Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
--------------------

Nguyễn Thị Khuyến

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN
GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Tuấn

Hà Nội - 2016


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 4
Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 6
1.1. Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae .........................................................6
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae................................................6
1.1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae .................................................................7
1.1.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae ..........................................................................................8
1.1.4. Ph}n biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin ....9
1.2. C|c phương ph|p chuyển gen v{o nấm sợi ............................................................... 12
1.2.1. Phương ph|p chuyển gen sử dụng tế b{o trần (protoplast).......................... 12
1.2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation) ................................. 13

1.2.3. Phương ph|p chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (ATMT) .... 13
1.2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc c|c chủng chuyển gen .................................... 17
1.2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm .......................................... 19
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................................. 23
2.1. Nguyên liệu .............................................................................................................................. 23
2.1.1. Chủng vi sinh vật................................................................................................................ 23
2.1.2. Thiết bị v{ hóa chất........................................................................................................... 25
2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu..................................................................... 28
2.2. Phương ph|p nghiên cứu .................................................................................................. 28
2.2.1. Thu nhận b{o tử nấm....................................................................................................... 29
2.2.2. T|ch chiết DNA, RNA v{ tổng hợp cDNA ................................................................. 29
2.2.3. Quan s|t hình th|i v{ kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa................ 30
2.2.4. Ph}n biệt A. oryzae v{ A. Flavus bằng c|c kỹ thuật sinh học ph}n tử ........ 31
2.2.5. Tạo c|c vector nhị thể dùng cho chuyển gen ........................................................ 32
2.2.6. Chuyển gen v{o nấm sợi A. oryzae ............... Error! Bookmark not defined.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................... Error! Bookmark not defined.


3.1. X|c nhận chủng A. oryzae an to{n để sử dụng cho chuyển gen ............... Error!
Bookmark not defined.
3.1.1. Ph}n biệt c|c chủng A. oryzae an to{n v{ chủng Aspergillus flavus sinh độc
tố aflatoxin .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Lựa chọn chủng A. oryzae phục vụ cho chuyển gen .Error! Bookmark not
defined.
3.2. Lựa chọn marker chuyển gen v{o A. oryzae Error! Bookmark not defined.
3.3. X}y dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ...... Error!
Bookmark not defined.
3.3.1. Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil ........... Error!
Bookmark not defined.
3.3.2. Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen v{o A. oryzae trợ dưỡng

uridine/uracil .................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.4. Đ|nh gi| hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP v{
DsRed Error! Bookmark not defined.
3.4.1. Chuyển gen GFP v{ DsRed v{o nấm sợi A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil
.................................................................................................. Error! Bookmark not defined.
3.4.2. X|c nhận c|c thể chuyển gen .......................... Error! Bookmark not defined.
3.5. Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA m~ hóa
enzyme phytase của A. fumigatus ở A. oryzae ..... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 34


MỞ ĐẦU
Aspergillus oryzaelà loài nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực
phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nước châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung
Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines. Loài nấm này đã
được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn
(GRAS). Ở Việt Nam, A. oryzae được sử dụng để sản xuấttương truyền thống tại một
số địa phương ở các tỉnh phía Bắc.A. oryzae có khả năng tiết một lượng lớn các
enzyme khác nhau vào môi trường. Do đó, loài nấm này được sử dụng như nhà máy
tế bào để sản xuất thương mại nhiều loại enzyme và protein cả ở dạng tự nhiên và tái
tổ hợp. Gần đây chủng A. oryzae RIB40 dùng trong sản xuất công nghiệp tại Nhật
Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen. Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của A.
oryzae mở ra nhiều cơ hội trong cải biến di truyền và biểu hiện gen trên loài nấm sợi
an toàn này.
Hiện nay, hai phương pháp phổ biến nhất trong chuyển gen vào nấm sợi là
chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Tuy nhiên việcchuyển gen vào nấm sợiA. oryzaecho đến nay chỉ sử
dụng phương pháp chuyển gen qua tế bào trần.Phương pháp này tương đối phức tạp
và tốn kém, khó có thể thực hiện tại điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens đơn giản hơn với chi phí
hợp lý. Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc chuyển gen thành
công ở nấm sợi A. oryzae. Bên cạnh đó, A. oryzaecókhả năng kháng lại hầu hết các
hợp chất kháng sinh thường được sử dụng cho chuyển gen.Do đó phát triển các
chủng A. oryzae trợ dưỡngđể sử dụng cho chuyển gen là giải pháp duy nhất để cải
biến di truyền cũng như biểu hiện gen ởA. oryzae.
Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển genhiệu quả cho nấm sợi A. oryzae
thông quavi khuẩn A. tumefaciensnhằm phục vụ hướng nghiên cứu bền vững về biểu


hiện enzyme/protein tái tổ hợp ở loài nấm này, chúng tôi thực hiện đề tài“Nghiên
cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
cho nấm sợi Aspergillus oryzae” với những nội dung chính như sau:
-

Xác nhận các chủng A. oryzae an toàn, có thể sử dụng làm đối tượng
chuyển gen.

-

Tạo chủng A. oryzae đột biến trợ dưỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen
pyrG.

-

Tạomột số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen và biểu
hiện gen ở nấm sợi A. oryzae.

-

Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh
quangGFP vàDsRed.

-

Bước đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạođược để biểu hiện gen
phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus.


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về nấm sợiAspergillus oryzae
1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợiAspergillus oryzae
Nấm sợiA. oryzae thuộc phân nhóm Flavicủachi Aspergillus, trong
họTrichocomaceae. A. oryzae có cấu tạo đa bào, khi được nuôi cấy trên môi trường
đĩa thạch,hệ sợicó màu trắng xámsau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến
xanh. Hệ sợi nấm A. oryzae sinh trưởng rất nhanh và phân mảnh, chiều ngang có kích
thước 5-7 µm. Trên những sợi này hình thành cấu trúc sinh sản vô tính, gọi là cuống
sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của A. oryzae thường dài 1-2 mm. Trên cuống phồng
lên tạo thành bọng, từ bọng này mọc lên các tế bào nhỏ, thuôn dài hình chai, xếp sát
nhau, gọi là thể bình; trên thể bình có đính những chuỗi bào tử màu vàng lục hay
màu vàng hoa cau (còn gọi là bào tử đính)[31, 53, 80, 99]. Hình thái khuẩn lạc và
cuống sinh bào tử của nấm sợi A. oryzae được Machida và cộng sựmô tả chi tiết như
trong Hình 1.1.


Hình 1.1.Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi Aspergillus
oryzae RIB40[53]
Nấm sợiA. oryzae sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 30ºC-40ºC, chúng có thể sinh
trưởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau như các mảnh vụn
thực vật, cây lá, gỗ mục nát, các loại hạt, thức ăn gia súc...A. oryzae phân bố rộng rãi

trên toàn thế giới, đặc biệt phổ biếnở các nước nhiệt đới. Trong quá trình sinh trưởng
và phát triển, A. oryzae tiết ra môi trường một lượng lớn các enzyme thủy phân như
cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase[36, 53].

1.1.2.Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae
Gần đây, chủng A. oryzaeRIB40 được sử dụngtrong công nghiệp sản xuất các
thực phẩm lên men truyền thống tại Nhật Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen,
theo đó hệ gencủa A. oryzaegồm 8 nhiễm sắc thể với tổng kích thước là 37 megabase
(Mb), dự đoán có 12.074 gen mã hóa protein, lớn hơn 25%-30% so với các loài khác
thuộc chi Aspergillus. Chẳng hạn,hệ gen của A. oryzae lớn hơn loài A. nidulans(loài
chuẩn dùng cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm) và A. fumigatus(tác nhân gây
bệnh cơ hội ở người) lần lượt là 29% và 34%[53].Hệ gencủa A. oryzae lớn hơnchủ
yếu do thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa. Việc mở rộng kích thước hệ gen
dường như đặc trưng cho các loài có quan hệgần gũi với A. oryzaenhư A. niger và A.
flavus, các loài này cókích thước hệ gen tương đương nhau. Đặc biệt loài có quan hệ
rất gần gũi với A. oryzae là A. flavuscó độ tương đồng DNA đến 99,5%[2, 53, 85].
A. oryzae có khả năng phân giải mạnh nhiều loại cơ chất có trong tự nhiêndo
loài này sở hữu các gen mã hóa enzyme thủy phân khác nhau. Các loàiA. oryzae, A.
fumigatusvà A. nidulans chứa lần lượt 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease,
chiếm khoảng 1% tổng số các gen trong hệ gen. Tất cả các gen mã hóa protease được
tìm thấy trong A. fumigatus và/hoặcA. nidulansđều có mặt trong A. oryzae, tuy
nhiêncác gen mã hóa một sốenzyme aminopeptidase có mặt trongA. oryzaelại không
có mặt trong hệ gen củaA. fumigatus và A. nidulans. Ngoài ra,A. oryzaecòn sở hữu


thêm nhiều gen mã hóa protease tiết có khả năng hoạt động trong môi trường có tính
axit. Sự gia tăng các protease hoạt động trong pH axit củaA. oryzaecó thể hình thành
trong quá trình thuần hóa của con người [53].Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của
Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu cải biến di truyền
ứng dụng loài nấm an toàn này trong sản xuất các sản phẩm nhằm phục vụ mục đích

con người.

1.1.3. Vai trò của nấm sợiA.oryzae
Nấm sợiA. oryzaeđược thuần hóa từ ít nhất 2000 năm trước và hiện nay được
sử dụng rộng rãitrong sản xuất thực phẩmởNhật Bản, Trung Quốc và các nước Đông
Á như lên men đậu nành, làm nước sốt, tương và một số đồ uống có cồn như
huangjiu, sake, makgeolli và shochu[4, 36, 111]. A. oryzae được sử dụng rộng rãi
trong thực phẩm do đặc tính sinh trưởng nhanh,tiết lượng lớn các enzyme thủy
phânnhư amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh
trưởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho các sản phẩm lên men[37].Trong lên men truyền
thống, A. oryzae thường được nuôi ởmôi trường rắn, điều kiện này thích hợp cho sự
phát triển hiếu khí của sợi nấm. Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi
trường rắn giúp tăng khả năng sản sinh các enzyme và các chất chuyển hóa mà
thường sẽ không được sản xuất trong điều kiện lên men lỏng[99].
Ngoài vai trò trong sản xuất các thực phẩm truyền thống, nấm sợi A. oryzae
còn được sử dụng trong một số ngành công nghiệp sản xuất enzyme có giá trị kinh tế
cao như glucoamylase, α-amylase và một số protease phục vụ sản xuất bánh kẹo, đồ
uống. Glucoamylase và α-amylase thuộc nhóm enzyme amylase, chiếm tới gần 20%
tổng sản lượng enzyme được sản xuất, trong đóchủ yếu được sản xuất bởinấm sợiA.
oryzae[16, 81, 98, 113].Nguồn cung cấp enzyme protease cho công nghiệp sản xuất
thực phẩm và các chất tẩy rửa đến từ các loài nấm sợi thuộc chi Conidiobolus,
Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó phải kể đến loài sinh protease rất
cao là A. oryzae[1, 106].


Bên cạnh những lợi ích về kinh tế, A. oryzae còn được coi là vi sinh vật mô
hình dùng cho nghiên cứu về biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp. Ngoài ra nghiên
cứu chuyển gen còn hỗ trợ trong việctìm ra chức năng cũng như vai trò của các gen
mới[54].

1.1.4. Phân biệt Aspergillus oryzae vớiAspergillus flavussinh độc tố
aflatoxin
Hiện nay, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư tăng lên ngày một tăng cao. Một trong
những nguyên nhân chính là do ăn phải thực phẩm chứa các chất gây ung thư, trong
đó cóđộc tố nấm aflatoxin. Độc tố aflatoxin được sinh ra bởi nấmmốcAspergillus
flavusvà Aspergillus parasiticustrên các loại hạt nông sản quan trọng không được bảo
quản tốt như gạo,lạc, ngô, đậu tương... Hình thái củaA. flavusgần như giống hệtvới
loàiA. oryzaemà thường được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm[17, 26,
80].
A. flavusvà A. oryzaelà hai loài thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus.
Tương tự như A. oryzae, nấm sợi A. flavus có khả năng tồn tại ở nhiệt độ từ 12ºC đến
48ºC và sinh trưởng tối ưu nhất ở 28ºC đến 37ºC. Hầu hết trong chu trình sống A.
flavus tồn tại ở dạng hệ sợi và sinh sản bằng bào tử đính.Giống với một số chủng A.
oryzae, dưới điều kiện bất lợi, sợi nấm A. flavus chuyển thành cấu trúc đặc biệt gọi là
hạch nấm (sclerotia). Hạch nấm giúp chúng có thể tồn tại dưới các điều kiện khắc
nghiệt. Khi điều kiện trở nên thuận lợi, các hạch nấm sẽphát triển thành dạng sợi vàtừ
đó sinh ra các cuống mang bào tử đính, phát tán ra ngoài môi trường đất và không
khí [17, 26].
Trong tự nhiên, rất khó để có thể phân biệt hai loài A. oryzae và A. flavus bởi
hình thái rất giống nhau.Hơn nữa,khi giải trình tự hai chủng đại diện cho hai loài,
nhận thấy genome của chủng A. oryzae RIB40 và A. flavus NRRL 3357 có độ tương
đồng 99,5% DNA và 98% protein [85]. Phân tích tiến hóa trên một số chủng thuộc


hai chi này, nhận thấyA. flavus và A. oryzaecó mức độ tương đồng tùy thuộc vào
từng chủng. Ví dụ như hai chủngA. flavusSRRC 1357 và SRRC 2112có mối quan hệ
gần gũi với A. oryzae hơn các chủngA. flavus khác, do có nhiều đặc điểm của A.
oryzae hơn (Hình 1.2). Từ các dữ liệu về hệ gen, A. oryzaeđược cho rằng có nguồn
gốc phát sinh từ loài A. flavus[18].

Hình 1.2.Mối quan hệ phát sinh loài và sự khác biệt trong hệ gen củaA. oryzae và
A. flavus (màu xanh lam là A. oryzae, màu xanh lá cây là A. flavus)[18]
A. oryzaekhác với A. flavus ở việc mất khả năng sinh độc tốaflatoxin trong quá
trình sinh trưởngdo trong quá trình tiến hóa đã tích lũy nhiều đột biến điểm và đột biến
mất đoạn ở một số gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin[8]. Con đường sinh tổng
hợp aflatoxin bắt nguồn từ axit norsolorinic (NOR), trải qua ít nhất 23 quá trình chuyển hóa
trung gian, nhờ các enzyme được mã hóa bởi 25 gen nằm trong một vùng DNA kích thước
70 kb để tạo thành aflatoxin có độc tính cao nhất là aflatoxin B1 (AFB1)[47, 97, 112].
Các bước chuyển hóa được thực hiện bởi các enzyme có chức năng riêng biệt. Các
gen liên quan đến từng bước chuyển hóa trong quá trình sản xuất aflatoxin trong tế bào
nấm được liệt kê tại Bảng 1.1.


Bảng 1.1. Các gen liên quan trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin.
Các gen liên quan

Quá trình chuyển đổi

aflA (fas-2), aflB (fas-1), và aflC (pksA)

Acetate -> NOR

aflD (nor-1), aflE (norA), và aflF (norB)

NOR -> AVN

aflG (avnA)

AVN -> HAVN

aflH (adhA)

HAVN -> AVF

aflI (avfA)

AVF -> VHA

aflJ (estA)

VHA -> VAL

aflK (vbs)

VAL -> VERB

aflL (verB)

VERB -> VERA

aflM (ver-1) và aflN (verA)

VERA -> DMST

aflO (omtB, dmtA)

DMST -> ST; DMDHST -> DHST

aflP (omtA)

ST -> OMST; DMST -> DHOMST

aflQ (ordA)

OMST -> AFB1, AFG1
DMDHST -> AFB2, AFG2

Trong hai thập kỷ qua, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng để
phân biệt các loài thuộc phân nhóm Flavi như kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction)[10], RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)[38], AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism) [66], phân tích so sánh trình tự vùng
ITS (Internal Transcribed Spacer) của DNA ribosome[41] hoặc phân tích tính đa


hình nucleotide đơn SNP (Single Nucleotide Polymorphism) [45]. Tuy nhiên, các
phương pháp kể trên vẫn còn những hạn chế nhất định trong việc phân biệtA.
oryzaevàA. flavus hoặc thiếu sự ổn định trong các lần lặp lại thí nghiệm[8]. Dựa trên
sự khác biệt về trình tự DNA của nhóm gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin ở
A. flavus và A. oryzae, một số cặp mồi PCR đặc hiệu cho các gen này đã được thiết
kế và sử dụng để phân biệt A. flavusvàA. oryzae[10].

1.2.Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi
Các nghiên cứu về di truyền học phân tử của nấm sợi đã có những đóng góp
đáng kể cho sự hiểu biết của con người về cơ chế gây bệnh và các con đường sinh
tổng hợp enzyme, protein. Chuyển gen là một công cụ không thể thiếu trong các
nghiên cứu này.
Hiện nay, nhiều phương pháp chuyển gen được sử dụng như chuyển gen thông
qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen bằng súng bắn
gen và chuyển gen sử dụng vi sinh vật trung gian là vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng và tùy thuộc vào

từng loài mà hiệu suất chuyển gen khác nhau đối với từng phương pháp. Tuy nhiên
phương pháp được sử dụng phổ biến nhấtở nấm sợi làchuyển gen qua tế bào trần
(protoplast), chuyển gen bằng xung điện (electroporation)và chuyển gen trung gian
qua vi khuẩn A.tumefaciens[6, 51, 62, 63].

1.2.1. Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast)
Ðể chuyển gen vào nấm thông qua tế bào trần, tế bào nấm cần được xử lý
enzyme nhằm loại bỏ thành tế bào, từ đó tạo protoplastgiúpDNA dễ dàng xâm nhập
vào tế bào. Phương phápnày có thể được sử dụng để chuyển trực tiếp các đoạn DNA
hoặc các vector mang gen mong muốn vào tế bào. Ðể nâng cao hiệu quả chuyển gen,
protoplast thường được xử lý với PEG (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện.
Phương pháp chuyển gen này khá hiệu quả, đặc biệt đối với những loài mà các
phương pháp chuyển gen kháckhông thể thực hiện được. Tuy nhiên, quá trìnhchuẩn
bị protoplast cũng như các bước chuyển genkhá phức tạp, tốn nhiều công sức, chi phí


cao và không ổn định, đòi hỏi người thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm, không thể
áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ. Đặc biệt protoplast phải được
sử dụng ngay sau khi chuẩn bị[51, 57].

1.2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện là phương pháp cơ học được sử dụng để
đưa các phân tử DNA vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp
này, một xung điện cao thế trong thời gian rất ngắn (vài phần nghìn giây) tạo ra các
lỗ thủng tạm thời giúp cho các phân tửDNA ngoại lai từ môi trường có thể xâm nhập
vào bên trong tế bào. Phương pháp xung điện đã được áp dụng thành công trên nhiều
loại tế bào, trong đó có tế bào nấm sợi[6, 7]. Trước khi xửlý với xung điện, bào tử
nấm nảy chồi sẽ được loại bỏ thành tế bào bằng một số enzyme để tạo tế bào trần.
Sau đó tế bào trần được trộn với DNA và được đưa vào máy tạo xung điện để chuyển
DNA vào trong tế bào nấm [7]. Phương pháp này mới chỉ áp dựng thành công với

một số loài nấm sợi và đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho quá trình
chuyển gen.

1.2.3. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
(ATMT)

1.2.3.1. Cơ chế chuyển gen vào tế bào chủ của A. tumefaciens
Vi khuẩn A. tumefacienslà một loài vi khuẩn Gram âm sống trong đất, thuộc
chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae. Vi khuẩn A. tumefaciens là tác nhân gây khối u
trên thực vật nhờ chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u (Tiplasmid) của nó vào tế bào thực vật. Các gen nằm trên T-DNA mã hóa cho các
enzyme ảnh hưởng đến sự sinh trưởng mất kiểm soát của tế bào thực vật là nguyên
nhân chính dẫn đến sự hình thành khối u[28, 108]. Quá trình chuyển gen gây khối u
nằm trên Ti-plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens được mô tả trên Hình 1.3.


Hình 1.3.Vi khuẩn A. tumefaciens gây khối u trên thực vật [95]
Ti plasmid có kích thước 200 kb-800 kb, bao gồm đoạn T-DNA được giới hạn
bởi biên trái (LB) và biên phải (RB), các biên có kích thước khoảng 25 bp.T-DNA
mang gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine. Các gen này sẽ tích hợp vào hệ gen
của thực vật ở một vị trí ngẫu nhiên. Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có vùng gen
độc, chứa các gen virmã hóa các protein (virA, virG, và một số protein khác)giúp vận
chuyển T-DNA vào trong tế bào thực vật[28]. Các gen vir này chính là yếu tố quyết
địnhkhả năng chuyển T-DNA vào tế bào chủ của vi khuẩn Agrobacterium. Sự hoạt
động của các gen virđược cảm ứng bởi hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật,
có tên là acetosyringone (AS) [63]. Khi có mặt chất cảm ứng, gen vir hoạt động dẫn
tới quá trình chuyển T-DNA trên Ti plasmid vào tế bào.

1.2.3.2. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Trong điều kiện có chất cảm ứng, vi khuẩnA. tumefaciens sẽ chuyển một phần
DNA trên Ti plasmid (còn gọi là T-DNA) của nó vào tế bào thực vật. T-DNA sau đó

được tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen [24, 28]. Lợi dụng cơ chế này, vi khuẩn A.
tumefaciens được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật từ
những năm 1980, sau đó vào năm 1998 vi khuẩn này lần đầu tiên được ứng dụng
thành công để chuyển gen vào nấm[12].


Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được coi là
phương pháp đơn giản nhất để chuyển gen vào nấm sợi. Phương pháp ATMT chuyển
gen vào nấm dựa trên cơ chế chuyển đoạn T-DNA trên Ti-plasmid có mặt trong tế
bào vi khuẩn sau đó tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen nấm. Các gen cần chuyển sẽ
được gắn vào vùng T-DNA, sau đó được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciensdùng
cho chuyển vào nấm. Phương pháp chuyển gen này đã được thực hiện thành công
trên nhiều loài nấm sợi khác nhau[12, 23, 62, 63, 93].
Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens cần một hệ thống
gồm hai plasmid là plasmid trợ giúp (vir helper)có chứacác gen vir (virulence) giúp
vận chuyển T-DNA vào tế bào chủ, và một vector nhị thể(binary vector)chứa đoạn TDNA đã được cải biến cho mục đích chuyển gen[63]. Trên vectornhị thể cóchứa gen
kháng kháng sinh dùng để chọn lọc vi khuẩn mang vector và vùng T-DNA giới hạn
bởi hai biên LB (left border) và RB (right border) có chứa marker chọn lọc thể
chuyển gen và một vùng DNA có thể được cải biến tùy vào mục đích chuyển gen[27,
74]. Mô hình hệ thống vector nhị thể hiện trong Hình 1.4.

Hình 1.4.Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể cho chuyển gen vào nấm
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens[46]
Một trong những ưu điểm lớn nhất của phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn
A. tumefaciens là có thể tạo ra một loạt các thể đột biến ngẫu nhiên do

T-DNA từ

tế bào vi khuẩn chèn ngẫu nhiên vào hệ gen của vi nấm. Một số nghiên cứu chỉ ra
rằng A. tumefaciens chèn T-DNA vào hệ gen của nấm chủ yếu chỉ ở dạng một bản

đơn và đoạn T-DNA này có thể phá hủy một gen duy nhất ở thể biến nạp tương ứng.


Từ việc nghiên cứu các thể đột biến chèn ngẫu nhiên có thể giúp xác định chức năng
của gen.Ngoài chức năng biểu hiện và tạo các thể đột biến ngẫu nhiên, phương pháp
chuyển gen bằng A. tumefaciens còn được sử dụng trong việc xóa các gen nhờ cơ chế
trao đổi chéo tương đồng trong tế bào nấm[49].
Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã được ghi nhận
chuyển thành công ở một số loài nấm sợithuộc chi Aspergillus (A. fumigatus, A.
awamori, A. japonicas, A. niger), tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào đề cập đến
việc chuyển gen vào A. oryzae thông qua vi khuẩn A. tumefaciens[12, 23, 62, 63, 93].

1.2.3.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens thực hiện đơn giản
hơn nhiều so với các phương pháp khác, tuy nhiênthời gian tiến hành dài hơn do cần
thời gian đồng nuôi cấy cảm ứnggiữa nấm và vi khuẩn [62]. Nguyên liệu của chuyển
gen có thể sử dụng hệ sợi hoặc bào tử nấm mà không cần bất cứ khâu xử lý bổ xung
nào như chuyển gen qua protoplast hay chuyển gen bằng xung điện. Thậm chí, chỉ sử
dụng phương pháp này mới khả thi đối với một số loài nấm[90, 102]. Hiệu quả
chuyển gen vàonấm sợikhi sử dụng vi khuẩn Agrobacterium thu được số thể chuyển
cao hơn nhiều lần so với chuyển gen bằng tế bào trần nhờ PEG [61, 86]. Bên cạnh
đó, các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng việc xóa gen ở nấm nhờ cơ chế trao đổi
DNA tương đồng nhờ A. tumefaciens đạt hiệu quả cao hơn so với xóa gen bằng các
phương pháp khác. Hiệu quả xóa gen khi sử dụng protoplast chỉ đạt 1%-50%, nhưng
khi sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens hiệu quả có thể đạt đến 97% [11].

1.2.3.4. Ứng dụng của phương pháp ATMT trong cải biến di truyền
Phương pháp chuyển gen vào nấm bằng vi khuẩn A. tumefaciens đã được
chứng minh lợi thế hơn các phương pháp chuyển gen thông thường. Nguyên liệu ban
đầu có thể được sử dụng như sợi nấm, tế bào trần hoặc bào tử. Chuyển gen bằng

phương pháp ATMT tạo một tỷ lệ cao các thể đột biến ngẫu nhiên do T-DNA chèn
vào hệ gen vật chủ[12, 61, 68]. Ngoài ra, chuyển gen bằng phương pháp này có thể


tạo ra các trao đổi chéo tương đồng. Do đó là công cụ hữu ích để xóa và xác định các
chức năng của gen [63].
Để xác định chức năng của một gencụ thể, phương pháp hữu hiệu nhất là gây
đột biến xóa hoặc làm hỏng gen đó. Xóa một gen cụ thể ởSaccharomyces
cerevisiaeđạt hiệu quả cao và chỉ cần hai đoạn tương đồng nhỏ (50 bp) ở hai phía
trình tự mã hóa[91].Tuy nhiên, ở nấm sợi cần hai đoạn tương đồng kích thước lớn
hơn.Xóa gen sử dụng phương pháp ATMT được ghi nhận là có hiệu quả cao hơn so
các phương pháp chuyển gen khác. Hiệu quả xóa gen dao động từ 14% đến 75%, cao
hơn hẳn so với các phương pháp chuyển gen thông thường[63].

1.2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen
Hiện nay, marker dùng trong chọn lọc các thể chuyển gengồm 2 loại là gen
kháng kháng sinhvà các gen liên quan đến sinh tổng hợp một hay nhiều hợp chất
thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của nấm.

1.2.4.1. Gen kháng kháng sinh dùng trong chuyển gen ở nấm
Các loại kháng sinh kháng nấm thông dụng nhất được sử dụng trong chọn lọc
thể chuyển gen là hygromycin B, phleomycin và nourseothricin. Hygromycin B là
một loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, được sản xuất từxạ khuẩn
Streptomyces hygroscopicus. Chúng có thể tiêu diệt vi khuẩn, nấm và các tế bào nhân
chuẩn bằng cách ức chế tổng hợp protein[76]. Phleomycin được sản xuất bởi xạ
khuẩn Streptomyces verticillus, là một kháng sinh phổ rộng có hiệu quả chống lại hầu
hết các loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, thực vật và tế bào động vật. Kháng sinh
phleomycin thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide, gây chết tế bàobằng cách bám vào
DNA và làm phá vỡ sợi kép của DNA dẫn đến các hoạt động của tế bào bị ngừng và
chết[9]. Nourseothricin, với tên thương mại là clonNAT, thuộc nhóm kháng sinh

aminoglycoside có nguồn gốc từ loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Kháng sinh
nàyhoạt động bằng cách gây lỗi mã hóa trong quá trình dịch mã dẫn tới không tổng


hợp được protein. ClonNAT được dùng rất phổ biến làm marker chọn lọc thể chuyển
gen gồm cả vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tế bào thực vật [39].

1.2.4.2. Gen trợ dưỡng dùng làm marker cho chuyển gen
Chủng nấm đột biến trợ dưỡng là các chủng mất khả năng sinh tổng hợp một
loại axit amin hoặc một hợp chấtcần thiết trong quá trình sinh trưởng, việc mất khả
năng tự tổng hợp khiến chúng không còn khả năng sinh trưởng trên môi trường tối
thiểu mà cần phải bổ sung thêm axit amin hoặc hợp chất tương ứng. Gen trợ dưỡng
được sử dụng nhiều nhất trong chọn lọc thể chuyển gen là gen pyrG (mã hóa protein
tham gia quá trình tổng hợp uridine/uracil)[49, 59, 94]. Ngoài ra còn có các gen trợ
dưỡng khác cũng được sử dụng nhưadeA(gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp
adenine), met(gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp methionine), trp(gen mã hóa
enzyme tham gia quá trình tổng hợp tryptophan), argB (gen mã hóa enzyme tham gia
quá trình tổng hợp arginine)…[30, 116].
Các marker dùng cho chọn lọc các thể chuyển gen giữ vai trò hết sức quan
trọng, quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen. Phần lớn các nghiên cứu
chuyển gen vào nấm sợi sử dụng các chất kháng sinh diệt nấm. Tuy nhiên, các kháng
sinh này thường có giá thành rất cao, khiến việc chuyển gen bị hạn chế. Bên cạnh đó,
nhiều loài nấm sợi (tiêu biểu là A. oryzae) có khả năng kháng tự nhiên với nhiều loại
kháng sinh hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh rất cao.Do đó việc sử dụng
kháng sinh trong chọn lọc thể chuyển gen là không khả thi[96]. Để khắc phục nhược
điểm này, một số loài nấm sợi đã được cải biến di truyền để có thể sử các gen trợ
dưỡng dụng làm các marker chuyển gen. Chuyển gen vào các chủng trợ dưỡng giúp
giảm chi phí, an toàn đối với môi trường và có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực
tiễn.

1.2.4.3. Marker pyrG
Uridine 5’-monophosphate (UMP) và uracil là những hợp chất quan trọng
trong quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, bởi chúng liên quan đến sự tổng
hợp các axit nucleic cần thiết cho mọi tế bào sống. Sinh tổng hợp UMP được thực


hiện bởi enzyme orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase)
được mã hóa bởi gen pyrG ở nấm sợi hoặc gen URA3 ở nấm men [13, 49]. Gen pyrG
giúp tế bào nấm tự tổng hợp UMP trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên với những
chủng đột biến hỏng gen pyrG, chúng chỉ có thể sinh trưởng được trong điều kiện
môi trường ngoại bào có bổ sung uridine hoặc uracil. Khi gen pyrG được đưa trở lại
các chủng đột biến này, chúng có thể sinh trưởng bình thường. Chính vì lý do đó
nhiều nghiên cứu trước đây đã sử dụng gen pyrG làm marker chọn lọc trong quá
trình chuyển gen [13, 58, 73, 104, 107].
Với chủng tự nhiên (wild type), hoạt động của enzyme OMP decarboxylase
mã hóa bởi gen pyrGsẽ chuyển hóa hợp chất 5-fluoroorotic acid (5-FOA) không độc
thành chất gây độc tế bào là 5-fluorouracil. Ngược lại, các chủng bị đột biến sai hỏng
về gen pyrG sẽ không thể chuyển hóa hợp chất 5-FOA và các chủng này có thể sinh
trưởng bình thường trên môi trường chứa 5-FOA.Chính vì vậy 5-FOA thường được
bổ sung vào môi trường trong quá trình chọn lọc các chủng vi nấm đột biến hỏng
hoặc mất gen pyrG. Việc đưa gen pyrGquay trở lại thể đột biến tương ứng sẽ giúp thể
đột biến tự tổng hợp uridine/uracil và sinh trưởng được trên môi trường tối thiểu
(không bổ sung uridine/uracil)[116].
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hànhnhằm tạo ra các chủngnấm sợi trợ dưỡng
uridine/uracil, trong đó có các loài thuộc chi Aspergillus. Phương pháp phổ biến nhất
để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil là chiếu tia UV sau đó sàng lọc trên
môi trường chọn lọc có chứa hợp chất 5-FOA, uridine và uracil[34, 49, 104]. Ngoài
cách chiếu UV, thể đột biến trợ dưỡng uridine/uracil còn được tạo ra nhờ phương
pháploại bỏ trực tiếp gen pyrG thông qua việc chuyển cấu trúc xóa gen pyrGvào tế
bào nấm. Nhờ cơ chế trao đổi chéo tương đồng, gen pyrG trong hệ gen của nấm có

thể được loại bỏ để tạo ra thể đột biến mất khả năng tổng hợp uridine/uracil[25, 49,
116].

1.2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm


Gen chỉ thị mã hóa các protein tương ứng được sử dụngtrong đánh giá hiệu
quả chuyển gen hoặc dùng như dấu hiệu để sàng lọc các thể chuyển gen. Sự có mặt
của gen chỉ thịkhiến các tế bào/khuẩn lạc của thểchuyển gen có kiểu hình khác biệt
và dễ dàng phân biệt với các chủng tự nhiên.Gen chỉ thị không gây ảnh hưởng đến
chức năng sinh lý cũng như sinh trưởng của các thể chuyển gen[33].
Ngược lại với marker chọn lọc bảo vệ thể chuyển gen trên môi trường chọn
chọn lọc và gây chết hoặc ngăn chặn sự phát triển của chủng tự nhiên, gen chỉ thị
được sử dụng để sàng lọc các chủng chuyển gen làm cho các tế bào/khuẩn lạc chứa
gen chỉ thịcó đặc điểm có thể quan sát trực quan bằng mắt. Các gen chỉ thị có thể
được gắn liền với gen đích và được điều khiển dưới cùng một promoter hoặc biểu
hiện độc lập mà không có gen đích đi kèm.Một số các gen chỉ thị hay được sử dụng
như: GFP, DsRed, GUS, lacZ…[40, 69, 72]. Các gen chỉ thị được dùng phổ biến
trong chuyển genở nấm sợi là gen mã hóa protein huỳnh quang xanhGFP và gen mã
hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed.

1.2.5.1. Gen mã hóa huỳnh quang xanh (GFP)
Gen GFPcó chiều dài 720 bp được phân lập lần đầu tiên từ sứa
Aequoreavictoria bởi Osamu Shimomura năm 1962.GFP mã hóa protein có kích
thước 238 axit amin (26,9 kDa). Protein này phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh lá
cây khi tiếp xúc với ánh sáng bước sóng 509 nm (Hình 1.5)[78, 89].
Trong lĩnh vực sinh học phân tử, genGFP thường được sử dụng như một gen
chỉ thịtrong chuyển gen và biểu hiện gen. GFPthường được đưa vào tế bàothông qua
các kỹ thuật chuyển gen vàsự tích hợp của GFP trong hệ gen của tế bào có thể đủ
bền vững qua các thế hệ sau. Đến nay, GFP đã được biểu hiện ở nhiều loài, bao gồm

cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, trong đó có nấm sợi[52].


Hình 1.5.Biểu hiện genGFPởnấm sợiAspergillus fumigatus[35]
Gen huỳnh quang GFPrất hữu ích trong việc nghiên cứu xác định vị trí của
protein hoặc kiểm tra mức độ biểu hiện của một gen mong muốn. Trong nghiên cứu
phát triển các phương pháp chuyển gen, biểu hiện gen chỉ thị GFPđã được chứng
minh là thành công trên nhiều loài nấm sợi như Aspergillus fumigatus [35],
Aspergillus oryzae[56], Aspergillus nidulans[5], Aspergillus niger[21], Fusarium
oxysporum[48]…

1.2.5.2. Gen mã hóa huỳnh quang đỏ (DsRed)
Gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRedcó chiều dài 678 bp được phân lập
từ một loài san hô thuộc chi Discosoma. Protein DsRed gồm 226 axit amin với kích
thước 28 kD, phát huỳnh quang màu đỏ và tín hiệu huỳnh quang mạnh nhất khi được
quan sát dưới ánh sáng bước sóng 583 nm[3].Do đặc tính tương tự như gen huỳnh
quang GFP nên DsRed cũng được sử dụng làm gen chỉ thị trong nghiên cứu ở nhiều
loài sinh vật khác nhau. Riêng với nấm sợi, gen DsRed được biểu hiện thành công
trên nhiều loài như Sordaria macrospora[15], Fusarium oxysporum[70],Acremonium
chrysogenum[32], Aspergillus fumigatus[44]…Các tế bào nhận được gen DsRed sẽ
có màu đỏ dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng phù hợp (Hình 1.6).


Hình 1.6. Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợiFusarium oxysporum[70]


Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Chủngvi sinh vật

Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu
STT

Tên chủng

Phân loại

Nguồn gốc

1

RIB40

A. oryzae

National Research Institute of Brewing
(Nhật Bản)

2

AUT1-PlD

A. oryzae

Bộ mônCông nghệ Sinh học, Đại học
Tokyo, Nhật Bản

3

VTCCF 032

A. oryzae

Viện Vi sinh vật học và Công nghệSinh
học, ĐHQGHN

4

VTCCF 040

A. oryzae

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN

5

VTCCF 047

A. oryzae

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

Sinh

học, ĐHQGHN
6

VTCCF 048

A. oryzae

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

Sinh

học, ĐHQGHN
7

VTCCF 051

A. oryzae

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh
học, ĐHQGHN


8

VTCCF 053

A. oryzae

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

Sinh

học, ĐHQGHN
STT

Tên chủng

Phân loại

9

VTCCF 912

A. oryzae

Nguồn gốc
Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

Sinh

học, ĐHQGHN
10

VTCCF 914

A. oryzae

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

Sinh

học, ĐHQGHN
11

VS1

A. oryzae

Phòng Genomic- Phòng thí nghiệm Trọng
điểm Công nghệ Enzyme và Protein,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

12

NRRL 3357

A. flavus

ARS (NRRL) Culture Colection (Mỹ)

13

VTCCF 013

A. flavus

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh
học, ĐHQGHN

14

N402

A. niger

CBS Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan)

15

VTCCF 015

A. fumigatus

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh
học, ĐHQGHN

16

VTCCF

A. fumigatus

Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh
học, ĐHQGHN

1414
17

FGSC A4

A. nidulans

Fungal Genetics Stock Center (Mỹ)

18

DH5α

E. coli

[22]

19

AGL1

A. tumefaciens

[43]


ChủngA. tumefaciens AGL1 là chủng đã được cải biến di truyền và được
sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào nấm. Chủng AGL1 mang gen
kar kháng kháng sinh kanamycin sử dụng trong chọn lọc các chủng mang vector
nhị thể.
Chủng A. oryzae AUT1-PlD có nguồn gốc từ chủng RIB40. Chủng n{yđ~
bị xóa gen pyrG trong hệ gen v{ được sử dụng trực tiếp để chuyển gen sử
dụng marker pyrG.

2.1.2. Thiết bị và hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật và trong các thí nghiệm
sinh học phân tử gồm: glucose, sucrose, KCl, NaCl, MgSO4, KH2PO4, K2HPO4,
FeSO4, MnSO4, glycerol, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl,
SDS…Các hóa chất với độ tinh khiết cao được mua từ những hãng uy tín như

Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Biozym.
Các mồi dùng cho phản ứng PCR do công ty IDT (Singapore) tổng hợp. Danh
sách mồi được liệt kê ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Mồi PCR dùng trong nghiên cứu

Tên mồi

Trình tự (5’-3’)

ITS1

TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS4

TCCTCCGCTTATTGATATGC

Enzyme
giới hạn

Kích
thƣớc

Tham
khảo
[114]

486[114]
599 bp

ATGGCCGCCGGGGGCTCT

[10]

AFB-F

AAGCAAACCAAGACCAACAAG

[10]

AFB-R

AACAAGTCTTTTCTGGGTTCTA

Aof-ITS-F

116 bp
P1
P2

[10]

GGGGAATTCGAGCTCTGAAATCAAATC
CTGCCTACC

EcoRI

AAAGGGCCCCTCGAGTGCACTAGCCAC

XhoI

1,41 kb