Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong phân hủy kỵ khí chất thải tại các lò giết mổ tập trung nhằm thu hồi khí sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------***------------

Chu Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN TRONG PHÂN HỦY KỴ
KHÍ CHẤT THẢI TẠI CÁC LÒ GIẾT MỔ TẬP TRUNG
NHẰM THU HỒI KHÍ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
------------***------------

Chu Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN TRONG PHÂN HỦY KỴ
KHÍ CHẤT THẢI TẠI CÁC LÒ GIẾT MỔ TẬP TRUNG
NHẰM THU HỒI KHÍ SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà
TS. Đỗ Tiến Anh

Hà Nội - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ,
chỉ bảo, động viên của thầy cô, bạn bè, sự động viên to lớn của gia đình và những
người thân.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS.
Bùi Thị Việt Hà, người đã trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ và hướng dẫn tôi tận tình
trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh môi
trường. Hơn nữa, cô đã động viên khích lệ giúp tôi, chỉ bảo cho tôi những kiến
thức, lời khuyên, kinh nghiệm quý báu trong học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Tiến Anh cùng các thành viên thực hiện
đề tài cấp nhà nước KC.08.31/11-15 "Nghiên cứu ứng dụng và phát triển mô hình
công nghệ tích hợp tiên tiến có tận thu và sử dụng năng lượng tái tạo để xử lý hiệu
quả, bền vững nguồn thải hỗn hợp rắn - lỏng từ các lò giết mổ tập trung" đã giúp
đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả
Thầy Cô và các cán bộ, thành viên trong bộ môn Vi sinh vật học, phòng sinh học
Nano và ứng dụng– KLEP, Khoa Sinh học, Khoa Môi trường và Phòng Sau đại
học- Đại học Khoa học Tự nhiên, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh họcĐHQGHN, Trung tâm kiểm định môi trường- Cục cảnh sát môi trường- Bộ công
an, đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn
này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những
người thân yêu đã luôn ở bên tôi, động viên và giúp đỡ tôi cả về mặt vật chất lẫn
tinh thần trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Hà nội, ngày 08 tháng 08 năm 2016
Tác giả

Chu Thanh Huyền


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 2
1.1. Tổng quan chất thải lò giết mổ ............................................................. 2
1.1.1. Nguồn thải ...................................................................................... 2
1.1.2. Nước thải lò giết mổ ....................................................................... 4
1.1.3. Chất thải rắn lò giết mổ .................................................................. 9
1.2. Các phương pháp xử lý chất thải lò giết mổ........................................ 12
1.2.1. Xử lý nước thải lò giết mổ ............................................................ 12
1.2.2. Xử lý chất thải rắn lò giết mổ ....................................................... 15
1.3. Lên men kỵ khí sinh biogas ................................................................ 18
1.4. Lên men kỵ khí sinh H2 ...................................................................... 19
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................... 24
2.1. Nguyên liệu và thiết bị ....................................................................... 24
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................. 24
2.1.2. Thiết bị ......................................................................................... 24
2.1.3. Các dụng cụ .................................................................................. 25
2.2. Phương pháp ...................................................................................... 25
2.2.1. Khảo sát các chỉ số ô nhiễm của một vài cơ sở giết mổ gia súc .... 25
2.2.2. Môi trường nuôi cấy ..................................................................... 26
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy .................................................................. 27
2.2.4. Định danh vi khuẩn dựa vào khóa định loại Bergey...................... 28
2.2.5. Định danh vi khuẩn dựa vào giải trình tự đoạn gen rRNA 16S ..... 31

2.2.6. Định danh vi khuẩn bằng khối phổ protein ................................... 33
2.2.7. Nghiên cứu hệ thống xử lý chất thải rắn lò giết mổ bể kỵ khí 50L 33
2.2.8. Phương pháp phân tích ................................................................. 34


PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 37
3.1. Khảo sát các chỉ số ô nhiễm của một số cơ sở giết mổ gia súc ............ 37
3.2. Phân lập các vi khuẩn lên men kỵ khí có khả năng tạo ra khí sinh học từ
các mẫu bùn và phân động vật................................................................... 40
3.2.1. Khả năng sinh khí của các chủng vi khuẩn ................................... 40
3.2.2. Đặc điểm hình thái tế bào ............................................................. 43
3.2.3. Định danh dựa vào khóa phân loại Bergey ................................... 45
3.2.4. Định danh loài bằng phân tích 16S rRNA ..................................... 45
3.2.5. Định danh loài bằng khối phổ Protein........................................... 49
3.3. Nghiên cứu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến quá trình lên
men kỵ khí ................................................................................................ 49
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến tổng lượng khí biogas sinh ra .................. 49
3.3.2. Ảnh hưởng của pH đến lượng khí H2 sinh ra ................................ 51
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh khí.... 53
3.4. Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và xử lý kỵ khí chất thải lò giết mổ ... 55
3.4.1.Tiền xử lý chất thải lò giết mổ: ...................................................... 56
3.4.2.Quá trình lên men kỵ khí ............................................................... 58
3.4.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung vi sinh vật lên sự tạo thành hydro.... 60
3.5. Ảnh hưởng của pH tới quá trình phân hủy kỵ khí bể 50L ................... 62
KẾT LUẬN ................................................................................................. 68
KIẾN NGHỊ................................................................................................ 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 70


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Đặc tính nước thải tại một số lò giết mổ trên thế giới ở một số
nghiên cứu ..................................................................................................... 5
Bảng 1.2: Đặc tính của nước thải giết mổ gia súc tại một số lò giết mổ tại
Việt Nam ....................................................................................................... 8
Bảng 3.1. Kết quả phân tích mẫu nước thải tại cơ sở giết mổ gia súc gia cầm thủ
công tại xã Vạn Phúc, Hà Nội ........................................................................ 37
Bảng 3.2: Sản lượng khí hydro trong các mẫu phân lập ................................ 41
Bảng 3.3: Sản lượng hydro từ các chủng phân lập ........................................ 43
Bảng 3.4: Tính chất sinh lý hóa sinh của các chủng đã phân lập từ phân bò
và bùn .......................................................................................................... 45
Bảng 3.5: Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử ....................... 47
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH đến tổng lượng khí sinh ra ............................. 50
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH đến thể tích khí H2 sinh ra .............................. 52
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh trưởng và sinh khí ..... 54
Bảng 3.9: Sự thay đổi của các chỉ số sinh học trong quá trình tiền xử lý ưa nhiệt,
hiếu khí ......................................................................................................... 56
Bảng 3.10: Sự thay đổi nồng độ các chất hữu cơ của bùn thải trước và sau quá
trình lên men kỵ khí ..................................................................................... 58
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nguồn vi sinh vật bổ sung lên sự tạo thành hydro .... 60
Bảng 3.12: Thông số ảnh hưởng đến tổng lượng khí sinh ra (pH 7- 7.5) ...... 63
Bảng 3.13: Thông số ảnh hưởng đến tổng lượng khí sinh ra (pH 6- 6.5) ...... 65


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Tủ nuôi vi sinh vật kỵ khí (Model: Labconco/ PreciseTM; Mỹ)...... 25
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong phân hủy kỵ khí chất thải
tại các lò giết mổ tập trung ........................................................................... 26
Hình 2.3: Phương pháp sục khí nitơ. ............................................................ 27
Hình 2.4:Mô hình xử lý chất kỵ khí xử lý chất thải rắn và bùn thải .............. 33
Hình 2.5: Mô hình lên men kỵ khí và hệ thống đo tổng lượng khí sinh ra bằng

phương pháp cột nước (Lettinga G., 1995) ................................................... 35
Hình 3.1: Hình thái tế bào của chủng BO1, BU1 .......................................... 44
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm nhân bản gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ
thuật PCR ..................................................................................................... 46
Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH đến tổng lượng khí sinh ra.............................. 51
Hình 3.4: Ảnh hưởng của pH đến thể tích khí H2 sinh ra .............................. 53
Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh khí .... 55
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn tổng lượng khí sinh ra ở khoảng pH 7- 7.5 ......... 64
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn tổng lượng khí sinh ra khi pH trong khoảng 6- 6.5 ...... 66


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ/cụm từ đầy đủ

Bp

Base pair

Btu

British Thermal Unit

C.bifermentans

Clostridium bifermentans

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

2’- deoxyribonucleotide 5’- triphosphate

EDTA

Ethylenediamintetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

GC

Gas chromatography

PCR

Polymerase chain reaction

rDNA

Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

COD

Chemical Oxygen Demand

BOD

Biochemical Oxygen Demand

TN

Total Nitrogen

TSS

Total Suspended Solids

TS

Total Solids

MPN

Most Probable Number

cs

Cộng sự


MỞ ĐẦU
Trên thế giới, để giải quyết các vấn đề khó khăn về nguồn nhiên liệu cạn
kiệt cũng như trái đất nóng lên mà một phần nguyên nhân là do quá trình đốt
cháy nhiên liệu hóa thạch, các nhà khoa học đã và đang tập trung nghiên cứu
tìm nguồn năng lượng mới, sạch và bền vững. Một trong những hướng khả thi

nhất là sản xuất biogas.
Biogas (khí sinh học) là sản phẩm khí được sinh ra khi chất thải hữu cơ
(thường là chất thải từ động vật, phụ phẩm nông nghiệp) bị lên men trong
điều kiện kỵ khí. Áp dụng công nghệ lên men kỵ khí trong thực tiễn phân hủy
vật chất hữu cơ có khả năng giúp giải quyết các vấn đề có tính chiến lược như
sản xuất và sử dụng năng lượng tái sinh, xử lý chất thải hữu cơ trong quá trình
phát triển đô thị và sản xuất công nghiệp, chăn nuôi.
Kinh tế càng phát triển thì các nhu cầu về ăn uống, đi lại của con người
ngày một cao hơn. Nhu cầu sử dụng các loại thịt gia súc gia cầm cũng ngày
một tăng đã kéo theo tình trạng ô nhiễm môi trường và các loại bệnh có liên
quan tới môi trường và vệ sinh thực phẩm cũng ngày càng tăng. Các lò mổ
hàng ngày đều thải ra một lượng lớn chất thải mà không qua xử lý chính,
lượng thực phẩm dư thừa không được sử dụng hết là những nguyên nhân gây
ra tình trạng ô nhiễm nguồn nước nói riêng và ô nhiễm môi trường nói chung.
Đề tài:“Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong phân hủy kỵ khí chất thải
tại các lò giết mổ tập trung nhằm thu hồi khí sinh học” nhằm tìm kiếm các
chủng vi khuẩn có khả năng phân giải các chất ô nhiễm như Bacillus,
Lactobacillus, Clostridium,… phù hợp với nguồn cơ chất từ lò giết mổ, xác lập
chế độ lên men kỵ khí tối ưu để tăng hiệu suất tạo khí sinh học, xây dựng mô
hình xử lý kỵ khí chất thải lò giết mổ tập trung ở quy mô phòng thí nghiệm.

1


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan chất thải lò giết mổ
1.1.1. Nguồn thải
Môi trường đang là một vấn đề thách thức đối với các quốc gia nói
chung, và với Việt Nam nói riêng. Sự phát triển của ngành lương thực, thực
phẩm nhằm đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của con người đang đồng

thời gây ra những vấn đề ô nhiễm ngày một tăng, đặc biệt là ngành giết mổ
gia súc gia cầm, có thể được gọi là một trong những ngành gây ra ô nhiễm cao
đối với môi trường.
Trên thế giới hiện nay, để cung ứng đủ lượng thịt cho nhu cầu tiêu dùng
của con người ngày một gia tăng đòi hỏi các cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm tại
các địa phương và các thành phố lớn trên thế giới phải hoạt động hết công
suất. Theo báo cáo hàng năm của OECD-FAO (2011), giá gia súc trong giai
đoạn 2011 – 2020 trung bình sẽ cao hơn 30% so với thập kỷ trước. Giá cao và
nhu cầu tăng lên đối với tất cả các loại thịt làm gia tăng nguồn cung trong
nước (OECD-FAO, 2012). Sản xuất thịt hàng năm dự kiến sẽ tăng trưởng
22% từ năm 2006 đến năm 2016 trên toàn thế giới. Cũng theo báo cáo của
Tổng cục thống kê Ireland (CSO, 2011), số xác động vật của gia súc giết lấy
thịt ở Ireland là 1600 nghìn đầu gia súc, 2421 nghìn đầu lợn, 2730 nghìn đầu
cừu trong năm 2009, và trong năm 2010 là 1717 nghìn đầu gia súc, 2657
nghìn đầu lợn, 2.383 nghìn đầu cừu. Kết quả là lượng chất thải từ các cơ sở
giết mổ này thải ra môi trường đang là một mối lo và cần phải được các cơ
quan, nhà chức trách có thẩm quyền quản lý nghiêm ngặt hơn nữa và quan
trọng nhất là phải tìm ra cách thức để có thể xử lý nguồn chất thải này để
giảm những tác động tiêu cực lên môi trường, tránh những ảnh hưởng xấu đến
sức khỏe của con người.
2


Ở Việt Nam, năng lực giết mổ gia súc, gia cầm này, trừ một vài nhà máy
chế biến thịt công nghiệp và được quy hoạch tổ chức khá hơn ở thành phố Hồ
Chí Minh, còn lại ở hầu hết các địa phương trong cả nước, đặc biệt là các tỉnh
thành phố ở phía Bắc, phần lớn gia súc lớn đều được giết mổ theo cách thức
giản đơn và tại chỗ, trong các lò giết mổ hình thành tự phát ngay trong cộng
đồng dân cư, hay thậm chí ngay tại gia đình chăn nuôi. Theo thống kê của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2014, hiện nay trong 53/64 tỉnh

thành trên toàn quốc mới có khoảng 851 cơ sở giết mổ đã được kiểm tra đánh
giá, ngoài ra còn hơn 28.285 cơ sở giết mổ nhỏ lẻ, trong đó ở 12 tỉnh trọng
điểm phía Bắc có khoảng 11485 điểm, trong đó chỉ có khoảng 59 cơ sở giết
mổ tập trung (chưa đến 1%). Điều này cho thấy, hiện trạng về năng lực giết
mổ gia súc, gia cầm ở Việt Nam hầu hết được thực hiện theo cách thức giản
đơn và tại chỗ, trong các lò giết mổ hình thành tự phát ngay trong cộng đồng
dân cư, hay thậm chí ngay tại gia đình chăn nuôi. Chỉ có một số ít nhà máy
chế biến thịt công nghiệp và được quy hoạch tổ chức với hệ thống xử lý nước
thải và chất thải theo tiêu chuẩn, tập trung chủ yếu ở các thành phố lớn như
Hà Nội, Hồ Chí Minh. Trong khi đó, các chất thải trong quá trình giết mổ gia
súc, gia cầm bao gồm nước thải và chất thải rắn. Các chất thải rắn phát sinh từ
các lò giết mổ thực chất là các thành phần không được sử dụng trong quá
trình giết mổ như: cặn, phân, các chất bẩn trong lòng ruột của các con gia súc
và các mảnh vụn từ lòng, mề, ruột, xương,... Các thành phần này chứa lượng
lớn các chất hữu cơ chưa phân hủy và rất nhiều các loại vi khuẩn, vi rút, nấm
có hại cho sức khỏe của con người, nếu không được xử lý sẽ gây ô nhiễm môi
trường và đe dọa nghiêm trọng tới sức khỏe của con người. Với đặc điểm của
hệ thống lò giết mổ nhỏ lẻ, tự phát và thiếu tập trung, lượng chất thải và nước
thải phát sinh từ các lò giết mổ thường không được xử lý mà đổ thẳng ra môi
trường, hoặc nếu có cũng xử lý chưa hiệu quả, mang tính đối phó.
3


Đứng trước thực trạng đó, yêu cầu thực tế đặt ra là cần phải tập trung và kế
hoạch hoá các khu vực lò giết mổ, để có thể xây dựng hệ thống xử lý nước thải
và chất thải tập trung, nhằm đảm bảo các yêu cầu về tiêu chuẩn môi trường.
1.1.2. Nước thải lò giết mổ
 Đặc tính nước thải các lò giết mổ trên thế giới
Hầu hết nước thải lò giết mổ được tạo ra trong sản xuất sản phẩm thịt
do các quá trình làm sạch: rửa thịt trước và sau khi giết mổ động vật và rửa

sàn nhà và các trang thiết bị. Nước thải từ lò giết mổ thường chứa một
lượng lớn protein, chất béo và chất hữu cơ lơ lửng (nghĩa là thịt, xương và
nội tạng). Đặc điểm của nước thải lò giết mổ phụ thuộc vào loại và số
lượng gia súc bị giết hàng ngày. Nói chung, nước thải lò giết mổ có hàm
lượng COD, BOD, TN, NH4+, và TSS cao (Cao và Mehrvar, 2011; Jia và
cs, 2012; Bustillo Lecompte và cs, 2014; Khamtib, 2014). Hàm lượng trung
bình COD, BOD, TN and TSS trong nước thải lò giết mổ có thể đạt các giá
trị lần lượt là 4221mg/l, 1209 mg/l, 427 mg/l và 1164 mg/l (BustilloLecompte, 2014).
Đặc tính của một số lò giết mổ theo các nghiên cứu trên thế giới được
thể hiện trong Bảng 1.1; trong đó, hàm lượng BOD và COD của nước thải
giết mổ là tương đối cao nằm vào khoảng 900-11000 mg/L đối với BOD, và
1820-27.500 mg/L đối với COD. Tổng nitơ và amoni thường dao động trong
khoảng 190-735mg/L đối với tổng nitơ và 0-221 mg/L đối với amoni. Việc xả
nước thải lò giết mổ có chứa chất gây ô nhiễm cường độ cao vào các nguồn
nước là một trong những vấn đề môi trường quan trọng của các cơ sở giết mổ
(Ủy ban Châu Âu, 2005).

4


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1.

Bùi Thanh Huyền, "Bức tranh năng lượng thế giới” Chuyên đề năng
lượng - VnGG, Chương 11.

2.

Nguyễn Lân Dũng và Bùi Thị Việt Hà (2009), “Sinh trưởng và phát triển

của vi sinh vật”, Vietscienses.

3.

Nguyễn Thu Hoài (2015), Nghiên cứu vi sinh vật sinh methan ứng dụng
cho sản xuất Biogas trong điều kiện môi trường nước lợ và nước mặn,
Luận án tiến sĩ sinh học, ĐHKHTN- ĐHQGHN.

4.

Hoàng Ngọc Huyền (2014), Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro sinh
học từ rác thải nông nghiệp nhờ chủng vi khuẩn ưa nhiệt Thermotoga
neapolitana DSM 4359, Luận văn thạc sĩ, ĐHQGHN.

5.

Nguyễn Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Yên, và cs (2013), “Tuyển chọn và
định danh một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro phân lập từ
phân gia súc tại Việt Nam”, Tạp chí sinh học. 35, T.79-87.

Tài liệu tiếng anh:
6.

Alalayah Walid M., et al. (2009), "Effect of environmental parameters
on hydrogen production using Clostridium saccharoperbutylacetonicum
N1-4 (ATCC 13564) ", American Journal of Environmental Sciences.
5(1), pp. 80-86.

7.

An D., Li Q. et al. (2014), “Characterization on hydrogen production
performance of a newly isolated Clostridium beijerinckii YA001 using
xylose”, International Journal of Hydrogen Energy, 39(35), pp.19928–
19936.

8.

Bailey K.L., Lazarovits L.G. (2003), “Suppressing soil-borne diseases
with residue management and organic amendments”, Soil Till Res,
72:169–180.
70


9.

Bayr S. et al. (2012), “Effect of additives on process stability of
mesophilic anaerobic monodigestion of pig slaughterhouse waste”,
Bioresource Technology, 120, pp.106–113.
10. Benoit L. et al. (1992), “Isolation of cellulolytic mesophilic clostridia
from a municipal solid waste digestor”, Microbial Ecology, 23(2),
pp.117–125.
11. Borowski S., Szopa J.S. (2007), “Experiences with the dual digestion of
municipal sewage sludge”, Bioresour Technol, 98: 1199– 1207.
12. Buitron German, Carjaval Carolina (2010), “Biohydrogen Production
from Tequila Vinasse in an Anaerobic Sequencing Batch Reactor: Effect

13.

14.

15.

16.

of Initial Substrate Concentration, Temperature, and Hydraulic
Retention Time”, Bioresource Technology, 101:9071 – 9077.
Cai M.L., Liu J.X., Wei Y.S. (2004), “Enhanced bio-hydrogen
production from sewage sludge with alkaline pretreatment”, Environ
Science Technol, 38: 3195– 3202.
Cailliez C. et al. (1992), “Characterization of 10 mesophilic cellulolytic
clostridia isolated from a municipal solid waste digestor”, Current
Microbiology, 25, pp.105–112.
Calusinska M., Happe T., Joris B., Wilmotte A. (2010), “The surprising
diversity of clostridial hydrogenases: a comparative genomic
perspective”, Microbial..156, pp. 1575-1588.
Cappelletti M. et al. (2014),Microbial BioEnergy: Hydrogen

Production.
17. Carol L. Wells and Tracy D. Wilkins (1996), “Chapter 18 Clostridia:
Sporeforming Anaerobic Bacilli”, Medical Microbiology, 4th edition.
18. Chang F.Y., Lin C.Y.(2006),“Calcium effect on fermentative hydrogen
production in an anaerobic up-flow sludge blanket system”,Water
Science and Technology, 54 (9), 105–112.
19. Choi J. & Ahn Y. (2014),“Characteristics of biohydrogen fermentation
from various substrates”, International Journal of Hydrogen Energy,
39(7), pp.3152–3159.
71


20. Dawoud B., Amer E. & Gross D. (2007),“Experimental investigation of

an adsorptive thermal energy storage”, International journal of energy
research, 31, pp.135–147.
21. Demain A.L., Newcomb M. & Wu J.H.D. (2005),“Cellulase, clostridia,
and ethanol”, Microbiology and molecular biology reviews : MMBR,
69(1), pp.124–54.
22. El-Bery H., Tawfik A. et al (2013), “Effect of thermal pre-treatment on
inoculum sludge to enhance bio-hydrogen production from alkali
hydrolysed rice straw in a mesophilic anaerobic baffled reactor”,
Environ Technol, 34 (13- 16).
23. Elsharnouby O. et al. (2013),“A critical literature review on biohydrogen
production by pure cultures”, International Journal of Hydrogen
Energy, 38(12), pp.4945–4966.
24. Fangkum A. & Reungsang A. (2011),“Biohydrogen production from
sugarcane bagasse hydrolysate by elephant dung: Effects of initial pH
and substrate concentration”, International Journal of Hydrogen Energy,
36(14), pp.8687–8696.
25. Gandía L.M., Arzamendi G. & Diéguez P.M. (2013),“Renewable
Hydrogen Technologies: Production, Purification, Storage, Applications
and Safety”, Renewable Hydrogen Technologies: Production,
Purification, Storage, Applications and Safety, pp.1–460.
26. Han S.K., Shin H.S. (2004), “Biohydrogen production by anaerobic
fermentation of food waste”, International Journal of Hydrogen Energy,
29: 569–77
27. Ho K.L. & Lee D.J. (2011),“Harvesting biohydrogen from cellobiose
from sulfide or nitrite-containing wastewaters using Clostridium sp.
R1”, Bioresource Technology, 102(18), pp.8547–8549.
28. Ibekwe A.M, Papiernik S.K. et al. (2001), “Microcosm enrichment of
1,3-dichloropropene-degrading soil microbial communities in a
compost-amended soil”, J Appl Microbiol, 91:668–676.
29. Kamalaskar L.B. et al. (2010),“High biohydrogen yielding Clostridium

72


sp. DMHC-10 isolated from sludge of distillery waste treatment plant”,
International Journal of Hydrogen Energy, 35(19), pp.10639–10644.
30. Kaye G., Weber P., Evans A., Venezia R. (1998), “Efficacy of Alkaline
Hydrolysis as an Alternative Method for Treatment and Disposal of
Infectious Animal Waste”, Contemp Top Lab Anim Sci,37:43–46.
31. Lars G. Ljungdahl, Michael W. Adams Larry L. Barton, James G. Ferr,
Michael K. Johnson (2003), Biochemistry and Physiology of Anaerobic
Bacteria, Springer; Softcover reprint of the original.
32. Lettinga G., Field J., Van Lier J., Zeeman G. (1997), “Advanced
anaerobic wastewater treatment in the near future”, Water Sci Technol,
35, pp.5-12.
33. Liu Y. (2010), “Green algae as a substrate for biogas productioncultivation and biogas po-tentials”, Linkoping University- Sweden.
34. Lu Jingquan, et al. (2008), "Improving anaerobic sewage sludge
digestion by implementation of a hyper-thermophilic prehydrolysis
step", Journal of Environmental Management. 88(4), pp. 881-889.
35. Lutoslawki Krzysztof, Ryznar-Luty A., et al. (2011), “Biodegradation of
beet molasses vinasse by a mixed culture of microorganisms: Effect of
aeration conditions and pH control”, Journal of Environmental Sciences,
23(11):1823–1830.
36. Maeda T., Sanchez-Torres V. & Wood T.K. (2012),“Hydrogen
production by recombinant Escherichia coli strains”, Microb Biotechnol,
5(2), pp.214–225.
37. Mamimin C. et al. (2015),“Two-stage thermophilic fermentation and
mesophilic methanogen process for biohythane production from palm oil
mill effluent”, International Journal of Hydrogen Energy, 40(19),
pp.6319–6328.
38. Maniatis K. (2003), "Pathways for the production of bio-hydrogen:

opportunities and challenges", Oil, Gas & Energy Law Journal (OGEL). 1(5).
39. Melorose J., Perroy R. & Careas S. (2015), Sustainable Energy Systems
73


and Applications.
40. Metcalf and Eddy (2003), “Wastewater Engineering: Treatment,
Disposal, and Reuse”, 4th ed., McGraw-Hill, Singapore.
41. NABC (2004), Carcass disposal: a comprehensive review. Report
written for the USDA Animal and Plant Health Inspection
Service. National Agricultural Biosecurity Centre; Kansas
University, USA.

State

42. Nasir I. M., Ghazi T.I.M., Omar R. (2012), “Production of biogas from
solid organic wastes through anaerobic digestion: a review”, Appl
Microbiol Biotechnol, 95, pp. 321- 329.
43. Noparat P., Prasertsan P. & O-Thong S. (2011), “Isolation and
characterization of high hydrogen-producing strain Clostridium
beijerinckii PS-3 from fermented oil palm sap”, International Journal of
Hydrogen Energy, 36(21), pp.14086–14092.
44. Oh You-Kwan, et al. (2003), “Isolation of hydrogen-producing bacteria
from granular sludge of an upflow anaerobic sludge blanket reactor”,
Biotechnology and Bioprocess Engineering. 8(1), pp. 54-57.
45. Pan C.M., et al (2008), “Fermentative hydrogen production by the newly
isolated Clostridium beijerinckii Fanp3”, International Journal of
Hydrogen Energy, 33(20):5383-5391.
46. Pattra S., Sangyoka S., Boonmee M., Reungsang A. (2008), “Biohydrogen production from the fermentation of sugarcane bagasse
hydrolysate by Clostridium butyricum”, International Journal Hydrogen

Energy, 33: 5256– 65.
47. Patrik R.Jones (2008), “Improving fermentative biomass-derived H2production by engineering microbial metabolism”, International journal
of hydrogen energy. Vol 33, pp. 5122–5130.
48. Reungsang A., Sittijunda S. & Angelidaki I. (2013),“Simultaneous
production of hydrogen and ethanol from waste glycerol by Enterobacter
aerogenes KKU-S1”, International Journal of Hydrogen Energy, 38(4),
pp.1813–1825.
74


49. Salminen E., Rintala J. et al. (2001), “Anaerobically digested solid
poultry slaughterhouse wastes to be used as fertiliser on agricultural
soil”, Bioresour Technol, 78, 81–88.
50. Sarma S.J. et al. (2013), “Evaluation of different supplementary
nutrients for enhanced biohydrogen production by Enterobacter
aerogenes NRRL B 407 using waste derived crude glycerol”,
International Journal of Hydrogen Energy, 38(5), pp.2191–2198.
51. Seelert, T., Ghosh, D., & Yargeau, V. (2015), “Improving biohydrogen
production using Clostridium beijerinckii immobilized with magnetite
nanoparticles”, Applied Microbiology and Biotechnology. 99(9), pp.
52.

53.
54.

55.

4107–4116.
Shinsuke Sakai, Tatsuo Yagishita (2007), “Microbial Production of
Hydrogen and Ethanol From Glycerol-Containing Wastes Discharged

From a Biodiesel Fuel Production Plant in a Bioelectrochemical Reactor
With Thionine”, Biotechnology and Bioengineering. 98(2), pp. 340-348.
Speece R.E. (1996), “Anaerobic Technology for Industrial
Wastewaters”, Archae Press, USA, p.4.
Sureewan Sittijunda, Alissara Reungsang, Sompong O-thong (2010),
“Biohydrogen production from dual digestion pretreatment of poultry
slaughterhouse sludge by anaerobic self-fermentation”, International
Journal of Hydrogen Energy, 35: 13427–13434.
Tanisho S., Suzuki Y. and Wakao N. (1987), "Fermentative hydrogen

evolution by Enterobacter aerogenes strain E. 82005", International
journal of hydrogen energy. 12(9), pp. 623-627.
56. Tenca A., et al. (2011),“Biohydrogen from thermophilic co-fermentation
of swine manure with fruit and vegetable waste: Maximizing stable
production without pH control”, Bioresource Technology, 102(18),
pp.8582–8588.
57. Tien Anh Ngo, Ha Thi Viet Bui (2011), “Study on biohydrogen
production from various substrates by Thermotoga neapolitana DSM
4359”, VNU, J. Scen Nat Sci & Tech, 27 (2S), 292-296.
75


58. Wang C.C., et al. (2003), "Producing hydrogen from wastewater sludge by
Clostridium bifermentans", Journal of Biotechnology. 102(1), pp. 83-92.
59. Wong Yen Ming, et al. (2014), “Draft genome sequence of C.
bifermentans strain WYM, a promising biohydrogen producer isolated
from landfill leachate sludge”, Genome announcements. 2(2), pp.77-14.
60. Zhu H.G., Beland M. ( 2006), “Evaluation of alternative methods of
preparing hydrogen producing seeds from digested wastewater sludge”,
International Journal of Hydrogen Energy, 31: 1980-8.

76