Nghiên cứu phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp bằng hydro peroxit (h2o2 ) và khảo sát khả năng hấp phụ ion kim loại nặng

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

LÊ THỊ LINH TRANG

NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG ĐIỀU CHẾ
CHITOSAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP
BẰNG HIDRO PEROXIT (H2O2) VÀ KHẢO SÁT
KHẢ NĂNG HẤP PHỤ ION KIM LOẠI NẶNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa Công nghệ môi trƣờng

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Lê Cao Khải, cùng toàn thể
các thầy cô giáo trong khoa Hóa Học - Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2,
đã tạo điều kiện cho em được tiếp thu những kiến thức chuyên môn về hóa
học hữu cơ và công nghệ môi trường.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Ý Nhi - Viện
Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình
hướng dẫn và truyền đạt cho em các phương pháp nghiên cứu khoa học và
những kinh nghiệm học thuật quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị tại Viện
Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình
giảng dạy, chỉ bảo và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Lê Thị Linh Trang


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của β-chitin........................................................... 33
Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của β-chitosan ...................................................... 35
Hình 3.3: Giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan .............................................. 35
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa /C và C ................................ 36
Hình 3.5: Phổ FT-IR của chitosan khối lượng phân tử thấp .......................... 40
Hình 3.6: Phổ 1H-NMR của chitosan khối lượng phân tử thấp ..................... 41
Hình 3.7: Phổ 13C-NMR của chitosan khối lượng phân tử thấp .................... 41
Hình 3.8: Phổ nhiễu xạ tia X của Chitosan khối lượng phân tử thấp ............ 42
Hình 3.9: Khả năng hấp phụ Cd2+ của LWC.................................................. 43


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số các kim loại nặng và ảnh hưởng của chúng đến cơ thể sống ... 21
Bảng 2.1: Thành phần chính của một số nguyên liệu chứa chitin ................ 27
Bảng 3.1: Hàm lượng β-chitin trong mai mực ống ........................................ 33
Bảng 3.2: Kết quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan tại các nồng độ khác
nhau. ................................................................................................................ 36
Bảng 3.3: Kết quả xác định khối lượng phân tử khi sử dụng nồng độ H2O2
khác nhau......................................................................................................... 37
Bảng 3.4: Kết quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở
nhiệt độ khác nhau .......................................................................................... 38
Bảng 3.5: Mối quan hệ giữa độ tan và khối lượng phân tử trung bình của các
mẫu LWC ........................................................................................................ 39
Bảng 3.6: Độ dịch chuyển hóa học của proton (1H) của chitosan.................. 41
Bảng 3.7: Độ dịch chuyển hóa học của cacbon (13C) của chitosan ................ 42

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, chitin, chitosan .......................................... 4
Sơ đồ 1.2: Sơ đồ điều chế chitosan................................................................. 10
Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống ........................... 10
Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan .......................................... 11
Sơ đồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin ........................................................ 11
Sơ đồ 1.6: Sơ đồ cơ chế phản ứng thủy phân axit liên kết glucozit của chitosan.......... 16
Sơ đồ 1.7: Cơ chế thủy phân liên kết N-axetyl (phản ứng SN2)..................... 17
Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp ................... 30
Sơ đồ 3.1: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin ........................................................ 34


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
Ac: CH3CO
CTS: Chitosan
DDA: Độ đề axetyl hóa
DA: Độ axetyl hóa
DMAc: N,N-đimetyl axetamit
DP: Độ polymer hóa trung bình
GlcN: D-glucosamin
GlcNAc: N-axetyl-D-glucosamin
IR: Hồng ngoại
LAB: Lactic axit bacterial

M n : Khối lượng phân tử trung bình
Me: CH3
NMR: Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân
LWC: Chitosan khối lượng phân tử thấp

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3
1. Giới thiệu chung [1,2,4,15,21] .................................................................... 3
1.1. Cấu trúc tinh thể [1,2,4,31] ........................................................................ 4
1.2. Tính tan [22,28] .......................................................................................... 5
1.3. Khối lượng phân tử [22]............................................................................. 5
1.4. Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,14,18] ...................... 6
2. Phƣơng pháp điều chế chitin/chitosan [8,20] ........................................... 8
2.1. Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,19,20] ................................... 8
2.2. Điều chế chitosan [1, 2, 4, 20] ................................................................... 9
3. Tính chất hóa học [1,2,5] .......................................................................... 11
3.1 Phản ứng ở nhóm -OH .............................................................................. 11
3.2. Phản ứng ở nhóm axetamit....................................................................... 11
3.3. Phản ứng ở nhóm -NH2 ............................................................................ 12
3.4. Phản ứng cắt mạch chitosan ..................................................................... 12
3.4.1. Phương pháp chiếu xạ........................................................................... 13
3.4.2. Phương pháp thủy phân bằng enzym .................................................... 14
3.4.3. Phương pháp hóa học ........................................................................... 15
4. Giới thiệu sơ lƣợc về kim loại nặng ......................................................... 18
4.1. Ảnh hưởng của kim loại nặng và hậu quả của chúng .............................. 19
4.2. Giới thiệu về cadimi ................................................................................. 21
5. Một số ứng dụng của chitin/chitosan và dẫn xuất ................................. 22
5.1. Ứng dụng trong xử lý nước thải ............................................................... 23

5.1.1. Hấp phụ ion kim loại nặng [35]............................................................ 23
5.1.2. Hấp phụ thuốc nhuộm hoạt tính [12,21,34] ......................................... 23
5.2. Ứng dụng trong y dược [16,29] ............................................................... 24
5.3. Ứng dụng trong nông nghiệp ................................................................... 24
5.3.1. Chất kích thích sinh trưởng [11,34] ..................................................... 24
5.3.2. Chất bảo quản nông sản [17,25,32,36] ................................................ 25
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 26
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ....................... 26
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất............................................................................ 26
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ................................................................. 26
2.2. Thực nghiệm: .......................................................................................... 27
2.2.1. Điều chế Chitin/chitosan: ...................................................................... 27
2.2.1.1. Điều chế chitin: .................................................................................. 27
2.2.1.2. Điều chế chitosan: .............................................................................. 28
2.2.1.3. Xác định độ axetyl hóa /deaxetyl hóa: ............................................... 29
2.2.1.4. Xác định khối lượng phân tử trung bình số của chitosan .................. 29
2.2.2. Điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC) .............................. 30
2.2.2.1. Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp ....................... 30
2.2.2.2. Khảo sát phản ứng với điều kiện thí nghiệm khác nhau .................... 30
2.2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến khối lượng phân tử

 

trung bình M n của chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC) ..................... 30
2.2.2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử
trung bình ( M n ) của chitosan trọng lượng phân tử thấp (LWC)................... 31
2.2.2.2.3. Khảo sát tính tan trong nước của chitosan trọng lượng phân tử thấp (LWC)
......................................................................................................................... 31
2.2.3. Thăm dò khả năng hấp phụ ion kim loại nặng của chitosan khối lượng

phân tử thấp. .................................................................................................... 31


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 33
3.1. Điều chế chitin/chitosan ......................................................................... 33
3.1.1. Điều chế chitin ...................................................................................... 33
3.1.2. Điều chế chitosan từ chitin theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệt
độ cao. ............................................................................................................. 34
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại .................................................................................. 34
3.1.2.2. Phổ X-Ray .......................................................................................... 35
3.1.2.3. Khối lượng phân tử ............................................................................ 36
3.2. Khảo sát các điều kiện ảnh hƣởng đến phản ứng điều chế chitosan
khối lƣợng phân tử thấp ............................................................................... 37
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử trung bình ( Mn )
sản phẩm phản ứng đề polyme hoá chitosan................................................... 37
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khối lượng phân tử trung bình ( Mn ) sản
phẩm phản ứng đề polyme hoá chitosan ........................................................ 37
3.2.3. Đánh giá độ tan trong nước của các mẫu chitosan trọng lượng phân tử
thấp .................................................................................................................. 39
3.3. Xác định cấu trúc của chitosan khối lƣợng phân tử thấp .................. 39
3.4. Nghiên cứu sơ bộ khả năng hấp phụ Cd2+ của sản phẩm phản ứng . 42
KẾT LUẬN CHUNG .................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 45


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Chitin

[poly-β-(1→4)-2-axetamiđo-2-đeoxy-D-glucopyranozơ],

một polysaccarit với hàm lượng đứng hàng thứ hai trong tự nhiên sau
xenlulozơ, là thành phần chính của vỏ các loài động vật giáp xác như: vỏ tôm,
mai cua, mai mực… Chitin/chitosan là một polyme có nhiều tính chất đặc
biệt: Tính hòa hợp sinh học, phân hủy sinh học, tính kháng khuẩn, kháng
nấm, chống độc… Do đó được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, dược
phẩm, nông nghiệp, mỹ phẩm, công nghệ môi trường…
Ở Việt Nam, giáp xác là nguồn nguyên liệu dồi dào chiếm 1/3 tổng sản
lượng nguyên liệu thủy hải sản. Trong công nghiệp chế biến thủy hải sản xuất
khẩu chiếm đến 70% - 80% công suất chế biến. Hằng năm, các nhà máy chế
biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm,
chính lượng phế thải này đã gây ra hiện tượng ô nhiễm môi trường nghiêm
trọng, gây ảnh hưởng lớn đến cuộc sống và sức khỏe của người dân. Vấn đề ô
nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm và có tính toàn cầu. Sự bùng
nổ dân số cùng với tốc độ đô thị hóa, công nghiệp hóa nhanh chóng đó tạo ra
một sức ép lớn tới môi trường sống ở Việt Nam, đặc biệt là với việc nguồn
nước sinh hoạt ngày càng trở nên thiếu hụt và ô nhiễm. Một trong số những
tác nhân gây ô nhiễm nguồn nước chính là ion kim loại nặng. Ở nồng độ thấp,
các nguyên tố như Fe (II, III), Cu (II), Mn (II, VII)… là những nguyên tố vi
lượng rất cần thiết cho cơ thể. Nhưng khi ở nồng độ cao, chúng tích lũy theo
chuỗi thức ăn gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Một số
nguyên tố như: Cr (VI), Cd (II), As (III,V)… còn được biết đến như tác nhân
gây ung thư. Đã có nhiều loại vật liệu được sử dụng để loại bỏ ion kim loại ra
khỏi nguồn nước như: silicagel, zeolit, ligin, tảo biển, rong biển, chitosan, vật
liệu clay, bã mía, than hoạt tính, chất dẻo tổng hợp… Tuy nhiên, trong số vật
Lê Thị Linh Trang

1

Lớp: K38A - SP Hóa học

liệu hấp phụ có nguồn gốc thiên nhiên thì chitin/chitosan và dẫn xuất của nó
được cho là vật liệu có khả năng tạo phức tốt nhất với ion kim loại nặng, ion
quý hiếm, thuốc nhuộm và có thể tái sử dụng. Vì vậy, nghiên cứu tổng hợp
vật liệu hấp phụ sinh học trên cơ sở chitin/chitosan đã và đang được nhiều tác
giả tiếp tục quan tâm và nghiên cứu.
Để góp phần mở rộng ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất,
góp phần bảo vệ môi trường, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp bằng hydro peroxit (H2O2)
và khảo sát khả năng hấp phụ ion kim loại nặng”.
2. Mục đích nghiên cứu
Điều chế chitosan khối lượng phân tử <10 000 Da bằng tác nhân oxy
hóa (H2O2) và nghiên cứu thăm dò khả năng hấp phụ ion kim loại nặng trong
môi trường nước của sản phẩm.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Khảo sát các điều kiện phản ứng để điều chế oligochitosan: ảnh hưởng
của nồng độ H2O2, thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng... để điều chế
chitosan khối lượng phân tử <10000 Da
- Khảo sát các tính chất hóa lý của sản phẩm.
- Khảo sát khả năng hấp phụ của ion kim loại nặng của sản phẩm.

Lê Thị Linh Trang

2

Lớp: K38A - SP Hóa học


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1. Giới thiệu chung [1,2,4,15,21]
Trong số các polysaccarit, chitin là nguồn tài nguyên sinh học tự nhiên
phong phú chỉ sau xenlulozơ. Chitin có cấu trúc phân tử tương tự như
xenlulozơ, mạch phân tử của chitin gồm các mắt xích N-axetyl-D-glucosamin
nối với nhau bằng liên kết (14) glycosit hay 2-axetamido-2-deoxy- -Dglucozơ. Chitosan là sản phẩm deaxetyl hoá của chitin có tên gọi là 2-amido2-deoxy - -D-glucozơ. Trong thực tế chitin, chitosan cùng tồn tại trong một
phân tử polymer, gồm các mắt xích (14)-N-axetyl-D-glucosamin và mắt
xích (14) - D - glucosamin. Khi tỷ lệ (14)-D-glucosamin nhiều hơn thì
được gọi là chitosan, ngược lại là chitin. Vì trong mắt xích: (14)-Dglucosamin có nhóm amino (-NH2) nên chitosan dễ tan trong một số dung
dịch axit loãng như axit axetic 1%, axit focmic, trong khi đó chitin hầu như
không tan trong các dung môi hữu cơ. Tính tan của chitin - chitosan trong dung
dịch axit axetic loãng tăng theo chiều tăng của tần suất xuất hiện nhóm amin
trong mắt xích phân tử. Người ta sử dụng đặc điểm này để phân biệt chitin hay
chitosan. Nếu tan trong axit axetic loãng thì gọi là chitosan, nếu không tan thì gọi
là chitin. Ngoài ra có thể phân biệt bằng giá trị độ axetyl hoá (DA), hay độ
deaxetyl hoá (DDA), DA=(1-DDA), nếu DA>50% được gọi là chitin, nếu
DA<50% thì được gọi là chitosan. Chitin-chitosan là polysacarit duy nhất có
chứa nhóm chức amin nên được đánh giá là vật liệu có tiềm năng hơn xenlulozơ
trong nhiều lĩnh vực với nhiều tính chất quý như có khả năng phân hủy sinh học,
có khả năng tương hợp sinh học và đặc biệt là có hoạt tính sinh học. Chính vì
vậy, ngày nay chitin-chitosan và các dẫn xuất vẫn đang được quan tâm nghiên
cứu ứng dụng trong nhiều các lĩnh vực khác nhau như y dược, công nghệ thực
phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, công nghệ môi trường…vv.

Lê Thị Linh Trang

3

Lớp: K38A - SP Hóa học

OH

6
4

HO

1

3

OH

OH

O

5
2

HO
O

O

OH

O
HO

HO
O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

O

O
HO

HO
O

OH

OH

O
O
OH

Xenluloz¬
OH

NHCOCH3
O
HO
O

O

HO
O
NHCOCH3

HO

OH
HO
O
NHCOCH3

OH

OH

NHCOCH3

O
HO
O

O

NHCOCH3
O
O

O

HO
O
NHCOCH3

OH

OH

Chitin
OH
O
HO

OH

NH2
HO
O

NH2

O

O
HO

OH

OH

NH2

O

HO
O

NH2

O

O
HO

O

NH2
HO

O

NH2

OH

O
O
OH

Chitosan
Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, chitin, chitosan
1.1. Cấu trúc tinh thể [1,2,4,31]
Chitin là một loại polisaccarit mạch thẳng với khối lượng phân tử lớn
được tạo bới mắt xích N-axetyl-D-glucozamin theo liên kết β(1→4)glucozit
như kiểu liên kết các mắt xích D-glucozo ở xenlulozo. Bằng phương pháp
nhiễu xạ tia X đã phát hiện chitin có 3 kiểu đa hình là: α, β, γ-chitin được mô
tả theo hình sau:

Chitin

Chitin

Chitin

- α-chitin: cấu trúc tinh thể mạng ghép đôi song song (một mạng lên
một mạng xuống liền nhau), α-chitin thường được tách từ vỏ cua.
- β-chitin: các mạch ghép trong tinh thể theo cách ghép song song cùng
chiều, β-chitin chủ yếu có trong mai mực nang sừng.
- γ-chitin: có mạch ghép trong tinh thể theo 2 cách, cứ 2 mạch song

song lại có 1 mạch đối song, γ-chitin được tách từ sợi kén của bọ cánh cứng,
dạ dày của mực ống, là loại có trữ lượng ít nhất.

Lê Thị Linh Trang

4

Lớp: K38A - SP Hóa học


1.2. Tính tan [22,28]
Chitin thể hiện ái lực hạn chế với phần lớn các dung môi vì có liên kết
hidro chặt chẽ giữa các phân tử. Chitin thường (α-chitin) không tan và hầu
như không trương trong dung môi thông dụng mà chỉ tan trong một số dung
môi đặc biệt, ví dụ: N,N-dimetylaxetamit (DMAC) có chứa 5-10% LiCl.
Chitosan là một polyamin không tan trong nước cũng như trong dung
môi hữu cơ nhưng tan trong môi trường axit loãng. Độ tan của chitosan phụ
thuộc vào độ axetyl hóa, loại axit và nồng độ axit trong dung dịch. Khi xử lý
chitin/chitosan trong môi trường axit mạnh với nồng độ lớn thường xảy ra
phản ứng depolyme hóa (cắt mạch) làm giảm khối lượng phân tử polyme.
1.3. Khối lƣợng phân tử [22]
Khối lượng phân tử chitin/chitosan là thông số quan trọng nhưng khó
có thể xác định được chính xác do tính tan kém của chúng và sự đa dạng về
kiểu phân bố các nhóm axetyl cũng như mức độ axetyl hóa.
Khối lượng phân tử của chitin tự nhiên càng khó xác định vì nó tồn tại
ở dạng chặt chẽ với protein, muối khoáng cũng như hầu hết các chất màu.
Hơn nữa, độ dài mạch chính của chitin/chitosan có thể giảm trong quá trình
xử lý với axit và kiềm. Khối lượng phân tử chitin sau khi tách khỏi protein
cũng như các chất khác được tính toán theo các phương pháp đo độ nhớt, sắc
ký thẩm thấu gel (GPC-Gel Permeation Chromatography) hoặc sắc ký loại trừ

theo độ lớn phân tử (SEC -Size Exclusion Chromatography) trong dung môi
DMAc/LiCl. Kết hợp các phương pháp SEC, tán xạ ánh sáng và đo độ nhớt
thì có thể xác định được chính xác khối lượng phân tử trung bình và độ phân
bố của khối lượng phân tử. Từ các số liệu thu được từ phương pháp GPC đã
khẳng định các mẫu chitin tách từ mai cua, vỏ tôm và mai mực ống có độ
polyme hóa (degree of polymeizaion - DP) nằm trong khoảng 2000 - 4000.
Chitosan tan được trong dung dịch axit loãng và khối lượng phân tử có thể

Lê Thị Linh Trang

5

Lớp: K38A - SP Hóa học


xác định theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép nối với cột loại trừ theo
độ lớn phân tử (SE-HPLC-size exlusion high performance liquid
chromatography). GPC-HPLC, GPC, phương pháp đo độ nhớt… cũng có thể
chuyển hóa chitosan thành chitin qua phản ứng N-axetyl hóa và khối lượng
phân tử được tính theo phương pháp GPC trong hệ dung môi DMAc/LiCl.
Trong đó phương pháp đơn giản nhất để xác định khối lượng phân tử polyme
là xác định theo phương pháp gián tiếp qua phép đo độ nhớt. Phép đo độ nhớt
không phải là phương pháp tuyệt đối để xác định khối lượng phân tử mà chỉ
là phương pháp tương đối dựa trên cơ sở độ nhớt của dung dịch polyme tăng
tỉ lệ với số lượng các phân tử thêm vào.
Phương pháp đo áp suất thẩm thấu là phương pháp dựa trên định luật
Vant-Hoff. Theo định luật này, sự phụ thuộc giữa áp suất thẩm thấu P, thể
tích V và nhiệt độ tuyệt đối T và số gam phân tử của vật chất trong dung dịch
pha loãng được biểu diễn bằng phương trình trùng với dạng phương trình của
dạng khí lí tưởng:

PV = nRT = (g/M)RT
→ P = (g/V)(RT)/M
→M = (RTC)/P
Trong đó:
g: khối lượng của chất hòa tan (g)
M: khối lượng phân tử của chất (g/mol)
C: nồng độ của dung dịch
R: hằng số
T: nhiệt độ tuyệt đối
1.4. Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,14,18]
Độ axetyl hóa là hàm lượng nhóm (-NHCOCH3) còn độ đeaxetyl hóa là
hàm lượng nhóm (-NH2) trong chitin và chitosan. Mắt xích cơ sở của chitin là

Lê Thị Linh Trang

6

Lớp: K38A - SP Hóa học


N-axetyl-D-glucosamin (GlcNAc). Mặc dù hầu hết các nhóm amino gắn với
C2 đã bị axetyl hóa, nhưng trong tự nhiên chitin vẫn tồn tại một số nhóm
amino tự do. Hơn nữa, phản ứng đeaxetyl hóa chitin còn xảy ra trong quá
trình tách loại protein bằng kiềm. Vì vậy, các mẫu chitin trên thực tế có DDA
khác nhau (khoảng 5 - 15%) phụ thuộc vào nguồn gốc và cách điều chế
chúng. Để thu được chitin có cấu trúc thuần nhất (chỉ gồm các mắt xích
GlcNAc) thì phải tiến hành N-axetyl hóa chọn lọc các nhóm amino tự do. Khi
chitin bị đeaxetyl hóa đáng kể thì trở nên tan trong dung dịch axit axetic loãng
và được gọi là chitosan.
OH

OH

O

O
O

OH
NH2

OH

O
NHCOCH3

DDA

DA

Trong đó, DDA = 100-DA. Đối với chitin thì DA > DDA, đối với
chitosan thì DA < DDA. Khi DA = DDA thì có chitin tan trong nước.
Tính chất của chitin cũng như chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ
đeaxetyl hóa (DDA) - một thông số quan trọng nhất để chỉ ra là chitin hay
chitosan. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp xác định DDA (hay DA) một cách
chính xác và đơn giản là vấn đề rất quan trọng và cần thiết. Có rất nhiều
phương pháp đã được áp dụng để xác định DDA của chitin/chitosan như:
phân tích nguyên tố, các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử
ngoại (UV), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NRM): 1H-NRM,
15

13

C-NRM, và

N-NRM ở trạng thái rắn, cho phép đo lưỡng sắc cầu, phổ khối, chuẩn độ

điện thế, chuẩn độ nitrat (phương pháp chuẩn độ sử dụng bạc nitrat), chuẩn độ
với axit picric, chuẩn độ độ dẫn, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí - lỏng, sắc ký
thẩm thấu gel, nhiệt phân - sắc ký khí, sắc ký khí.
Trong các phương pháp xác định DA đã được áp dụng thì phổ IR là
phương pháp thuận tiện đặc biệt trong trường hợp mẫu ở trạng thái rắn, không

Lê Thị Linh Trang

7

Lớp: K38A - SP Hóa học


hòa tan trong các dung môi. Đối với chitosan (tan trong môi trường axit
loãng) thì phổ 1H-NRM là phương pháp nhanh, chính xác và có độ nhạy cao.
Đo trong dung môi D2O, CD3COOD/D2O hoặc DCl/D2O.
2. Phƣơng pháp điều chế chitin/chitosan [8,20]
Chitin có ở nhiều loài khác nhau, từ các loài nấm đến các động vật bậc
thấp. Vỏ của các loài động vật chân đốt là nguồn nguyên liệu chính để điều
chế chitin, trong thành phần của vỏ các loài động vật này có chứa 20 - 50%
chitin tính theo khối lượng khô. Vỏ tôm, mai cua là nguồn nguyên liệu phế
thải từ công nghiệp chế biến thủy sản, hải sản được sử dụng để sản xuất chitin
thương mại. Các nguồn nguyên liệu khác để sản xuất chitin là: mai mực, sâu

bọ, tảo, nấm… Thành tế bào một số loại nấm chứa cả chitin cũng như
chitosan và được coi là nguồn chitosan tự nhiên. Chitosan được điều chế bằng
cách thực hiện phản ứng deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm.
2.1. Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,19,20]
Nguyên tắc chung để điều chế chitin là loại bỏ muối khoáng (chủ yếu là
canxicacbonat), protein và các chất màu khỏi phế liệu thủy, hải sản. Hai
phương pháp chủ yếu được áp dụng để tách chitin/chitosan là phương pháp
hóa học và phương pháp lên men vi sinh vật.
Theo phương pháp hóa học: Quá trình điều chế chitin được thực hiện
theo các bước: tách khoáng - tách protein - khử màu. Muối khoáng thường
được tách ra bằng cách xử lý nguyên liệu với dung dịch axit HCl, protein bị
thủy phân trong môi trường kiềm, chất màu được loại bỏ bằng dung môi hoặc
tác nhân oxi hóa. Trong quá trình xử lý, một số nhóm axetamit trong các mạch
đại phân tử chitin bị thay thế bởi nhóm amino do phản ứng deaxetyl hóa.
Điều chế chitin theo phương pháp hóa học có một số mặt hạn chế như
phải sử dụng một lượng lớn kiềm, axit, nước rửa do đó chi phí lớn và gây ô
nhiễm môi trường. Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt giảm
mạch chitin tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau.

Lê Thị Linh Trang

8

Lớp: K38A - SP Hóa học


Theo phương pháp xử lý vi sinh vật: Protein được tách khỏi vỏ các
loài giáp xác bằng cách xử lý với enzim hay vi sinh vật theo nguyên tắc: vi
khuẩn sinh ra lactic (LAB: lactic acid bacterial) tự có trong phủ tạng của vỏ
phế thải (vỏ tôm, cua, mai mực…) với một lượng rất nhỏ cùng với nguồn

LAB thuần chủng được bổ sung có tác dụng bảo quản và thủy phân phế thải.
Hỗn hợp lên men bao gồm: vỏ phế thải, LAB, dung dịch glucozo. Trong quá
trình lên men, LAB sản sinh ra axit lactic làm giảm pH của môi trường, tạo
điều kiện cho quá trình thủy phân protein, thủy phân khoáng tạo thành các
lactat canxi, magie…là các muối tan được trong nước. Bằng phương pháp ly
tâm, phần dung dịch lỏng chứa protein và các muối khoáng hòa tan được loại
bỏ thu được phần chitin không hòa tan. Để có chitin sạch, có thể xử lý tiếp
bằng dung dịch axit và kiềm loãng.
Phương pháp điều chế chitin bằng phương pháp lên men vi sinh vật có
một số ưu điểm như chi phí thấp, cấu trúc sản phẩm không bị thay đổi nhiều
và đặc biệt là ít gây ô nhiễm môi trường.
β-chitin được sản xuất chủ yếu từ mai mực ống theo cách đơn giản hơn
vì thành phần của mai mực ống chủ yếu là chitin, hàm lượng protein và muối
khoáng thường rất thấp. Hơn nữa, do sự sắp xếp các mạch đại phân tử trong
β-chitin khác hẳn với α-chitin nên α-chitin có các liên kết hidro chặt chẽ hơn,
vì vậy khi xử lý mai mực ống với axit và kiềm thường ở điều kiện êm dịu hơn
nhiều so với xử lý vỏ tôm để thu được β-chitin
2.2. Điều chế chitosan [1, 2, 4, 20]
Chitosan là sản phẩm deaxetyl hóa của chitin. Chitosan thương mại có
nhiều loại với độ deaxetyl hóa khác nhau nhưng thường được điều chế bằng
cách deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm nồng độ 40 - 50% ở 100 130oC trong 24 giờ. Phản ứng deaxetyl hóa xảy ra như sau:

Lê Thị Linh Trang

9

Lớp: K38A - SP Hóa học


OH

OH
O

dd NaOH, to

O

OH

NHCOCH3

OH
O

OH

O
O

OH

NH2

n

O
NHCOCH3

x

y

Sơ đồ 1.2: Điều chế chitosan
Chitosan thu được theo phương pháp này có DDA lên tới 90%. Để thu
được chitosan có độ deaxetyl hóa cao hơn phải tiến hành phản ứng lặp đi lặp
lại nhiều lần. Phản ứng deaxetyl hóa β-chitin diễn ra dễ dàng hơn nhiều so với
α-chitin: Từ các mẫu α-chitin, β-chitin có DDA tương đương nhau tiến hành
phản ứng deaxetyl hóa trong NaOH 30% ở 100oC với thời gian như nhau (2
giờ) thu được β-chitosan với DDA ≈ 70% trong khi đó đối với α-chitin giá trị
đó là ≈20%. Tuy nhiên khi sử dụng dung dịch kiềm đặc thì bên cạnh phản ứng
deaxetyl hóa còn xảy ra phản ứng thủy phân mạch chitin/chitosan làm giảm
đáng kể khối lượng phân tử của chitin/chitosan.
Ta có thể mô tả quá trình điều chế chitosan từ vỏ mai mực ống qua sơ
đồ 1.3:
Vỏ phế thải thủy hải sản
↓
Xay nghiền
↓
Khử khoáng bằng axit loãng (axit HCl)
↓
Tách loại protein bằng kiềm loãng (NaOH loãng)
↓
Chitin
↓
Deaxetyl hóa (bằng NaOH 50%, trong vòng 2h ở 100oC)
↓
Chitosan
Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống

Lê Thị Linh Trang

10

Lớp: K38A - SP Hóa học


3. Tính chất hóa học [1,2,5]
Công thức tổng quát của chitin là: (C8H13NO5)n
OH

OH

O

O
O

OH
NHAc

O

OH
NH2

n

m

Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan
Ta thấy trong mỗi mắt xích của chitin/chitosan vừa có nhóm chức (OH) vừa có nhóm chức amin (-NHCOCH3/NH2) nên có ba trung tâm phản
ứng chính, vì vậy nó vừa có tính chất của ancol lại vừa có tính chất của amin.
3.1 Phản ứng ở nhóm -OH
Phản ứng với axit, anhidric axetic hay HCl thu được sản phẩm ở dạng este.
[Chit(OH)2]n + 2nHCl → [Chit(OCl)2]n + 2nH2O
Phản ứng với ankyl sunfat trong ankyl halogenua thu được các este.
Phản ứng với các hợp chất vinyl tạo este
Trong mỗi mắt xích của chitin có 2 nhóm (-OH) ở C3 và C6, đều có khả
năng tham gia phản ứng. Do cấu trúc phân tử, nhóm (-OH) bậc 2 ở C3 bị án
ngữ không gian nên phản ứng kém hơn nhóm (-OH) bậc 1 ở C6.
3.2. Phản ứng ở nhóm axetamit
Chitin có khả năng tham gia phản ứng thể hiện tính chất của amin bậc 2
như phản ứng đeaxetyl hóa tạo thành chitosan.
OH

OH
O

dd NaOH, to

O

OH

NHCOCH3

O
OH

O
NH2

n

Chitin

m

Chitosan

M = (203)n

M = (161)m

Sơ đồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin

Lê Thị Linh Trang

11

Lớp: K38A - SP Hóa học


Phản ứng trên thường được thực hiện với NaOH 40% ở 120oC trong
1→3h. Hiệu suất đeaxetyl hóa chỉ đạt 70%. Điều này có nghĩa là sản phẩm
phản ứng là chuỗi polyme vẫn có cả mắt xích N-axetyl-D-glucozamin đan xen
với β (1→4) glucozamin.
Để đánh giá mức độ đeaxetyl hóa của chitin người ta đưa ra khái niệm
độ đeaxetyl hóa (DDA) được tính theo công thức sau:

DDA =
Với A là tổng số % mắt xích N-axetyl-D-glucozamin.
Muốn thu được chitosan đeaxetyl hóa hoàn toàn DDA  0, phải rửa
sạch mẫu rồi xử lý kiềm lặp lại nhiều lần.
3.3. Phản ứng ở nhóm -NH2
Phản ứng xảy ra ở nhóm amin -NH2 và nhóm amit - NHCOCH3 hai nhóm
này gắn ở vị trí C2 (hay ở vị trí N). Tại đây nhóm -NH2 của chitin/chitosan có
đôi điện tử không phân chia do đó về mặt hóa học, chúng có khả năng phản
ứng cao với các tác nhân ái lực electron để tạo ra các dẫn xuất tương ứng.
Phản ứng gắn với các nhóm -OH tại C3 (hoặc C6) hay gắn
polietylenglycol vào nhóm -NH2 thu được các dẫn xuất có cấu trúc hóa học
cồng kềnh nhằm cản trở không gian, làm giảm các liên kết cầu hidro giữa các
mạch và trong mạch phân tử của chitin/chitosan như lúc ban đầu, để tạo ra các
dẫn xuất tan trong nước.
3.4. Phản ứng cắt mạch chitosan
Do quá trình chuyển hóa trong động thực vật chủ yếu xảy ra trong môi
trường nước nên chitosan với khả năng tan kém trong nước đã làm hạn chế
phần nào hiệu quả và phạm vi ứng dụng. Vì vậy, để tăng khả năng ứng dụng
của chitosan chúng ta phải cải thiện khả năng tan trong nước của chitosan.
Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra rất
nhiều phương pháp để cải thiện khả năng tan trong nước của chitosan, trong
Lê Thị Linh Trang

12

Lớp: K38A - SP Hóa học


đó phương pháp đề polyme hóa được coi là phương pháp đơn giản và hiệu
quả nhất.

Quá trình depolyme hóa là quá trình phả hủy các liên kết glucozit trong
mạch đại phân tử dưới các tác nhân cắt mạch như: enzym, hóa chất chiếu
xạ…Các tác nhân cắt mạch phá hủy liên kết glucozit, chuyển hóa chitosan
thành oligome có khả năng tan trong nước cao hơn so với chitosan đại phân tử.
Có nhiều phương pháp cắt mạch chitosan như: cắt mạch bằng enzym,
cắt mạch bằng chiếu xạ, cắt mạch bằng phản ứng hóa học… Trong đó cắt
mạch bằng phản ứng hóa học là phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng
rãi nhất.
3.4.1. Phương pháp chiếu xạ
Quy trình chiếu xạ để thủy phân chitosan:
Chitosan bột, đóng gói bằng polyetylen, được chiếu xạ với nguồn tia γ
Co60(coban), tốc độ chiếu 1,4 kGy.h-1, liều chiếu xạ từ 10-500 kGy. Chitosan
sau khi chiếu xạ được làm trương nở trong nước (100g chitosan/1 lít H2O)
trong 30 phút. Sau đó cho thêm axit axetic 1N, khuấy trong 4 giờ cho tan
hoàn toàn. Tiến hành trung hòa bằng 0,5M natribicacbonat, pH của dung dịch
là 6. Dùng H2O2 để khử màu của sản phẩm và các sản phẩm khác trong quá
trình chiếu xạ. Tiến hành phân tách: Kết tủa bằng dung dịch etanol, sau đó lọc
thu được hai dạng sản phẩm, phần kết tủa, phần nước lọc. Phần kết tủa được
rửa bằng MeOH và làm khô. Phần nước trong được cô đặc lại, kết tủa và đem
lọc thu hồi sản phẩm. Tiến hành đo độ nhớt (η) đồng thời xác định khối lượng
phân tử trung bình (

M

w

) của sản phẩm. Cơ chế của quá trình chiếu xạ:

R  H  R  C4  C6   H 
R  H  H   R  C1  C6   H 2

R  C1  C4   F1  F2


R  NH 2  H   R C2   NH 3

Lê Thị Linh Trang

13

Lớp: K38A - SP Hóa học


Trong đó R-H và R-NH2 là các phân tử chitosan có khối lượng phân tử

lớn, R C n  là gốc chitosan khối lượng phân tử lớn nằm trong nguyên tử


cacbon Cn, F1 , F2 là phần của chuỗi chính. Sau khi bị bẻ gãy, độ nhạy chiếu
xạ của phân tử polyme cho trước có thể được đánh giá từ hiệu suất depolyme
chiếu xạ của nó.
Phương trình của Charlesby Pnner:

 1
1 

  Gd  1,04  10 7  D

 M n M no 
Trong đó, Mn là khối lượng phân tử trung bình số của chitosan ở liều

lượng hấp thụ được; D và Mno là khối lượng phân tử trung bình số của
chitosan ban đầu. Kết quả thu được cho thấy chitosan 8B (DDA=99%) thì
nhạy cảm hơn phương trình chiếu xạ so với 10B (DDA=90%).
Ưu điểm của phương pháp là không có dư lượng hóa chất nên có độ
tinh khiết cao. Nhược điểm là yêu cầu có thiết bị đặc biệt, hiệu quả cắt mạch
kém hơn so với phương pháp hóa học. Phương pháp chiếu xạ phù hợp cho sự
phân hủy các loại polyme khác nhau.
3.4.2. Phương pháp thủy phân bằng enzym
Có tới hơn 30 loại enzymcó thể sử dụng được để phân hủy chitin/chitosan:
chitosanaza, aminaza, hemicellulaza, cellulaza, papain, lysozyme, pepsin…
Trong dó pepsin, papain, pectinaza, có tác nhân lytic tốt hơn các loại enzym
khác và hiệu quả cắt mạch polyme cao nhất là sử dụng pectinaza. Phương
pháp thủy phân bằng enzym cho phép thu được sản phẩm có dư ít lượng hóa
chất, nên rất phù hợp với mục đích sử dụng trong y học. Tuy nhiên vấn đề mở
rộng quy trình sản xuất còn có nhiều khó khăn. Trong số các loại enzym được
sử dụng loại hemicellulaza có giá thành rẻ hơn cả.
Quá trình thủy phân bằng enzym: Chitosan được hòa tan trong dung
dịch axit axetic 1% ÷ 2% khuấy sau 3 giờ, điều chỉnh pH= 5,5. Để qua đêm,

Lê Thị Linh Trang

14

Lớp: K38A - SP Hóa học


sau đó đặt vào bể ổn nhiệt (50oC với hemixenlluloza) hay tủ ấm (37oC với
pectinaza). Cho dung dịch enzym vào, lượng enzym được tính theo lượng chất
tan (chitosan). Dừng phản ứng cắt mạch sau 3÷30 giờ (tùy từng loại enzym)
bằng cách đun sôi dung dịch phản ứng trong 10 phút để tách bỏ enzym. Tiến

hành lọc, dung dịch sau khi lọc được trung hòa bằng NaOH 10%, pH đạt giá
trị pH=9. Tiến hành ly tâm thu được phần kết tủa, rửa sản phẩm kết tủa bằng
etanol nhiều lần. Sản phẩm lại được tách bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC để
phân đoạn.
Quá trình thủy phân khi có mặt pectinaza (chiết từ nấm cúc màu nâu
sẫm) ở pH=3, nhiệt độ 37oC làm cho độ nhớt của dung dich giảm nhanh.
Oligome thu được trong quá trình này có khối lượng phân tử dao động trong
khoảng 20,000÷5000 Da. Chitosan khối lượng phân tử thấp có độ kết tinh cao
hơn và đa dạng hình hơn chitosan.
3.4.3. Phương pháp hóa học
 Phương pháp thủy phân axit:
Một số tác giả thủy phân chitosan bằng cách hòa tan chitosan trong axit
HCl (0,5%) với nồng độ polyme 1%÷ 1,5% khuấy ở 65oC÷100oC trong 3 giờ.
Sau đó để nguội đến nhiệt độ thường. Dùng NaOH để trung hòa (đến pH8).
Tiến hành lọc, phần kết tủa được rửa nhiều lần bằng etanol, sau đó làm khô
bằng axeton. Phần nước trong được tách muối bằng MeOH, sau đó cô đặc lại
và kết tủa trong etanol để thu phần sản phẩm tan trong nước. Các nghiên cứu
cho thấy độ polyme hóa DP phụ thuộc vào nồng độ axit HCl. Khi dùng axit
HCl đặc nóng thu được sản phẩm có DP= 2÷5, khi dùng axit HCl loãng
(0,5%) thu được sản phẩm có DP≈30…
Các loại axit vô cơ đã được sử dụng như: Axit clohydric (HCl), axit
sunfuric (H2SO4), axit photphoric (H3PO4), axit nitric (HNO3).. Trong đó axit
clohydric được nghiên cứu nhiều hơn cả. Do giá thành HCl và khi trung hòa
bằng NaOH, sản phẩm phụ là NaCl không độc, dễ tách.

Lê Thị Linh Trang

15

Lớp: K38A - SP Hóa học

Ưu điểm của phương pháp là: Phản ứng cắt mạch xảy ra mạnh nhanh,
nhưng các bước tách sản phẩm và dư lượng hoá chất thường khó triệt để.
Sự thủy phân của liên kết glucozit (depolyme hóa) và liên kết N-axetyl
của chitosan được nghiên cứu trong HCl đặc, HCl loãng. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy, tốc độ thủy phân của kiên kết glucozit tương đương với tốc độ
đề N-axetyl hóa trong axit loãng. Trong khi đó thì liên kết glycozit được thủy
phân nhanh hơn 10 lần so với liên kết N-axetyl trong HCl đặc. Điều này có
thể giải thích bằng cách giả sử rằng, quá trình thủy phân của liên kết N-axetyl
là phản ứng SN2, trong khi thủy phân của liên kết glucozit là phản ứng SN1,
với bước làm giảm vận tốc là sự hình thành cacbocation.
H
H+

O

O
O

O

O

O
O

O

H

Tốc độ tới hạn
(Rate-limiting)
H2O

H

O

O
H
O

O

O

+

H, OH

+
OH

OH

O

O

Sơ đồ 1.6: Sơ đồ cơ chế phản ứng thủy phân axit liên kết glucozit của chitosan
Cơ chế được chấp nhận của quá trình thủy phân liên kết glucozit (phản ứng SN1)

Lê Thị Linh Trang

16

Lớp: K38A - SP Hóa học