Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua (Đề tài NCKH)

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CÁC PHƢƠNG PHÁP NHÂN TẠO ĐỂ LÂY
NHIỄM VIRUS GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA
Mã số: ĐH2013-TN06-08

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Hải Yến

Thái Nguyên, tháng 2/2017


ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CÁC PHƢƠNG PHÁP NHÂN TẠO ĐỂ LÂY
NHIỄM VIRUS GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA
Mã số: ĐH2013-TN06-08

Xác nhận của tổ chức chủ trì
(Ký, họ tên, đóng dấu)

Thái Nguyên, tháng 2/2017

Chủ nhiệm đề tài
(Ký, họ tên)


iii


i

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI VÀ
ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Họ và tên

TT
1

TS. Nguyễn Thị Hải Yến

2

ThS. Nguyễn Thị Thu Huyền

3

ThS. Đỗ Thị Tuyến

Đơn vị công tác
Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học
Thái Nguyên
Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học
Thái Nguyên
Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học
Thái Nguyên

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
Tên đơn vị
trong và ngoài
nƣớc

Nội dung phối hợp nghiên
cứu

Họ và tên ngƣời đại diện

Khoa Khoa học Tiến hành các thí nghiệm về PGS.TS. Nguyễn Vũ
Sự sống, Trƣờng lây nhiễm thông qua bọ Thanh Thanh
Đại học Khoa học phấn và ghép ở trong vƣờn
thí nghiệm
Trung tâm Bệnh
cây nhiệt đới,
Trƣờng Đại học
Nông nghiệp Hà
Nội

Cung cấp chủng vi khuẩn
mang vector chứa gen

TYLCV và lây nhiễm bằng TS. Hà Viết Cƣờng
Agro-inoculation

Phòng Công nghệ Cố vấn khoa học
tế bào Thực vật,
Viện Công nghệ
sinh học

PGS.TS. Chu Hoàng Hà


ii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu
2. Những đóng góp khoa học
3. Ý nghĩa của đề tài nghiên cứu
Chƣơng 1. MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1. Mục tiêu nghiên cứu
1.2. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
1.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
1.2.2. Vật liệu thực vật
1.2.3. Chủng vi khuẩn
1.2.4. Hóa chất, thiết bị, máy móc
1.3. Phạm vi và địa điểm nghiên cứu
1.3.1. Phạm vi nghiên cứu
1.3.2. Địa điểm nghiên cứu
1.4. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu

1.4.1. Cách tiếp cận nghiên cứu
1.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
1.4.2.1. Phƣơng pháp lây nhiễm bằng bọ phấn
1.4.2.2. Phƣơng pháp lây nhiễm bằng ghép áp
1.4.2.3. Phƣơng pháp lây nhiễm bằngAgroinoculation
1.4.2.4. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ biểu hiện bệnh
1.4.2.5. Phƣơng pháp phân tích sự có mặt của TYLCV
Chƣơng 2. NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan tài liệu nghiên cứu
2.1.1. Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua
2.1.1.1.Nguồn gốc và Phân loại
2.1.1.2. Đặc điểm sinh học
2.1.1.3. Một số bệnh hại cà chua
2.1.2. Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua
2.1.2.1. Triệu chứng biểu hiện bệnh

Trang
1
1
2
2
3
3
4
4
4
5
6
6
7

7
7
8
8
8
9
10
12
13
14
14
14
14
15
17
18
18


iii

2.1.2.2. Phân loại virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua
1.1.2.3. Đặc điểm hình thái và cấu tạo
1.1.2.4. Đặc điểm lây lan và môi giới truyền bệnh
1.1.2.5. Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua
2.1.3. Các phƣơng pháp lây nhiễm TYLCV trong thực nghiệm
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.3. Kết quả nghiên cứu
2.3.1. Kết quả tạo nguồn bệnh
2.3.1.1. Kết quả lây nhiễm virus trong vƣờn có nguồn bệnh

2.3.1.2. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh
2.3.2. Kết quả lây nhiễm TYLCV cho cà chua bằng bọ phấn
2.3.3. Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng phƣơng pháp ghép cây lành với
cây bị bệnh
2.3.4. Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng Agro - inoculation
2.3.5. Đánh giá hiệu quả lây nhiễm TYLCV của các phƣơng pháp lây
nhiễm nhân tạo
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
2. KIẾN NGHỊ

18
19
20
23
23
24
26
26
26
34
37
39
40

44
47
47
47

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1 Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng số

24

1.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen từ mẫu DNA tổng số

26

2.1 Kết quả tạo nguồn bệnh trong vƣờn có áp lực bệnh cao

27

2.2

Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua

31

sau lây nhiễm qua bọ phấn
2.3

Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua

33

sau lây nhiễm bằng ghép áp
2.4

Kết quả giá trị OD ở bƣớc sóng 660 nm của các chủng khuẩn sau

35

nuôi lắc phục vụ thí nghiệm lây nhiễm
2.5

Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh sau lây nhiễm TYLCV bằng

36

Agro- inoculation vào các giống cà chua
2.6

Tổng hợp kết quả theo dõi biểu hiện bệnh trung bình của thí
nghiệm lây nhiễm TYLCV vào cây cà chua bằng 3 phƣơng pháp

38


v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

21

1.2 Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua

24

2.1

Sơ đồ cấu trúc genome của TYLCV

9

2.2

Chu kỳ sinh trƣởng của bọ phấn (Bemisia tabaci)

11

2.3

Hình ảnh cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV trồng

27

tại vƣờn có nguồn bệnh sau 50 ngày
2.4 Kết quả điện di sản phẩm tách DNA tổng số của một số dòng cà

28

chua nhiễm bệnh
2.5

Kết quả PCR kiểm tra gen CP của TYLCV trong các mẫu cà chua

29

nhiễm bệnh
2.6 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của

32

virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng bọ phấn.
2.7

Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của

34

virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng phƣơng
pháp ghép.
2.8

Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 10 ngày lây

37

nhiễm bằng Agro- inoculation
2.9

Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 50 ngày lây
nhiễm bằng Agro- inoculation

37


vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

Nghĩa tiếng Anh

Bp

Cặp base

base pair

CTAB

CTAB

Cetyltrimethylammonium Bromid

CP

protein vỏ

Coat protein

DNA

Axit Deoxyribonucleic

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

EDTA

EDTA

Ethylene
Acid

EtBr

EtBr

Ethidium Bromide

GB

GB

Gel binding buffe

Kb

Kb

Kilobyte

ORF

trình tự đọc mở

Open reading frame

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp

Polymerase Chain Reaction

Primer F

Mồi xuôi

Primer Forward

Primer R

Mồi ngƣợc

Primer Reverse

Taq

Diamine

Tetraacetic

Thermus aquaticus

IR

Vùng liên gen

Intergenic region

Rep

Tái bản

Replication

SCR

vùng vệ tinh

Satelite Conserved Region

TYLCV

Virus gây bệnh xoăn vàng lá Tomato Yellow Leaf Curl Virus
cà chua

TB

Trung bình

RAPD

nhân bản ngẫu nhiên những Random Amplified Polymorphic
đoạn DNA
DNA


vii

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
Đơn vị: Trƣờng Đại học Khoa học
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung

- Tên đề tài: “Nghiên cứu một số phƣơng pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây
bệnh xoăn vàng lá cà chua”.
- Mã số: ĐH2013-TN06-08
- Chủ nhiệm: TS. Nguyễn Thị Hải Yến
- Cơ quan chủ trì: Trƣờng Đại học Khoa học
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2013-12/2014
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm đƣợc phƣơng pháp lây nhiễm virus TYLCV phù hợp để lây bệnh cho cà
chua nhằm tạo phƣơng pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho cà
chua trong điều kiện nhà lƣới và vƣờn thí nghiệm.
3. Tính mới và sáng tạo:
(1) Đánh giá khả năng lây nhiễm TYLCV thông qua một số phƣơng pháp nhƣ
ghép áp, thông qua bọ phấn và thông qua vi khuẩn. Đây là công trình đầu tiên đã
thử nghiệm các phƣơng pháp lây nhiễm virus nhân tạo để xác định phƣơng thức
lây nhiễm hiệu quả nhất.
(2) Đề xuất đƣợc quy trình lây nhiễm TYLCV để đánh giá khả năng kháng virus
cho cà chua.
4. Kết quả nghiên cứu
(1) Thu thập giống cà chua phục vụ thí nghiệm:
+ Giống PT 18 do viện rau quả Việt Nam cung cấp. Cà chua PT18 có chiều
cao trung bình 80 – 100 cm, dạng cây gọn, màu lá xanh nhạt, phân cành ít, sinh
trƣởng hữu hạn. PT18 là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV.


viii

+ Giống F1 GM - 2008, là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp. Quả của F1
GM - 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tƣơi, thịt dày, rắn chắc. F1 GM 2008 sinh trƣởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, giống F1 GM2008 đƣợc lai
tạo theo hƣớng kháng bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV.
+ Giống DV 2962 là giống lai F1 có nguồn gốc từ Ấn Độ. DV 2962 có biên độ

thích ứng rộng, sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 17oC – 32oC. thuộc loại hình
sinh trƣởng bán hữu hạn, sinh trƣởng khoẻ. Cây cao trung bình từ 110 – 130 cm,
nhiều hoa, sai quả, đƣợc chọn tạo theo hƣớng kháng virus TYLCV.
+ Dòng cà chua PT18 chuyển gen kháng TYLCV đƣợc tạo ra từ đề tài luận án
TS “Nghiên cứu tạo cây cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng kỹ thuật
chuyển gen” của chủ nhiệm đề tài.
(2) Tạo đƣợc 63 dòng cây bị bệnh trong tổng số 75 cây trồng trong vƣờn có áp
lực bệnh cao. Các dòng cây bệnh đã đƣợc kiểm tra sự có mặt của TYLCV bằng
phƣơng pháp PCR với cặp mồi pRV 324N/pRC889N.
(3) Đã tiến hành lây nhiễm thành công virus TYLCV trên 3 giống cà chua PT18,
GM - 2008, DV - 2962 bằng 3 phƣơng pháp : (i) phƣơng pháp ghép áp giữa cây
lành với cây bệnh, (ii) phƣơng pháp nuôi thả bọ phấn, (iii) Lây nhiễm bằng Agro
- inoculation.
(4) Đã đề xuất 01 quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua phù
hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm là phƣơng pháp ghép áp giữa cây lành với
cây bệnh, có thể áp dụng trong thực nghiệm để đánh giá khả năng kháng virus
TYLCV của các giống cà chua.
5. Sản phẩm:
5

c

Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Văn Quang (2016), “Nghiên cứu một số phƣơng
pháp lây nhiễm virux gây bệnh xoăn vàng lá cà chua”, Tạp chí Khoa học và
Công nghệ - ĐHTN, 149(4), 11-15.


ix

52

đà tạ :

Đào tạo thạc sĩ:
Nguyễn Văn Quang (2015), Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây
nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh
học, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
Đào tạo cử nhân:
(1). Nguyễn Thị Bình (2014), Sử dụng phương pháp ghép áp để lây nhiễm virus
gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Trƣờng
Đại học Khoa học –Đại học Thái Nguyên.
(2). Triệu Văn Huy (2014), Sử dụng phương pháp Agroinoculation để lây nhiễm
virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trƣờng Đại
học Khoa học – Đại học Thái Nguyên
5.3

ứ g dụ g:

Đã đề xuất 01 quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua phù hợp
trong điều kiện phòng thí nghiệm, có thể áp dụng trong thực nghiệm để đánh giá
khả năng kháng virus TYLCV của các giống cà chua
6. Phƣơng thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích đem lại
của kết quả nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu của đề tài là thông tin khoa học hữu ích cho sinh viên, học
viên cao học học tập, nghiên cứu. Là cơ sở cho các Viện nghiên cứu, trung tâm
giống sử dụng để triển khai nghiên cứu đánh giá cây kháng virus đƣợc tạo ra
trong các chƣơng trình chọn giống. Từ đó thúc đẩy hợp tác nghiên cứu khoa học
với các cơ sở khác.
Tổ chức chủ trì
(Ký, đóng dấu)

Ngày.... tháng.... năm 2017
Chủ nhiệm đề tài
(Ký, ghi rõ họ tên)


x


xi

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
- Project title: A number of method research to infect tomato yellow leaf curl virus.
- Code number: DH2014-TN06-08.
- Coordinator: Dr. Nguyen Thi Hai Yen
- Implementing institution: College of sciences.
- Duration: from January 2013 to December 2014 .
2. Objective:
Research the best methods to infect TYLCV for tomato plant. Since then proposed
standard method to assess the ability of this virus resistant tomatoes in a greenhouse
and garden conditions experiments.
3. Creativeness and innovativeness:
1) Assessment ability TYLCV infection through a number of methods such as grafting
pressure, via whitefly and through bacteria. This is the first project tested methods of
artificial virus infection to determine the most effective method of infection;
2) Recommended by TYLCV infection process to evaluate viral resistance to tomato;
4. Research results:
(1) Tomato varieties collected for experiments:
- PT 18 varieties of vegetables by the Vietnam Institute offers. PT18 is quite

susceptible varieties curly gold leaf by TYLCV.
- GM 2008 varieties was bred towards resistance to TYLCV.
- DV 2962 varieties are F1 hybrids, which is bred in the direction of antiviral TYLCV
- Transgenic tomato lines PT18 TYLCV resistance generated from the thesis Dr
Nguyen Thi Hai Yen.
(2) Created 63 lines of 75 diseased plants in the garden have high disease pressure.
The tree line patients were examined in the presence of TYLCV by PCR with primers
PRV 324N / pRC889N .
(3) Conducted a successful infection TYLCV virus on tomato varieties PT18,
GM2008, DV2962 by three methods: (i) grafting pressure between wide type tomato
with tomato carrying TYLCV, (ii) insect feeding method chalk, (iii) infection by Agro
- inoculation.


xii

(4) One procedures proposed artificial virus infects tomatoes suitable TYLCV in
laboratory conditions is grafting pressure between healthy trees with sick trees, can be
applied in experiments to evaluate viral resistance TYLCV of tomatoes.
5. Products:
5.1. Journal papers
Nguyen Thi Hai Yen, Nguyen Van Quang (2016), “A number of method research to
infect tomato yellow leaf curl virus”, Journal of Science and Technology, Thainguyen
University, VietNam 149(4), pp. 11- 16.
5.2. Education
Master education
Nguyen Van Quang (2015), Research a number of method research to infect tomato
yellow leaf curl virus, The Biotechnological master thesis, Thai Nguyen University of
Scienses.
Graduate education

Nguyen Thi Binh (2014), Using grafting pressure infecting tomato yellow leaf curl
virus, The Research science students, Thai Nguyen University of Scienses.
Trieu van Huy (2014), Using Agroinoculation infecting tomato yellow leaf curl virus,
The Biotechnological graduate thesis, Thai Nguyen University of Scienses.
5.3. In terms of application
One procedures proposed artificial virus infects tomatoes suitable TYLCV in laboratory
conditions is grafting pressure between wide type tomato with tomato carrying
TYLCV, can be applied in experiments to evaluate viral resistance TYLCV of tomatoes.
6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research
results:
The results of this reference is good for students, graduate students study, study.
Recommend 01 processes infecting tomato yellow leaf curl virus. Research results are
the basis for the research institute, the center used to evaluate varieties resistant to the
tomato virus. Thereby encouraging scientific research cooperation with other
institutions.


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu

Cà chua (Lycopersicon esculentum) là loại rau quả đƣợc trồng phổ biến
hiện nay, quả cà chua chín giàu dinh dƣỡng và vitamin, đƣợc con ngƣời sử
dụng thƣờng xuyên. Cà chua dễ trồng, chi phí đầu tƣ ban đầu thấp, là loại cây
thích ứng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau, thời gian từ khi trồng đến thu
hoạch ngắn, do vậy có thể mở rộng sản xuất ở nhiều vùng khác nhau trên thế
giới.
Cũng nhƣ các cây trồng khác, các giống cà chua đang trồng ở trên thế
giới và Việt Nam bị tấn công bởi các loại sâu bệnh nhƣ nấm, côn trùng, vi

khuẩn và đặc biệt là virus. Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới, bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV gây nên đƣợc xem là bệnh
gây hậu quả nghiêm trọng nhất [17], [21]. Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá trên
cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thƣờng rất cao, có khi
tới 100%. TYLCV là loài virus thuộc chi Begomovirus, họ Geminividae và
chúng chỉ truyền nhiễm vào cây thông qua vector truyền bệnh là bọ phấn
Bemisia tabaci một cách nhanh chóng và liên tục dẫn đến bùng phát thành
dịch bệnh [7], [9]. Sự kiểm soát bệnh TYLCV ở các vùng trồng cà chua chú
trọng chính vào sự kiểm soát bọ phấn bằng các loại thuốc hóa học tiêu diệt
côn trùng hoặc các bẫy bắt, các rào cản vật lý nhƣ lƣới chắn bọ phấn… Tuy
nhiên, các phƣơng pháp kiểm soát bệnh TYLCV vừa nêu gây tốn kém về kinh
phí và sức lực con ngƣời trong sản xuất, hơn nữa còn gây ô nhiễm môi trƣờng
và tích lũy độc tính trong quả [26].
Biện pháp hiệu quả nhất để phòng chống virus là sử dụng giống kháng.
Trong thực tế, các giống tự nhiên kháng virus rất hạn chế, vì vậy các nhà khoa
học đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo các giống có khả năng
kháng virus gây bệnh xoăn vàng lá để đƣa vào sản xuất. Trong quy trình tạo


2

giống kháng thì việc đánh giá khả năng kháng cho dòng, giống mới lai tạo là
rất quan trọng. TYLCV không lây lan qua va chạm cơ học mà chỉ lây lan
thông qua môi giwois truyền bệnh là bọ phấn. Dựa trên đặc điểm lan truyền
của TYLCV, các nhà khoa học cũng đã áp dụng một số phƣơng pháp để lây
nhiễm TYLCV cho cà chua nhƣ lây nhiễm thông qua nuôi thả bọ phấn, tuy
nhiên vẫn chƣa có công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống.
Xuất phát từ thực tiễn và cơ sở lý luận trên chúng tôi thực hiện nghiên
cứu đề tài là “Ng iê cứu
gây bệ

ột số

ươ g

á

â tạ để lây

iễ

virus

x ă và g lá cà c u ” . Nhằm phục vụ trong nghiên cứu, đánh giá

khả năng kháng virus TYLCV ở cà chua.
2. Những đóng góp khoa học của đề tài
Xác định đƣợc phƣơng pháp lây nhiễm virus TYLCV cho cà chua trồng
trong điều kiện nhà lƣới và vƣờn thí nghiệm, nhằm tạo phƣơng pháp chuẩn để
đánh giá khả năng kháng virus này cho cà chua.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài là thông tin khoa học hữu ích cho sinh
viên, học viên cao học học tập, nghiên cứu. Là cơ sở cho các Viện nghiên cứu,
trung tâm giống sử dụng để triển khai nghiên cứu đánh giá cây kháng virus
đƣợc tạo ra trong các chƣơng trình chọn giống. Từ đó thúc đẩy hợp tác nghiên
cứu khoa học với các cơ sở khác.


3

Chƣơng 1. MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu tổ g quát
Đề xuất đƣợc quy trình lây nhiễm TYLCV phục vụ đánh giá khả năng kháng
virus cho cà chua.
Mục tiêu cụ t ể
(1) Sƣu tập và đánh giá đƣợc khả năng kháng TYLCV của các giống cà chua địa
phƣơng khu vực trung du miền núi phía bắc Việt Nam;
(2) Tạo đƣợc nguồn bệnh ổn định trong phòng thí nghiệm và vƣờn thực nghiệm;
(3) Lây nhiễm đƣợc TYLCV cho cà chua bằng các phƣơng pháp khác nhau;
(4) Đề xuất đƣợc ít nhất 01 quy trình lây nhiễm TYLCV cho cà chua có thể sử dụng
để đánh gái khả năng kháng virus cho các chƣơng trình chọn giống cà chua kháng.
1.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

1.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các dòng cà chua kháng và mẫm cảm với TYLCV, các dòng virus
TYLCV trong tự nhiên và đƣợc tạo ra bằng kỹ thuật di truyền.
1.2.2. Vật liệu thực vật
(1) Giống cà chua PT18
Cà chua PT18 có chiều cao trung bình 80 - 100cm, dạng cây gọn, màu
lá xanh nhạt, phân cành ít, sinh trƣởng hữu hạn (100 - 120 ngày), kháng bệnh
khá, nhất là bệnh héo xanh vi khuẩn. PT18 sinh trƣởng và phát triển tốt nhất
trong mùa khô dƣới nhiệt độ 21 – 25oC Thời vụ gieo hạt thích hợp nhất là
tháng 9 - 10. Cà chua PT18 trồng đƣợc cả 3 vụ (vụ sớm, vụ chính và vụ
muộn). Đây là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV.
(2) Giống cà chua F1 GM – 2008


4

Giống cà chua F1 GM – 2008 là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp.
Quả của F1 GM – 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tƣơi, thịt dày, rắn
chắc. F1GM 2008 sinh trƣởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, có thể trồng
sớm ngay từ tháng 7, nhanh thu hoạch. Đây là giống lai tạo theo hƣớng kháng
bệnh héo xanh và xoăn lá.
(3) Giống cà chua DV 2962
DV 2962 là giống cà chua lai F1 có nguồn gốc từ Ấn Độ. DV 2962 là
giống cà chua có biên độ thích ứng rộng, sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ
17 – 32oC, thích hợp cho ăn tƣơi và chế biến công nghiệp. Giống thuộc loại hình
sinh trƣởng bán hữu hạn, sinh trƣởng khoẻ. Cây cao trung bình từ 110 - 130 cm,
nhiều hoa, sai quả. DV 2962 có khả năng chống chịu tốt một số bệnh nguy
hiểm nhƣ héo xanh, mốc sƣơng, xoăn lá do virus.
(4) Cà chua dại mang virus TYLCV thu thập ở vƣờn có áp lực bệnh cao. Sử
dụng trong lây nhiễm bằng bọ phấn và ghép áp để lây nhiễm TYLCV.
1.2.3. Chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA404 mang vector
PCAMBIA 2300 chứa genome TYLCV do bộ môn bệnh cây nhiệt đới,
Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp gồm 2 dòng: A. tumefaciens
LBA404/2300/TY (chứa đầy đủ vòng DNA – A của TYLCV) và A.
tumefaciens LBA404/2300/β (chứa vòng DNA vệ tinh β của TYLCV). Chủng
vi khuẩn này có đặc tính kháng rifamycin và kanamycin.
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 PGV2260 do Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm khoa
học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
1.2.4. Hoá chất, thiết bị máy móc
(1) Hoá chất


5

Sodium chloride (NaCl), Tris – HCl, EDTA, CTAB, sorbitol, sodium
dihydrogen phosphate (NaH2PO4), chloroform (CHCl3), isoamyl alcohol
((CH3)2CHCH2CH2OH), ethanol (C2H5OH). Taq polymerase, dNTPs (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), buffer PCR, MgCl2, mồi xuôi (Forward primer), mồi
ngƣợc (Reverse primer), agarose, TAE, glycerol, bromophenol blue, thang
DNA chuẩn (Fermentas) – DNA marker, ethydium bromide (EtBr), glucose,
Tris – base, NaOH, SDS, CH3COOK, MES, AS, bacto – tryptone, yeast
extract, bacto – agar, kanamycin, rifamycin, cồn 90o.
(2) Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Các thiết bị, dụng cụ thuộc phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống
trƣờng Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên gồm: máy ly tâm lạnh (Hettich Germany), box cấy (Nuaire - USA), máy lắc (Korea), máy soi gel (Wealtec USA), bộ điện di (USA), máy vortex (CLP - USA), máy đo quang phổ, máy
PCR (Applied Biosystems), máy đo pH (Martini - Rumani), tủ lạnh - 20 – 4oC
(Fiochetti - Italy), cân điện tử (Sartorius), lò vi sóng (Sharp - Japan), bể ồn
nhiệt (Joiotech), nồi hấp vô trùng, máy cất nƣớc, pipetman (Hettich Germany), đầu côn các loại, ống Eppendorf, ống fancol, cối chày sứ, bơm
kim tiêm y tế, bình tam giác (loại 100, 250, 500 ml), cốc đong, ống đong,
gang tay cao su, đũa thủy tinh
Ngoài ra trong đề tài còn sử dụng các dụng cụ, thiết bị khác nhƣ lọ
penicilin, bông, kéo, găng tay y tế, xi lanh tiêm, lồng lƣới, chậu trồng cây, dao
lam, băng dính y tế, giấy bạc, đũa inox, bình xịt thuốc sâu.
1.3. PHẠM VI VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
1.3.1. Phạm vi nghiên cứu
Tiến hành lây nhiễm virus TYLCV chủng Việt Nam cho các dòng cà chua mẫn
cảm và kháng với TYLCV bằng ba cách khác nhau là (1) lây nhiễm thông qua
bọ phấn Bemisia tabaci; (2) lây nhiễm thông qua ghép với cây đã mang nguồn


6

bệnh và (3) lây nhiễm bằng Agro-inoculation. So sánh, phân tích để tìm ra

phƣơng pháp phù hợp để đề xuất quy trình lây nhiễm TYLCV chủng Việt Nam
cho cà chua.
1.3.2. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm phân lập gen đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh
học, Khoa Khoa học Sƣ sống, Trƣờng Đại học Khoa học và tại Phòng thí
nghiệm Công nghệ gen, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học
Thái Nguyên.
1.4. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.4.1. Cách tiếp cận nghiên cứu
Nghiên cứu phƣơng pháp lây nhiễm TYLCV nhân tạo cho cà chua
đƣợc thực hiện theo các cách tiếp cận sau: (1) Phƣơng pháp lây nhiễm thông
qua môi giới trung gian là bọ phấn và ghép cây bệnh đƣợc tiếp cận dựa theo
đặc điểm sinh trƣởng, đặc tính lây nhiễm của virus TYLCV trong cây chủ. (2)
Phƣơng pháp Agro-inoculation đƣợc tiếp cận theo hƣớng sinh học phân tử
1.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
THU THẬP GIỐNG

TẠO NGUỒN BỆNH
Phương pháp nuôi thả bọ phấn

LÂY NHIỄM VIRUS

Phương pháp ghép
Phương pháp Agroinoculation

Theo dõi biểu hiện
KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ
PCR nhân gen virus

ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH LÂY NHIỄM

7

Hình 1.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu

1.4 2

P ươ g

á lây

iễ

bằ g b

ấ

Gieo hạt và cách li cây sau nảy mầm, sau đó tiến hành lây nhiễm bọ phấn,
tiến hành thả 10 -20 cá thể bọ phấn cùng với cây bệnh trong lồng cách li. Nuôi
cộng sinh trong 48 giờ, tiến hành phun thuốc diệt côn trùng để diệt bọ phấn. Sau
lây nhiễm 10 ngày, tiến hành thu lá để tách DNA kiểm tra gen virus trong các
dòng lây nhiễm bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Theo dõi biểu hiện bệnh sau
50 ngày sau nuôi thả bọ phấn, tiến hành thu lá tách DNA kiểm tra gen virus.
1.4.2.2. P ươ g

á lây

iễ

bằ g g é á

Phƣơng pháp ghép áp cây cà chua bình thƣờng với cây cà chua đã biểu
hiện bệnh gồm các bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Chuẩn bị cây bệnh ở mức độ 3 hoặc 4. Trồng cây ở vƣờn có áp lực
bệnh cao có nguồn bọ phấn trắng để tạo cây bệnh.
Bƣớc 2: Gieo hạt cà chua thí nghiệm và cách ly cây sau nảy mầm để tạo
nguồn cây sạch bệnh phục vụ thí nghiệm.
Bƣớc 3: Tiến hành ghép áp: sau khi cây con cao khoảng 15 cm khỏe mạnh
tiến hành ghép áp với cây bệnh và cách li trong lồng cách li.
Phƣơng pháp ghép: Tiến hành trồng các cây cà chua bình thƣờng vào
chậu thí nghiệm. Sau khi cây đạt chiều cao khoảng 30 - 35 cm thì mang đi
ghép với cây bệnh đã đƣợc chuẩn bị trƣớc. Dùng dao lam sắc cắt vát 1 miếng
nhỏ (dài 1,5 - 2 cm rộng 0,4- 0,5cm) vừa chạm vào lớp gỗ của cây ở vị trí gần
ngọn chỗ cành non của cây. Sau đó, dùng băng dính y tế buộc chặt hai mặt cắt
của 2 cây sao cho hai mặt cắt của thân cây áp vào nhau là đƣợc. Khi ghép
xong phun sƣơng lên toàn bộ cây và chụp lồng cách li.
Bƣớc 4: Theo dõi biểu hiện bệnh sau 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ngày
Bƣớc 5: Sau 50 ngày theo dõi tiến hành thu lá tách DNA kiểm tra gen virus.


8

1.4 2 3 P ươ g

á lây

iễm bằng Agro - inoculation

(1) Gieo hạt và trồng cây thí nghiệm.

(2) Cách ly cây sau nảy mầm bằng lồng cách ly.
(3) Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: nuôi lắc các dòng khuẩn lây nhiễm
C58/PC2300/TY (PCAMBIA 2300 mang vòng DNA – A genome TYLCV)
và C58/PC2300/β (PCAMBIA 2300 mang vòng DNAβ vệ tinh của TYLCV)
riêng biệt trên môi trƣờng LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin và
rifamycin, sau đó ly tâm thu cặn tế bào vi khuẩn và hòa từng dòng khuẩn vào
dung dịch lây nhiễm (MgCl2 10 mM, MES 10 mM, AS 100 µM, H2O), cuối
cùng trộn hai dòng khuẩn này lại với nhau với tỷ lệ 1 : 1, để ở nhiệt độ phòng
1 – 2 giờ rồi tiến hành tiêm cho các cây cà chua thí nghiệm.
(4) Tiến hành lây nhiễm bằng tiêm: Sau khi cây con cao khoảng 10 cm
khỏe mạnh, tiến hành tiêm khoảng 5 ml/cây (OD dịch khuẩn 0,5 – 1). Lặp lại
thí nghiệm 3 lần, mỗi lần cách nhau 10 ngày.
Phương pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)
Dung dịch tế bào vi khuẩn đƣợc đo OD bằng máy quang phổ ở bƣớc
sóng 660 nm (OD660). Khi độ OD660 = 0,5 – 1 thì dịch khuẩn có thể dùng cho
thí nghiệm lây nhiễm ở trên (mục 2.2.3).
DNA đƣợc đo bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm.
Nồng độ DNA đƣợc tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/µl) = OD260 × 50 × hệ số pha loãng.
Độ sạch DNA = OD260/OD280.
Trong đó: OD260 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm, OD280 là chỉ số
đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm.
Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 – 2,0 thì DNA đó là tinh sạch.
1.4.2.4 Các c ỉ tiêu đá

giá

ức độ biểu iệ bệ

9

Để xác định các mức độ biểu hiện bệnh chúng tôi căn cứ theo tiêu chí
Lapidot và Friedman đƣa ra năm 2002. Theo tác giả, biểu hiện bệnh xoăn vàng
lá do TYLCV đƣợc chia thành 5 mức độ từ 0 đến 4 (Hình 2.2).

0: Cây không nhiễm
bệnh, sinh trưởng và
phát
triển
bình
thường.

1: Những lá 2: Lá vàng và 3: Lá vàng,
trên đỉnh ngọn xoăn nhẹ ở xoăn và cụp
có biểu hiện mép lá.
xuống
đồng
vàng nhẹ ở
thời
kích
mép lá.
thước bị thu
nhỏ lại.

4: Lá xoăn, kích
thước lá thu
nhỏ nhiều, cây
cằn
cỗi

và
ngừng
sinh
trưởng.

Hình 1.2. Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua

1.4.2.5 P ươ g

á

â tíc sự có

ặt củ virus TYLCV

Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số
a, Thu thập và bảo quản mẫu
Dùng găng tay và kéo đã khử trùng bằng cồn, cắt lấy những lá non của
các cây thí nghiệm nghi nhiễm bệnh xoăn vàng do TYLCV (thu mẫu vào thời
điểm khô ráo). Các mẫu lá sau khi thu đƣợc bảo quản trong bình thuỷ tinh có
chứa các hạt silica gel hút ẩm và bảo quản nơi khô ráo trong điều kiện nhiệt độ
phòng.
b, Tách chiết DNA tổng số các mẫu lá.
Bảng 1.1. Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng số
Nồng độ gốc

TT

Nồng độ dung dịch đệm

1

1M Tris-HCl pH =8,0

50mM

2

5M NaCl

300mM

3

0,5M EDTA pH=8

20mM

4

CTAB

5

Nước khử ion, khử trùng

4%


10

Để tách chiết DNA tổng số của các mẫu cà chua chúng tôi tiến hành
pha dung dịch đệm tách với nồng độ các chất theo công thức (Bảng 1.1).
Tách DNA của mẫu cà chua nghi nhiễm TYLCV sử dụng phƣơng pháp
dùng CTAB với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm
[12].
Các bƣớc tiến hành
(1) Nghiền 0.5g mẫu lá trong nitơ lỏng trong ống eppendorf 2 ml thành dạng bột
mịn sau đó bố sung nhanh vào mỗi ống 600 µl dung dịch đệm tách (Bảng 2.1),
đảo đều ủ ở 65 oC trong 1 giờ 45 phút.
(2) Thêm hỗn hợp cloroform : isoamylalcohol (24 : 1) với tỷ lệ tƣơng đƣơng về
thể tích với mẫu, trộn đều 10 phút đến khi dung dịch màu sữa. Ly tâm 12000
vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC, thu dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf
1,5 ml vô trùng.
(3) Thêm isopropannol với tỷ lệ tƣơng đƣơng về thể tích với mẫu, trộn nhẹ, để tủ
lạnh -20oC khoảng 30 phút.
(4) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ dịch, úp ống eppendorf
xuống giấy cho khô, thu tủa DNA sau đó rửa DNA bằng cồn 70o.
(5) Rửa tủa DNA bằng cách bổ sung 300 µl cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút
trong 15 phút ở 4oC, loại bỏ cồn (bƣớc này lặp lại 2 lần)
(6) Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt.
(7) Hòa tan DNA trong 50 µl nƣớc khử ion, vô trùng
(8) Kiểm tra DNA tổng số bằng phƣơng pháp điện di hoặc đo quang phổ.
Phương pháp điện di trên gel agarose
(1) Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Hòa 0,8g agarose trong 100ml dung dịch
đệm TAE 1X, đun sôi cho agarose tan hoàn toàn bằng lò vi sóng. Để nhiệt độ hạ
xuống còn khoảng 50 – 60o C, đổ dung dịch agarose vào khuôn điện di đã gài
sẵn răng lƣợc thích hợp. Sau 30 – 60 phút, khi gel đã đông, đặt gel vào hộp điện
di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel 1 – 2 mm.