Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men kombucha từ trà ngọc thanh, vĩnh phúc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

----------

NGUYỄN THỊ MINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG
DINH DƯỠNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN KOMBUCHA
TỪ TRÀ NGỌC THANH, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật

Người hướng dẫn khoa học

TS. PHƯƠNG PHÚ CÔNG

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN

Qua 4 năm học tập và rèn luyện tại Trƣờng ĐH Sƣ Phạm Hà Nội 2,
đƣợc sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy
cô khoa Sinh- KTNN đã truyền đạt cho em những kiến thức về lý thuyết và
thực hành trong suốt thời gian học ở trƣờng. Cùng với sự nỗ lực của bản thân,
em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình.
Từ những kết quả đạt đƣợc này, em xin chân thành cám ơn:
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 và TS. Phƣơng Phú Công công tác tại Bộ

Giáo dục và Đào tạo đã trực tiếp hƣớng dẫn, dạy bảo, động viên và cho em
nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện
đề tài tốt nghiệp này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà
Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân,
những ngƣời luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài.

Hà Nội,

tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Minh



LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất
cả những số liệu đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê,
hoàn toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không
trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác, em
xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Minh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài .............................................. 2
6. Điểm mới của đề tài ............................................................................................ 3
NỘI DUNG ............................................................................................................. 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
1.1. Tổng quan về kombucha .................................................................................. 4
1.1.1. Sơ lƣợc về kombucha .................................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ........................................................................................... 5
1.2.1. Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc ...................................................... 6
1.2.1.1. Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè ................................................... 7
1.2.1.2. Thành phần hóa học ................................................................................... 8
1.2.2. Hệ vi sinh vật trong kombucha ..................................................................... 9
1.2.2.1. Vi khuẩn acetic ........................................................................................... 9
1.2.2.1.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 9
1.2.2.1.2. Đặc điểm sinh thái ................................................................................... 9
1.2.2.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .................................................................... 10
1.2.2.2. Nấm men .................................................................................................. 10
1.2.2.3. Vi khuẩn lactic ......................................................................................... 11
1.3. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha ......................................... 11

1.4. Thành phần và công dụng của kombucha ...................................................... 14
1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ................................... 15


1.5.1. Trên thế giới ................................................................................................ 15
1.5.2. Ở Việt Nam ................................................................................................. 17
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 19
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và thiết bị hóa chất .................................................... 19
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.................................................................................. 19
2.1.1.1 Mẫu thực vật.............................................................................................. 19
2.1.1.2 Mẫu vi sinh vật .......................................................................................... 19
2.1.3. Các loại môi trƣờng ..................................................................................... 20
2.1.4. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 21
2.1.5. Thời gian, địa điểm nghiên cứu .................................................................. 21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 21
2.2.1 Phƣơng pháp lên men ................................................................................... 21
2.2.2 Phƣơng pháp vi sinh ..................................................................................... 21
2.2.2.1 Phƣơng pháp phân lập các chủng VSV và quan sát hình thái tế bào trên
tiêu bản nhuộm Gram............................................................................ 21
2.2.2.2. Bảo quản chủng giống .............................................................................. 23
2.2.2.3. Phƣơng pháp hoạt lực lên men ................................................................. 23
2.2.2.4. Phƣơng pháp hoạt hóa giống .................................................................... 23
2.2.3. Phƣơng pháp hóa sinh ................................................................................. 24
2.2.3.1 Xác định đƣờng khử .................................................................................. 24
2.2.3.2 Xác định độ cồn......................................................................................... 24
2.2.3.3. Phƣơng pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với
NaOH 0,1N có phenolphthalein 0,1% làm chỉ thị. ............................... 25
2.2.3.4. Phát hiện hoạt tính catalaza ...................................................................... 25
2.2.3.5. Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic ................................................... 25
2.2.4. Phƣơng pháp cảm quan ............................................................................... 26

2.2.5. Xử lí số liệu bằng thống kê toán học .......................................................... 28


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 29
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ
chè Ngọc Thanh .................................................................................... 29
3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid ...................... 29
3.1.1.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter................................................................ 29
3.1.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha tốt ............ 33
3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men......................................................... 35
3.1.2.1. Phân lập các chủng nấm men ................................................................... 35
3.1.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha tốt ........... 36
3.2.2.2. Chất lƣợng cảm quan của kombucha đƣợc lên men từ 4 chủng nấm
men ........................................................................................................ 37
3.2. Động thái phát triển của chủng vi khuẩn Acetobacter V1 và chủng nấm
men Saccharomyces N2 ......................................................................... 38
3.2.1. Động thái phát triển của chủng vi khuẩn Acetobacter V1 ........................... 38
3.2.2. Động thái sinh trƣởng của chủng nấm men Saccharomyces N2 ................. 39
3.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới quá trình lên men kombucha từ
trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc .................................................................. 41
3.3.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng glucose tới quá trình lên men
kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc ............................................ 41
3.3.2. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc
Thanh, Vĩnh Phúc ................................................................................. 43
3.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của MgSO4.7H2O tới quá trình lên men kombucha
từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc .............................................................. 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 49
1. Kết luận ............................................................................................................. 49
2. Kiến nghị ........................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 50

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Lớp màng kombucha............................................................................... 6
Hình 1.2: Lá chè tƣơi .............................................................................................. 8
Hình 1.3 Cơ chế phân giải đƣờng trong tế bào nấm men ..................................... 12
Hình 3.1: Lá chè Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc ............................................................ 30
Hình 3.2: Dịch kombucha lên men tự nhiên từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc ....... 30
Hình 3.3: Mẫu phân lập vi khuẩn .......................................................................... 30
Hình 3.4: Chủng vi khuẩn Acetobacter V1, Acetobacter V2 và Acetobacter V3
trên môi trƣờng thạch nghiêng .............................................................. 30
Hình 3.5: Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Acetobacter V1 ở độ phóng đại
1000 trên kính hiển vi quang học.......................................................... 31
Hình 3.6. Khả năng oxy hoá acetate ..................................................................... 32
Hình 3.7. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter ........................................ 33
Hình 3.8: Mẫu phân lập nấm men ......................................................................... 35
Hình 3.9: Chủng nấm men Saccharomyces N1 và N3 trên môi trƣờng thạch
nghiêng .................................................................................................. 35
Hình 3.11. Hình thái tế bào học của chủng nấm men Saccharomyces N2 ở độ
phóng đại 1000 trên kính hiển vi quang học ......................................... 36
Hình 3.10: Hình thái tế bào học của chủng nấm men Saccharomyces N3 ở độ
phóng đại 1000 trên kính hiển vi quang học......................................... 36
Hình 3.12: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ....................... 42
ở các hàm lƣợng đƣờng glucose khác nhau .......................................... 42
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót ......................... 42
Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha ở các hàm
lƣợng đƣờng khác nhau......................................................................... 43
Hình 3.15: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ....................... 44

ở các hàm lƣợng (NH4)2SO4 khác nhau ............................................. 44
Hình 3.16: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót .......................... 45
ở các hàm lƣợng (NH4)2SO4 khác nhau ............................................. 45
Hình 3.17: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi điểm cảm quan .................................... 45
ở các hàm lƣợng (NH4)2SO4 khác nhau ............................................. 45
Hình 3.18: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng acid tổng số ....................... 47
ở các hàm lƣợng MgSO4.7H2O khác nhau ......................................... 47
Hình 3.19: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng sót .......................... 47
ở các hàm lƣợng MgSO4.7H2O khác nhau ......................................... 47
Hình 3.20: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi điểm cảm quan .................................... 48
ở các hàm lƣợng MgSO4.7H2O khác nhau ......................................... 48


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá trà ........................................................... 8
Bảng 2.1. Bảng quy định đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ......................... 26
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha .................. 27
Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu ................................................... 28
Bảng 3.1. Hàm lƣợng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha
từ 4 chủng vi khuẩn Acetocbacter .................................................... 34
Bảng 3.2. Chất lƣợng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng vi khuẩn
Acetobacter ....................................................................................... 34
Bảng 3.3. Hàm lƣợng khí CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng
nấm men ............................................................................................ 37
Bảng 3.4. Chất lƣợng cảm quan của các chủng nấm men ................................ 37
Bảng 3.5. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn Acetobacter V1 ............. 39
(x106 tế bào) ...................................................................................... 39
Bảng 3.6. Động thái sinh trƣởng của chủng nấm men N2 ................................ 40
(x106 tế bào) ...................................................................................... 40

Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng glucose tới quá trình lên men
kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc ........................................ 41
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng(NH4)2SO4 tới quá trình lên men
kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc ........................................ 44
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng MgSO4.7H2O tới quá trình lên men
kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc ........................................ 46


BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

1. ATP

Adenozin triphotphat

2. STT

Số thứ tự

3. SCOBY

Symbiotic colony of Bacteria and Yeast

4. NADP

Nicotiamide adenine

5. Nxb

Nhà xuất bản

6. TCVN

Tiêu chuẩn Việt nam


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Chẳng biết từ bao giờ ngƣời Việt Nam ta đã coi việc uống trà là một tập
tục tao nhã. Uống trà là cách vận động thần khí một cách khôn ngoan nhất và
có lợi cho sức khỏe nhất, giảm bớt đƣợc những căng thẳng mệt mỏi sau một
ngày làm việc. Trên thị trƣờng có rất nhiều loại thức uống đƣợc chế biến từ
trà nhƣng dòng sản phẩm lên men còn rất mới mẻ đối với thị trƣờng tiêu dùng
Việt Nam.
Trà thủy sâm , ngƣời Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm
trƣờng sinh), ngƣời Nhật gọi nó là kombucha, ngƣời Trung Quốc gọi là thủy
hoài sâm, Nga gọi là nấm trà. Đây là một loại men (giống nhƣ men giấm),
đƣợc nuôi trong dung dịch nƣớc trà đƣờng. Lọc nƣớc (trà giấm) để uống. Do
dễ uống nên đƣợc dùng nhƣ một loại nƣớc giải khát. Đây là một cấu trúc có
dạng nhƣ thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn.
Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp
chất hữu cơ. Trà kombucha còn chứa một lƣợng nhỏ cafein vì đƣợc lên men
từ các loại trà nhƣ trà xanh, trà đen, trà ô long...Là sản phẩm lên men nên
chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid Llactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, nhiều
vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B3, B5, B6, B12, vitamin C, acid folic, amino
acid và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc.
Hiện nay trà kombucha đƣợc phổ biến ở các nƣớc trên thế giới nhƣ
Pháp, Nhật, Trung Quốc, Nga…Ở Việt Nam cũng có sử dụng trà dƣới dạng
đóng chai, đồ hộp nhập khẩu, tuy nhiên chƣa phổ biến, do đó công trình
nghiên cứu kombucha ở nƣớc ta chƣa hoàn chỉnh, đầy đủ. Đối tƣợng chè
Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc để sản xuất trà kombucha chƣa nhiều. Đặc biệt là

1


những nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới quá trình lên
men kombucha. Vì vậy tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng
của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc
Thanh, Vĩnh Phúc”
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới quá trình lên men
kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kom bucha
3.2. Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha
3.3. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn, nấm men đã
tuyển chọn
3.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng glucose tới quá trình lên men
kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc.
3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 tới quá trình lên men kombucha
từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc.
3.6. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng MgSO4.7H2O tới quá trình lên men kombucha
từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Ngọc
Thanh, Vĩnh Phúc.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men
kombucha cho sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng trên môi trƣờng nƣớc trà
đƣờng Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc.

2


5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc lên men kombucha tạo ra sản phẩm
mới, góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càng
cao của ngƣời tiêu dùng. Tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phổ biến
lên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng, có lợi cho sức khỏe con ngƣời.
6. Điểm mới của đề tài
Xác định đƣợc một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men từ trà
Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc. Tìm ra đƣợc hàm lƣợng đƣờng glucose là 100(g/l),
(NH4)2SO4 là 2(g/l) và MgSO4.7H2O là 1,5(g/l) thích hợp cho quá trình lên
men kombucha từ chè Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về kombucha
1.1.1. Sơ lược về kombucha
Kombucha đã đƣợc sử dụng phổ biến qua hơn 200 năm ở vùng Viễn
Đông và khoảng hơn 100 năm ở Đông Âu. Một số tài liệu ghi chép cho thấy
có một số cƣ dân sống tại vùng Caucase đã thọ trên trăm tuổi. Những ngƣời
sống trƣờng thọ nhƣ vậy còn tìm thấy tại một số làng mạc ở Poltaya, Ukraine,
Tây Tạng và Tây Ban Nha. Những ngƣời trƣờng thọ ở Nga cho biết họ sống
lâu nhƣ vậy nhờ từ hàng trăm năm nay họ có thói quen dùng loại trà lên men
kombucha.

Trà “thủy sâm” kombucha là một loại nƣớc uống có lợi cho sức khỏe.
Đây là một cấu trúc có dạng nhƣ thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm
men và vi khuẩn. [20]
Nấm kombucha là một khối vi sinh vật đƣợc phân loại theo tên khoa học
là “Zoogleal mat” liên kết với nhau thành màng phủ kín trên bề mặt nƣớc trà
đƣờng. Trong quá trình lên men, màng nấm kombucha lớn dần tạo thành khối
dày giống nhƣ một cái bánh, thƣờng đƣợc gọi là “nấm”, “cái dấm” hoặc bằng
các từ viết tắt SCOBY (Symbiotic colony of Bacteria and Yeast: khối cộng
sinh của vi khuẩn và nấm men). Các vi khuẩn và nấm men trong nấm
kombucha làm chuyển hóa đƣờng trong dung dịch nƣớc trà đƣờng thành rƣợu
và axit hữu cơ và có thể một số chất tan từ trà cũng đƣợc chuyển hóa trong
quá trình lên men, tạo thành một loại nƣớc giải khát có độ cồn thấp, vị chua
ngọt, chát nhẹ. Các vi sinh vật biến đổi đƣờng thành gluconic acid, đồng thời
sản xuất ra một lƣợng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acetic
acid. Thành phần trà sau cùng chứa: acid folic, gluco. Thành phần trà

4


Kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ. Vì đây là
sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic,
acid glycuronic, acid L-lactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid
oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B3, B6, B12, vitamin
C, acid folic, amino acid, và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng
và giải độc. Trà Kombucha còn chứa một lƣợng nhỏ cafein vì nó đƣợc lên
men từ các loại trà nhƣ trà xanh, trà đen, trà ô long hoặc trà kukicha.
Nồng độ acid và rƣợu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc
trong không khí và các bào tử vi khuẩn. Kết quả là kombucha có thể tƣơng
đối dễ dàng lên men trong điều kiện thƣờng. Các vi khuẩn và nấm men trong
kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh .

Trong quá trình làm cẩn thận để tránh cho trà không bị nhiễm các loại
nấm mốc gây độc cho cơ thể. Các yếu tố để đảm bảo an toàn cho việc lên
men: môi trƣờng sạch sẽ, nhiệt độ thích hợp, pH thấp.
Nếu quá trình lên men bị nhiễm, có thể nhận thấy bằng mắt thƣờng nhƣ
trên bề mặt con nấm có xuất hiện màu xanh lá cây, xanh dƣơng hoặc màu
đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm mốc Aspergillus
parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum… Các loại nấm mốc trên
sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là các độc tố có khả năng
gây ung thƣ, khi xuất hiện sẽ làm sản phẩm mất giá trị dinh dƣỡng và gây mùi
khó chịu.
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo
Kombucha là môi trƣờng cộng sinh của vi khuẩn và nấm men. Hệ vi
sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter
nhƣ: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter Ketogenum…
và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus,
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có

5


thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium
gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là
Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Kombucha
còn đƣợc gọi là nấm trà. Chúng sinh trƣởng tốt trong môi trƣờng nƣớc trà
đƣờng. Bởi vậy, thƣờng đƣợc sử dụng để lên men dung dịch trà đƣờng, nên
gọi là nấm trà. Trong quá trình lên men kombucha sẽ tạo ra một lớp màng
mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một
kombucha thứ hai (thƣờng gọi là kombucha con) tách biệt với kombucha ban
đầu. Hình dạng và kích thƣớc của kombucha phụ thuộc vào hình dạng tiết
diện của bình chứa.

Hình 1.1: Lớp màng kombucha
1.2. Tổng quan về nguyên liệu
1.2.1. Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
Ngọc Thanh là xã miền núi duy nhất của thị xã Phúc Yên tỉnh Vĩnh
Phúc. Với địa hình trung du miền núi Bắc bộ, Ngọc Thanh tập chung vào gieo
trồng các loại cây có hiệu quả kinh tế cao. Trong đó cây chè là một trong
những cây đƣợc chú trọng. Toàn xã có 470 mẫu chè, cho 500 tấn chè mỗi
năm.

6


Cây chè đã có mặt trên đất Ngọc Thanh từ hàng trăm năm nay. Với điều
kiện khí hậu thoáng mát, thổ nhƣỡng phù hợp nên cây chè ở đây sinh trƣởng
phát triển tốt, chất lƣợng thơm ngon mang đặc trƣng hƣơng vị riêng của chè
Ngọc Thanh. Ngay cả những cụ già lớn tuổi cũng chỉ biết rằng khi mình sinh
ra thì ở đây đã có cây chè rồi. Nhiều ngƣời đã làm quen với việc hái chè, xao
chè từ nhỏ và đến bây giờ họ vẫn làm công việc đó. Làm chè đã trở thành một
nghề truyền thống góp phần tạo công ăn việc làm, thu nhập cho nhiều gia
đình, nhiều thế hệ ngƣời dân địa phƣơng.
1.2.1.1. Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè
Thời vụ
Vụ Xuân (tháng 3-4): Hái chừa 2 lá và lá cá, tạo tán bằng những búp
cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.
Vụ Hè Thu (tháng 5 - 10): Hái chừa 1 lá và lá cá, tạo tán bằng những
búp cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.
Vụ Thu Đông (Tháng 11): hái chừa lá cá , tháng 12 hái cả lá cá.
Với các giống chè có dạng thân bụi, sinh trƣởng đỉnh đều có thể hái
kéo hay hái bằng máy để nâng cao năng suất lao động.

Chu kỳ phát triển
Chu kỳ của một cây chè bao gồm ba giai đoạn. Giai đoạn đầu tiên là
giai đoạn cây non hay giai đoạn thiết kế cơ bản. Các bụi chè phải trồng 3-4
năm kể từ khi gieo trồng mới phát triển thành cây trƣởng thành. Sau đó là giai
đoạn cây lớn và giai đoạn cuối là giai đoạn chè già cỗi. Giai đoạn chè lớn kéo
dài 20 – 30 năm, tuỳ giống, điều kiện đất đai, dinh dƣỡng và khai thác. Chăm
sóc kém và khai thác nhiều sẽ làm cho cây chè bị suy thoái, già trƣớc tuổi.
Đây là giai đoạn chè cho năng suất cao nhất. Sau đó là giai đoạn chè già cỗi,
cây chè suy yếu dần, lá nhỏ, búp ít, chóng mù xoè, hoa quả nhiều, cành tăm
hƣơng nhiều, chồi gốc mọc nhiều vì lý do này.

7


Hình 1.2: Lá chè tươi
1.2.1.2. Thành phần hóa học
Trong lá chè tƣơi có chứa nhiều thành phần hóa học nhƣ: tinh dầu, các
dẫn xuất polyphenolic (flavonoid, catechol, tannin), alkaloid là cafein,
theophyllin, theobromin, xanthin, và các vitamin C, B1, B2, B3.
Các thành phần trong nƣớc chè xanh có tác dụng lớn đối với sức khỏe.
Chất catechin có tác dụng giảm nguy cơ gây ung thƣ, giảm kích thƣớc khối u,
chống phóng xạ, giảm lƣợng đƣờng máu, giảm cholesterol, diệt khuẩn, diệt
virut cúm.... Chè xanh chứa chất cafein có tác dụng chống buồn ngủ, giảm
mệt mỏi và lợi tiểu. Vitamin C làm tăng sức đề kháng, vitamin nhóm B giúp
cho quá trình trao đổi cacbon hydrat. Flavonoid có tác dụng giảm huyết áp,
tăng độ bền vững thành mạch...
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá trà [10]
Thành phần

Hàm lƣợng (% chất khô)

Nƣớc

75 – 80

Tổng polyphenol

25 – 30

Flavanols
(-) Epigallocatechin gallate (EGCG)

8 – 12

(-) Epicatechin gallate (ECG)

3–6

(-) Epigallo catechhin (EGC)

3–6

(-) Epicatechin

1–3

8


(+) Catechin (C)

1–2

(+) Gallocatechin (GC)

3–4

Caffeine

3–4

Axit hữu cơ ( ctric, malic, oxalic,...)

0,5 – 0,6

Đƣờng (glucose, fructose,saccharose..)

4–5

Xơ ( cellulose, hemicellulose, lignin)

4–7

1.2.2. Hệ vi sinh vật trong kombucha
1.2.2.1. Vi khuẩn acetic
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Dạng hình
que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trƣờng nuôi cấy) mà các
vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng
kéo dài hoặc phình to ra. Kích thƣớc thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0µm).
Có thể di động, hoặc không di động. Không sinh nha bào tử. Hiếu khí bắt

buộc. Chịu đƣợc độ acid cao.
1.2.2.1.1. Đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái thƣờng đƣợc khảo sát gồm màu sắc, hình dạng
khuẩn lạc, trạng thái nhuộm Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thƣớc tế
bào. Ngoài ra, số lƣợng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong
định danh vi khuẩn acetic.
1.2.2.1.2. Đặc điểm sinh thái
Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thƣờng gắn liền với các nguồn
dinh dƣỡng chứa đƣờng hay alcohol nhƣ các loại hoa, quả, bia, rƣợu và các
nơi sản xuất giấm. Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp, đặc điểm sinh thái
đƣợc đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài. Cụ thể nhƣ
Acidomonas chỉ có thể phân lập đƣợc trong bùn hoạt tính có methanol;
Granulibacter đƣợc tìm thấy trong cơ thể ngƣời bị u hạch.

9


1.2.2.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid đƣợc phân
biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa nhƣ: Oxy hóa acetate tạo CO2 và H2O;
phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau; phát
triển sinh khối trong các môi trƣờng chứa D- glucose 30%; acetic acid 0,35%
1.2.2.2. Nấm men
Hình thái và cấu tạo
Tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…,
thƣờng có kích thƣớc rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thƣớc
trung bình: chiều dài: 9 – 10 μm, chiều rộng: 2 – 7 μm. Hình dạng và kích
thƣớc tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi
khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản
bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh
sản đơn tính).
Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
Nấm men cũng nhƣ các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ,
phospho, kali, magiê…
Dinh dƣỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đƣờng khác
nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…Dinh dƣỡng oxy, hydro: đƣợc
cung cấp cho tế bào từ nƣớc của môi trƣờng nuôi cấy hay dịch. Dinh dƣỡng
nitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể
phân cắt albumin của môi trƣờng mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có
thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thƣờng dùng là acid amin,
pepton, amid, urê. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…Các
vitamin và chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hƣởng to lớn đến hoạt động sống

10


của nấm men. Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của
nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rƣợu, chúng tạo
ra liên kết có năng lƣợng lớn. Lƣu huỳnh: tham gia vào thành phần một số
acid amin, albumin, vitamin và enzyme. Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng
trung gian của sự lên men. Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô
hấp và các quá trình khác. Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự
phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rƣợu, tạo điều kiện phục hồi
phosphorin hóa của acid pyruvic. Mangan: đóng vai trò tƣơng tự nhƣ magiê.
1.2.2.3. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực
khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trƣờng acid pH từ 5,5 ÷ 6,

khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho quá
trình lên men từ 15 ÷ 500C. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp
khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn.[8]
1.3. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha
Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá
trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:

11


Lên men ethanol

Hình 1.3 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men
Lên men rƣợu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm
men, chúng sẽ chuyển hóa đƣờng lên men thành ethanol và CO2. Quá trình
lên men rƣợu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự
có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển
đƣờng thành rƣợu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh
dƣỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học
trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rƣợu và CO2). Sau
khi đƣợc vận chuyển vào trong tế bào chất, đƣờng hexose đƣợc chuyển hóa

12


theo chu trình đƣờng phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic
sẽ đƣợc chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone
phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đƣờng phân, hợp chất
này có thể chuyển hoá thành glyxerol. Trong môi trƣờng pH acid, glycerol chỉ
đƣợc tạo ra với hàm lƣợng nhỏ. Ngƣợc lại, trong môi trƣờng pH kiềm lƣợng

glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những
sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.
Phƣơng trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trƣờng pH acid:
C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP
Sự chuyển hóa đƣờng hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế
bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lƣợng của nấm men
trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ đƣợc nấm men
thải vào môi trƣờng lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải
vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những
hợp chất này đƣợc tìm thấy với hàm lƣợng rất nhỏ, chúng đƣợc chia thành 4
nhóm: glyxerol cùng rƣợu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá
trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ đƣợc tạo thành (The Moll, 1990).
Một số acid hữu cơ đƣợc sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu nhƣ quá trình
lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ
chiếm hàm lƣợng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic,
lactic...
* Lên men acetic:
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rƣợu thành acid acetic dƣới
tác dụng của vi khuẩn.
C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O
CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde)
CH3CH(OH)2 + O2

→ CH3COOH + H2O

13