng rất
nhanh trong vòng 5 năm qua. Trên thế giới (tính đến tháng 4/ 2006), 78 nước trồng đậu
tương với diện tích khoảng hơn 91 triệu ha với năng suất bình quân khá cao 22-23 tạ/
ha đã tạo ra một sản lượng đậu tương lớn gấp hơn 2 lần so với 20 năm về trước. Các
nước trồng đậu tương đứng hàng đầu trên thế giới về diện tích và sản lượng là Mỹ,
Braxin, Achentina và Trung Quốc [5].

19


Năm 2003

Năm 2004

Năm 2005

Diện
tích
(triệu
ha)

Năng Sản Diện Năng
suất lượng tích
suất
(tạ/ (triệu (triệu (tạ/
ha)

ha)
tấn)
ha)

Sản
lượng

Diện Năng
tích
suất
(triệu (tạ/
ha)
ha)

Sản
lượng

Mỹ

29,33

22,77 66,77 29,93

85,740 28,84 28,72

82,82

Braxin

18,52

28,08 52,02 21,52 23,14 49,793 22,89 21,92

50,10

Achentina

12,4

28,0

33,30

Trung Quốc

9,32

16,53 15,39

Nước

34,88 14,03
9,70

28,6

22,0

(triệu
tấn)

31,500 14,03 27,28

18,14 17,600

9,50

17,79

(triệu
tấn)

16,90

(Nguồn: FAOSTAT Database, 2006) [5]
Qua bảng số liệu ta thấy Mỹ là nước đang dẫn đầu về sản lượng và diện tích. Bộ
Nông nghiệp Mỹ ước tính sản lượng đậu tương trên thế giới năm 2010 đạt 242,07 triệu
tấn. Tổng diện tích đậu tương dự báo đạt 99,72 triệu ha, năng suất đậu tương sẽ đạt
bình quân 2,43 tấn/ha [1].
II.2.4.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở trong nước
Ở Việt Nam trong vòng hơn 20 năm qua (1985 - 2006) diện tích, năng suất và
sản lượng đậu tương đã không ngừng tăng, đặc biệt trong những năm gần đây, cụ thể:
năm 2000 diện tích trồng đậu tương là 124100 ha đến năm 2005 tăng lên 203600 ha,
năng suất đạt từ 12000 tạ/ha năm 2000 lên đến 14300 tạ/ha năm 2005 và sản lương đạt
từ 147300 tấn năm 2000 lên 290600 tấn năm 2005 [11].
Một số tài liệu cho rằng cây đậu tương được đua vào trồng ở nước ta từ thời vua
Hùng và xác định nhân dân ta trồng cây đậu tương trước cây đậu xanh và cây đậu đen
(Ngô Thế Dân & CS 1999). Ngày nay đậu tương đã trở nên quen thuộc với nhân dân
ta. Các món ăn được chế biến từ đậu tương tở thành những món ăn phổ biến thường
ngày. Tuy nhiên đậu tương được trồng ở nước ta chủ yếu là sử dụng làm thực phẩm

mang tính tự cung tự cấp. Trong những năm gần đây, cây đậu tương đã phát triển khá
nhanh về cả diện tích và năng suất góp phần tạo mặt hàng nội địa quan trọng. Tình
hình sản suất đậu tương trong nước mấy năm trở lại đây được trình bày ở bảng 2:

20


Bảng 2: Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây
( 2001 – 2007 )
Chỉ tiêu

Diện tích

Năng suất

Sản lượng

2001

(nghìn ha)
140,3

(tạ / ha)
12,4

(nghìn tấn)
173,7

2002

158,6

13,0

205,6

2003

165,6

13,3

219,7

2004

183,8

13,4

245,9

2005

204,1

14,3

292,7

2006

185,6

13,9

258,1

2007

187,4

14,7

275,2

Năm

(Nguồn: Tổng cục Thống kê, 2006)
Hiện nay cây đậu tương được trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước, do
điều kiện sinh thái của mỗi vùng khác nhau nên có sự khác biệt khá rõ về diện tích,
năng suất và sản lượng [11].
Bảng 3: Diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương của 7 vùng năm 2005
Địa điểm
Cả nước
Đồng bằng Sông Hồng
Vùng Đông Bắc
Vùng Tây Bắc
Vùng Bắc Trung Bộ
Tây Nguyên

Đông Nam Bộ
Đồng bằng Sông Cửu Long

Diện tích

Năng suất

Sản lượng

(nghìn ha)
203,6
67,3
48,4
25,0
6,5
27,1
5,3
21,2

(tạ/ ha)
14,3
16,0
10,4
11,5
12,2
15,7
10,6
21,0

(nghìn tấn)

291,5
107,5
50,2
28,7
7,9
42,5
5,6
44,5

Bảng 3 cho thấy Tây Nguyên là vùng có diện tích trồng đậu tương lớn thứ 3
trong 7 vùng nông nghiệp trên cả nước. Cùng với sự tăng trưởng của các loại cây
chính như: cao su, cà phê, hồ tiêu… thì đậu tương cũng đang được chú trọng và phát
triển trên vùng đất này.
Mặc dù sản lượng đậu tương ở nước ta vẫn tăng nhưng so với các nước trên thế
giới và trong khu vực năng suất của ta vẫn còn thấp và đặc biệt trong những năm gần
đây diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương của nước ta giảm đi đáng kể. Năm

21


2005 diện tích từ 203,6 nghìn ha giảm xuống chỉ còn 185,6 nghìn ha và sản lượng
giảm từ 290,6 nghìn tấn xuống còn 186,9 nghìn tấn năm 2006.
Tuy nhiên, đánh giá về tình hình sản xuất và phát triển cây đậu tương trong
nước thời gian qua (niên giám thống kê năm 2008) cho thấy: Tổng diện tích cây đậu
tương đạt 204100 ha, sản lượng đạt 292000 tấn, năng suất đạt 1,43 tỉ tấn /ha (năng suất
cao nhất trong khối Asean và bằng 58% so với bình quân thế giới). Thực tế, sản lượng
đậu tương của nước ta chỉ đáp ứng được khoảng 15% nhu cầu tại chỗ. Mặt khác, nhu
cầu đậu tương của thế giới ngày càng tăng, chỉ tính riêng Trung Quốc nhu cầu hàng
năm là 25-30 triệu tấn/ năm. Do vậy, việc tăng sản lượng đậu tương là vấn đề chiến
lược của Nông nghiệp nước ta, trong đó công tác cải tạo giống đóng vai trò quan trọng

trong tình hình hiện nay [1].
II.3. Lịch sử nghiên cứu nuôi cấy mô cây đậu tương
Đã có nhiều nghiên cứu về việc tái sinh cây đậu tương thông qua nuôi cấy các
cơ quan như: Lá mầm, mắt thật đầu tiên (Barwale và Cs 1986, Kim và Cs 1990), lá
thật đầu tiên của cây non (Wright và Cs 1987), phôi soma (Lazzeri và Cs 1985, Rouch
và Cs, 1985).
Một trong những phương pháp hiệu quả nhất để tái sinh cây đậu tương là thông
qua phôi vô tính từ các mô nuôi đậu tương. Năm 1983, Christinanson & Cs đã công bố
công trình đầu tiên về nuôi cấy mô đậu tương. Sau đó có nhiều bài báo công bố tiếp
theo (Lippmann, 1984; Lazzeri et al, 1985; Ranch et al, 1986; Parrott et al, 1988) [10]
Hầu hết các mẫu nuôi cấy ban đầu là lá mầm, thân mầm, trụ dưới lá mầm, lá thật
đầu tiên để tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô. Các phôi nhanh chóng phân hoá thành
các chồi hay bất cứ bộ phận nào cũng đều có ý nghĩa trong quy trình tái sinh cây [11].
Cây đậu tương được coi là cây trồng khó tái sinh trong quá trình nuôi cấy. Đặc
biệt là các callus có nguồn gốc từ lá mầm, từ chồi, phôi,… Và có thể không tái sinh từ
callus (Hu and Wang, 1999). Người ta cho rằng có hai yếu tố then chốt đẫn tới thành
công trong quá trình nuôi cấy. Một là, phản ứng của kiểu gen đối với môi trường nuôi
cấy. Hai là, tuổi thọ và bộ phận của cây đem vào nuôi cấy. Tất cả hai yếu tố này đều
ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến khả năng tái sinh cây đậu tương.
PHẦN BA:

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
22


III.1. Vật liệu nghiên cứu:
* Các giống đậu tương DT84 và DT2001 do Bộ môn Đột biến và Ưu thế lai – Viện Di
truyền Nông Nghiệp Việt Nam cung cấp.
* Bộ phận lấy mẫu:
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chủ yếu là đỉnh sinh trưởng làm

nguyên liệu cho nuôi cấy mô. Hạt đậu tương sau khi nảy mầm 3-5 ngày được tách đỉnh
sinh trưởng làm vật liệu nghiên cứu.
Các giống đậu tương trên đều là giống năng suất cao, thời gian sinh trưởng
trung bình hoặc ngắn ngày, có thể thâm canh tối đa 3 vụ/ năm.
III.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu của đề tài là:
(1) Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu trước khi đưa mẫu vào môi trường
nuôi cấy.
(2) Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo thể protocorm từ đỉnh sinh trưởng.
(3) Ảnh hưởng của Zeatin tới khả năng tái sinh chồi từ protocorm và khả năng
tái sinh chồi trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng.
III.3. Phương pháp nghiên cứu
III.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu
Cách tiến hành: Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủ yếu các hoá chất
là: HgCl2, H2O2, cồn 70°.
Trước tiên, hạt đâụ tương được rửa bằng cồn 70° trong 30 giây để sơ loại các
mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau khi ngâm trong 30 giây, đổ bỏ cồn và rửa
lại bằng nước cất vô trùng 2 lần.
Sau đó mẫu được ngâm trong dung dịch HgCl 2 0,1% hoặc H 2O2 20% trong
10 phút.
Cuối cùng, rửa lại mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi rửa sạch mẫu, tiến
hành cấy vào môi trường cơ bản – môi trường Murashige Skoog (MS).

23


Các bình nuôi cấy được chuyển vào phòng nuôi cấy mô trong điều kiện chiếu
sáng 10h/ ngày, cường độ chiếu sáng 2000 lux, ở nhiệt độ 28°C
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, nhắc lại 3 lần.

Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) =

Tỷ lệ mẫu chết (%) =

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

Tổng số mẫu sống
Tổng số mẫu cây
Tổng số mẫu chết
Tổng số mẫu cây
Tổng số mẫu nhiễm
Tổng số mẫu cây

x 100%

x 100%

x 100%

III.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BAP lên khả năng tạo thể
protocorm.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên các môi trường sau:
MSP1: MS – B5+ 1,0 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3%
phytagel
MSP2: MS – B5+ 1,5 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3%
phytagel
MSP3: MS – B5+ 2,0 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3%
phytagel
MSP4: MS – B5+ 2,5 mg/l BAP+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 0,3%
phytagel

Hạt đậu tương sau khi vào mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS từ 5-7 ngày,
chúng tôi cắt bỏ 2 lá mầm, trụ dưới lá mầm (cách lá mầm 5-6 mm) lấy phần đỉnh sinh
trưởng gắn liền với phần trụ dưới lá mầm khoảng 5-6 mm cấy trên môi trường có bổ
sung BAP với nồng độ khác nhau cấy chuyển vào môi trường MS đã chuẩn bị sẵn và
được đưa vào phòng nuôi cấy mô.

Để đánh giá mức độ phù hợp của môi trường, chúng tôi tiến hành theo dõi
tỷ lệ phần trăm protocorm được tạo ra.
24


Số protocorm được tạo ra

Tỷ lệ protocorm được tạo ra =

Tổng số đỉnh sinh trưởng được cấy vào

x 100%

III.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi
từ thể protocorm.
Chúng tôi sử dụng 5 công thức môi trường sau:
MSZ1: MS – B5+ 0,5 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l
Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel
MSZ2: MS – B5+ 1,0 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l
Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel
MSZ3: MS – B5+ 1,5 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l
Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel
MSZ4: MS – B5+ 2,0 mg/l Zeatin+ 0,2 mg/l GA3+ 30 mg/l Glutamin+ 25 mg/l
Asparagin+ 630 mg/l MES+ 3% đường saccaroza+ 3% phytagel

Các chồi/ cụm protocorm được cấy chuyển vào môi trường tái sinh chồi để theo
dõi ảnh hưởng của Zeatin tới sự hình thành chồi của một số giống đậu tương.

Để đánh giá sự phù hợp của môi trường tái sinh chồi, chúng tôi tiến hành
theo dõi hệ số nhân chồi của hai giống.
Hệ số tạo chồi =

Số protocorm có chồi tạo thành
Tổng số protocorm được cấy vào môi trường

x 100%

III.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học với phần mềm
Excel và IRRISTAT trên máy vi tính. Kết quả thống kê được trình bày tại các bảng.

25