Nghiên cứu bào chế vi nang lactobacillus acidophilus với alginat và chitosan bằng phương pháp đông tụ

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .....................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................2
1.1 Tổng quan về probiotic .......................................................................................2
1.1.1. Đại cương về probiotic ............................................................................. 2
1.1.2 Vai trò của probiotic .................................................................................. 2
1.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm probiotic trên thế giới và
Việt Nam .............................................................................................................. 4
1.1.4 Loài Lactobacilus acidophilus .................................................................. 6
1.2 Tổng quan về vi nang ......................................................................................9
1.2.1 Khái niệm, đặc điểm và ưu nhược điểm của vi nang ................................ 9
1.2.2 Các ứng dụng của vi nang trong ngành Dược ....................................... 12
1.2.3 Các phương pháp bào chế vi nang .......................................................... 13
1.2.4 Tổng quan một số thành phần sử dụng trong bào chế vi nang ............... 19
1.2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về bào chế vi nang probiotic .. 22
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................28
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu .......................................................28
2.1.1 Nguyên liệu ............................................................................................. 28
2.1.2 Thiết bị .................................................................................................... 29
2.2 Nội dung nghiên cứu .....................................................................................30
2.2.1

Bào chế vi nang L. acidophilus ............................................................ 30

2.2.2 Theo dõi độ ổn định của vi nang L. acidophilus đông khô ..................... 31
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ..............................................................................31
2.3.1

Phương pháp bào chế vi nang L. acidophilus ..................................... 31

2.3.2 Phương pháp đánh giá ............................................................................. 35
2.3.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định của vi nang L. acidophilus đông khô 40
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................41


3.1 Kết quả bào chế vi nang L. acidophilus .......................................................41
3.1.1 Kết quả khảo sát yếu tố công thức ảnh hưởng đến vi nang ..................... 41
3.1.2 Kết quả khảo sát quy trình bào chế đến vi nang ...................................... 56
3.2 Kết quả theo dõi độ ổn định của vi nang L. acidophilus đông khô ...........62
3.3.1 Kết quả đánh giá vi nang L. acidophilus ở thời điểm t = 0 ..................... 62
3.3.2 Kết quả đánh giá khả năng hút ẩm của vi nang bào chế trong môi trường
bão hòa muối Kali dihydro phosphat ............................................................... 63
3.3.3 Kết quả theo dõi độ ổn định của vi nang L. acidophilus khi bảo quản ở các
điều kiện khác nhau .......................................................................................... 64
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN.......................................................................................67
4.1 Bàn luận về kết quả bào chế vi nang L. acidophilus ...................................67
4.1.1 Bàn luận về kết quả khảo sát công thức .................................................. 67
4.1.2 Bàn luận về kết quả xây dựng quy trình ................................................. 73
4.2 Bàn luận về kết quả theo dõi độ ổn định của vi nang đông khô ................76
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................80
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ATCC

Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
(American Type Culture Collection)

ALG

Alginat

B. longum

Bifidobacterium longum

B. bifidum

Bifidobacterium bifidum

B. subtilis

Bacillus subtilis

Cfu

Số đơn vị khuẩn lạc (Colony-Forming Units)

CMC

Critical Micelle Concentration

CS

Chitosan

CT

Công thức

DP

Degree of Polymerization (Mức độ trùng hợp)

ĐK

Đông khô

E. coli

Escherichia coli

EE

Hiệu suất tạo nang (Encapsulation efficiency)

EY

Hiệu suất bao vi sinh vật (Encapsulation yield)

FOS

Fructo- oligosaccharides

FAO

Tổ chức Nông lƣơng thế giới (Food and Agriculture

Organization)

GOS

Galacto- oligosaccharides

GRAS

Chứng nhận an toàn (Generally Recognized As Safe)

h

Giờ

IDF

Liên

đoàn

Sữa

thế

giới

(International

Federation)
kl/tt

Khối lƣợng/thể tích

KT
LAB

Kích thƣớc
Nhóm vi khuẩn Lactic (Lactic acid bacteria)

L.

Lactobacillus

Dairy


MRS

Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa,
Sharpe)

MRSA

Môi trƣờng nuôi cấy thạch (MRS Agar)

MRSB

Môi trƣờng nuôi cấy lỏng (MRS Brown)

MT

Môi trƣờng

NC

Nghiên cứu

PE

Polyethylene

SEM

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron
Microscope)

TB

Tế bào

TC NSX

Tiêu chuẩn nhà sản xuất

TD

Tá dƣợc

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission
Electron Microscope)

TKHH

Tinh khiết hóa học

VK

Vi khuẩn

v/ph

Vòng/phút

VN

Vi nang

VSV

Vi sinh vật

WHO

Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)


DANH MỤC CÁC BẢNG
TÊN BẢNG

STT

TRANG

Bảng 1.1

Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotic

5

Bảng 1.2

Một số sản phẩm probiotic chứa L. acidophilus trên thị trường

9

Bảng 2.1

Các nguyên liệu pha môi trường

28

Bảng 2.2

Các tá dược sử dụng

29

Bảng 2.3

Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

29

Bảng 2.4

Các yếu tố ảnh hưởng và các mức khảo sát

30

Bảng 2.5

Các thông số kỹ thuật và các mức khảo sát

31

Bảng 3.1

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi thể tích cắn sinh khối tế bào

42

Bảng 3.2

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi tỷ lệ pha nước /pha dầu

43

Bảng 3.3

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi tỷ lệ Tween 80

44

Bảng 3.4

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi nồng độ alginat

46

Bảng 3.5

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi nồng độ Calciclorid

48

Bảng 3.6

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi nồng độ glycerol

49

Bảng 3.7

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi nồng độ chitosan

51

Bảng 3.8

Kết quả đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang trong môi
trường acid pH 1,2 khi thay đổi nồng độ Chitosan

52

Bảng 3.9

Phần trăm số VSV sống sót ở các thời điểm so với mật độ ban
đầu ở pH 1,2

53

Bảng 3.10

Kết quả đánh giá khả năng giải phóng VSV trong môi trường đệm
phosphat pH 7,4 khi thay đổi nồng độ Chitosan

54

Bảng 3.11

Phần trăm số VSV giải phóng ở pH 7,4 so với mật độ ban đầu

55


Bảng 3.12

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi thời gian nhũ hóa

TÊN BẢNG

STT

56
TRANG

Bảng 3.13

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi tốc độ khuấy môi trường

57

Bảng 3.14

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi thời gian ủ trong calci clorid

58

Bảng 3.15

Bảng 3.16

Bảng 3.17
Bảng 3.18
Bảng 3.19
Bảng 3.20
Bảng 3.21
Bảng 4.1

Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi thời gian ủ vi nang trong
chitosan
Công thức vi nang L. acidophilus bào chế bằng phương pháp nhũ
tương

59

60

Thông số quy trình bào chế vi nang L. acidophilus bằng phương
pháp nhũ tương
Đặc tính của vi nang L. acidophilus sau đông khô

60
62

Phần trăm khối lượng vi nang tăng lên trong môi trường bão hòa
muối Kali dihydrophotphat

63

Kết quả theo dõi chất lượng vi nang L. acidophilus sau 5 tháng
bảo quản ở điều kiện thường

65

Kết quả theo dõi chất lượng vi nang L. acidophilus sau 5 tháng
bảo quản trong tủ lạnh

65

So sánh kết quả nghiên cứu về thời gian nhũ hóa với các tác giả
khác

74


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

TÊN HÌNH

TRANG

Hình 1.1

Hình ảnh L. acidophilus trên kính hiển vi điện tử

6

Hình 1.2

Các loại vi nang

10

Hình 1.3

Các giai đoạn của quá trình tách pha đông tụ đơn

15

Hình 1.4

Công thức cổ điển của hai đơn vị monomeric acid alginic

19

Hình 1.5

Cấu trúc dạng mono α-L-guluronic acid (G); β-D-mannuronic acid
(M) và dạng liên hợp của Alginat

20

Hình 1.6

Vị trí của ion calci trong gel và sự tạo gel calci alginat

21

Hình 1.7

Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose

22

Hình 2.1

Mô tả qui trình pha loãng mẫu

35

Hình 3.1

Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng

43

VSV sau đông khô khi thay đổi tỷ lệ pha nước /pha dầu
Hình 3.2

Hình 3.3

Hình 3.4

Hình 3.5

Hình 3.6

Hình 3.7
Hình 3.8

Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng
VSV sau đông khô khi thay đổi tỷ lệ chất diện hoạt
Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng
VSV sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat
Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng
VSV sau đông khô khi thay đổi nồng độ Calciclorid
Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng

VSV sau đông khô khi thay đổi nồng độ glycerol
Đồ thị biểu diễn hiệu suất bao VSV, số lượng VSV trong 1g vi nang
ĐK khi thay đổi nồng độ Chitosan
Đồ thị biểu diễn phần trăm số lượng VSV sống sót trong môi
trường acid pH 1,2 khi thay đổi nồng độ Chitosan
Đồ thị biểu diễn phần trăm số lượng VSV giải phóng trong môi

45

47

48

50

51

53
55


trường pH 7,4 khi thay đổi nồng độ Chitosan
STT

TÊN HÌNH

TRANG

Hình 3.9

Sơ đồ quy trình bào chế vi nang L. acidophilus

61

Hình 3.10

Hình thái học của vi nang đông khô

62

Hình 3.11
Hình 3.12

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa kích thước vi nang và khả
năng hút ẩm trong môi trường bão hòa muối Kali dihydrophotphat
Đồ thị biến thiên độ ẩm theo thời gian bảo quản

Hình 3.13 Đồ thị biến thiên số lượng VSV theo thời gian bảo quản

64
65
66


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của xã hội, khoa học công nghệ thì cụm từ, “chế phẩm
sinh học” không còn quá xa lạ đối với mọi ngƣời. Nhắc tới chế phẩm sinh
học probiotic, prebiotic chúng ta thấy ngay đƣợc những lợi ích mà chúng mang lại
cho sức khỏe của con ngƣời. Chế phẩm sinh học ngày nay đã đƣợc ứng dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống nhƣ công nghiệp thực phẩm, sản xuất dƣợc

phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, thuốc thú y.
Đối với chế phẩm probiotic, khả năng ổn định hoạt tính của probiotic là một
vấn đề quan trọng. Những năm gần đây, việc sử dụng các polyme tự nhiên để thiết
kế xây dựng các hệ phân phối thuốc đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới chú ý
đến bởi khả năng tƣơng thích sinh học và phân hủy sinh học rất tốt của chúng. Các
công nghệ mới khác nhau nhƣ bao vi nang, cố định tế bào và lên men liên tục đã
đƣợc phát triển để có thể cho ra tế bào có số lƣợng cao ở quy mô lớn và đảm bảo
tính ổn định của probiotic trong một thời gian dài.
Tuy nhiên, ở Việt Nam, các sản phẩm probiotic vẫn chƣa đƣợc chú trọng
nghiên cứu, nguồn cung cấp chủ yếu phụ thuộc vào nhập khẩu và sản xuất trong
nƣớc chỉ với quy mô nhỏ. Sản phẩm nhập khẩu có chất lƣợng ổn định nhƣng giá
thành cao; trong khi các nhà sản xuất trong nƣớc vẫn chƣa quan tâm đến việc đầu tƣ
công nghệ mới. Sản phẩm probiotic trong nƣớc chủ yếu là các thế hệ cũ, ít đƣợc bảo
vệ khỏi sự suy thoái trong đƣờng tiêu hóa cũng nhƣ sự giảm tỷ lệ sống sót gây ra
bởi các yếu tố bên ngoài nhƣ bao bì và điều kiện bảo quản. Do đó, các chế phẩm
probiotic không phát huy đƣợc tác dụng cũng nhƣ hiệu quả điều trị không cao.
Vì các lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế vi nang
Lactobacillus acidophilus với alginat và chitosan bằng phương pháp đông tụ từ
nhũ tương” với hai mục tiêu sau:
1. Xây dựng đƣợc công thức bào chế và xác định đƣợc một số thông số quy
trình bào chế vi nang L. acidophilus với alginat và chitosan bằng phƣơng pháp nhũ
tƣơng ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Bƣớc đầu đánh giá độ ổn định của vi nang L. acidophilus bào chế đƣợc.

1


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về probiotic
1.1.1. Đại cƣơng về probiotic

Khái niệm probiotic đầu tiên đƣợc đƣa ra bởi nhà khoa học Eli Metchnikoff,
ghi trong cuốn sách “Kéo dài sự sống” năm 1908. Ông cho rằng những ngƣời nông
dân Bulgary sống lâu vì họ thƣờng xuyên sử dụng sữa chua có chứa VK lactic có
lợi cho VSV đƣờng ruột [38]. Đến năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ
chức Nông lƣơng thế giới (FAO) đã đƣa ra định nghĩa hoàn chỉnh nhất về probiotic
nhƣ sau: “Probiotic là những VSV sống mà khi đƣa vào cơ thể với một lƣợng đủ
lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [82]. Những loài VK hay sử
dụng trong chế phẩm probiotic thuộc chi Bifidobacterium và chi Lactobacillus.
Trong quá trình sử dụng, VK probiotic bị ảnh hƣởng bởi nhiều điều kiện bất lợi của
MT bên ngoài và đƣờng tiêu hóa, cho nên để có tác dụng, bất kỳ sản phẩm nào chứa
probiotic nào cũng phải có ít nhất 107 - 108 cfu/ml TB VSV sống cho đến ngày hết
hạn sử dụng [45, 70].
1.1.2 Vai trò của probiotic
1.1.2.1 Tác động kháng khuẩn
Probiotic làm giảm số lƣợng VK để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là:
Tiết ra các chất kháng khuẩn: VK probiotic tạo ra các chất đa dạng có thể ức
chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-) gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxid và
chất diệt khuẩn. Những hợp chất này không chỉ làm giảm những sinh vật mang
mầm bệnh có thể sống đƣợc mà còn ảnh hƣởng đến sự trao đổi chất của VK và tạo
ra các độc tố do làm giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid chuỗi ngắn
dễ bay hơi, chủ yếu là các acid acetic, propionic, và butyric, nhất là acid lactic. Các
VSV probiotic còn có khả năng cạnh tranh với các VSV gây bệnh để ngăn chặn sự
bám dính của chúng vào đƣờng ruột và cạnh tranh dinh dƣỡng cần thiết [72].
1.1.2.2 Tác động trên mô biểu bì ruột
-

Probiotic đẩy mạnh sự liên kết chặt chẽ giữa những TB biểu mô và sự tạo ra các

phân tử phòng vệ nhƣ chất nhầy.

2


-

Làm giảm kích thích việc bài tiết và những hậu quả do bị viêm của quá trình lây

nhiễm VK [61].
1.1.2.3 Tác động miễn dịch
Probiotic đƣợc xem nhƣ là tác nhân kích thích giải phóng các phân tử kháng viêm
cho đƣờng ruột [48]. Cụ thể:
-

Đẩy mạnh sự báo hiệu cho TB vật chủ để làm giảm đáp ứng viêm.

-

Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng.

-

Cải thiện hệ VSV đƣờng ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón.

1.1.2.4 Tác động đến vi khuẩn đường ruột
VK probiotic điều chỉnh thành phần của VK đƣờng ruột và điều hòa hoạt
động trao đổi chất của sinh vật đƣờng ruột. Sự sống sót của probiotic phụ thuộc vào
công dụng và liều lƣợng của mỗi giống VK đƣợc tiêu hóa, vị trí trong đƣờng tiêu
hóa: ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ vi sinh đƣờng ruột,
sự thay đổi này có thể thấy đƣợc sau một vài ngày sử dụng. Probiotic có thể làm
giảm pH của đƣờng tiêu hóa và do đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết enzym của

VSV. Mặt khác, probiotic còn làm tăng sự dung nạp đƣờng lactose: giúp tránh khỏi
tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và
làm tăng VK có lợi và giảm VK gây hại [3].
1.1.2.5 Một số vai trò khác đối với cơ thể
Chống dị ứng: Bổ sung probiotic góp phần chống lại một số phản ứng dị ứng
của cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể nhƣ (acid folic, niacin,
riboflavin, vitamin B6 và B12.
Chống ung thƣ: nhiều NC cho thấy các VK probiotic có thể làm giảm nguy
cơ ung thƣ ruột kết và ung thƣ bàng quang. Ngoài ra còn có tác dụng khử chất độc
gây ung thƣ có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bƣớu.
Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm
giảm huyết áp cao. Ngoài ra, còn giúp ngƣời bệnh nhanh chóng bình phục sau khi
mắc bệnh tiêu chảy do sử dụng kháng sinh. Probiotic đem lại nhiều tác dụng có lợi
cho cơ thể vật chủ, nhƣng hiểu biết của con ngƣời về cơ chế tác dụng của các VK
probiotic còn rất hạn chế [59]. Một số tác giả cho rằng VK probiotic ức chế sự phát
3


triển của các VK gây bệnh trong đƣờng tiêu hóa. Các cơ chế cụ thể đƣợc nêu ra
nhƣ: cạnh tranh chất dinh dƣỡng, cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc ruột, ức
chế sự phát triển của VK có hại bằng kích thích hệ thống miễn dịch ruột, bằng các
sản phẩm trao đổi chất của VK probiotic [33, 63].
1.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm probiotic trên thế giới và
Việt Nam
Việc sử dụng thực phẩm có chứa các VSV có lợi cho cơ thể đã đƣợc biết đến
từ lâu, tuy nhiên việc NC hệ VSV đƣờng ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát
triển từ những năm 80 của thế kỉ 20. Năm 1998, Apajalahti và cộng sự đã thực hiện
những NC về đặc điểm phân loại và quần thể VSV đƣờng ruột ở ngƣời và động vật.
Netherwood và cộng sự (1999) [61]; Gong và cộng sự (2002) [36]; Yoon và
cộng sự (2002) [83] đã sử dụng kỹ thuật gen để NC sự thay đổi cấu trúc quần thể và

đặc điểm sinh học của hệ VSV đƣờng ruột ở động vật dƣới tác động của probiotic.
Ở nƣớc ta, các chế phẩm probiotic đã chiếm lĩnh thị trƣờng hơn 10 năm nay,
tuy nhiên việc NC sản xuất probiotic phục vụ cho đời sống mới bắt đầu đƣợc quan
tâm. Trong khoảng một thập kỷ gần đây, đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lƣợng các
sản phẩm y tế có nguồn gốc từ probiotic. Probiotic ngày càng đƣợc bào chế dƣới
nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đƣờng uống nhƣ bột, cốm, viên nang,
pellet… và đƣờng khác nhƣ viên đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra
rằng các VK probiotic trong các chế phẩm chủ yếu thuộc thế hệ 1 nên khả năng bảo
vệ VSV vẫn còn rất thấp, số lƣợng VSV sống sót đƣợc còn hạn chế [5].
Khác với các chế phẩm khác, chế phẩm probiotic phải duy trì số lƣợng VSV
sống sót nhất định trong hệ tiêu hóa của ngƣời dùng trong thời hạn sử dụng. Đa
phần các sản phẩm probiotic sử dụng theo đƣờng uống, nên chúng chịu tác dụng
của dịch vị ở dạ dày và của acid mật ở ruột, vì vậy VSV bị chết rất nhiều, không đi
đến ruột đƣợc hoặc đến ruột với số lƣợng ít không đủ gây tác dụng. Việc đảm bảo
khả năng sống sót của VSV probiotic trong sản xuất, bảo quản, lƣu hành và giữ
đƣợc tỉ lệ VSV sống sót cao ở ruột không hề đơn giản. Do vậy, trong thành phần
công thức và quy trình sản xuất các sản phẩm probiotic cần cải tiến so với các chế
phẩm thông thƣờng. Chế phẩm probiotic thƣờng có thêm các TD bảo vệ nhƣ chất
4


xơ, đƣờng… Về phƣơng pháp: có nhiều hƣớng NC khác nhau nhƣ tối ƣu hóa
phƣơng pháp ĐK tạo bột, áp dụng phƣơng pháp lên men 2 bƣớc, phƣơng pháp vi
nang hóa, phƣơng pháp bào chế kết hợp với sử dụng các TD bảo vệ [60].
Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotic ở nƣớc ta là công ty TNHH –
MTV Pasteur Đà Lạt (Davacco) công ty TNHH – MTV vaccin và sinh phẩm Nha
Trang (viết tắt Biopharco) với một số chế phẩm hay gặp trên thị trƣờng nhƣ enzym
Biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio với chủng VSV B. subtilis. Công ty cổ
phần ANABIO có nhà máy sản xuất nguyên liệu probiotic chứa các chủng VSV
lactic và B. subtilis. Do vậy, thị trƣờng chế phẩm probiotic không chỉ lớn về số

lƣợng mà còn đa dạng về chủng loại VSV, đồng thời giá thành sản phẩm các chế
phẩm probiotic đã đƣợc hạ nhiều lần. Đến nay trên thị trƣờng nƣớc ta đã có mặt các
sản phẩm probiotic của bốn thế hệ bào chế nhƣ sau:
Bảng 1.1: Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotic [5]:
Thế hệ
Thế hệ 1
(non-coated)

Đặc điểm VSV
Ƣu điểm
VSV sống (trong Giá rẻ, dễ sử dụng
sữa chua, phomat,
kim chi,… )
Bào tử
Thuận lợi cho nuôi
cấy, sản xuất, lƣu
hành

Nhƣợc điểm
VSV gần nhƣ không sống
sót khi qua dạ dày và dịch
mật
Mất nhiều thời gian phát
triển thành VSV → Chậm
tác dụng, hạn chế khả năng
cạnh tranh với VSV gây
bệnh.
Probiotic đông khô
Tỷ lệ sống ở nhiệt độ Tỷ lệ VSV bị chết vẫn cao ở
thƣờng cao hơn

dạ dày.
VSV đƣa vào dƣới Bảo vệ VSV khi đi Mất thời gian màng bao tan
Thế hệ 2
(Entericcoated)
dạng viên nén, viên qua dạ dày và dịch rã để giải phóng VSV [5].
nang có lớp ngoài mật
bao tan trong ruột
Dạng bao vi nang
Hoàn thiện ý tƣởng Chƣa khắc phục đƣợc nhƣợc
Thế hệ 3
(Microcapsulated)
của thế hệ 2
điểm của thế hệ 2. Khả năng
phóng thích tại ruột chƣa tốt,
tan chậm trong ruột.
Lớp
bên
trong
là
VSV
có
tỷ
lệ
sống
Đòi hỏi công nghệ cao, kỹ
Thế hệ 4
(Dual- coated)
protein, lớp ngoài là cao. Chịu đƣợc acid thuật bào chế hiện đại, trang
polysaccharid
dịch vị và muối mật. thiết bị đắt tiền. Giá thành

Lớp bao bên trong có cao [5].
tính thúc đẩy giải
phóng VSV tại đích
5


1.1.4 Loài Lactobacilus acidophilus
VK sinh acid lactic (viết tắt là LAB) là một trong những VK đƣợc sử dụng
rộng rãi nhất trong sản xuất probiotic và đƣợc NC thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất.
VK lactic đƣợc đặc trƣng bởi khả năng sinh acid lactic rất mạnh từ các loại đƣờng
khác nhau đặc biệt là đƣờng lactose. Hầu hết LAB đều thuộc họ Lactobacillaceae
và đƣợc xếp 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc.
Thuật ngữ LAB là để chỉ một nhóm đa dạng VK gồm: VK Gram dƣơng,
không sinh bào tử, catalase âm đƣợc tìm thấy trong một số MT sống [21]. LAB
bao gồm nhiều chi trong đó chi Lactobacillus là chi lớn nhất với 185 loài theo kết
quả phân loại lại năm 2008 [25].
1.1.4.1 Đặc điểm hình thái
L. acidophilus đƣợc phân lập đầu tiên bởi Moro (năm 1900) từ phân trẻ sơ
sinh và vào thời điểm đó đã đƣợc phân loại nhầm là Bacillus acidophilus.
L. acidophilus là trực khuẩn Gram dƣơng, dạng hình que KT khoảng 210µm, không sinh bào tử, không có lông roi, không di động, không ƣa muối, không
ƣa acid, calatase âm tính, kỵ khí tùy tiện và có khả năng chuyển hóa đƣờng lactose
tạo ra sản phẩm L (+) lactic [44].

Hình 1.1 : Hình ảnh L. acidophilus trên kính hiển vi điện tử
Tại Việt Nam, trong các chế phẩm probiotic có mặt trên thị trƣờng thì chủng
L. acidophilus có tần suất xuất hiện nhiều nhất. Trong NC của nhóm tác giả của
trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội năm 2012 đã tiến hành khảo sát thành phần
VSV sống và đánh giá đặc tính probiotic của 24 sản phẩm men tiêu hóa có mặt trên
thị trƣờng Hà Nội. Kết quả cho thấy theo thông tin ghi trên nhãn, VK trong các sản

6


phẩm men tiêu hóa thuộc 4 chi: Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus và
Bifidobacterium, trong đó loài L. acidophilus là VKthƣờng dùng nhất, có mặt trong
80% các sản phẩm [8].
1.1.4.2 Điều kiện sinh trưởng, phát triển
Nhiệt độ thích hợp cho L. acidophilus sinh trƣởng là 370C - 420C và có thể
phát triển đƣợc ở nhiệt độ cao đến 450C nhƣng không phát triển ở 20 - 220C hoặc
nhiệt độ cao hơn 48oC. Có khả năng chịu đƣợc điều kiện acid trong khoảng pH 5-6
trong thời gian 24 - 36 giờ [16].
1.1.4.3 Môi trường nuôi cấy
L. acidophilus là VSV có nhu cầu dinh dƣỡng rất cao, để sinh trƣởng bình
thƣờng ngoài nguồn Cacbon chúng cần Nitơ, một phần dƣới dạng các acid amin,
một số vitamin, các chất sinh trƣởng và các chất khoáng nhƣ Mg, Mn, Fe,.. Chúng
không phát triển đƣợc trong MT đơn giản chỉ có Glucose và NH4+ nhƣ một số loài
khác. Vì thế phải cho vào MT một số chất giàu dinh dƣỡng: pepton, cao nấm men,
cao thịt, các loại đƣờng để chúng lên men. L. acidophilus là VK vi hiếu khí, do đó
MT nuôi cấy thƣờng là kỵ khí hoặc với 5-10% CO2. Trên MT thạch MRSA hoặc
canh dinh dƣỡng MRSB, sau 48 giờ ủ ở 370C, 5% CO2 VK phát triển rất tốt, làm
MT trở nên đục, có cặn lắng ở đáy hay những khuẩn lạc đều hình cầu, đƣờng kính
1mm [35].
1.1.4.4. Tác dụng của các chủng L. acidophilus
L. acidophilus đƣợc biết là một loài có vai trò probiotic. Tính chất bám dính
và khả năng liên kết với nhau của L. acidophilus tạo thành một tập đoàn VK lactic
chính là cơ chế hữu hiệu để hạn chế VK có hại. Khi VK lactic vào trong cơ thể chúng
định cƣ ở đƣờng ruột và cạnh tranh vị trí gắn kết trên thành ruột với VSV có hại,
làm hạn chế số lƣợng VSV có hại trong đƣờng ruột. Đồng thời, L. acidophilus có
khả năng sinh tổng hợp một số chất có hoạt tính kháng khuẩn nhƣ acid lactic,
hydrogen peroxid, diacetyl và bacteriocin làm hạn chế sự phát triển của VK có hại.

Ngoài ra, L. acidophilus còn có vai trò nhƣ một chất hỗ trợ tiêu hóa lactose cho
những ngƣời thiếu hụt men tiêu hóa lactose.

7


Các chủng probiotic thƣơng mại chính của L. acidophilus đƣợc mô tả bởi
Shan (2007) [72], bao gồm L. acidophilus LA-1 và LA-5, NCFM, DDS-1 và SBT2026, các ATCC,… Các chủng đều đã đƣợc FDA cấp tiêu chuẩn An toàn (GRAS)
đồng thời đƣợc coi là probiotic quan trọng nhất. Hỗn hợp các chủng L. acidophilus
NCFM có tác dụng làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy ở trẻ em. Nếu sử dụng hợp
lý, thƣờng xuyên, L. acidophilus có tác dụng tiêu hóa lƣợng đƣờng lactose trong các
bệnh nhân không dung nạp lactose.
Một NC của trƣờng đại học của Nebraska đã cho thấy rằng thức ăn bổ sung
có L. acidophilus L1 sẽ làm giảm 61% lƣợng Escherichia coli O157: H7 trong
đƣờng ruột. NC cũng chỉ ra L. acidophilus có khả năng làm giảm cholesterol.
Khi các bệnh nhân điều trị bằng kháng sinh, một lƣợng lớn VK có lợi trong
đƣờng ruột sẽ bị tiêu diệt. Do đó các bác sỹ khuyên các bệnh nhân nên sử dụng L.
acidophilus để củng cố lợi khuẩn cho đƣờng ruột
Lactobacillus GG dùng cho trẻ em từ 5-14 tuổi bị hội chứng ruột kích thích
trong hơn 8 tuần và tạo ra 3 tỉ TB mỗi ngày khi dùng 2 lần. VK này giúp giảm số
lần đau và mức độ đau bụng. Lactobacillus GG dùng cho trẻ em đang uống thuốc
kháng sinh và hỗ trợ giảm tiêu chảy.
L. acidophilus LA-5 có khả năng sản xuất bacteriocin CH5 có tác dụng
kháng khuẩn và ức chế Typhimurium Salmonella và Campylobacter jejuni, cải thiện
đƣờng ruột, ngăn ngừa tiêu chảy, tăng cƣờng sức đề kháng cho đƣờng ruột. L.
acidophilus LA-5 tác dụng lên hệ miễn dịch, làm lƣợng cytokine tăng lên, tăng hoạt
động thực bào và sản xuất kháng thể. L. acidophilus LA-5 đã cho thấy ức chế sự
phát triển của các TB ung thƣ vú, và tác động tích cực trên các bệnh nhân hóa trị
liệu.
Ngoài ra, ngƣời ta cũng chứng minh đƣợc rằng L. acidophilus NCFM có tác

dụng làm giảm tỷ lệ mắc các triệu chứng sốt, ho và sổ mũi, tác dụng chống viêm
cũng đã đƣợc quan sát thấy ở những ngƣời sử dụng L. acidophilus NCFM [72].
Hiện nay, L. acidophilus đƣợc sử dụng nhiều trong các chế phẩm probiotic
nhƣ: Antibio, Lactomin, Lacteolforte,… để điều trị các trƣờng hợp rối loạn tiêu hóa
do dùng kháng sinh dài ngày hoặc trong các trƣờng hợp đầy bụng khó tiêu, trẻ kém
8


ăn, chậm lớn. Bên cạnh các sản phẩm probiotic thì chúng còn khả năng lên men tạo
acid lactic, một dung môi đƣợc ứng dụng nhiều trong thực tiễn bảo quản thực phẩm
hay dùng trong dung dịch vệ sinh nhƣ dạ hƣơng, lactacyd,…
Một số sản phẩm chứa L. acidophilus đƣợc liệt kê trong bảng 1.2.
Bảng 1.2: Một số sản phẩm probiotic chứa L. acidophilus trên thị trường [5].
Stt

Tên

Thành phần

Hàm
lƣợng

Dạng bào chế

Nhà sản xuất

L. acidophilus

108

Gói bột 1g

Organon (Mỹ)

107-108

Gói bột 1g

Viện Vaccin Đà lạt

108

Viên nang

Union (Mỹ)

Viên nang
320 mg

II Dong (Hàn Quốc)

1.

Antibio

2.

Biosubtyl LD L. acidophilus, B. subtilis

3.

Biolacto

4.

Lactomed

5.

Antibio-philus

6.

Biolac

7.

Lacbiopro

8.

Probio

9.

L. acidophilus, B.longum,
Lactominplus
108-109
L.rhamnosus

10. Laclean gold

L. acidophilus, L.
bulgaricus

L. acidophilus, L.biphilus,
2x
6
Streptococus faecaelis 10 /chủng
L. acidophilus

108-109

Viên nang

Lyocentre (Pháp)

L. sporogenes, L.
acidophilus, L. kefir
L. acidophilus

108

Viên nang

Biopharco (VN)

109

Gói

Bidiphar (VN)

L. acidophilus

109

bột đông khô

Imexpharm (VN)

HH probiotic
bao vi nang
300mg

Mebipharm (VN)

L. acidophilus, B.longum,
Cốm pha HD
L.rhamnosus, B.bifidus, 107 - 109
Biotech (Hàn Quốc)
uống
Entercoccus faecium

L. acidophilus, B.longum,
108-109
B.breve, Entercoccus
faecium
1.2 Tổng quan về vi nang

11. Kidlac

Bột pha HD
Biotech (Hàn Quốc)
uống

1.2.1 Khái niệm, đặc điểm và ƣu nhƣợc điểm của vi nang
1.2.1.1 Khái niệm
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, KT
từ 0,1 µm đến 5mm (thông thƣờng từ 100 - 500 µm) bên trong chứa hoạt chất dạng
lỏng hoặc rắn, còn bên ngoài đƣợc bao bằng màng mỏng polyme liên tục [58].
9


Vi nang hóa là quá trình bao gói những giọt chất lỏng nhỏ, rắn hoặc phân tử
nhỏ bằng một lớp màng thích hợp [58]. Đây là một trong những phƣơng pháp cố
định TB đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay với các chất tạo màng (tạo gel) là các
polyme có nguồn gốc tự nhiên nhƣ gelatin, AGL, CS, cellulose,… hoặc có nguồn
gốc nhân tạo nhƣ polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester,
polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói
các TB, cơ thể VSV sống [11]. Vi nang giúp TB đƣợc cách ly với MT xung quanh,
làm giảm sự tổn thƣơng cũng nhƣ sự tổn thất số lƣợng TB, bằng cách này chúng sẽ
đƣợc bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi nhƣ acid cao, pH thấp, muối mật,
sốc nhiệt,... và chỉ phóng thích TB tại nơi mong muốn.
.

a)

b)

c)
d)
Hình 1.2 – Các loại vi nang

e)

a) Vi nang dạng lỏng; b) Vi nang dạng rắn; c) Vi nang nhiều lớp;
d) Vi nang đa nhân; e) Vi nang trong vi nang
Vi nang có nhiều loại: VN đơn nhân là VN phần nhân bên trong chỉ chứa một
khối dung dịch hoặc chất rắn, VN đa nhân là VN bên trong có chứa nhiều nhân nhỏ
(VN trong VN), VN nhiều lớp là VN đƣợc thiết kế với nhiều lớp bao khác nhau [5].
1.2.1.2 Đặc điểm của vi nang
-

Vi nang không làm tổn hại đến các TB sống mà còn bảo vệ TB sống [47].

-

Vi nang cho phép cố định số lƣợng TB sống lớn hơn các phƣơng pháp cố định
TB khác.

-

Mỗi loại vật liệu vi nang và mỗi loại TB sống lại hoạt động ở các điều kiện
khác nhau nên phải lựa chọn điều kiện tạo thành vi nang nhƣ pH, nhiệt độ, thời
gian…

-

Độ bền cơ học của lớp màng của VN là một đặc điểm quan trọng. Nó phải có

độ bền tƣơng đối để có thể bảo vệ đƣợc các TB sống, tuy nhiên lớp màng này

10


lại không đƣợc quá vững chắc làm ảnh hƣởng đến khả năng phóng thích TB khi
cần thiết [81].
-

KT hạt VN, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích TB có mối quan hệ
với nhau. KT hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ
TB sống càng cao, nhƣng khả năng phóng thích TB càng khó, đôi khi còn làm
giảm giá trị cảm quan của sản phẩm. KT hạt VN càng nhỏ thì độ bền càng thấp,
khả năng bảo vệ TB sẽ thấp đi nhƣng khả năng phóng thích TB sẽ dễ dàng hơn.

-

Ngoài ra còn một số đặc điểm khác nhƣ sự mài mòn của các hạt VN do sự va
chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn…
1.2.1.3 Ưu điểm của vi nang

-

Vi nang giúp bảo vệ TB sống và tạo ra mật độ VSV đủ lớn tại ruột non và trực
tràng. VN nhƣ tấm áo bảo vệ các TB sống chống chịu đƣợc điều kiện khắc
nghiệt của MT và đƣờng tiêu hóa: nhiệt độ, acid,… Ngoài ra, VN làm ổn định
hoạt tính trao đổi chất của TB khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ, hay sự có mặt
các chất ức chế có trong MT lên men do đó làm tăng độ ổn định và kéo dài khả
năng tồn tại của chúng [57, 81].

-

Bảo vệ VK chống lại các tác nhân bacteriophage bên ngoài, từ đó đảm bảo quá
trình lên men không bị nhiễm tạp, hƣ hại. Quá trình bao gói cũng có thể ngăn
chặn các VSV sinh sôi nảy nở trong thực phẩm để tránh thay đổi các hƣơng vị
của sản phẩm [22].

-

Tăng cƣờng khả năng tồn tại của VK, tạo điều kiện để điều khiển TB và cho
phép kiểm soát liều lƣợng. VN cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trƣởng của
VSV, cho phép sử dụng TB ở một pha riêng biệt đối với MT lên men, do đó có
khả năng dừng phản ứng nhanh.

-

Vi nang có khả năng tạo ra mật độ VSV lớn do có thể cố định một lƣợng lớn
TB sống. Trong các ngành thực phẩm có các sản phẩm lên men nhƣ bia, rƣợu,
thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những phƣơng pháp cố định TB VSV
trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng VSV tiết kiệm, tối ƣu và hiệu quả hơn.

-

Vi nang có thể làm cho TB kéo dài khả năng tồn tại, từ đó giúp cho thời gian
bảo quản chủng, giống TB VSV đƣợc lâu dài cũng nhƣ dự kiến sẽ kéo dài thời
11


hạn sử dụng của các chế phẩm sinh học ở nhiệt độ phòng, tăng khả năng chịu
nhiệt, tăng khả năng chịu nén, chịu biến dạng và tăng khả năng chịu acid.

-

Trong lĩnh vực sản xuất, đặc biệt là ngành sản xuất các sản phẩm liên quan đến
probiotic, thì việc vi nang hóa TB có ý nghĩa rất quan trọng. Nó giúp cho các
sản phẩm probiotic khi đến tay ngƣời tiêu dùng vẫn còn nguyên giá trị sử dụng.

1.2.1.4 Nhược điểm của vi nang
-

Màng hay thành TB nguyên vẹn thƣờng chống lại sự thẩm thấu của chất nền,
sản phẩm và những phản ứng thích hợp nên trƣớc hoặc sau khi vi nang hóa đòi
hỏi phá hủy rào cản để thẩm thấu.

-

Phần lớn các vật liệu sử dụng trong quá trình tạo VN nhƣ gelatin, thạch, các
loại tinh bột,… đều là các nguồn dinh dƣỡng mà VSV có thể tiêu hóa đƣợc.
Điều này làm VSV bên trong vi nang hoặc VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể
tiêu hóa lớp vỏ nang và làm cho lớp màng bảo vệ bị rách, thủng,… dẫn đến hiệu
quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể. Có bằng chứng cho thấy một số chủng
VK có khả năng tiêu hóa, sử dụng chính vật liệu vi nang. Do vậy, mỗi chủng
VSV phải đƣợc NC vật liệu phù hợp nhất [68].

-

Kích thƣớc VN quá lớn có thể làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm.

-

Bên cạnh thách thức trong việc NC để tìm ra kỹ thuật bào chế VN thích hợp,

chọn vật liệu đóng gói an toàn - hiệu quả, lựa đƣợc chủng VK có hiệu lực, tiềm
năng thì để sử dụng và sự phát triển các sản phẩm vi nang probiotic đòi hỏi cả
yếu tố về thời gian và nguồn lực tài chính. Brownlie ƣớc tính rằng các công
đoạn vi nang hóa probiotic có thể làm tăng chi phí hai hoặc ba lần so với không
bao gói [20]. Chi phí vi nang hóa probiotic sử dụng polyme sinh học tự nhiên
thƣờng rất cao và khả năng để mở rộng quy mô sản xuất cũng khá khó khăn.

1.2.2 Các ứng dụng của vi nang trong ngành Dƣợc
Tuy rằng không phải hoạt chất nào cũng có thể bào chế dƣới dạng VN, nhƣng
công nghệ vi nang hóa đã là một trong những bƣớc tiến bộ của ngành Dƣợc, góp
phần giải quyết những vấn đề khó khăn trong lĩnh vực sản xuất dƣợc phẩm. VN
đƣợc tạo ra nhằm rất nhiều mục đích khác nhau [80]:

12


-

Bảo vệ dƣợc chất trƣớc ảnh hƣởng của MT (ví dụ bào chế aspirin kéo dài kháng
acid dịch vị tốt), bảo vệ các chất nhạy cảm với độ ẩm, ánh sáng, chất oxi hóa
(nifedipin, vitamin A, vitamin K).

-

Chuyển các dƣợc chất ở dạng lỏng thành các hệ chất rắn khô (giả rắn) thuận lợi
cho việc vận chuyển, bảo quản hoặc thành các dạng bột có độ trơn chảy cao
thuận lợi cho việc bào chế (dễ dàng đƣa vào viên nén).

-

Tách các phần tƣơng kỵ với nhau (ví dụ để tăng độ ổn định của cặp tƣơng kỵ
aspirin và clorpheniramin maleat bằng cách tạo thành VN của từng chất trƣớc
khi trộn chung với nhau).

-

Giảm độc tính và tƣơng tác với dịch vị (KCl, sắt sulfat…

-

Che dấu mùi vị (paracetamol…).

-

Bào chế dạng bao tan ở ruột đối với những thuốc cần hấp thu chọn lọc ở dịch
ruột hơn là ở dạ dày.

-

Hạn chế bay hơi (methol) [10].

-

Kiểm soát sinh khả dụng của dƣợc chất trong VN (tăng hoặc giảm khả năng giải
phóng hoặc hƣớng đến tác dụng tại đích).

1.2.3 Các phƣơng pháp bào chế vi nang
Về nguyên tắc, phƣơng pháp chung nhất để bào chế vi nang không yêu cầu bắt
buộc phải có những thiết bị riêng đặc biệt, có thể sử dụng máy và phƣơng tiện có
sẵn nhƣ: nồi phản ứng, máy làm đồng nhất, nồi bao viên thông thƣờng, máy bao

màng mỏng. Việc lựa chọn phƣơng pháp chế tạo phụ thuộc vào đặc điểm, tính chất
của nguyên vật liệu nhƣ độ tan, tính tƣơng đồng, KT vi nang…
Vi nang có thể đƣợc chế tạo bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣng có thể
tổng quát thành các phƣơng pháp sau [9].
1.2.3.1 Phương pháp tách pha hay đông tụ
Nguyên tắc: Các pha đƣợc tách nhờ sự thay đổi nhiệt độ, sự hóa muối hoặc
khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ vi nang.
Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc áp dụng đối với các dung dịch polyme thân
nƣớc, polyme đƣợc dùng phải có khả năng tạo thành màng phim. Nếu chỉ sử dụng
một loại dung dịch keo thì gọi là phƣơng pháp tách pha đông tụ đơn, nếu sử dụng
13


nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phƣơng pháp tách pha đông tụ phức.
a. Đông tụ đơn giản
Nguyên tắc: là quá trình loại nƣớc của các keo thân nƣớc dùng trong hệ do đó
làm giảm độ tan của các chất keo, các chất keo sẽ tủa lại trên bề mặt tiểu phân phân
tán (dung dịch TB tự do).
Trong phƣơng pháp này thƣờng chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin,
polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose), làm giảm độ tan của chất keo bằng cách:
thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với nƣớc (ethanol, aceton, isopropanol,…)
hoặc thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [5].

Hình 1.3 – Các giai đoạn của quá trình tách pha đông tụ đơn [5].
b. Đông tụ phức tạp
Nguyên tắc: Là quá trình tƣơng tác giữa các phân tử tích điện âm và tích điện
dƣơng của hai hay nhiều hợp chất cao phân tử, thƣờng do sự thay đổi nồng độ các
chất tan cao phân tử hay pH. Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện
càng dễ dàng tạo thành hạt đông tụ [12].
Thực chất quá trình đông tụ phải trải qua 3 giai đoạn với điều kiện khuấy

trộn liên tục.
-

Giai đoạn 1: Tạo ra hệ 3 pha không trộn lẫn từ môi trƣờng phân tán lỏng: pha
dƣợc chất tạo nhân, pha vật liệu tạo vỏ và dung môi.
14


-

Giai đoạn 2: Hoàn thiện tạo lớp vở bao xung quanh nhân.

-

Giai đoạn 3: Làm rắn vỏ bao vi nang.

Quá trình tách pha có thể bao gồm:
-

Tách pha do thay đổi nhiệt độ.

-

Tách pha do thêm vào một polyme khác không tƣơng đồng: Nhân đƣợc phân
tán vào dung dịch polyme thứ nhất để tạo màng không tan trong dung dịch.
Màng này sẽ đông vón xung quanh nhân khi phân tán thêm dung dịch đậm
đặc polyme thứ hai không tƣơng đồng.

-

Tách pha do sự hóa muối: Thêm dung dịch đậm đặc muối điện ly mạnh vào
hệ chế tạo vi nang, sẽ tạo thành 2 pha, kết quả là một pha trong đó sẽ trở nên
bão hòa các tiểu phân keo.

-

Tách pha do sự tƣơng tác giữa các polyme: các polyme trái dấu sẽ tƣơng tác
với nhau tạo thành hạt đông tụ bao quanh nhân.
Kĩ thuật đông tụ hóa muối còn đƣợc biết đến là kỹ thuật ion hóa cố
định gel, ion hóa tạo gel để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel). Trong
phƣơng pháp này các polyanion nhƣ alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo
thành các hạt gel có mạng lƣới không gian ba chiều bao gói lấy VSV hoặc có
thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat
để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn.
Kỹ thuật đông tụ hóa muối sử dụng alginat và calci clorid làm chất
bao gói có những ƣu điểm sau: đơn giản, dễ làm, chi phí thấp, không phải sử
dụng nhiệt độ cao hoặc các dung môi hữu cơ. Đông tụ cho phép kết hợp một
số lƣợng lớn VSV với chất bao gói [31], tuy nhiên nhƣợc điểm là gây thất
thoát VSV trong quá trình bào chế. Kỹ thuật nhỏ giọt thƣờng cho các vi nang
có kích thƣớc lớn nằm trong khoảng 2 - 5 mm [51]. Đối với kỹ thuật phun
đông tụ, sử dụng hệ thống phun dung dịch alginat dƣới áp suất không khí tạo
các giọt nhỏ và trở thành đông tụ khi gặp môi trƣờng có tác nhân liên kết
chéo. Kỹ thuật này cho vi nang có kích thƣớc bé (5 – 15µm) nhƣng yêu cầu
bắt buộc là phải có thiết bị thích hợp, tốn kém, khả năng tắc nghẽn cao [62].
Nồng độ alginat thƣờng đƣợc sử dụng để tạo thành gel khoảng 0,6 15


2% và nồng độ dung dịch calci clorid là 0,05 - 1,5 M. Kích thƣớc và hình
dạng của vi nang khác nhau tùy thuộc vào các thiết bị sử dụng.
Hydrogel đƣợc bào chế bằng các kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt,

kỹ thuật phun đông tụ và kỹ thuật hóa rắn nhũ tƣơng.
Kỹ thuật phun sấy
Kỹ thuật phun sấy liên quan đến việc phát tán nhũ tƣơng hoặc hỗn dịch của
VSV và các chất mang vào một luồng khí khô, làm nƣớc bốc hơi ngay lập tức, chất
rắn còn lại là các vi nang mang VSV ở dạng bột khô. Phun sấy cho các vi nang có
kích thƣớc nang từ 5 – 80 µm [34]. Quá trình phun sấy đƣợc điều khiển bằng thay
đổi tốc độ phun dịch, tốc độ của khí sấy và nhiệt độ.
So với các phƣơng pháp khác, phƣơng pháp phun sấy có những ƣu điểm sau:
quá trình liên tục, chi phí thấp và dễ dàng để mở rộng quy mô. Tuy nhiên, do quá
trình sử dụng nhiệt độ cao nên có thể gây ngừng hoạt động hoặc gây thƣơng tích
trong tế bào làm tỷ lệ VSV sống thấp và ổn định thấp trong bảo quản.
Theo Anal và Singh khi quá trình này đƣợc sử dụng để bao probiotic, một số
VSV bị ngừng hoạt động sau một vài tuần lƣu trữ ở nhiệt độ phòng, điều này có liên
quan tới sự sốc gây ra bởi nhiệt độ [11]. Có thể khắc phục bằng cách tìm kiếm các
chủng chịu đƣợc nhiệt độ cao, tối ƣu hóa các thông số bào chế, lựa chọn nhiệt độ
thích hợp và sử dụng thêm chất bảo vệ. Ảnh hƣởng của các chất bảo vệ đƣợc biết
đến làm tăng cƣờng sự sống sót của VSV trong phun sấy [17].
Kỹ thuật nhỏ giọt
Phƣơng pháp nhỏ giọt ứng dụng nguyên lý căn bản là khi một chất lỏng đƣợc
để rơi tự do thì sẽ tạo thành giọt hình cầu do sức căng bề mặt của chất lỏng. Phƣơng
pháp nhỏ giọt đƣợc thực hiện theo nguyên tắc tạo giọt đồng thời và lồng vào nhau
của hỗn dịch TB và dung dịch tạo vỏ gói.
Quy trình thực hiện vi nang bằng AGL theo phƣơng pháp nhỏ giọt đƣợc thực
hiện nhƣ sau:
- Điều chế dung dịch AGL, dung dịch CaCl2 (chất hỗ trợ tạo gel).
- Bổ sung TB tự do vào dung dịch AGL để tạo huyền phù TB.
- Cho tất cả lƣợng hỗn hợp AGL và TB tự do vào trong ống bơm tiêm và nhỏ
16

giọt vào trong dung dịch hỗ trợ tạo gel. Khi giọt hỗn hợp AGL và TB tiếp xúc với
dung dịch hỗ trợ tạo gel (calci clorid) thì ngay lập tức polyme AGL bao quanh TB
và hình thành khung 3 chiều bởi liên kết với ion Ca2+. Nồng độ phổ biến thƣờng
đƣợc sử dụng để đóng gói TB là AGL 1-2% và dung dịch hỗ trợ tạo gel là khoảng
0,05-1,5M.
- Hạt vi nang sau khi bào chế sẽ đƣợc sấy khô. Giai đoạn sấy này ít nhiều sẽ
ảnh hƣởng đến TB, có thể làm tổn thƣơng TB. Các phƣơng pháp sấy thƣờng sử
dụng là sấy thăng hoa, sấy phun và sấy tầng sôi.
- Ƣu điểm của phƣơng pháp nhỏ giọt là thiết bị tƣơng đối đơn giản, gọn gàng,
dễ sử dụng, năng suất vi nang cao và bảo vệ TB tốt.
- Nhƣợc điểm của phƣơng pháp nhỏ giọt là chỉ có thể tạo ra các hạt VN có
hình dạng cầu, không tạo ra đƣợc các hạt VN có hình dạng thay đổi linh hoạt [5].
Kỹ thuật hóa rắn nhũ tương
Vi nang có thể đƣợc tạo ra từ nhũ tƣơng gồm hai hay nhiều chất lỏng không
đồng tan với nhau. Nhũ tƣơng tạo thành có thể là loại dầu/nƣớc (D/N) hoặc
nƣớc/dầu (N/D) phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong nƣớc và polyme sử dụng.
Dựa vào kỹ thuật hóa rắn nhũ tƣơng mà có thể chia thành 3 phƣơng pháp: bốc hơi
dung môi, thay đổi dung môi và tạo liên kết chéo.
Vi nang probiotic đƣợc tạo từ nhũ tƣơng thƣờng sử dụng phƣơng pháp tạo liên
kết chéo (đông tụ). Quá trình bào chế tiến hành cơ bản nhƣ sau: Hỗn dịch polyme
chứa TB VSV đƣợc thêm vào một lƣợng lớn dầu thực vật nhƣ dầu đậu nành, dầu
hƣớng dƣơng, dầu hạt cải, dầu ngô. Các hỗn hợp đƣợc đồng nhất để tạo thành một
nhũ tƣơng N/D. Khi nhũ tƣơng N/D đƣợc hình thành, các polyme hòa tan trong
nƣớc phải đƣợc đông tụ từ các hạt gel nhỏ trong pha dầu bằng cách tạo liên kết chéo
với các ion hóa trị II nhƣ Ca2+, Mg2+… [50].
Quá trình đông tụ có thể xảy ra từ bên trong hoặc từ bên ngoài [50].
-

Đông tụ từ bên trong (internal gelation method):
Muối của calci trộn cùng với dung dịch AGL và VSV. Sau khi quá trình nhũ

hóa xảy ra, nhỏ từ từ dung dịch acid acetic vào nhũ tƣơng làm giải phóng ion Ca2+
ra khỏi muối. AGL tạo liên kết chéo với ion Ca2+, đông tụ lại và tạo thành vi nang.
17