Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen Phương Nam ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ THỊ HẠNH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ
PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VIRUS
LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số

: 62 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội1 – 2017


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
Thầy hƣớng dẫn 1: PGS.TS. Phạm Xuân Hội
Thầy hƣớng dẫn 2: PGS.TS. Hà Viết Cƣờng

Phản biện 1: ……………………………
Phản biện 2:…………………………….
Phản biện 3:…………………………….

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà

nƣớc họp tại:Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi
giờ
ngày
tháng
năm 2017

-

Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
Thƣ viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
2


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của tề tài
Việt Nam là quốc gia trồng lúa và là một trong các nƣớc xuất
khẩu lúa hàng đầu thế giới. Sản xuất lúa có vai trò cực kỳ quan trọng
đối với khoảng 70% dân số nông nghiệp và an ninh lƣơng thực của
đất nƣớc. Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm
nhất và là nguyên nhân chính làm cho sản lƣợng lúa không ổn định
và tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Dịch bệnh vius mỗi khi xảy ra
thƣờng để lại những hậu quả nghiêm trọng, xảy ra luân phiên và tái
bùng phát dịch sau một khoảng thời gian nhất định.
Virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam (Southern rice black-streaked
dwarf virus-SRBSDV)gây bệnh lúa lùn sọc đen đƣợc phát hiện lần
đầu tiên vào năm 2001 tại các vùng trồng lúa thuộc tỉnh Quảng
Đông, phía Nam Trung Quốc. Virus này là thành viên mới thuộc
nhóm Fijivirus-2, họ Reoviridae. Triệu chứng chủ yếu của cây lúa

nhiễm bệnh thƣờng thấy là cây lúa tƣơng đối thấp lùn, lá xanh đậm,
lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách mép lá và đặc biệt có những
u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá
hoặc các đốt thân. Bệnh chủ yếu nhiễm trên các cây thuộc dạng thực
vật thân cỏ nhƣ: lúa, ngô, cỏ. Môi giới truyền bệnh của SRBSDV là
rầy lƣng trắng và rầy nâu nhỏ nhƣng chỉ có rầy lƣng trắng mới có khả
năng truyền SRBSDV từ lúa sang ngô. Hệ gen virus có chiều dài
29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi có kích thƣớc từ 1,8 đến
4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 nhƣng hầu hết đều
chƣa đƣợc xác định chức năng. Dựa vào mức độ bảo thủ protein,
phân đoạn S9 và S10 có mức độ bảo thủ cao, mã hóa cho protein vỏ
1


của virus, do vậy thích hợp để nghiên cứu chẩn đoán. Phân đoạn S7
cũng có mức bảo thủ cao và mã hóa protein P7.1 có vai trò quan
trọng trong tiến hóa, do vậy thích hợp để nghiên cứu mức độ biến
động trong quần thể virus.
Ở Việt Nam, dịch bệnh lúa lùn sọc đen đƣợc phát hiện thấy lần
đầu tiên trên lúa mùa năm 2009 tại 20 tỉnh miền Bắc và miền Trung
với diện tích lúa nhiễm bệnh lên tới 42.000 ha. Vì là virus mới và lần
đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam nên công tác chẩn đoán gặp rất nhiều
khó khăn. Hai kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus hiện đại và phổ biến
nhất hiện nay là kỹ thuật RT-PCR và E IS . Trong khi kỹ thuật
chẩn đoán bằng RT-PCR cho kết quả có độ chính xác cao thì kỹ thuật
chẩn đoán bằng ELISA cho kết quả tƣơng đối chính xác, kỹ thuật
đơn giản, giá thành rẻ nên rất phù hợp với điều kiện Việt Nam. Tuy
nhiên, do chƣa có kháng thể đặc hiệu nên việc chẩn đoán cây bị
nhiễm SRBSDV đều đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp RT-PCR sử
dụng cặp mồi từ Trung Quốc hoặc tự thiết kế dựa trên trình tự phân

đoạn S10 của một số mẫu bệnh. Ngoài ra, các virus thực vật vốn có
tốc độ đột biến rất cao do đặc tính mắc lỗi sao mã của enzyme RdRP
(RNA dependent RNA polymerase) của virus, sự thay đổi nhanh
chóng các lực tiến hóa nhƣ ký chủ và vector cũng nhƣ bản chất bộ
gen phân đoạn nên khả năng hình thành các chủng/loài virus mới rất
cao. Cho đến nay, chúng ta vẫn chƣa có một nghiên cứu nào về đánh
giá đa dạng di truyền SRBSDV gây bệnh ở các vùng sinh thái trồng
lúa khác nhau ở Việt Nam cũng nhƣ nghiên cứu chuẩn hóa quy trình
chẩn đoán SRBSDV. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề
tài: “Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán
virus lúa lùn sọc đen Phương Nam ở Việt Nam”.
2


2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở các vùng sinh thái trồng
lúa khác nhau của Việt Nam dựa trên kết quả giải trình tự phân
đoạn S7, S9 và S10.
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng kỹ
thuật RT-PCR và ELISA.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng
- Các mẫu virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam ở Việt Nam.
- Các mẫu lúa nhiễm bệnh, sạch bệnh và các mẫu rầy nhiễm, sạch
virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam
Nội dung
- Phân lập, giải trình tự ba phân đoạn S7, S9, S10 của 13 mẫu
SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái ở Việt Nam và đánh
giá đa dạng di truyền.
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV tại Việt Nam

bằng kỹ thuật RT-PCR.
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV tại Việt Nam
bằng ELISA.
4. Tính mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu chuyên
sâu và có hệ thống về đa dạng di truyền virus lúa lùn sọc đen phƣơng
Nam và bƣớc đầu chứng minh chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệ
di truyền gần gũi hơn với mẫu SRBSDV Quảng Đông.
Luận án đã phát triển thành công kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV
bằng RT-PCR cho kết quả chính xác 100% với các mẫu lúa nhiễm
bệnh đã biểu hiện rõ triệu chứng và có thể phát hiện sớm mẫu lúa
nhiễm bệnh chƣa biểu hiện rõ triệu chứng.
3


Luận án cũng là công trình nghiên cứu đầu tiên tạo thành công
kháng thể đa dòng kháng virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam bằng
protein/peptide tái tổ hợp; kháng thể đa dòng có tính đặc hiệu cao, có
thể phát hiện virus ở cả mẫu lúa và rầy nhiễm virus.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Luận án cung cấp các cơ sở dữ liệu, thông tin khoa học mới về đa
dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam, cung cấp tƣ liệu khoa học mới
về cơ sở khoa học và khả năng áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
trong chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam
Kết quả đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam làm cơ
sở cho nghiên cứu chẩn đoán, diễn biến phát dịch và đề xuất các biện
pháp phòng trừ hiệu quả giúp giảm thiểu tổn thất mùa màng cho
ngƣời nông dân.
Kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR có độ chính xác
cao, phát hiện đƣợc sự có mặt của virus trong những cây lúa chƣa

biểu hiện rõ triệu chứng và chẩn đoán virus bằng ELISA phát hiện
nhanh sự có mặt của virus trong mẫu lúa và mẫu rầy nhiễm virus rất
có ý nghĩa trong công tác chẩn đoán sớm và chính xác tác nhân gây
bệnh.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án dày 152 trang đánh máy vi tính khổ A4 với 6 bảng số
liệu, 49 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài
liệu 34 trang; Vật liệu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 22
trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 71 trang; Kết luận và kiến
nghị 02 trang. Đã tham khảo 125 tài liệu bao gồm 23 tài liệu tiếng
Việt và 102 tài liệu tiếng Anh.

4


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁC VIRUS HẠI LÚA

Virus hại lúa đã có từ lâu và đƣợc xem là bệnh hại nguy hiểm
hàng đầu ở cây lúa trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.
Tuy nhiên phải đến năm 1895 các nhà khoa học Nhật Bản mới
nghiên cứu và lần đầu tiên virus gây bệnh lúa vàng lùn (Rice dwarf
virus-RDV) đƣợc phát hiện. Tiếp theo, virus lúa lùn sọc đen
(RBSDV) đƣợc phát hiện và rất nhiều virus hại lúa khác đƣợc xác
định nhƣ virus gây bệnh Tungro (Tungro baccili-form virus-RTBV
và Tungro spherical virus-RTSV), vàng lá di động (RTYV- Rice
transitory yellow-ing virus), lá khảm đốm chết (RNMV-Rice necrosis
mosaic virus), lùn xoắn lá (RRSV-Rice ragged stunt virus), vàng lùn
(RGSV- Rice grassy stunt virus), trắng lá lúa (RHBV-Rice hoja
blanca virus)… Cho tới nay, đã có 16 loại virus gây hại trên lúa đƣợc

phát hiện.
Các virus phát hiện (vàng lùn, lùn xoắn lá, tungro, lùn sọc đen
phƣơng Nam...) ở Việt Nam đều có tầm quan trọng kinh tế và lan
truyền qua rầy. Việc chẩn đoán các virus trên lúa thƣờng khó do triệu
chứng có thể bị nhầm lẫn do sử dụng thuốc trừ cỏ hoặc các nguyên
nhân sinh lý. Phát hiện virus trên rầy buộc phải sử dụng các kỹ thuật
chẩn đoán nhƣ E IS hoặc PCR.
1.2. ĐẶC ĐIỂM CÁC FIJIVIRUS THUỘC HỌ REOVIRIDAE

Các virus thuộc họ Reoviridae đƣợc đặc trƣng bởi bộ gen RN
sợi kép (dsRN ), phân đoạn, bao gồm 9 đến 12 phân tử RNA sợi kép
mạch thẳng. Chi Fijivirus có hệ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA
sợi kép, mạch thẳng (S1-S10). Các phân tử RN
dao động từ 1,4 kb đến 4,5 kb.
5

này có kích thƣớc


1.3. VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG N M

Bệnh lúa lùn sọc đen phƣơng nam lần đầu tiên xuất hiện ở tỉnh
Quảng Đông, Trung Quốc (2001) và đƣợc xem là một biến chủng
của RBSDV. Cây lúa bị nhiễm SRBSDV sinh trƣởng còi cọc, lá xanh
đậm, xoăn trắng ở lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu
trắng hoặc đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các
đốt thân. Rầy lƣng trắng và một tỷ lệ nhỏ rầy nâu nhỏ là vector
truyền SRBSDV. Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29124 bp, gồm
10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb. Trong
đó, phân đoạn S7 dài 2176 bp, chứa hai ORF mã hóa hai protein

(40,5 kDa và 36,4 kDa); phân đoạn S9 dài 1899 bp, chứa hai ORF
mã hóa hai protein (39,9 kDa và 24,2 kDa); phân đoạn S10 dài 1797
bp, chứa một ORF mã hóa protein (62.6 kDa) hình thành lớp vỏ
ngoài của phân tử virus. SRBSDV có sự tƣơng đồng về triệu chứng,
phổ ký chủ, hình thái học phân tử virus, huyết thanh học với các
thành viên khác trong chi Fijivius, đặc biệt là RBSDV. Hai kỹ thuật
chẩn đoán SRBSDV phổ biến nhất là thử nghiệm miễn dịch liên kết
men (E IS ) và phản ứng trùng hợp chuỗi (RT-PCR).
1.4. VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG N M Ở VIỆT NAM

SRBSDV lần đầu tiên xuất hiện vào tháng 8 2009, tại Nghệ An,
sau đó lan ra tại 20 tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ với diện tích bị
hại tới 42.000 ha. Do tính chất nghiêm trọng của SRBSDV, ngoài
việc xác định tác nhân gây bệnh, nhiều nghiên cứu về bản chất hệ
gen và đa dạng di truyền của SRBSDV ở Việt Nam đƣợc nghiên cứu
trong thời gian qua. Năm 2010 và 2011, bệnh có xu hƣớng mở rộng
ra nhiều địa bàn trồng lúa khác nhau và có tới 34 tỉnh có diện tích
trồng lúa bị bệnh.
6


Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Vật liệu thực vật
13 mẫu lúa nhiễm bệnh lúa lùn sọc đen đặc trƣng đƣợc xác định
bằng RT-PCR và ELISA và các mẫu lúa nghi nhiễm bệnh thu thập
vào vụ xuân và vụ mùa các năm 2009-2012 tại các tỉnh: Thái Bình,
Nam Định, Ninh Bình, Sơn a, ào Cai, Nghệ An, Quảng Trị, Huế

do phòng Bệnh học phân tử - Viện di truyền Nông nghiệp cung cấp.
Các mẫu rầy khỏe, rầy nhiễm SRBSDV; các cây lúa nhiễm
SRBSDV, RRSV lây nhiễm nhân tạo đƣợc cung cấp bởi Trung tâm
bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Bảng 2.1. Mẫu lúa nhiễm SRBSDV dùng trong nghiên cứu
STT

Tên mẫu

Giống lúa

Thời vụ

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

SonLa-1
SonLa-2
LaoCai -1

NinhBinh-1
NinhBinh-2
ThaiBinh-1
ThaiBinh-2
NamDinh-1
NgheAn-1
QuangTri-1
QuangTri-2
Hue-1
Hue-2

Xén cù
Xén cù
Nhị ƣu 838
BT7
BT7
BT7
BT7
BT7
Xi 23
Nhị ƣu 986
Xi 23
Nhị ƣu 986
Nhị ƣu 986

Vụ xuân 2010
Vụ xuân 2010
Vụ xuân 2009
Vụ mùa 2009
Vụ mùa 2010

Vụ mùa 2009
Vụ mùa 2010
Vụ mùa 2009
Vụ mùa 2009
Vụ xuân 2010
Vụ xuân 2010
Vụ xuân 2010
Vụ xuân 2010

Địa điểm
thu mẫu
Sơn a
Sơn a
Lào Cai
Ninh Bình
Ninh Bình
Thái Bình
Thái Bình
Nam Định
Nghệ An
Quảng Trị
Quảng Trị
Huế
Huế

2.1.2. Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α mua của hãng Invitrogen, E.coli
7

Rosetta (DE3) mua của hãng Novogen.
2.1.3. Vector và oligonucleotide
Vector pET28a/P10 do phòng Bệnh học phân tử, Viện di truyền
Nông nghiệp cung cấp; pET32a mua của hãng Novogen; pGEM-T
mạch thẳng có đầu T mua của hãng Promega.
Các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu đặt mua từ hãng
Invitrogen và Sigma.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam.
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng RT-PCR.
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng ELISA.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA
- Định lƣợng protein bằng bằng phƣơng pháp Bradford.
- Thiết kế mồi dựa trên trình tự đƣợc công bố trên GenBank
(EU784841.1, EU784843.1, EU784840).
- Nhân bản DNA/RNA bằng PCR và RT-PCR.
- Nhân dòng và giải trình tự DNA.
- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR.
- Xác định vùng gen mã hóa polypeptide giàu tính kháng nguyên
bằng phần mềm Immune Epitope Database Analysis Resource.
- Thiết kế vector biểu hiện gen đích trong tế bào vi khuẩn.
- Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV theo phƣơng pháp
Amero (1994) và Regenmortel (1993).
- Phƣơng pháp kháng nguyên kháng thể: Kỹ thuật Western blot
của Sambrook & Rusel (2001); kỹ thuật Dot-blot của Wang
(2012); kỹ thuật PTA-ELISA của Mowat & Dawson (1987).
8

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU Đ DẠNG DI TRUYỀN SRBSDV Ở VIỆT NAM

Mục tiêu của phần nghiên cứu này là đánh giá đặc điểm phân tử
và đa dạng di truyền SRBSDV của Việt Nam dựa trên trình tự 3 phân
đoạn S7, S9 và S10 của các mẫu virus thu thập từ các vùng sinh thái
trồng lúa Việt Nam.

Hình 3.2. Tinh sạch phân đoạn S10, S9 và S7
Ghi chú: Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: hệ gen SRBSDV; giếng
2: phân đoạn S10; giếng 3: phân đoạn S9; giếng 4: phân đoạn S7.

Hệ gen của 13 mẫu SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái
trồng lúa đƣợc tách chiết và điện di trên gel agarose. Các băng RN
tƣơng ứng với các phân đoạn S7, S9 và S10 đƣợc tinh sạch từ gel
agarose. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tinh sạch có kích thƣớc
tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của các phân đoạn (Hình 3.2).
Phân đoạn S7, S9, S10 đƣợc dòng hóa vào vector nhân dòng
pGEM-T, giải trình tự và phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm
MEGA5.
Kết quả giải trình tự cho thấy thấy tất cả các phân đoạn S7, S9
và S10 của 13 mẫu SRBSDV phân lập tại Việt Nam đều có kích
thƣớc giống nhau, lần lƣợt là 2176 bp, 1849 bp và 1798 bp. Mức độ
tƣơng đồng nucleotide của các mẫu virus Việt Nam với nhau dao
động từ 97,6-100% và với các chủng Trung Quốc dao động từ 97,3 99,8%. Kết quả so sánh trình tự axit amin trên các khung đọc mở cho
9

thấy chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệ di truyền gần gũi hơn với
SRBSDV Quảng Đông (Hình 3.10, Hình 3.11, Hình 3.13).

Hình 3.10. So sánh trình tự amino acid của protein P9.1

Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid của protein P9.2

Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid của protein P10
10


Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide của SRBSDV cho thấy
các mẫu Việt Nam và Trung Quốc xuất hiện xen kẽ trên cây phả hệ,
chứng tỏ chúng là một quần thể virus gây hại trong một vùng địa lý ở
cùng một thời điểm, chƣa hình thành chủng mới.
NinhBinh-2
JQ692578.1-VN
20

JN388912.1-TQ
ThaiBinh-2

60

NamDinh
Hue-1

100
80

EU784841.1-QuangDong-TQ
FN563995.1-HaiNam-TQ
HQ731498.1-ThuaThienHue

HM998850.1-TQ
Hue-2
HM585273.1-TQ
JQ034354.1-TQ

50

SonLa-1

80

SonLa-2
NgheAn

100

NinhBinh-1

80
40

LaoCai

ThaiBinh-1
QuangTri-1

100
100

QuangTri-2

2

Hình 3.9. Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự
phân đoạn S7
Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo %). Mẫu Việt
Nam được chỉ rõ bằng chấm đen. Thanh bar là số thay thế nucleotide.
33

HQ731500-VN
QuangTri-1

44
77

EU523359-HaiNam-TQ
LaoCai

44

ThaiBinh-2
22

100

HM585271-TQ

JQ692580.1-ThuaThienHue
NinhBinh-2

66
11

ThaiBinh-1

55
100

SonLa-2

100

HM998852-TQ
JQ773428-TQ

22

QuangTri-2

22

Hue-1

100
100

33

Hue-2
SonLa-1

77

33

NgheAn
JQ034356-TQ
EU784843-QuangDong-TQ
NamDinh
NinhBinh-1

Hình 3.12. Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự
phân đoạn S9
Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo % (1000 lần lặp).
Mẫu Việt Nam được chỉ rõ bằng chấm đen.

11


ThaiBinh-2
GQ472845-TQ
SonLa-1
LaoCai
NinhBinh-1

57
28

71

NinhBinh-2
HM585270-TQ

57

JQ692581.1-ThuaThienHue

85
100

EU784840-QuangDong-TQ
JQ034357-TQ

42

NamDinh
100

HQ731501-VN
EU523360-HaiNam-TQ

NgheAn
SonLa-2
HQ394212-TQ
100

ThaiBinh-1
100

100

QuangTri-1

100

Hue-1
100

QuangTri-2
Hue-2

5

Hình 3.14. Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự
phân đoạn S10
Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo %). Mẫu Việt
Nam được chỉ rõ bằng chấm đen. Thanh bar là số thay thế nucleotide
3.2. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN SRBSDV
BẰNG RT-PCR

Quy trình chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV của Việt Nam bằng kỹ
thuật RT-PCR đƣợc tối ƣu các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ: vị trí lấy mẫu,
phƣơng pháp chiết RNA, trình tự mồi, loại phản ứng RT-PCR, điều
kiện phản ứng RT-PCR.
Phản ứng RT-PCR tối ƣu cho quy trình xét nghiệm SRBSDV có
thành phần bao gồm 8,6 µl ddH2O, 0,6 µl mỗi loại mồi (Fw:
CACCCCACATCGCGTCATCT, Rv: CCCATTTGAGCAGGAAC
TTCAC), 0,5 µl RN

khuôn, 1,5 µl đệm 10X, 1,5 µl dNTP 2 mM,

0,2 µl Taq DNA polymerase 5 U/µl; 0,75 µl Reverse transcriptase 4
U/µl, 0,75 µl Ribolock Rnase và chu trình nhiệt là: 42oC - 10 phút,
94oC - 5 phút, (94oC - 30 giây, 56oC - 20 giây, 72oC - 1,5 phút) x 35
chu kỳ, 72oC - 7 phút, bảo quản ở 4oC.
12


Tiến hành thử nghiệm quy trình đã tối ƣu đƣợc đối với 192 mẫu
lúa gồm 102 mẫu khô và 90 mẫu tƣơi (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Thử nghiệm quy trình chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR
Loại mẫu
Lúa sạch bệnh
Lúa nhiễm RRSV
Lúa thu thập từ vùng
dịch, đã giải trình tự gen
Lúa lây nhiễm nhân tạo
biểu hiện bệnh
Lúa lây nhiễm nhân tạo
chƣa biểu hiện bệnh
Lúa thu thập từ các
vùng dịch

Dạng bảo
quản

Tình trạng
nhiễm
Tƣơi Khô SRBSDV

Kết quả chẩn đoán
Mồi đặc Tỉ lệ phát
hiệu hiện bệnh
0/10
0%
0/5
0%

10
0

0
5

Không
Không

Mồi
Actin
10/10
5/5

0

13

Nhiễm

13/13

13/13

100 %

64

0

Nhiễm

64/64

64/64

100 %

10

0

Nghi nhiễm

10/10

2/10

20 %

6

84

Nghi nhiễm

90/90

79/90

88 %

Kết quả thử nghiệm cho thấy quy trình đƣợc xây dựng phát hiện
chính xác 100% sự có mặt của SRBSDV trong mẫu bệnh, bao gồm
cả mẫu tƣơi và mẫu khô, có thể phát hiện sự có mặt của SRBSDV ở
giai đoạn cây chƣa biểu hiện bệnh.
3.3. PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN SRBSDV BẰNG ELISA

Mục tiêu của nội dung nghiên cứu này là tạo kháng thể đặc hiệu
virus và phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam bằng kỹ
thuật E IS . Các định hƣớng tạo kháng thể đa dòng nhƣ: (1) sử
dụng hạt virus tinh chiết từ cây nhiễm bệnh hoặc (2) sử dụng protein
vỏ (dạng đầy đủ hoặc một đoạn peptide) tái tổ hợp.
3.3.1. Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV bằng hạt virus
tinh chiết
Hạt virus đƣợc tinh chiết từ mẫu lúa lây nhiễm nhân tạo
SRBSDV để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ. Kháng thể IgG tinh
sạch đƣợc kiểm tra bằng PTA-ELISA. Kết quả thu đƣợc cho thấy
13

kháng thể IgG tinh sạch có hiệu giá là 1/200 (Hình 3.30) và phát hiện
chính xác sự có mặt của SRBSDV trong mẫu cây bệnh (Hình 3.31).

Hình 3.30. Xác định hiệu giá kháng thể IgG bằng PTA- ELISA
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng theo tỉ lệ:1/100,
1/200, 1/500, 1/1000, mẫu dịch chiết cây bệnh (cột màu xanh) và cây khỏe
(cột màu đỏ). Đồ thị thể hiện ODA405 trung bình 3 lần xét nghiệm.

Hình 3.31. Xét nghiệm SRBSDV trong mẫu lúa bệnh
Ghi chú: Mẫu dich chiết cây được pha loãng theo tỷ lệ 1/5; 1/10 và 1/20.
Kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng theo tỉ lệ:1/200, mẫu dịch chiết
cây bệnh (cột màu xanh) và cây khỏe (cột màu đỏ). Đồ thị thể hiện giá trị
ODA405 trung bình của 3 lần xét nghiệm.

3.3.2. Nghiên cứu tạo kháng thể kháng SRBSDV bằng protein
vỏ tái tổ hợp P10 của SRBSDV
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu của
SRBSDV bằng protein vỏ tái tổ hợp sử dụng vector pET28a/P10.
Protein tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong vi khuẩn E. coli Rossetta
và tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực Ni2+ agarose (Hình 3.33). Protein
14


tái tổ hợp tinh sạch đƣợc sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên
chuột. Kháng thể IgG đƣợc tinh sạch từ kháng huyết thanh (đã kiểm
tra đáp ứng miễn dịch) bằng cột sắc ký ái lực Protein A-sepharose
(Hình 3.35).

Hình 3.33. Tinh sạch protein P10 bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA
Ghi chú: (A) Dịch chiết tế bào và các phân đoạn tinh sạch protein được

điện di trên gel SDS-PAGE 12%. (B). Protein P10 được phát hiện bằng
kháng thể anti-His-tag pha loãng 1: 5000. MK: thang chuẩn protein; giếng
1: Dịch chiết tế bào; giếng 2: dịch không gắn cột; giếng 3,4: phân đoạn rửa
cột; giếng 5-8: các phân đoạn đẩy cột bằng imidazol 250 mM.

Hình 3.35. Kiểm tra kháng thể IgG tinh sạch
Ghi chú: (A) Kháng thể tinh sạch qua cột Protein A-Sepharose được điện di
trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng Mk: Thang chuẩn protein; giếng 1: phân
đoạn rửa giải. (B) Khả năng phát hiện protein P10 của kháng thể IgG tinh
sạch pha loãng 1: 2000; Giếng Mk: Thang chuẩn Protein; Giếng 1: Protein
P10 tinh sạch; Giếng 2: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a (Đối chứng âm);
Giếng 3: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a/P10.

15


Hiệu giá của kháng thể đƣợc xác định kĩ thuật Dot-blot. Kết
quả thu đƣợc cho thấy kháng thể IgG sau đƣợc tinh sạch phát hiện
đƣợc protein P10 tái tổ hợp ở nồng độ pha loãng 1:6000 (Hình 3.36A
cột 2) và SRBSDV trong mẫu dịch chiết lúa và ngô bệnh ở nồng độ
pha loãng 1:5000 (Hình 3.36B).

1: 50
1: 100
1: 200

B

A

Hình 3.36. Xác định hiệu giá kháng thể tinh sạch bằng Dot-blot
Ghi chú: (A) Xác định hiệu giá của kháng thể sau tinh sạch được đánh giá
bằng protein P10 bằng phương pháp Dot-blot; kháng huyết thanh (cột 1) và
kháng thể sau tinh sạch (cột 2) được pha loãng tỉ lệ 1:1000, 1:2000, 1:3000,
1:4000, 1:5000 và 1:6000. (B) Độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch được
đánh giá bằng dịch chiết cây lúa và ngô pha loãng theo tỉ lệ 1:50, 1:100 và
1:200; mẫu kháng thể tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1:1000 và 1:5000; (+):
dịch chiết cây nhiễm SRBSDV; (-): dịch chiết cây sạch bệnh.

Độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch đƣợc tiếp tục xác định bằng
kĩ thuật ELISA sử dụng mẫu lúa nhiễm SRBSDV và RRSV. Kết quả
cho thấy kháng thể ở nồng độ pha loãng 1:5000 có khả năng nhận
biết đặc hiệu SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen (Hình
3.37), ngoài ra, kháng thể sau tinh sạch cũng có khả năng phát hiện
sớm sự có mặt của SRBSDV trong trong mẫu xét nghiệm có tỉ lệ rầy
nhiễm SRBSDV cao hơn 50% (bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân
tạo) (Hình 3.38).
16


Hình 3.37. Đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể bằng ELISA
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1/5000 và được
kiểm tra bằng ELISA với mẫu dịch chiết cây khỏe (cột màu xanh dương),
cây nhiễm SRBSDV (cột màu đỏ) và cây nhiễm RRSV (cột màu xanh lá) pha
loãng tỉ lệ 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 và 1/60. Đồ thị thể hiện giá trị ODA492
trung bình của 3 lần xét nghiệm.

Hình 3.38. Đánh giá khả năng phát hiện SRBSDV trong mẫu rầy
nhiễm SRBSDV bằng ELISA
Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1/5000 và được

kiểm tra bằng ELISA với mẫu rầy được trộn theo tỉ lệ [số rầy bệnh (B)]:[số
rầy khỏe (K)] là 0B:5K, 1B:4K, 2B:3K, 3B:2K, 4B: 1K và 5B:0K. Đồ thị thể
hiện giá trị ODA492 trung bình của 3 lần xét nghiệm. (ĐC) đối chứng âm.

3.3.3. Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng SRBSDV bằng
polypeptide giàu tính kháng nguyên
Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra kháng thể kháng P10 từ
polypeptide giàu tính kháng nguyên nhằm tăng tính đặc hiệu cho xét
17


nghiệm ELISA
Đoạn polypeptide giàu tính kháng nguyên trên protein vỏ P10
đƣợc lựa chọn bằng các phần mềm tin sinh.
Kết quả phân tích tính ƣa nƣớc, khả năng nằm trên bề mặt và cấu
trúc không gian của các vùng polypeptide trên P10 bằng phần mềm
IEDB cho thấy 2 vùng polypeptide ở vị trí 259-425 và vị trí 365-557
đƣợc dự đoán là giàu tính kháng nguyên (Hình 3.39 và 3.40) và đảm
bảo tính bảo thủ trên tất cả các mẫu SRBSDV đã phân lập ở Việt
Nam.

A

B
Hình 3.39. Dự đoán tính kháng nguyên trên protein P10
Ghi chú: Biểu đồ dự đoán tính ưa nước (A) và khả năng nằm trên bề mặt
phân tử (B) của các vùng polypeptide trên P10. Vùng màu vàng: vùng
polypeptide ưa nước và nằm trên bề mặt phân tử; vùng màu xanh: vùng
polypeptide kỵ nước và không nằm trên phân tử. Threshold: giá trị ngưỡng.

18


Hình 3.40. Dự đoán vùng polypeptide có cấu trúc không gian có
khả năng tạo epitope
Ghi chú: Các vùng polypeptide có cấu trúc không gian có khả năng tạo
epitope nằm ở vị trí 1-166 (A), 235-415 (B), 446-557 (C) trên P10.

2 đoạn nucleotide mã hóa chuỗi axit amin ở vị trí 259-425 và
365-557 (đặt tên là P10.1 và P10.2) đƣợc phân lập bằng kỹ thuật
PCR (Hình 3.41, giếng 1 và 3). Sản phẩm PCR sau đó đƣợc nhân
dòng vào vector pGEM-T.

Hình 3.41. Nhân bản đoạn gen P10.1 và P10.2 bằng PCR
Ghi chú: Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1 và 2: PCR với cặp
mồi S10-P1-Fw/ S10-P1-Rv ; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/
S10-P2-Rv; giếng 1 và 3: khuôn là pGEM/S10; giếng 2 và 4: Đối chứng âm
(khuôn là H2O)

Tiếp theo, đoạn gen P10.1 và P10.2 đƣợc cắt và ghép nối vào
vector biểu hiện pET32a. Vector tái tổ hợp đƣợc kiểm tra bằng PCR
và cắt bằng enzyme giới hạn. Kết quả thu đƣợc trên hình 3.45 cho
thấy đoạn gen P10.1 và P10.2 đã đƣợc ghép nối thành công vào
vector biểu hiện pET32a. Các vector pET32a/P10.1 và pET32a/P10.2
19


sau đó đƣợc giải trình tự bằng mồi T7.

Hình 3.45. Kiểm tra pET32a/P10.1 và pET32a/P10.2 bằng PCR

và cắt giới hạn
Ghi chú: (A) PCR pET32a/P10.1; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi S10-P1Fw/S10-P1-Rv; giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv; giếng 1 và 3:
đối chứng âm (khuôn là H2O); giếng 2 và 4: khuôn là plasmid. (B) PCR
pET32a/P10.2; giếng 1 và 2: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/S10-P2-Rv;
giếng 3 và 4: PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv; giếng 1 và 3: khuôn là
plasmid; giếng 2 và 4:đối chứng âm (khuôn là H2O).(C) Cắt giới hạn
plasmid bằng EcoRI/XhoI; giếng 1 và 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 2 và
4: plasmid nguyên bản; giếng 1 và 2: pET32a/P10.1; giếng 3 và 4:
pET32a/ 10.2. iếng : Thang DN chuẩn 1 kb.

Hình 3.46. Biểu hiện protein tái tổ hợp P10.1 và P10.2 trong tế
bào E. coli
Ghi chú: (A) Kết quả điện di dịch chiết tế bào trên SDS-PAGE 12%. (B)
Polypeptide P10.1 và P10.2 phát hiện bằng kháng thể anti-His-tag (pha
loãng 1: 5000). Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: dịch chiết tế bào
mang pET32a trống; giếng 2: thể tan của dịch chiết tế bào mang
pET32a/P10.1; giếng 3: thể cặn của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.1;
giếng 4: thể tan của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.2; giếng 5: thể cặn
của dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.2.

20


Polypeptide tái tổ hợp P10.1 và P10.2 đƣợc biểu hiện trong vi
khuẩn E. coli Rossetta (Hình 3.46) và tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực
Ni2+ agarose (Hình 3.47). Protein tái tổ hợp tinh sạch đƣợc sử dụng
để gây đáp ứng miễn dịch trên chuột.

Hình 3.1. Tinh sạch polypeptide P10.1 và P10.2 bằng sắc ký ái
lực Ni-NTA

Ghi chú: Mẫu protein được điện di trên gel SDS-PAGE 12%. (A) Kết quả
tinh sạch polypeptide P10.1; giếng 1-4: dịch rửa cột bằng imidazol 30 mM;
giếng 5-14: các phân đoạn đẩy cột bằng imidazol 250m . (B) Kết quả tinh
sạch P10.2; giếng 1: dịch chiết tế bào không cảm ứng bằng IPTG; giếng 2:
dịch chiết tế bào cảm ứng bằng IPTG; giếng 3: dịch rửa cột; giếng 4: thang
chuẩn protein; giếng 5-12: các phân đoạn đẩy cột bằng imidazol 250m

Kháng huyết thanh chuột sau 4 tuần tiêm đƣợc kiểm tra khả năng
nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn
dịch. Kết quả thu đƣợc trên hình 3.48 cho thấy kháng thể có mặt
trong 2 mẫu kháng huyết thanh chuột ở độ pha loãng 1:2000 đều có
khả năng nhận biết đặc hiệu với protein P10 tái tổ hợp tinh sạch cho
phép kết luận việc gây kháng thể đa dòng từ polypeptide P10.1 và
P10.2 tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công.

21


Hình 3.48. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của kháng huyết thanh
Ghi chú: Kháng huyết thanh chuột sau khi tiêm P10.1 (giếng 1) và P10.2
(giếng 2) 4 tuần (pha loãng 1:2000) được kiểm tra bằng lai thẩm tách miễn
dịch. Giếng Mk: thang protein chuẩn; giếng 1 và 2: mẫu P10 tinh sạch.

Hiệu giá của kháng thể đƣợc xác định bằng kĩ thuật Dot-blot. Kết
quả thu đƣợc cho thấy kháng huyết thanh tạo ra từ polypeptide P10.1
ở độ pha loãng 1:7000 (Hình 3.49 hàng 1) và P10.2 ở độ pha loãng
1:6000 (Hình 3.49 hàng 2) có thể phát hiện protein tái tổ hợp P10.

Hình 3.49. Xác định hiệu giá của kháng huyết thanh
Ghi chú: Hiệu giá của kháng huyết thanh kháng P10.1 (hàng 1) và P10.2

(hàng 2) được đánh giá bằng mẫu protein P10 tinh sạch. Kháng huyết thanh
được pha loãng tỉ lệ 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000,
1:6000,1:7000 và 1:8000.

22


KẾT LUẬN

1.

Đã phân lập và giải trình tự đầy đủ ba phân đoạn S7, S9 và

S10 của 13 mẫu SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái khác nhau
của Việt Nam với các kích thƣớc lần lƣợt là 2176 bp, 1849 bp và
1798 bp. Mức độ tƣơng đồng nucleotide của các mẫu virus Việt Nam
với nhau dao động từ 97,6-100% và với các chủng Trung Quốc dao
động từ 97,3 - 99,8%. Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide cho
thấy các mẫu virus Việt Nam và Trung Quốc là một quần thể virus
gây hại trong một vùng địa lý ở cùng một thời điểm. Kết quả so sánh
trình tự amino acid trên các khung đọc mở, SRBSDV Việt Nam có
quan hệ di truyền gần gũi hơn với SRBSDV Quảng Đông.
2.

Đã phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng

kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu S10-t1-Fw/S10-t1-Rv.
Thử nghiệm kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV trên 192 mẫu bệnh cho kết
quả chính xác 100% với các mẫu lúa nhiễm bệnh đã biểu hiện rõ
triệu chứng. Đặc biệt, kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV có thể phát hiện

sớm sự có mặt của virus ở giai đoạn cây lúa chƣa biểu hiện rõ triệu
chứng bệnh.
3.

Đã tạo thành công bốn kháng thể kháng SRBSDV từ hạt

virus gây bệnh, protein tái tổ hợp P10 và các polypeptide giàu tính
kháng nguyên để phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng
ELISA. Kháng thể tạo ra từ hạt SRBSDV ở nồng độ pha loãng 1:200
có thể phát hiện đƣợc sự có mặt của SRBSDV trong dịch chiết mẫu
cây nhiễm bệnh bằng kỹ thuật PTA - ELISA. Kháng thể tạo ra từ
protein vỏ P10 tái tổ hợp ở nồng độ pha loãng 1:5000 có thể phát
23