Hoàn thiện quá trình lên men kombucha từ trà phú thọ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
Khoa Sinh – KTNN

----------

NGUYỄN THỊ CHUNG

HOÀN THIỆN QUÁ TRÌNH LÊN MEN
KOMBUCHA TỪ TRÀ PHÚ THỌ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên nghành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học

TS. Phương Phú Công
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và tiến hành thực hiện đề tài: “Hoàn thiện
quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ”, em đã nhận được sự hướng
dẫn, giúp đỡ tận tình, quý báu của các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới:
TS. Phương Phú Công và PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã trực tiếp
hướng dẫn, dạy bảo, động viên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo
mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện đề tài tốt nghiệp này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ

môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học sư phạm Hà
Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân,
những người luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài.

Hà Nội, tháng

năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Chung


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây
là kết quả của riêng em. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều
được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép
hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dưới sự
hướng dẫn của TS. Phương Phú Công và PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác,
em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Chung

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 3
5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 3
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 3
6.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................. 3
6.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................. 3
7. Đóng góp của đề tài ................................................................................... 3
NỘI DUNG ............................................................................................. 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.......................................................................... 4
1.1. Sản phẩm kombucha ............................................................................ 4
1.1.1. Sơ lược về nguồn gốc và sản phẩm kombucha ............................. 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ........................................................................... 5
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men kombucha ........................ 6
1.1.3.1. Vi khuẩn acetic ........................................................................ 6
1.1.3.2. Nấm men.................................................................................. 7
1.1.3.3. Vi khuẩn lactic ......................................................................... 9
1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha ......................... 9
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của trà kombucha ................ 12
1.1.5.1. Thành phần hóa học của trà kombucha ................................. 12
1.1.5.2. Công dụng của kombucha ..................................................... 12
1.1.5.3. Một số lưu ý khi sử dụng trà ................................................. 13
1.2. Nguồn nguyên liệu trà Phú Thọ ............................................................ 14
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................... 14
1.3.1. Trên thế giới................................................................................. 14
1.3.2. Ở Việt Nam .................................................................................. 16

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 18


2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................. 18
2.1.1. Vi sinh vật .................................................................................... 18
2.1.2. Thiết bị và hóa chất...................................................................... 18
2.1.2.1. Thiết bị................................................................................... 18
2.1.2.2. Hóa chất ................................................................................. 18
2.1.3. Môi trường ................................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 19
2.2.1. Phương pháp vi sinh .................................................................... 19
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn và nấm men theo phương
pháp Vinogradski................................................................................ 19
2.2.1.2. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản .................................. 20
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống ........................................................... 21
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giống ................................................. 22
2.2.1.5. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men ......... 22
2.2.2. Phương pháp hóa sinh.................................................................. 22
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase ................................................... 22
2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic................................. 23
2.2.2.3. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose .................................. 23
2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn
độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị .................... 23
2.2.2.5. Xác định đường sót................................................................ 23
2.2.2.6. Phương pháp kết lắng ............................................................ 24
2.2.2.7. Xác định hàm lượng vitamin C ............................................. 24
2.2.3. Phương pháp cảm quan................................................................ 25
2.2.4. Phương pháp toán học ................................................................. 27
CHƯƠNG 3 ................................................................................................. 28
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................... 28

3.1. Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men lên men kombucha từ trà Phú Thọ
...................................................................................................................... 28
3.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter lên men kombucha từ trà
Phú Thọ .................................................................................................. 28
3.1.2. Phân lập chủng nấm men lên men kombucha từ trà Phú Thọ .... 30
3.1.2.1. Phân lập ................................................................................. 30
3.1.2.2. Nhuộm đơn để quan sát hình dạng tế bào ............................. 30


3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha
từ trà Phú Thọ ............................................................................................... 31
3.2.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha
................................................................................................................ 31
3.2.1.1. Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi
chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn........................................ 31
3.2.1.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha được lên men từ
4 chủng vi khuẩn .................................................................................. 32
3.2.2. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men
kombucha ............................................................................................... 32
3.2.2.1. Hoạt lực lên men.................................................................... 32
3.2.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha được lên men từ 7 chủng
nấm men .............................................................................................. 33
3.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A3
và chủng nấm men Saccharomyces M4 ....................................................... 34
3.3.1. Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A3 ........ 34
3.3.2. Động thái sinh trưởng của chủng nấm men M4 ........................... 35
3.4. Xác định nguồn cacbon thích hợp lên men kombucha từ trà
Phú
Thọ .............................................................................................................. .37
3.5. Tìm một số điều kiện thích hợp cho quá trình lên men kombucha

từ trà Phú Thọ............................................................................................... 40
3.5.1. Hàm lượng giống bổ sung ........................................................... 41
3.5.2. Nhiệt độ lên men.......................................................................... 43
3.5.3. pH ban đầu ................................................................................... 45
3.5.4. Xác định thời gian lên men và thu mẫu sản phẩm kombucha
từ trà Phú Thọ ........................................................................................ 47
3.6. Hoàn thiện quy trình lên men và bảo quản sản phẩm kombucha từ trà
Phú Thọ quy mô phòng thí nghiệm.............................................................. 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 54
1. Kết luận .................................................................................................... 54
2. Kiến nghị .................................................................................................. 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 55


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học trà kombucha ............................................... 12
Bảng 2.1. Công thức các loại môi trường ..................................................... 19
Bảng 2.2. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm ..................... 25
Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu ............................................... 26
Bảng 2.4. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha .............. 26
Bảng 3.1. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha
từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter .................................................. 31
Bảng 3.2. Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng vi khuẩn
Acetobacter ................................................................................... 32
Bảng 3.3. Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 7 chủng nấm men
....................................................................................................... 33
Bảng 3.4. Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A3 ......... 34
Bảng 3.5. Động thái sinh trưởng của chủng nấm men M4 .............................. 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sản phẩm kombucha ................................................................... 5
Hình 1.2. “Con nấm” (SCOBY).................................................................. 6
Hình 1.3. Sơ đồ phân giải đường thành rượu nhờ nấm men ....................... 10
Hình 3.1. Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn A1 (x1000 lần) .................. 28
Hình 3.2. Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn A3 (x1000 lần) .................. 28
Hình 3.3. Hình thái tế bào của chủng nấm men M1 (x1000 lần)................. 30
Hình 3.4. Hình thái tế bào của chủng nấm men M4 (x1000 lần) ................ 30
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn lượng CO2 thoát ra ........................................... 33
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng
Acetobacter A3 ............................................................................ 35
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng
nấm men M4 ................................................................................ 36
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol
ở các pH khác nhau ..................................................................... 37
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót các
mức đường bổ sung khác nhau ................................................... 38
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm theo
mức đường bổ sung khác nhau .................................................. 38
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol
ở các hàm lượng giống bổ sung khác nhau ............................... 41
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót
ở các hàm lượng giống bổ sung khác nhau .............................. 42
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm ở các
hàm lượng giống bổ sung khác nhau ........................................ 42
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol,

vitamin C ở các nhiệt độ khác nhau .......................................... 44
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót ở các
nhiệt độ khác nhau ................................................................... 44
Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm ở các nhiệt độ
khác nhau ................................................................................. 45
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên acid tổng số, ethanol, vitamin C
ở các nhiệt độ khác nhau ........................................................... 46
Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót ở các pH
khác nhau .................................................................................. 46
Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm ở các pH
khác nhau ................................................................................. 47
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH acid tổng số, ethanol ở
thời gian lên men khác nhau .................................................... 48
Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót ở các
thời gian khác nhau .................................................................. 48
Hình 3.22. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm ở các
thời gian lên men khác nhau ..................................................... 49


BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

1. ATP

Adenozin triphotphat

2. STT

Số thứ tự

3. SCOBY

Symbiotic colony of Bacteria and Yeast

4. NADP

Nicotiamide adenine

5. Nxb

Nhà xuất bản

6. TCVN

Tiêu chuẩn Việt nam

7. MT

Môi trường

8. SLTB

Số lượng tế bào


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trà " thủy sâm", người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm
trường sinh), người Nhật gọi nó là kombucha, người Trung Quốc gọi là thủy
hoài sâm, Nga gọi là nấm trà. Đây là một loại men (giống như men giấm),
được nuôi trong dung dịch nước trà đường. Lọc nước (trà giấm) để uống. Do

dễ uống nên được dùng như 1 loại nước giải khát. Đây là một cấu trúc có
dạng như thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn. Ở Nhật
Bản, Nga, Trung Quốc và nhiều nước Đông Âu, Kombucha được sử dụng phổ
biến.
Đã có rất nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng có lợi đối
với sức khỏe con người từ kombucha. Vi khuẩn và nấm men trong trà
kombucha thể hiện mối quan hệ cộng sinh rất chặt chẽ, có thể ngăn chặn sự
phát triển của nhiều vi sinh vật tạp nhiễm. Trong quá trình lên men, nấm men
phân giải đường sucrose thành fructose và glucose, sinh khí CO2 và ethanol.
Một phần lượng ethanol sinh ra sẽ được oxi hóa bởi vi khuẩn acid acetic tạo
sản phẩm chính là acid acetic. Các sản phẩm phụ khác được hình thành, bao
gồm acid gluconic, acid lactic, các loại vitamin, phối hợp với các hợp chất
thơm như aldehyde, amino acid, cùng với các poly phenol có trong trà tạo nên
hương vị rất đặc biệt của trà kombucha. Ngoài ra trong quá trình lên men một
lượng kháng sinh nhỏ cũng được tổng hợp, kết hợp với các thành phần khác
tạo nên nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe người dùng.
Ở Việt Nam trà là loại đồ uống khá gần gũi và phổ biến với người dân,
tuy nhiên đối với các dòng sản phẩm lên men từ trà thì còn khá mới mẻ đối
với người tiêu dùng. Mặc dù nước ta có tiềm năng rất lớn về nguồn nguyên

1


liệu và thị trường tiêu thụ. Việc lên men trà kombucha trước đây mới chỉ
manh nha xuất hiện ở một số hộ gia đình với qui mô nhỏ lẻ, thủ công. Bên
cạnh đó các cơ sở sản xuất lại chưa đưa ra được những minh chứng khoa học
cho sản phẩm của mình làm cho sản phẩm kombucha rất khó cạnh tranh trên
thị trường.
Khác với các sản phẩm lên men thông thường, kombucha là sản phẩm
tổng hợp của nhiều quá trình lên men. Chất lượng và thành phần của

kombucha cũng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Trong đó lựa chọn được
chủng giống và nguồn nguyên liệu trà là yếu tố đầu tiên cho quá trình sản xuất
kombucha. Trong vài năm trở lại đây tại Việt Nam đã có những nghiên cứu
lên men kombucha từ các loại trà khác nhau như trà Thái Nguyên, trà Tuyên
Quang, San Tuyết Hà Giang... Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu kombucha từ
trà Phú Thọ còn hạn chế. Vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện
quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ”.
2. Mục tiêu của đề tài
Hoàn thiện quy trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ tạo sản phẩm
trà đạt chất lượng tốt.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà
Phú Thọ.
3.2. Xác định hàm lượng đường sucrose thích hợp cho quá trình lên men
kombucha từ trà Phú Thọ.
3.3. Tìm một số điều kiện thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà
Phú Thọ.
3.4. Hoàn thiện qui trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ quy mô phòng thí
nghiệm.

2


4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú
Thọ.
5. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp vi sinh: Phương pháp phân lập vi khuẩn, nấm men và quan
sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; phương pháp đếm số lượng tế
bào vi sinh vật; phương pháp bảo quản chủng giống; Phương pháp xác định hoạt

lực lên men của nấm men….
Phương pháp hóa sinh: Phát hiện hoạt tính catalase; phát hiện khả năng
oxy hoá acid acetic; phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng
chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị….
Phương pháp toán học
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học
Hoàn thiện quy trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ quy mô phòng
thí nghiệm.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng trà Phú Thọ lên men kombucha tạo ra sản phẩm trà mới, thơm
ngon, bổ, rẻ và góp phần đa dạng hóa đồ uống trên thị trường.
7. Đóng góp của đề tài
Đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn Acetobacter A3 và chủng nấm men
Saccharomyces M4 có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Đã xác
định được nhiệt độ: 300C, pH: 4, hàm lượng giống bổ sung ban đầu : 10%,
hàm lượng đường sucrose: 100g/l là điều kiện thích hợp cho quá trình lên men
kombucha từ trà Phú Thọ; Hoàn thiện quy trình lên men và bảo quản sản
phẩm trà kombucha quy mô phòng thí nghiệm.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Sản phẩm kombucha
1.1.1. Sơ lược về nguồn gốc và sản phẩm kombucha
Trà kombucha là một sản phẩm được bắt nguồn từ phương Đông cũng
có thể là từ Trung Quốc cách đây khoảng 2000 năm. Loại nước uống len men

này biết đến đầu tiên ở Trung Quốc từ 221 trước Công Nguyên tên gọi là thủy
hoài sâm và được xem như một loại thần dược.
Trà kombucha đã trở nên phổ biến ở nhiều nước Đông Âu, Nga, Nhật
Bản trong suốt nhiều thập kỉ qua. Qui trình lên men kombucha được biết đến
ở Nga và Ukraine vào cuối những năm 1800 và trở nên phổ biến vào đầu năm
1900. Hệ vi sinh vật trong kombucha chỉ biết đến đó là một màng nấm (tea
mushroom), và tên gọi của loại đồ uống này là kvass trà. Đối với các gia đình
người Nga từ ngày đó đến nay trà kombucha được xem như một loại nước
uống phổ biến và dùng để chữa bệnh. Tại đất nước Nhật Bản, trà kombucha
được biết đến vào những năm 415 sau Công Nguyên. Một bác sĩ người Đại
Hàn có tên là Kombu đã sử dụng sản phẩm lên men trà để chữa bệnh và cái
tên kombucha bắt nguồn từ đó, đó là sự kết hợp giữa tên của ông vớí
“cha”(trà). Sau đó kombucha phổ biến dần dần đến Phần Lan, Đức, Đan
Mạch. Nhưng nó bị lãng quên trong suốt chiến tranh thế giới thứ 2. Sau chiến
tranh thế giới thứ 2, nó được bác sĩ Rudolph Skelnar phục hồi lại tại Đức khi
ông sử dụng nó để thử nghiệm trong điều trị cho bệnh nhân ung thư, rối loạn
chức năng, cao huyết áp và đái tháo đường.
Từ năm 1852 kombucha mặc dù được sử dụng khá phổ biến nhưng
những công trình nghiên cứu trên thế giới phần lớn tập trung đến việc xác
định thành phần vi sinh vật, thành phần hóa học và phương pháp lên men.
4


nhưng việc nghiên cứu tác dụng, dược tính của trà kombucha đối với sức
khỏe con người vẫn còn rất hạn chế. Trong những năm gần đây các nhà khoa
học trên thế giới đang đi theo hướng nghiên cứu, chứng minh tác dụng có lợi
đối với sức khỏe con người khi sử dụng kombucha. Sản phẩm kombucha đã
được chứng minh chứa rất nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe người sử dụng
như: các acid hữu cơ, các vitmin nhóm B, vitamin C và các acid amin tự do.
Các công trình nghiên cứu đã được thực nghiệm trên chuột và các dòng tế bào

ở người hay thông qua các cuộc điều tra, khảo sát về tác dụng có lợi của
kombucha đã được công bố.

Hình 1.1. Sản phẩm kombucha
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo
Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men. Hệ vi
sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter
như: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter Ketogenum…
và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus,
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có
thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium
gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là
Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacter
5


xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh
với thuốc nhuộm Iod và H2SO4. Nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp,
thường được gọi là “con nấm” hay SCOBY. Kombucha sinh trưởng tốt trong
môi trường nước trà đường, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà
đường. Trong quá trình lên men, kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên
bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai
(thường gọi là “nấm con”), tách biệt với lớp màng ban đầu ( “nấm mẹ”).

Hình 1.2. “Con nấm” (SCOBY)
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men kombucha
1.1.3.1. Vi khuẩn acetic
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng
rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất,
nước, lương thực thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài

thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có
ý nghĩa kinh tế.
Đặc điểm chung của chủng Acetobacter.
Dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường
nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái

6


khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. Kích thước thay đổi tùy loài (0.3-0.6
x 1.0-8.0µm). Có thể di động, hoặc không di động. Không sinh nha bào tử.
Hiếu khí bắt buộc. Chịu được độ acid cao. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng
đồng hóa nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được
tinh bột. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi. Có khả năng tạo
thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại:
Acetobacter xylinum: tạo thành váng cenllulose khá dày và chắc.
Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc.
Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo.
Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã.
Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành
váng không chắc chắn.
Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton.
Một số đòi hỏi có acid amin nhất định như acid pntothenic và các chất khoáng
K, Mg, Ca, Fe, P, S…ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Ngoài
khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng
hợp vitamin B1, vitamin B2, oxy hóa sorbit thành đường sorbose (dùng trong
công nghiệp sản xuất vitamin C)…
1.1.3.2. Nấm men
* Hình thái và cấu tạo
Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…,

thường có kích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước
trung bình: chiều dài: 9 – 10 m, chiều rộng: 2 – 7 m. Hình dạng và kích thước
tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác
nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào
nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần
cơ bản sau:
7


Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau. Chủ yếu là:
glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin,
volutin,…Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein,
phospholipit enzyme permeraza…Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ
yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ
quan trong đó. Nhân tế bào. Những bào quan khác: không bào, ty lạp thế,
riboxom,…[5].
* Sự sinh sản của nấm men.
Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy
chồi; Sinh sản bằng cách phân đôi; Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào
tử: Tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính.
* Phân loại nấm men
Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi
imporfecti)
Lớp nấm men thật (Ascomyces): Phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces.
Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) bao gồm giống: Crytococus
(toscula, tornlopsis), Mycoderma, Eandida, Geotrichum, Rhodotorula.
* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon,
nito, phospho, kali, magie,…

Dinh dưỡng Cacbon: Nguồn Cacbon cung cấp là các loại đường khác
nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…Dinh dưỡng oxy, hydro: được
cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch. Dinh dưỡng
Nitơ: Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể
phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có
thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin,
8


pepton, amid, urê. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…Các
vitamin và chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống
của nấm men. Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của
nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo
ra liên kết có năng lượng lớn. Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số
acid amin, albumin, vitamin và enzyme. Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng
trung gian của sự lên men. Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô
hấp và các quá trình khác. Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự
phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi
phosphorin hóa của acid pyruvic. Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê.
1.1.3.3. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực
khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó
cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu
đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá
trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 ÷ 6, khi pH nhỏ
hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên
men từ 15 ÷ 500C. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác
nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn.

1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha
Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá
trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:
* Lên men ethanol
Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men,
chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2. Quá trình lên men
9


rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự có mặt
của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển đường
thành rượu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử
dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình
trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2). Sau khi được vận
chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình
đường phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic sẽ được chuyển
hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone phosphat là một
sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển
hoá thành glyxerol. Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với
hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra
sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ
yếu của quá trình lên men.

Hình 1.3. Sơ đồ phân giải đường thành rượu nhờ nấm men
Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH
acid:
C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP
Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế
bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men
trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men

thải vào môi trường lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải
vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những
10


hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4
nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá
trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990).
Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình
lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ
chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, acetic, lactic...
* Lên men acetic:
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới
tác dụng của vi khuẩn.
C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O
CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde)
CH3CH(OH)2 + O2

→ CH3COOH + H2O

* Lên men lactic:
Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP
được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại
trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh
vật. Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải
vào môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi
trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những
biến đổi hóa lý khác. Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid
lactic nhờ vi sinh vật.
Phương trình phản ứng:

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + 94kcal
Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men
đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men
còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác. Chúng là sản phẩm trung
gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men.
11


Phương trình tổng quát:
C6H12O6

CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + COOH(CH2)2COOH + CO2

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh
vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid
lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%,
ethanol chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%.
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của trà Kombucha
1.1.5.1. Thành phần hóa học của trà Kombucha
Theo nghiên cứu của tổ chức The American FDA and CDC tỷ lệ các
chất hóa học có trong trà kombucha như sau:
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của trà kombucha
Thành phần

Giá trị

Đơn vị

Acetic Acid

2,36

g/l

Glyconic Acid

0,129

g/l

Formic Acid

0,109

g/l

Oxalic Acid

0,01

g/l

Caffeine

0,065

g/l

Vitamin B1

0,74

g/l

Vitamin B6

0,52

g/l

Vitamin B12

0,84

g/l

Vitamin C

1,51

g/l

pH

3,2

1.1.5.2. Công dụng của Kombucha
Hội nghị khoa học quốc tế tổ chức tại Nhật Bản năm 1997 đánh giá
thuỷ sâm có 3 chất cơ bản mà nếu không có các chất ấy thì con người không
thể hình thành ra được và rất quan trọng trong việc chống lão hoá.

Theo giáo sư, TS, bác sĩ Paupell ở Nhật thì thuỷ sâm Kombucha có thể
trị dứt/hoặc giảm bớt các bệnh như đái tháo đường hoặc tiểu đường (Thủy
sâm điều hoà được lượng đường trong cơ thể đối với những người bị bệnh
tiểu đường); trị bệnh cao huyết áp. Đối với những người cao tuổi, giảm
12


cholestorol trong máu, ngăn ngừa xơ cứng động mạch, phù thủng; bệnh tái đỏ,
nổi mụn vòng quanh bụng; chống lão hoá, giảm nếp nhăn trên trán, mặt; chống
ung thư, giảm bớt sự nhạy cảm với hoá chất, men gan cao đối với bệnh nhân
điều trị xạ trị ung thư,các bệnh về thận; làm sáng mắt, trị bệnh mắt kéo mây
(mắt có cảm giác có sợi tơ trong mắt), chữa mắt có vấng nâu xám làm mờ mắt
sưng húp; làm cơ bắp rắn chắc hơn; chữa khỏi bệnh chai mạch máu do sự chậm
tiêu hoá các chất độc khi ăn uống; mỏi nhức gân cốt, xuyên, lác, ung nhọt, lở
loét; sung sức về sinh lý, cơ thể cường tráng; chữa các bệnh trong đường đông
mạch máu; chữa chân tay đổ mồ hôi, đau lưng và các khớp xương; đặc trị bệnh
mất ngủ (hay bị tỉnh giấc về đêm, đảm bảo dùng sẽ khỏi hoàn toàn) giúp ăn
ngon miệng hơn; trị sạm mặt, đau gan, đau bao tử; đăc trị bệnh viêm đường ruột,
các bệnh mật, tiêu chảy (các bệnh về đường ruột như hay ăn thức ăn lạ bị đi
ngoài,viêm ruột,hay bị đi ngoai ko rõ nguyên nhân); trị táo bón làm cho nhuận
tràng; trị chóng mặt do thiếu máu lên lão; trị bệnh trĩ; làm tóc bạc trở lên đen
hơn,tóc mọc dày hơn; trị gan nhiễm mỡ; trị bệnh máu nhiễm mỡ,máu nhiễm
mỡ, có tác dụng làm tan mỡ trong máu,gan,thanh lọc cơ thể; giải độc, trị men
gan cao,giải độc bị nhiễm thuỷ ngân,tăng cường sự hoạt động của gan và túi
mật; trị bệnh về thận; trị bênh thấp khớp; trị bệnh đau cơ bắp, vai, cổ; trị căng
thẳng thần kinh, điều hoà thần kinh; làm cân đối với những bệnh nhân béo phì,
những người phì mập (nấm có tác dụng đào thải, làm giảm cân, giảm từ 2 đến 4
kg và làm săn chắc cơ thể) [25].
1.1.5.3. Một số lưu ý khi sử dụng trà
Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thư do xạ trị hoặc hóa

trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc. Do trà chứa quá nhiều acid
lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt và
viêm xoang; trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng
và quan trọng cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ
13


dưới 2 tuổi uống; phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn
trong nước trà, không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng
cho trẻ sơ sinh; người tiểu đường chỉ nên dùng trà đang lên men vì hầu hết
lượng đường bị biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đường (dưới 50
g/l) thì khó xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha vì vậy người tiểu
đường cũng không nên uống nhiều. Men trà kombucha có thể bị hỏng và mất
hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách [24].
1.2. Nguồn nguyên liệu trà Phú Thọ
Với các thành phần hóa học của lá chè tại Phú Thọ đã làm cho các sản
phẩm chế biến từ chè Phú Thọ có hương vị đặc biệt khác hẳn cây chè ở những
vùng đất khác. Chè ngọt mát, thơm, hàm lượng tanin cao.
Đối với chè xanh: Hình dáng màu xanh tự nhiên, cánh chè dài, xoăn
đều non, màu nước xanh và trong, hương thơm mạnh tự nhên, thoảng cốm.
Đối với chè đen: Hình xoăn, tương đối đều, đen tự nhiên, màu nước đỏ
nâu sáng, rõ viền vàng, vị đậm, dịu, có hậu ngọt, chè có vị ngọt, tính mát.
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1. Trên thế giới
Trước năm 1990 những nghiên cứu về kombucha còn hạn chế, chỉ bước
đầu nghiên cứu về khu hệ vi sinh vật. Đến năm 1995 trong một cuốn sách
“Kombucha: Healthy Beverage and Natural Remedy from the Far East” tác
giả Gunther W. Frank , đã cung cấp thông tin cơ bản hữu ích, cách thức sử
dụng và những thắc mắc cơ bản về kombucha. Theo những nghiên cứu của
Reiss (1994) đã kết luận về các giá trị chữa bệnh và các hướng ứng dụng

trong sản xuất của kombucha như: hiệu lực trong điều trị các bệnh chuyển
hóa, hỗ trợ tiêu hóa ứng dụng sản xuất enzyme và vitamin nhóm B. Năm
2000 tác giả Chen C và Liu B.Y [17] đã đưa ra kết luận về sự biến thiên hàm
lượng các chất trong quá trình lên men: hàm lượng đường sucrose giảm tuyến
14


tính theo thời gian, trong khi đó hàm lượng ethanol tăng lên, nhưng có dấu
hiệu chậm lại, hàm lượng acid acetic tăng lên đáng kể và tăng chậm sau ngày
thứ 7 của quá trình lên men làm pH dịch lên men giảm đáng kể. Tác giả
Dufresne và Farm Worth (2000) trong nghiên cứu của mình đã cho thấy
những tác dụng có lợi của kombucha như tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa
ung thư. Vijayaraghavan R & cs (2000), đã tiến hành các liệu pháp thử
nghiệm trên chuột sau quá trình sử dụng kombucha sau 90 ngày đã kết luận
rằng kombucha là đồ uống có nhiều lợi ích cho sức khỏe và là liệu pháp thay
thế. Cũng trên đối tượng trên chuột tác giả Dipti. P & cs (2003) đã đưa ra kết
quả cho sự chống ôxy hóa, giảm GSH và tăng cường miễn dịch. Cavusoglu
K., Gluer P. (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên
nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của
con người trong ống nghiệm. Dutta D., Gachhui R. (2006) [18] đã phân lập vi
khuẩn Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov. cố định đạm từ trà kombucha.
Dutta D., Gachhui R. (2007) đã phân lập từ trà kombucha vi khuẩn cố định
đạm và cellulose là Gluconacetobacter kombucha sp.nov. J Reiss, (1994) đã
tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường khác nhau lên quá trình trao đổi chất
của nấm trà .Jayabalan R., Malini K., Sathishkumar M., Swaminathan K.,Yun
S.-E. (2010) tìm hiểu đặc điểm sinh hóa của nấm trà .K.H. Steinkraus, K.B.
Shapiro, J.H. Hotchkiss, R.P. Mortlock,(1996) viết về hoạt động kháng sinh
của trà nấm kombucha .Nguyen Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley,
Michael J.; Dykes, Gary A. (2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng
Gluconacetobacter xylinus phân lập từ kombucha .Petrushevska-Tozi L.,

Bauer-petrovska B. (2000) đã xác định được hàm lượng vitamin hòa tan và
khoáng trong nước uống kombucha. Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic,
Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết
về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha .Yapar K.,
15