Thực hành nuôi cấy mô

150

Bài 1

Mở đầu
I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực
vật
(ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu)
1. Phòng rửa và cất nước
+ Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ)
+ Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ)
- Máy sản xuất nước khử ion
2. Phòng sấy hấp
+ Tủ sấy 60-300oC
+ Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L)
- Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L)
3. Phòng chuẩn bị môi trường
+ pHmeter
+ Máy khuấy từ
+ Cân phân tích 10-4g
+ Cân kỹ thuật 10-2g
+ Bếp điện
- Microwave
+ Tủ lạnh 100-200 L
- Tủ lạnh sâu (-20 ÷ -80oC)
4. Phòng cấy vô trùng
+ Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench)
+ Quạt thông gió
+ Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m)
- Thiết bị lọc không khí

151

5. Phòng ảnh
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu
6. Phòng kính hiển vi
+ Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần).
+ Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) có gắn máy
chụp ảnh kỹ thuật số.
+ Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần).
- Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học.
- Kính hiển vi huỳnh quang
7. Phòng nuôi
+ Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chỗ
để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.
+ Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút)
+ Tủ ấm
- Nồi phản ứng sinh học (bioreactor)
8. Phòng sinh hóa
+ Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng...)
+ Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide)
+ Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh của DNA, RNA và
protein (Gene documentation system)
+ Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm
- Một số thiết bị khác để phân tích thành phần sinh hóa của các tế
bào và mô nuôi cấy.

II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tế bào

thực vật
Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng.
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách.


152

- Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
1. Bảo đảm điều kiện vô trùng
1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường,
muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát
triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với
các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào
tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi
trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn.
Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát
triển và chết dần.
Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực dài từ 1-5
tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy), trong khi thí nghiệm vi sinh
vật có thể kết thúc trong một vài ngày. Nói cách khác, mức độ vô trùng
trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc,
điều kiện này đặc biệt quan trọng khi nuôi cấy các tế bào đơn thực vật
trong các nồi phản ứng sinh học (bioreactor), điều kiện vô trùng phải rất
cao mới có hy vọng thành công được.
1.2. Nguồn nhiễm tạp
Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng
tuyệt đối.

- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào
tử nấm hoặc vi khuẩn.
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên
bề mặt môi trường.
1.3. Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy và môi trường
a. Dụng cụ thủy tinh
Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là
loại thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính
để tránh kiềm từ thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi
cấy.


153

Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thông
thường, chỉ cần xử lý dụng cụ thủy tinh bằng sulfochromate một lần đầu
khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch
bằng nước máy nhiều lần và cuối cùng tráng bằng nước cất. Sau khi để ráo
nước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích) cần được vô
trùng khô bằng cách sấy ở 60-70 oC/2 giờ. Sau khi nguội được lấy ra cất
vào chỗ ít bụi.
b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông không thấm nước.
Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời
nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất, nhưng có các nhược
điểm sau:
+ Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ
bị nhiễm nấm, nhất là ở các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài.
+ Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên

quy mô lớn.
+ Chỉ dùng được một vài lần, sau phải bỏ.
Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút
bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống
nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt
độ 121oC (khoảng 1 atm) mà không bị biến dạng. Một số phòng thí
nghiệm dùng nắp ống nghiệm inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô
trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy.
Trong giáo trình này, chúng tôi sử dụng giấy nhôm làm nút đậy.
c. Môi trường
Nói chung, môi trường được pha chế và dự trữ trong điều kiện
không vô trùng và đem hấp vô trùng khi đã phân phối vào các dụng cụ
thủy tinh đã đậy nút hoặc nắp. Thời gian hấp từ 15-20 phút ở áp suất
khoảng 1 atm (121oC). Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm
hoặc nút bông.
Các dung dịch mẹ (stock solutions) dùng để pha chế môi trường
(dung dịch muối khoáng, vitamine, chất kích thích sinh trưởng...) cần
được bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch mẹ của hỗn hợp vitamin nên chia
thành nhiều lọ nhỏ và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha


154

một lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất sinh trưởng, thường chỉ nên
dùng các lọ có dung tích từ 100 đến 200 mL.
Ở áp suất khoảng 1 atm hầu hết các vi sinh vật có trong môi trường
đều bị diệt, kể cả các vi sinh vật ở dạng bào tử. Thời gian hấp thường từ
15 đến 20 phút ở 1 atm.
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải dùng nước cất hoặc
nước khử ion, tốt nhất là dùng nước cất 2 lần từ các máy cất hoàn toàn

bằng thủy tinh.
Đôi khi ta cần cho vào môi trường nuôi cấy các chế phẩm mẫn
cảm với nhiệt, có thể bị phân hủy khi ta hấp ở 121 oC. Trường hợp này cần
tiến hành lọc vô trùng riêng các chế phẩm đó và sau đó đưa vào môi
trường được khử trùng.
d. Lọc vô trùng
Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore (Hình
1.1) do hãng Millipore sản xuất hoặc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5.

Hình 1.1. Một số loại màng lọc vô trùng của hãng Millipore (disposable). Đây là loại
màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng một lần.


155

Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: Hãng Millipore cung
cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa chịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc
loại Millipore Swinex có đường kính 25 mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng
loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng
lọc (có kích thước lỗ 0,25 μm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp
vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong
nồi áp suất ở 121oC trong 15-20 phút. Đồng thời vô trùng một bình thủy
tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc.
1.4. Vô trùng mô nuôi cấy
Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật
như: hạt giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân
củ... Tùy theo sự tiếp xúc với điều kiện môi trường bên ngoài, các bộ phận
này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mô
nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong chứ không
hạn chế ở bề mặt.

Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là
dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn
của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm
nhập của chúng vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả
năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy.
Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn,
thông thường người ta xử lý mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn
70% sau đó mới xử lý trong dung dịch diệt khuẩn.
Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không
triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy.
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch
diệt khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lý
nên rửa kỹ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy
được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần trên mô
cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô
cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô
trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào
dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước
khi đặt mô cấy lên môi trường.
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần
đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng
thích hợp thì sau vài lần thử, chắc chắn sẽ đạt kết quả.


156

Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn để xử lý mô
cấy thực vật

Stt

Tác nhân vô trùng

Nồng độ

Thời gian xử lý
(phút)

Hiệu quả

1

Calcium hypochlorite

9-10%

5-30

Rất tốt

2

Sodium hypochlorite

2%

5-30

Rất tốt

3

Nước Bromine

1-2%

2-10

Rất tốt

4

H2O2

10-12%

5-15

Tốt

5

HgCl2

0,1-1%

2-10

Khá

6

Kháng sinh

4-50 mg/L

30-60

Khá

1.5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào
dụng cụ thủy tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để
thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại
nguồn nhiễm tạp này.
Buồng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15 m 2, có
hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi
vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước
khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót
formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi
trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau
đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH 3
25% cũng trong 24 giờ. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn
bằng cồn 90%.
Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: từ áo
choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc,
bình đựng nước cất... Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn (hoặc
đèn gas) để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các
dụng cụ làm việc.
Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ

đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong
phòng cấy cần có một đèn tử ngoại 40W treo trên trần. Chỉ cho đèn này
làm việc khi không có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30
phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng


157

cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải
chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần.

Hình 1.2. Tủ cấy vô trùng

2. Chọn môi trường dinh dưỡng
Xem bài 2
3. Chọn mô cấy và xử lý mô cấy
Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về
nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực
vật đều có thể dùng làm mô cấy. Tuy vậy, có thể nhận xét chung là các mô
đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh...
khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều
có khả năng phân chia và phân hóa (Bảng 1.2). Để bắt đầu nghiên cứu
nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên người ta chú ý đến các
chồi nách và mô phân sinh ngọn.
Cần biết rằng tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau,
các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh trưởng và phát triển với
khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau.
Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây cụ thể bằng
phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm
hiểu phản ứng các bộ phận khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng

độ chất sinh trưởng khác nhau.
Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh
sáng ổn định. Tùy vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu
sáng khác nhau, chẳng hạn quá trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc


158

chiếu sáng nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần
ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ ổn định từ 25 ± 2 oC bằng máy điều
hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng từ 2000-3000 lux.
4. Một số điểm cần lưu ý
- Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sau khi tiệt trùng
ở nồi khử trùng đều phải được tiệt trùng sau mỗi lần dùng đến bằng cách
nhúng vào cồn 90% rồi hơ lên ngọn lửa đèn cồn.
- Trước khi cấy phải vệ sinh toàn bộ khu vực cấy bằng cồn 90%.
- Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4-5 mẫu, tránh trường hợp
để nhiều không cấy kịp mẫu sẽ bị khô.
- Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi đợt cấy.
Bảng 1.2. Các cơ quan của thực vật sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào
Stt

Nguồn gốc mẫu vật
nuôi cấy

Kích thước

Mẫu nuôi cấy

Mô phân sinh đỉnh

(meristem)

0,5-1 mm

2

Chồi đỉnh
(shoot tip)

0,5-1 cm

3

Chồi nách
(axillary bud)

0,5-1 cm

Chồi bên có chứa một phần thân, lá
và chồi nách

4

Cuống lá
(leaf petiole)

0,2-0,3 cm

Cuống lá được cắt nhỏ, phân nửa
được cấy chìm vào môi trường

5

Phiến lá
(leaf blade)

0,2-1 cm

Phiến lá non đặt trên môi trường, mặt
dưới đặt trên mặt thạch

6

Rễ
(root)

0,5-1 cm

7

Dạng hành
(bulds, scale)

1-2 cm

8

Cây mầm
(seedling)

2-3 mm

9

Hạt phấn
(pollen, microspore)

1

0,1-0,5 mm

Đỉnh sinh trưởng
Chóp đỉnh có chứa một phần thân

Mẫu rễ được đặt trên mặt thạch
Mẫu được đặt trên bề mặt hay cấy
chìm phân nửa vào môi trường
Chồi non
Hạt phấn trong bao phấn


159

Bài 2

Môi trường dinh dưỡng
Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực
vật là tìm ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế
bào có thể sinh trưởng và phát triển được. Thành phần của môi trường
dinh dưỡng thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát

triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo việc muốn duy trì mô ở trạng thái
callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh.
Người ta đã đưa ra đất nhiều loại môi trường khác nhau cho các thí
nghiệm nuôi cấy mô. Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng
được nghiên cứu ra để nuôi cấy những mô đặc biệt nào đó. Một số môi
trường khác có ứng dụng rộng hơn và đảm bảo sinh trưởng tốt cho nhiều
loài cây, tuy nhiên không có những chỉ dẫn chung nào cho rằng môi
trường nào trong chúng bảo đảm sinh trưởng tốt hơn. Để bắt đầu, cần phải
thử trong những môi trường thông dụng nào đó, chẳng hạn môi trường
Murashige-Skoog (1962) nếu không thành công thì sau đó thử trên các
môi trường khác.
Tuy vậy, tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm năm
thành phần chính:
- Đường cung cấp nguồn carbon.
- Các muối khoáng đa lượng.
- Các muối khoáng vi lượng.
- Các vitamin.
- Các chất điều khiển sinh trưởng.
Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ
có thành phần hóa học xác định (các amino acid, EDTA...) hoặc không xác
định (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết cà chua ...).

I. Thành phần chính của môi trường
1. Đường
Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để mô và tế bào thực vật
tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối của mô
không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do đường có trong môi
trường dinh dưỡng.

160

Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose.
Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy
mà nồng độ saccharose biến đổi từ 1-12%, thông dụng là 2-3%.
2. Các muối khoáng đa lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không
khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa
lượng cần phải cung cấp là: N, P, K, Ca, Mg và S (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô

Stt

Nguyên tố
đa lượng

1

N
(NO3-, NH4+)

Dạng sử dụng
Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3, NH4NO3,

Nồng độ
(mM)
∑[NO3-, NH4+]

(NH4)2SO4

khoảng 20

2

P

NaH2PO4.7H2O, KH2PO4

khoảng 1

3

K

KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4

khoảng 10

4

Ca

Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.2H2O hoặc

khoảng 2

CaCl2.6H2O
5

Mg

6

S

MgSO4.7H2O
(NH4)2SO4

0,5-3
khoảng 1

3. Các muối khoáng vi lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô thực vật trong nuôi cấy là lĩnh vực ít
được nghiên cứu. Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là
không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Tuy
nhiên, nó đã được sinh lý học thực vật chứng minh đối với cây hoàn chỉnh
do đó có thể sử dụng được hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với
cây cho mô và tế bào nuôi cấy trong môi trường nhân tạo. Vì vậy, sự cung
cấp này có tính kinh nghiệm trong những trường hợp cụ thể có thể là
không cần thiết (Bảng 2.2).
4. Các vitamin


161

Bảng 2.3 trình bày các vitamin thường được dùng trong các môi
trường nuôi cấy (chủ yếu là bốn loại đầu). Các dung dịch stock vitamin dễ
hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới
0oC (trong ngăn đá tủ lạnh).
Bảng 2.2. Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô

Stt

Nguyên tố
vi lượng

1

Mn

2

Dạng sử dụng

Nồng độ
(mg/L)

MnSO4.4H2O

15-100

B

H3BO3

6-100

3

Zn

ZnSO4.7H2O

15-30

4

Cu

CuSO4.5H2O

0,01-0,08

5

Mo

Na2MoO4.2H2O

0,007-1

6

Co

CoCl2.6H2O

0,1-0,4

7

I

KI

2,5-20

8

Fe

FeSO4.7H2O

15-27,9

Bảng 2.3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô

Stt

Tên vitamin

Nồng độ
(mg/L)

1

myo-inositol

100

2

Nicotinic acid

0,5-1

3

Pyridoxine.HCl (Vit B6)

0,05-0,5

4

Thiamine.HCl (Vit B1)

10-50

5

Panthotenate calcium (Vit B5)

1-5

6

Riboflavin (Vit B2)

1-5

7

Biotin

0,1-1

8

Folic acid

0,1-1


162

5. Các chất điều khiển sinh trưởng
Một số chất sinh trưởng không tan trong nước, do đó khi pha dung
dịch mẹ chất sinh trưởng cần chú ý:
- Đối với 2,4-D, NAA, IAA, IBA và GA 3: cân một lượng chất sinh
trưởng đủ pha trong 50 mL dung dịch mẹ vào một ly khô, thêm 2-3 mL
cồn 90% rồi lắc đến khi tan hết, sau đó mới thêm nước cất đến 50 mL.
- Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất và vài
giọt HCl 1 N, lắc cho tan sau đó thêm nước cất đến thể tích cần pha.
- Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1 N trước khi pha đến thể tích
cần thiết.
Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA
bảo quản trong lọ màu nâu), cất giữ tủ lạnh. 2,4-D, NAA tương đối bền có
thể bảo quản như vậy trong một năm. BAP, IBA, KIN, và GA 3 bảo quản
được từ 2 đến 3 tháng. IAA cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính.
Bảng 2.4. Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng
Chữ

viết tắt

Chất kích thích sinh trưởng

Chữ
viết tắt

Chất kích thích sinh trưởng

BA

Benzyladenin

KIN

Kinetin

BAP

Benzyladeninpurine

NAA

Naphthaleneacetic acid

GA3

Gibberellic acid

2hZ

Dihydrozeatin

IAA

Indoleacetic acid

TDZ

Thidiazuron

IBA

Indolebutyric acid

Zea

Zeatin

2-iP

2-Isopentenyl adenin

2,4-D

NOA

Naphthoxyacetic acid

Pic

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
Picloram

Chú ý
Các chất sinh trưởng có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp
(10-8). Cần dùng pipette riêng cho từng loại chất sinh trưởng một. Và chú ý rửa
cẩn thận các ly, cốc, chai lọc đã dùng để đựng và pha các chất sinh trưởng ở nồng
độ cao. Ngoại trừ IAA và GA3, các chất sinh trưởng còn lại được coi là bền vững
trong quá trình hấp vô trùng.
IAA sau khi pha dung dịch stock, được lọc qua màng lọc millipore (xem
bài trước) sau đó chứa trong các tube eppendof được bọc giấy nhôm bên ngoài,
bảo quản lạnh sâu. Môi trường sau khi hấp khử trùng để nhiệt độ giảm xuống còn


163

khoảng 50-60oC khi đó mới cho IAA đã lọc vào (các thao tác thực hiện trong tủ
cấy vô trùng).

6. Các chất hữu cơ khác
6.1. Nước dừa
Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là
myo-inositol và một số amino acid khác. Lượng nước dừa dùng trong môi
trường nuôi cấy thường khá cao, từ 10-20% thể tích môi trường. Lấy nước
dừa già, lọc trong, cho vào các túi nilon và bảo quản trong lạnh sâu cho
đến khi dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng. Tốt nhất là nên sử
dụng tươi.
6.2. Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein
Đây là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô

và tế bào động vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạn thương phẩm,
thành phần hóa học không rõ. Dung dịch thủy phân casein cung cấp một
số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L môi trường.

II. Vấn đề lựa chọn môi trường
Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn
đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các
chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các
tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về
mặt phân loại đã dùng loại môi trường gì. Bước đầu có thể giữ nguyên
môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp
qua một số thí nghiệm thăm dò.
Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều
loại cây khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau, có thể chia ra làm
ba loại:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi trường
White, Knop và Knudson C.
- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg.
- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: Điển hình là môi trường
Murashige-Skoog và Linsmaier-Skoog.
Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới,
chưa có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem
đối tượng nghiên cứu thích hợp với loại môi trường nào nhất. Sau đó, cần


164

tìm tỷ lệ NO3-/NH4+ thích hợp. Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm đối
với một số môi trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộ trong các nghiên
cứu về nuôi cấy mô và tế bào thực vật.

Hiện nay, môi trường Murashige-Skoog được coi như là một môi
trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh
dưỡng. Vì vậy, những người mới tập sự nuôi cấy mô thường bắt đầu với
môi trường này trước khi tìm ra được môi trường riêng của mình.

III. Chuẩn bị các dung dịch làm việc
Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường
làm việc), người ta không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà
chuẩn bị trước dưới dạng đậm đặc (stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử
dụng. Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh
thường hoặc tủ lạnh sâu. Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì sẽ giảm một số
thời gian đáng kể cho công tác nuôi cấy.
1. Chuẩn bị môi trường Murashige-Skoog (MS, 1962). Chia làm 5 phần:
Bảng 2.5. Thành phần môi trường MS

Dung dịch stock
MS1:

Nồng độ
(mg/L)

Nồng độ trong dung
dịch mẹ (g/200 mL)

KNO3

1900

KH2PO4

170

NH4NO3

1650

16,5

MgSO4.7H20

370

3,7

MS2:

CaCl2.2H2O

440

MS3:

H3BO3

6,2

0,124

MnSO4.4H2O

22,3

0,446

CoCl2.6H2O

0,025

0,5 mg

CuSO4.5H2O

0,025

ZnSO4.4H2O

8,6

0,172

Na2MoO4.2H2O

0,25

5 mg

KI

0,83

16,6 mg

FeSO4.7H2O

27,8

MS4:

Dung tích dùng cho
1 L môi trường

19
(× 10)

(×20)

(× 20)

(× 20)

1,7

8,8

0,5 mg

0,556

20 mL

10 mL

10 mL

10 mL


165

MS5:

Na2-EDTA

37,3

0,746

myo-inositol

100

2

Thiamine.HCl

0,1

2 mg

Pyridoxine.HCl

0,5

Nicotinic acid

0,5

10 mg

2

40 mg

Glycine

(× 20)

10 mL

10 mg

2. Chuẩn bị môi trường Nitsch (Nt, 1956). Chia làm 5 phần:
Bảng 2.6. Thành phần môi trường Nitsch

Dung dịch stock
Nt1:

Nồng độ
(mg/L)

Nồng độ trong dung
dịch mẹ (g/200 mL)

KNO3

950

KH2PO4

68

NH4NO3

720

7,2

MgSO4.7H20

185

1,85

Nt2:

CaCl2.2H2O

166

(×20) 1,66

Nt3:

H3BO3

10

0,2

MnSO4.4H2O

25

0,5

CuSO4.5H2O

0,0025

ZnSO4.4H2O

10

Nt4:

Nt5:

9,5
(× 10)

(× 20)

0,68

0,05 mg

0,25

FeSO4.7H2O

27,8

Na2-EDTA

37,3

0,746

myo-inositol

100

2

Thiamine.HCl

0,5

10 mg

Pyridoxine.HCl

0,5

10 mg

Glycine
Biotin

5

20 mL

10 mL

10 mL

0,2

Na2MoO4.2H2O

Nicotinic acid

Dung tích dùng cho
1 L môi trường

0,5 mg
(× 20)

(× 20)

0,556

100 mg

0,05

40 mg

2

1 mg

10 mL

10 mL


166
Acid folic

0,5

10 mg

3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy protoplast (theo Trigiano & Gray, 2000)
- Môi trường phân lập (Protoplast Isolation medium –PI)
Bảng 2.7. Thành phần môi trường phân lập PI

Stt

Nồng độ
(mg/L)

Thành phần

1

CaCl2.H2O

1480

2

KH2PO4

27,2

3

KNO3

101

4

MgSO4.7H2O

246

5

CuSO4.5H2O

0,025

6

KI

0,16

pH môi trường

5,8

- Môi trường nuôi cấy (Protoplast Culture medium –PC)
Bảng 2.8. Thành phần môi trường PC

Dung dịch stock
PC1:
PC2:

PC3:

Nồng độ
(mg/L)

Nồng độ trong
dung dịch mẹ

(g/200 mL)

Ca(H2PO4)2.2H2O

100

CaCl2.2H2O

450

9

KNO3

2500

50

NaH2PO4.2H2O

170

(NH4)2SO4

134

1,68

MgSO4.7H20

250

5

H3BO3

(× 20)

(× 20)

3

2

3,4

Dung tích
dùng cho 1 L
môi trường
10 mL

10 mL

60 mg

MnSO4.4H2O

13,2

132 mg

CoCl2.6H2O

0,025

0,5 mg

CuSO4.5H2O

0,025

ZnSO4.7H2O

2

(× 20)

0,5 mg
40 mg

10 mL


167

PC4:

Na2MoO4.2H2O

0,25

5 mg

KI

0,75

15 mg

myo-inositol

100

Nicotinic acid

1

(× 20)

2

10 mL

20 mg

Lấy mỗi loại stock PC (PC1, PC2, PC3 và PC4) 10 mL. Bổ sung
thêm:
+ Sequestrene 330
+ Sucrose
+ Glucose

+ Mannitol

28 mg/L
10 g/L
18 g/L
100 g/L


168

Bài 3

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
I. Mục đích và yêu cầu
Một phương thức dễ dàng nhất để đạt được mục tiêu trong nuôi
cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy
chồi đỉnh và chồi bên). Môi trường thích hợp thay đổi tùy theo từng loại
cây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản là môi trường chứa đầy đủ
chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ, được bổ sung chất kích thích
sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy
nhất định sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục
phát triển vươn thân, ra lá và rễ trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con
được chuyển ra đất có điều kiện sinh trưởng phát triển bình thường. Đây là
một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông
thường, được thực hiện bằng kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro thông
qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Khi chọn đỉnh sinh trưởng để nhân giống cần lưu ý, nếu dùng đỉnh
sinh trưởng nhỏ quá thì nuôi cấy khó thành công, nếu dùng đỉnh sinh
trưởng lớn quá thì nuôi cấy dễ thành công nhưng cũng dễ bị nhiễm trùng.
Kích thước của đỉnh sinh trưởng thay đổi tùy theo từng loài cây, tuy nhiên

một đỉnh sinh trưởng có kích thước 5-10 mm là thích hợp hơn cả.
Con đường phát triển của đỉnh sinh trưởng để thành cây có thể trực
tiếp hoặc thông qua giai đoạn protocorm (dẽ hành).
II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
1. Dụng cụ
- Bình tam giác (100 mL, 250 mL)
- Giấy nhôm
- Giấy thấm vô trùng
- Lọ thủy tinh khử trùng mẫu vật nuôi cấy
- Forceps, kéo, dao mổ
- Đĩa petri vô trùng
- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette các loại


169

2. Thiết bị
- Nồi khử trùng
- Tủ sấy
- Laminar
- Tủ lạnh
- Microwave
- Cân phân tích 10-4g
- Cân kỹ thuật 10-2g
- Máy cất nước 2 lần
3. Hóa chất
- Dung dịch stock môi trường MS (MS1, MS2, MS3, MS4 và MS5)
- Dung dịch HgCl2 0,1%
- Cồn 90%
- Agar

- Saccharose
- Nước cất vô trùng
- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: BAP và NAA.
- Nước dừa

III. Phương pháp tiến hành
1. Nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp
a. Nguyên liệu thực vật
- Đỉnh sinh trưởng của cây hông (Paulownia fortunei)
- Đỉnh sinh trưởng cây keo lai (Acasia hybrid)
b. Môi trường nuôi cấy
- MS đầy đủ
- Saccharose 3%
- Agar 0,8%
- BAP 2 mg/L
- NAA 1 mg/L


170

- pHmôi trường ∼ 5,8
c. Tiến hành
 Pha môi trường dinh dưỡng (1 L). Chia môi trường vào trong 20
hoặc 40 bình tam giác loại 250 hoặc 100 mL, tương ứng. Nút miệng bình
bằng giấy nhôm, sau đó đem khử trùng ở 121 oC (1 atm)/15-30 phút (môi
trường chuẩn bị trước từ 2 ngày trở lên).
 Rửa sạch đỉnh sinh trưởng bằng xà phòng dưới dòng nước chảy,
cắt bỏ những lá chung quanh chỉ để lại một vài lá, cho vào lọ thủy tinh vô
trùng để chuẩn bị khử trùng mẫu vật.
 Trước khi cấy, laminar phải được bật đèn khử trùng 30 phút. Các

dụng cụ cần thiết cho quá trình cấy (forceps, kéo, dao, bình khử trùng,
cồn, giấy thấm...) được đặt trong laminar trước khi bật đèn.
 Khử trùng sơ bộ bằng cồn 90% từ 30 giây đến 1 phút, sau đó
bằng HgCl2 0,1 % trong 5 phút, cuối cùng rửa sạch HgCl 2 bằng nước cất
vô trùng từ 4-5 lần (các thao tác này thực hiện trong laminar).
 Lấy mẫu vật ra thấm khô trên giấy thấm vô trùng bóc bỏ những lá
chung quanh, chỉ giữ lại đỉnh sinh trưởng (những phần mô thấm dung dịch
khử trùng cũng cần phải cắt bỏ). Sau đó, cấy mẫu vào các bình tam giác
chứa môi trường dinh dưỡng đã được chuẩn bị sẵn. Các bình môi trường
đã cấy mẫu được đặt trong phòng nuôi với nhiệt độ 25 ± 2 oC, thời gian
chiếu sáng 8-10 giờ/ngày với cường độ 2000-3000 lux.
Sau 3-4 tuần, đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành cây nhờ quá
trình kéo dài chồi (shoot elongation).
2. Nuôi cấy phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm
a. Nguyên liệu thực vật
- Đỉnh sinh trưởng hoặc chồi nách của hoa lan Dendrobium
- Đỉnh sinh hoặc dứa (Ananas comusus)
b. Môi trường nuôi cấy
- Lan: MS đầy đủ
Saccharose 2%
Agar 0,8%
Nước dừa 15%
NAA 0,1 mg/L


171

BAP 1,0 mg/L
pHmôi trường ∼ 5,8
- Dứa: MS đầy đủ

Saccharose 2%
Agar 0,8%
NAA 0,5 mg/L
BAP 0,2 mg/L
pHmôi trường ∼ 5,8
c. Tiến hành
Các bước tiến hành tương tự như trường hợp nuôi cấy phát triển
thành cây trực tiếp. Nhưng lưu ý thêm:
- Đỉnh sinh trưởng của các loài lan hoặc dứa thường rất bẩn nên
phải rửa thật kỹ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy.
- Lan và dứa là những cây có khả năng sinh trưởng khá mạnh nên
thời gian khử trùng đỉnh sinh trưởng của chúng có thể lâu hơn các đối
tượng khác (khoảng 7-10 phút) để đảm bảo tỷ lệ nhiễm bẩn thấp.
Các bình môi trường đã cấy mẫu được đặt trong phòng nuôi với
thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2000-3000 lux,
nhiệt độ phòng 25 ± 2oC.


172

Bài 4

Nuôi cấy đơn bội in vitro
I. Mục đích và yêu cầu
Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật tạo dòng thuần chủng
luôn luôn giữ vai trò quan trọng. Có nhiều phương pháp tạo dòng thuần
chủng khác nhau, nhưng thông thường nhất là tiến hành chọn lọc và kiểm
tra qua nhiều thế hệ tự phối. Cách làm này mang lại kết quả chắc chắn,
nhưng đòi hỏi chi phí lớn về trồng trọt và mất nhiều thời gian.
Bằng con đường đơn bội, nghĩa là chọn ra những cá thể 1n rồi sau

đó lưỡng bội hóa chúng, trong một thời gian ngắn sẽ thu được những cá
thể đồng hợp tử tuyệt đối, đó là những dòng thuần rất lý tưởng. Hai biện
pháp truyền thống để thu được cây đơn bội là:
- Chọn lọc đơn bội xuất hiện ngẫu nhiên.
- Lai xa và chọn lọc sau khi bộ nhiễm sắc thể của một trong hai
giao tử mất đi (thoái biến) sẽ thu được thể đơn bội, hiện tượng này chỉ mới
phát hiện được ở một số cặp lai khác loài của đại mạch.
Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là làm sao để có được một số lượng cây
đơn bội lớn. Phương pháp này hầu như không thể giải quyết vấn đề nói
trên.
Năm 1964, Guha và Maheshawari đã đưa ra một phương pháp tạo
cây đơn bội mới, đó là tạo cây đơn bội từ hạt phấn thông qua nuôi cấy in
vitro. Trên nhiều đối tượng cây trồng, phương pháp này đã tạo được hàng
loạt cá thể đơn bội trong một thời gian ngắn (chỉ một vài tháng). Chính vì
vậy, đã có nhiều chương trình tạo giống cây trồng ra đời trên cơ sở áp
dụng kỹ thuật đơn bội in vitro và đã thu được kết quả tốt.
Có hai trường hợp tạo cây đơn bội từ hạt phấn: hạt phấn tạo trực
tiếp cây đơn bội (thường gặp ở thuốc lá) hay hạt phấn tạo gián tiếp cây
đơn bội thông qua giai đoạn phát triển callus (ở lúa). Để tạo cây đơn bội
kép có thể sử dụng hai phương thức: cây đơn bội kép tạo từ cây đơn bội
được xử lý colchicine hay cây đơn bội kép tái sinh từ callus của cây đơn
bội (trường hợp này thường chỉ đạt hiệu suất khoảng 60 %).

II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất


173

1. Dụng cụ
- Ống nghiệm (1,5 cm × 20 cm)

- Giấy thấm vô trùng
- Giấy nhôm
- Lọ khử trùng mẫu vật nuôi cấy
- Forceps, kéo, dao mổ, kim nhọn
- Đĩa petri vô trùng
- Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette
2. Thiết bị
- Nồi khử trùng
- Tủ lạnh
- Laminar
- Tủ sấy
- Microwave
- Cân phân tích 10-4g
- Cân kỹ thuật 10-2g
- Máy cất nước 2 lần
- Kính hiển vi
3. Hóa chất
- Dung dịch stock môi trường Nt (Nt1, Nt2, Nt3, Nt4 và Nt5)
- Dung dịch HgCl2 0,1%
- Cồn 90%
- Agar
- Saccharose
- Nước cất vô trùng
- Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: IAA, BAP, KIN
và 2,4-D

III. Phương pháp tiến hành
1. Nguyên liệu thực vật

174

Sử dụng bao phấn của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) đế nuôi
cấy đơn bội.
2. Môi trường nuôi cấy
Bảng 4.1. Thành phần các môi trường nuôi cấy bao phấn thuốc lá
Thành phần môi trường
(1)

Tạo cây 1n
(2)

Tạo callus 1n
(3)

Tạo chồi 1n
(4)

Nitsch đầy đủ (Nt 1, Nt2,
Nt3, Nt4 và Nt5)

+

+

+

+

Saccharose (%)

2

2

2

2

Agar (%)

0,8

0,8

0,8

0,8

IAA (mg/L)

0,1

-

-

0,1

2,4-D (mg/L)

-

0,1-0,5

-

-

KIN (mg/L)

0,1

0,1

0,1-1

-

BAP (mg/L)

-

-

0,1-1

-

Tạo rễ 1n

(5)

Chú ý
Môi trường được chuẩn bị trong ống nghiệm (làm thạch nghiêng).

3. Nuôi cấy bao phấn
Nụ thuốc lá hái ở giai đoạn cánh hoa sắp ló ra khỏi lá đài (nụ dài
khoảng 10-15 mm) được khử trùng theo thứ tự: 2 phút trong cồn 70%, 5
phút trong dung dịch HgCl2 0,05% và rửa bằng nước cất vô trùng từ 4-5
lần. Trong điều kiện vô trùng, dùng forceps và dao mổ tách nụ lấy các bao
phấn cấy vào ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng đã chuẩn bị sẵn
(Bảng 4.1, cột 2). Mỗi ống nghiệm cấy 5-10 bao phấn và đặt ở nhiệt độ
25-27oC, chiếu sáng từ 10-12 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 20003000 lux.
Sau 6-8 tuần nuôi, vỏ bao phấn sẽ nứt ra và xuất hiện các cây thuốc
lá đơn bội, cấy chuyển những cây thuốc lá này sang những bình tam giác
loại 250 mL chứa 50 mL của cùng một loại môi trường để cây đơn bội
phát triển.