Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae

I H C QU C GIA HÀ N I
TR

NGă

IăH CăKHOAăH CăT ăNHIểN
KHOAăSINHăH C
--------------------

Nguy năTh ăKhuy n

NGHIểNăC UăPHÁTăTRI NăH ăTH NGăCHUY Nă
GENăB NGăVIăKHU NăAgrobacterium tumefaciens
CHOăN MăS IăAspergillus oryzae

Chuyên ngành: Vi sinh v t h c
Mã s : 60420107
LU NăV NăTH CăS ăKHOAăH C
Ng

iăh

ngăd năkhoaăh c:ăTS.ăTr năV năTu n

HƠăN iă- 2016


M CL C
Trang
M
Ch

Đ U ............................................................................................................................. 4
ng

T NG QUAN ................................................................................................. 6

1.1. Gi i thi u chung v n m s i Aspergillus oryzae .........................................................6
Đ c đi m sinh h c c a n m s i Aspergillus oryzae................................................6

Đ c đi m di truy n c a n m s i A. oryzae .................................................................7

Vai trò c a n m s i A. oryzae ..........................................................................................8

Ph}n bi t Aspergillus oryzae v i Aspergillus flavus sinh đ c t aflatoxin ....9

C|c ph

ng ph|p chuy n gen v{o n m s i ............................................................... 12

Ph

ng ph|p chuy n gen s d ng t b{o tr n (protoplast).......................... 12

Ph

ng ph|p chuy n gen thông qua vi khu n A. tumefaciens (ATMT) .... 13

1.2.2. K thu t chuy n gen b ng xung đi n (electroporation) ................................. 13

1.2.4. Marker s d ng trong ch n l c c|c ch ng chuy n gen .................................... 17

1.2.5. M t s gen ch th dùng trong chuy n gen
Ch

ng

V T LI U VÀ PH

vi n m .......................................... 19

NG PHÁP .............................................................. 23

Nguyên li u .............................................................................................................................. 23

2.1.1. Ch ng vi sinh v t................................................................................................................ 23
2.1.2. Thi t b v{ hóa ch t........................................................................................................... 25
Môi tr

Ph

ng s d ng trong nghiên c u..................................................................... 28

ng ph|p nghiên c u .................................................................................................. 28

2.2.1. Thu nh n b{o t n m....................................................................................................... 29
T|ch chi t DNA RNA v{ t ng h p cDNA ................................................................. 29

Quan s|t hình th|i v{ ki m tra m t s đ c đi m sinh lý sinh hóa................ 30
Ph}n bi t A. oryzae v{ A. Flavus b ng c|c k thu t sinh h c ph}n t ........ 31

2.2.5. T o c|c vector nh th dùng cho chuy n gen ........................................................ 32

2.2.6. Chuy n gen v{o n m s i A. oryzae ............... Error! Bookmark not defined.
Ch

ng

K T QU VÀ TH O LU N ................... Error! Bookmark not defined.


X|c nh n ch ng A. oryzae an to{n đ s d ng cho chuy n gen ............... Error!

Bookmark not defined.

Ph}n bi t c|c ch ng A. oryzae an to{n v{ ch ng Aspergillus flavus sinh đ c

t aflatoxin .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.2. L a ch n ch ng A. oryzae ph c v cho chuy n gen .Error! Bookmark not
defined.
3.2. L a ch n marker chuy n gen v{o A. oryzae Error! Bookmark not defined.

X}y d ng h th ng chuy n gen thông qua vi khu n A. tumefaciens ...... Error!

Bookmark not defined.

Xóa gen pyrG đ t o ch ng đ t bi n tr d

ng uridine/uracil ........... Error!

Bookmark not defined.

3.3.2. T o m t s vector nh th dùng cho chuy n gen v{o A. oryzae tr d

ng

uridine/uracil .................................................................... Error! Bookmark not defined.
Đ|nh gi| hi u qu c a h th ng chuy n gen v i gen huỳnh quang GFP v{

DsRed Error! Bookmark not defined.

3.4.1. Chuy n gen GFP v{ DsRed v{o n m s i A. oryzae tr d

ng uridine/uracil

.................................................................................................. Error! Bookmark not defined.
X|c nh n c|c th chuy n gen .......................... Error! Bookmark not defined.

3.5. ng d ng h th ng chuy n gen m i thi t l p đ bi u hi n gen phyA m~ hóa
enzyme phytase c a A. fumigatus

A. oryzae ..... Error! Bookmark not defined.

K T LU N VÀ KI N NGH ......................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LI U THAM KH O ................................................................................................. 34


M

U

Aspergillus oryzaelà loài n m s i đ

ph m truy n th ng và đ u ng t i nhi u n

c s d ng r ng rãi trong s n xu t th c
c châu Á bao g m Nh t B n, Trung

Qu c, Hàn Qu c, Vi t Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines. Loài n m này đã
đ

c C c Qu n lý Th c ph m và D

(GRAS).

Vi t Nam, A. oryzae đ

s đ a ph

ng

c ph m Hoa K (FDA) công nh n là an toàn
c s d ng đ s n xu tt

ng truy n th ng t i m t

các t nh phía B c.A. oryzae có kh n ng ti t m t l

enzyme khác nhau vào môi tr
t bào đ s n xu t th

ng. Do đó, loài n m này đ

ng l n các

c s d ng nh nhà máy

ng m i nhi u lo i enzyme và protein c

d ng t nhiên và tái

t h p. G n đây ch ng A. oryzae RIB40 dùng trong s n xu t công nghi p t i Nh t
B n đã đ

c gi i trình t toàn b h gen. S hi u bi t t

ng t n v h gen c a A.

oryzae m ra nhi u c h i trong c i bi n di truy n và bi u hi n gen trên loài n m s i
an toàn này.
Hi n nay, hai ph

ng pháp ph bi n nh t trong chuy n gen vào n m s i là

chuy n gen qua t bào tr n và chuy n gen thông qua vi khu n Agrobacterium
tumefaciens. Tuy nhiên vi cchuy n gen vào n m s iA. oryzaecho đ n nay ch s
d ng ph

ng pháp chuy n gen qua t bào tr n.Ph

ng pháp này t

ng đ i ph c t p

và t n kém, khó có th th c hi n t i đi u ki n phòng thí nghi m t i Vi t Nam.
Ph

ng pháp chuy n gen s d ng vi khu n A. tumefaciens đ n gi n h n v i chi phí

h p lý. Tuy nhiên ch a có m t nghiên c u nào báo cáo v vi c chuy n gen thành
công

n m s i A. oryzae. Bên c nh đó, A. oryzaecókh n ng kháng l i h u h t các

h p ch t kháng sinh th
ch ng A. oryzae tr d

ng đ

c s d ng cho chuy n gen.Do đó phát tri n các

ngđ s d ng cho chuy n gen là gi i pháp duy nh t đ c i

bi n di truy n c ng nh bi u hi n gen A. oryzae.
V i m c đích xây d ng h th ng chuy n genhi u qu cho n m s i A. oryzae
thông quavi khu n A. tumefaciensnh m ph c v h

ng nghiên c u b n v ng v bi u


hi n enzyme/protein tái t h p

loài n m này, chúng tôi th c hi n đ tài“Nghiênă

c uă phátătri năh ă th ngăchuy nă gen b ngă viă khu nă Agrobacterium tumefaciens
choăn măs iăAspergillus oryzae” v i nh ng n i dung chính nh sau:
-

Xác nh n các ch ng A. oryzae an toàn, có th s

d ng làm đ i t

ng

chuy n gen.
-

T o ch ng A. oryzae đ t bi n tr d

ng uridine/uracil b ng cách xóa gen

pyrG.
-

T om t s vector nh th (binary vector) s d ng cho chuy n gen và bi u
hi n gen

n m s i A. oryzae.

ánh giá hi u qu c a h th ng chuy n gen s d ng các gen ch th hu nh

-

quangGFP vàDsRed.
-

B

c đ u ng d ng h th ng chuy n gen m i t ođ

c đ bi u hi n gen

phyA mã hóa enzyme phytase t n m s i Aspergillus fumigatus.


Ch

ngă1.ăT NG QUAN

1.1. Gi i thi u chung v n m s iAspergillus oryzae
1.1.1.

căđi măsinhăh căc aăn măs iAspergillus oryzae

N m s iA. oryzae thu c phân nhóm Flavic achi Aspergillus, trong
h Trichocomaceae. A. oryzae có c u t o đa bào, khi đ

c nuôi c y trên môi tr

ng

đ a th ch,h s icó màu tr ng xámsau đó phát tri n chuy n sang màu vàng nh t đ n
xanh. H s i n m A. oryzae sinh tr

th

ng r t nhanh và phân m nh, chi u ngang có kích

c 5-7 µm. Trên nh ng s i này hình thành c u trúc sinh s n vô tính, g i là cu ng

sinh bào t . Cu ng sinh bào t c a A. oryzae th

ng dài 1-2 mm. Trên cu ng ph ng

lên t o thành b ng, t b ng này m c lên các t bào nh , thuôn dài hình chai, x p sát
nhau, g i là th bình; trên th bình có đính nh ng chu i bào t màu vàng l c hay
màu vàng hoa cau (còn g i là bào t đính)[31, 53, 80, 99]. Hình thái khu n l c và
cu ng sinh bào t c a n m s i A. oryzae đ
trong Hình 1.1.

c Machida và c ng s mô t chi ti t nh


H̀nhă1.1.Hình thái khu n l c và c u trúc cu ng sinh bào t c a n m s i Aspergillus
oryzae RIB40[53]
N m s iA. oryzae sinh tr
tr

ng t t

nhi t đ 30ºC-40ºC, chúng có th sinh

ng và phát tri n d dàng trên nhi u lo i c ch t khác nhau nh các m nh v n

th c v t, cây lá, g m c nát, các lo i h t, th c n gia súc...A. oryzae phân b r ng rãi
trên toàn th gi i, đ c bi t ph bi n các n
và phát tri n, A. oryzae ti t ra môi tr

c nhi t đ i. Trong quá trình sinh tr

ng m t l

ng

ng l n các enzyme th y phân nh

cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase[36, 53].

1.1.2.

căđi mădiătruy năc aăn măs iăA. oryzae

G n đây, ch ng A. oryzaeRIB40 đ

c s d ngtrong công nghi p s n xu t các

th c ph m lên men truy n th ng t i Nh t B n đã đ

c gi i trình t toàn b h gen,

theo đó h genc a A. oryzaeg m 8 nhi m s c th v i t ng kích th

c là 37 megabase

(Mb), d đoán có 12.074 gen mã hóa protein, l n h n 25%-30% so v i các loài khác
thu c chi Aspergillus. Ch ng h n,h gen c a A. oryzae l n h n loài A. nidulans(loài
chu n dùng cho nghiên c u trong phòng thí nghi m) và A. fumigatus(tác nhân gây
b nh c h i

ng

i) l n l

t là 29% và 34%[53].H genc a A. oryzae l n h nch

y u do thu n p thêm DNA trong quá trình ti n hóa. Vi c m r ng kích th
d

c h gen

ng nh đ c tr ng cho các loài có quan h g n g i v i A. oryzaenh A. niger và A.

flavus, các loài này cókích th

c h gen t

r t g n g i v i A. oryzae là A. flavuscó đ t

ng đ

ng nhau.

c bi t loài có quan h

ng đ ng DNA đ n 99,5%[2, 53, 85].

A. oryzae có kh n ng phân gi i m nh nhi u lo i c ch t có trong t nhiêndo
loài này s h u các gen mã hóa enzyme th y phân khác nhau. Các loàiA. oryzae, A.
fumigatusvà A. nidulans ch a l n l

t 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease,

chi m kho ng 1% t ng s các gen trong h gen. T t c các gen mã hóa protease đ

c

tìm th y trong A. fumigatus và/ho cA. nidulansđ u có m t trong A. oryzae, tuy
nhiêncác gen mã hóa m t s enzyme aminopeptidase có m t trongA. oryzael i không
có m t trong h gen c aA. fumigatus và A. nidulans. Ngoài ra,A. oryzaecòn s h u


thêm nhi u gen mã hóa protease ti t có kh n ng ho t đ ng trong môi tr

ng có tính

axit. S gia t ng các protease ho t đ ng trong pH axit c aA. oryzaecó th hình thành
trong quá trình thu n hóa c a con ng

i [53].S hi u bi t t

ng t n v h gen c a

Aspergillus oryzae đã m ra nhi u c h i m i trong nghiên c u c i bi n di truy n
ng d ng loài n m an toàn này trong s n xu t các s n ph m nh m ph c v m c đích

con ng

i.

1.1.3. Vaiătròăc aăn măs iA.oryzae
N m s iA. oryzaeđ

c thu n hóa t ít nh t 2000 n m tr

c và hi n nay đ

s d ng r ng rãitrong s n xu t th c ph m Nh t B n, Trung Qu c và các n
Á nh

lên men đ u nành, làm n

c s t, t

phânnh
tr

c ông

ng và m t s đ u ng có c n nh

huangjiu, sake, makgeolli và shochu[4, 36, 111]. A. oryzae đ
trong th c ph m do đ c tính sinh tr

c

ng nhanh,ti t l

c s d ng r ng rãi

ng l n các enzyme th y

amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh

ng và t o mùi th m d ch u cho các s n ph m lên men[37].Trong lên men truy n

th ng, A. oryzae th

ng đ

c nuôi môi tr

phát tri n hi u khí c a s i n m.

ng r n, đi u ki n này thích h p cho s

m thích h p trong quá trình lên men

môi

tr

ng r n giúp t ng kh n ng s n sinh các enzyme và các ch t chuy n hóa mà

th

ng s không đ

c s n xu t trong đi u ki n lên men l ng[99].

Ngoài vai trò trong s n xu t các th c ph m truy n th ng, n m s i A. oryzae
còn đ

c s d ng trong m t s ngành công nghi p s n xu t enzyme có giá tr kinh t

cao nh glucoamylase, -amylase và m t s protease ph c v s n xu t bánh k o, đ
u ng. Glucoamylase và -amylase thu c nhóm enzyme amylase, chi m t i g n 20%
t ng s n l

ng enzyme đ

c s n xu t, trong đóch y u đ

c s n xu t b in m s iA.

oryzae[16, 81, 98, 113].Ngu n cung c p enzyme protease cho công nghi p s n xu t
th c ph m và các ch t t y r a đ n t các loài n m s i thu c chi Conidiobolus,
Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó ph i k đ n loài sinh protease r t
cao là A. oryzae[1, 106].


Bên c nh nh ng l i ích v kinh t , A. oryzae còn đ

c coi là vi sinh v t mô

hình dùng cho nghiên c u v bi u hi n enzyme và protein tái t h p. Ngoài ra nghiên

c u chuy n gen còn h tr trong vi ctìm ra ch c n ng c ng nh vai trò c a các gen
m i[54].

1.1.4. Phơnăbi tăAspergillus oryzae v iAspergillus flavussinhăđ căt ă
aflatoxin
Hi n nay, t l ng

i m c b nh ung th t ng lên ngày m t t ng cao. M t trong

nh ng nguyên nhân chính là do n ph i th c ph m ch a các ch t gây ung th , trong
đó cóđ c t n m aflatoxin.

c t aflatoxin đ

c sinh ra b i n mm cAspergillus

flavusvà Aspergillus parasiticustrên các lo i h t nông s n quan tr ng không đ
qu n t t nh g o,l c, ngô, đ u t
loàiA. oryzaemà th

ng đ

cb o

ng... Hình thái c aA. flavusg n nh gi ng h tv i

c s d ng trong ngành công nghi p th c ph m[17, 26,

80].
A. flavusvà A. oryzaelà hai loài thu c phân nhóm Flavi c a chi Aspergillus.

T

ng t nh A. oryzae, n m s i A. flavus có kh n ng t n t i

48ºC và sinh tr
flavus t n t i
oryzae, d

ng t i u nh t

nhi t đ t 12ºC đ n

28ºC đ n 37ºC. H u h t trong chu trình s ng A.

d ng h s i và sinh s n b ng bào t đính.Gi ng v i m t s ch ng A.

i đi u ki n b t l i, s i n m A. flavus chuy n thành c u trúc đ c bi t g i là

h ch n m (sclerotia). H ch n m giúp chúng có th t n t i d

i các đi u ki n kh c

nghi t. Khi đi u ki n tr nên thu n l i, các h ch n m s phát tri n thành d ng s i vàt
đó sinh ra các cu ng mang bào t đính, phát tán ra ngoài môi tr

ng đ t và không

khí [17, 26].
Trong t nhiên, r t khó đ có th phân bi t hai loài A. oryzae và A. flavus b i
hình thái r t gi ng nhau.H n n a,khi gi i trình t hai ch ng đ i di n cho hai loài,

nh n th y genome c a ch ng A. oryzae RIB40 và A. flavus NRRL 3357 có đ t

ng

đ ng 99,5% DNA và 98% protein [85]. Phân tích ti n hóa trên m t s ch ng thu c


hai chi này, nh n th yA. flavus và A. oryzaecó m c đ t

ng đ ng tùy thu c vào

t ng ch ng. Ví d nh hai ch ngA. flavusSRRC 1357 và SRRC 2112có m i quan h
g n g i v i A. oryzae h n các ch ngA. flavus khác, do có nhi u đ c đi m c a A.
oryzae h n (Hình 1.2). T các d li u v h gen, A. oryzaeđ

c cho r ng có ngu n

g c phát sinh t loài A. flavus[18].

H̀nhă1.2.M i quan h phát sinh loài và s khác bi t trong h gen c aA. oryzae và
A. flavus (màu xanh lam là A. oryzae, màu xanh lá cây là A. flavus)[18]
A. oryzaekhác v i A. flavus
trình sinh tr
m t đo n

vi c m t kh n ng sinh đ c t aflatoxin trong quá

ngdo trong quá trình ti n hóa đã tích l y nhi u đ t bi n đi m và đ t bi n
m t s gen liên quan đ n sinh t ng h p aflatoxin[8]. Con đ ng sinh t ng

h p aflatoxin b t ngu n t axit norsolorinic (NOR), tr i qua ít nh t 23 quá trình chuy n hóa
trung gian, nh các enzyme đ c mã hóa b i 25 gen n m trong m t vùng DNA kích th c
70 kb đ t o thành aflatoxin có đ c tính cao nh t là aflatoxin B1 (AFB1)[47, 97, 112].
Các b

c chuy n hóa đ

gen liên quan đ n t ng b
n mđ

c th c hi n b i các enzyme có ch c n ng riêng bi t. Các

c chuy n hóa trong quá trình s n xu t aflatoxin trong t bào

c li t kê t i B ng 1.1.


B ngă1.1. Các gen liên quan trong quá trình sinh t ng h p aflatoxin.
Cácăgenăliênăquan

Quáătr̀nhăchuy năđ i

aflA (fas-2), aflB (fas-1), và aflC (pksA)

Acetate -> NOR

aflD (nor-1), aflE (norA), và aflF (norB)

NOR -> AVN

aflG (avnA)

AVN -> HAVN

aflH (adhA)

HAVN -> AVF

aflI (avfA)

AVF -> VHA

aflJ (estA)

VHA -> VAL

aflK (vbs)

VAL -> VERB

aflL (verB)

VERB -> VERA

aflM (ver-1) và aflN (verA)

VERA -> DMST

aflO (omtB, dmtA)

DMST -> ST; DMDHST -> DHST

aflP (omtA)

ST -> OMST; DMST -> DHOMST

aflQ (ordA)

OMST -> AFB1, AFG1
DMDHST -> AFB2, AFG2

Trong hai th p k qua, nhi u k thu t sinh h c phân t đã đ

c s d ng đ

phân bi t các loài thu c phân nhóm Flavi nh k thu t PCR (Polymerase Chain
Reaction)[10], RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)[38], AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism) [66], phân tích so sánh trình t vùng
ITS (Internal Transcribed Spacer) c a DNA ribosome[41] ho c phân tích tính đa


hình nucleotide đ n SNP (Single Nucleotide Polymorphism) [45]. Tuy nhiên, các
ph

ng pháp k trên v n còn nh ng h n ch nh t đ nh trong vi c phân bi tA.

oryzaevàA. flavus ho c thi u s

n đ nh trong các l n l p l i thí nghi m[8]. D a trên

s khác bi t v trình t DNA c a nhóm gen liên quan đ n sinh t ng h p aflatoxin
A. flavus và A. oryzae, m t s c p m i PCR đ c hi u cho các gen này đã đ

c thi t

k và s d ng đ phân bi t A. flavusvàA. oryzae[10].

1.2.Các ph

ng pháp chuy n gen vào n m s i

Các nghiên c u v di truy n h c phân t c a n m s i đã có nh ng đóng góp
đáng k cho s hi u bi t c a con ng

i v c ch gây b nh và các con đ

ng sinh

t ng h p enzyme, protein. Chuy n gen là m t công c không th thi u trong các
nghiên c u này.
Hi n nay, nhi u ph

ng pháp chuy n gen đ

c s d ng nh chuy n gen thông

qua t bào tr n (protoplast), chuy n gen b ng xung đi n, chuy n gen b ng súng b n
gen và chuy n gen s
tumefaciens. M i ph

d ng vi sinh v t trung gian là vi khu n Agrobacterium
ng pháp đ u có nh ng u, nh

c đi m riêng và tùy thu c vào

t ng loài mà hi u su t chuy n gen khác nhau đ i v i t ng ph
ph

ng pháp đ

ng pháp. Tuy nhiên

c s d ng ph bi n nh t n m s i làchuy n gen qua t bào tr n

(protoplast), chuy n gen b ng xung đi n (electroporation)và chuy n gen trung gian
qua vi khu n A.tumefaciens[6, 51, 62, 63].

1.2.1.ăPh

ngăphápăchuy năgenăs ăd ngăt ăbƠoătr nă(protoplast)

Ð chuy n gen vào n m thông qua t bào tr n, t bào n m c n đ

c x lý

enzyme nh m lo i b thành t bào, t đó t o protoplastgiúpDNA d dàng xâm nh p
vào t bào. Ph

ng phápnày có th đ

c s d ng đ chuy n tr c ti p các đo n DNA

ho c các vector mang gen mong mu n vào t bào. Ð nâng cao hi u qu chuy n gen,
protoplast th

ng đ

c x lý v i PEG (polyethylene glycol) ho c b ng xung đi n.

Ph

ng pháp chuy n gen này khá hi u qu , đ c bi t đ i v i nh ng loài mà các

ph

ng pháp chuy n gen kháckhông th th c hi n đ

b protoplast c ng nh các b

c. Tuy nhiên, quá trìnhchu n

c chuy n genkhá ph c t p, t n nhi u công s c, chi phí


cao và không n đ nh, đòi h i ng

i th c hi n ph i có nhi u kinh nghi m, không th

áp d ng r ng rãi t i các phòng thí nghi m v a và nh .

c bi t protoplast ph i đ

c

s d ng ngay sau khi chu n b [51, 57].

1.2.2. K ăthu tăchuy năgenăb ngăxungăđi nă(electroporation)
K thu t chuy n gen b ng xung đi n là ph

ng pháp c h c đ

c s d ng đ

đ a các phân t DNA vào trong t bào ch qua màng t bào. Trong ph

ng pháp

này, m t xung đi n cao th trong th i gian r t ng n (vài ph n nghìn giây) t o ra các
l th ng t m th i giúp cho các phân t DNA ngo i lai t môi tr
vào bên trong t bào. Ph

ng pháp xung đi n đã đ

lo i t bào, trong đó có t bào n m s i[6, 7]. Tr
n m n y ch i s đ
Sau đó t bào tr n đ

ng có th xâm nh p

c áp d ng thành công trên nhi u

c khi x lý v i xung đi n, bào t

c lo i b thành t bào b ng m t s enzyme đ t o t bào tr n.
c tr n v i DNA và đ

DNA vào trong t bào n m [7]. Ph

c đ a vào máy t o xung đi n đ chuy n

ng pháp này m i ch áp d ng thành công v i

m t s loài n m s i và đòi h i ph i có thi t b chuyên d ng dùng cho quá trình
chuy n gen.

1.2.3.ăPh
(ATMT)

ngăphápăchuy năgenăthôngăquaăviăkhu năA. tumefaciens

1.2.3.1. C ch chuy n gen vào t bào ch c a A. tumefaciens
Vi khu n A. tumefacienslà m t loài vi khu n Gram âm s ng trong đ t, thu c
chi Agrobacterium, h Rhizobiaceae. Vi khu n A. tumefaciens là tác nhân gây kh i u
trên th c v t nh chuy n m t ph n DNA (T-DNA) trên plasmid c m ng kh i u (Tiplasmid) c a nó vào t bào th c v t. Các gen n m trên T-DNA mã hóa cho các
enzyme nh h

ng đ n s sinh tr

ng m t ki m soát c a t bào th c v t là nguyên

nhân chính d n đ n s hình thành kh i u[28, 108]. Quá trình chuy n gen gây kh i u

n m trên Ti-plasmid c a vi khu n A. tumefaciens đ

c mô t trên Hình 1.3.


H̀nhă1.3.Vi khu n A. tumefaciens gây kh i u trên th c v t [95]
Ti plasmid có kích th

c 200 kb-800 kb, bao g m đo n T-DNA đ

b i biên trái (LB) và biên ph i (RB), các biên có kích th

c gi i h n

c kho ng 25 bp.T-DNA

mang gen t ng h p auxin, cytokinin và opine. Các gen này s tích h p vào h gen
c a th c v t

m t v trí ng u nhiên. Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có vùng gen

đ c, ch a các gen virmã hóa các protein (virA, virG, và m t s protein khác)giúp v n
chuy n T-DNA vào trong t bào th c v t[28]. Các gen vir này chính là y u t quy t
đ nhkh n ng chuy n T-DNA vào t bào ch c a vi khu n Agrobacterium. S ho t
đ ng c a các gen virđ

c c m ng b i h p ch t phenolic có ngu n g c t th c v t,

có tên là acetosyringone (AS) [63]. Khi có m t ch t c m ng, gen vir ho t đ ng d n
t i quá trình chuy n T-DNA trên Ti plasmid vào t bào.

1.2.3.2. Chuy n gen thông qua vi khu n A. tumefaciens
Trong đi u ki n có ch t c m ng, vi khu nA. tumefaciens s chuy n m t ph n
DNA trên Ti plasmid (còn g i là T-DNA) c a nó vào t bào th c v t. T-DNA sau đó
đ

c tích h p ng u nhiên vào h gen [24, 28]. L i d ng c ch này, vi khu n A.

tumefaciens đ

c s d ng làm sinh v t trung gian đ chuy n gen vào th c v t t

nh ng n m 1980, sau đó vào n m 1998 vi khu n này l n đ u tiên đ
thành công đ chuy n gen vào n m[12].

c ng d ng


Ph
ph

ng pháp chuy n gen thông qua vi khu n A. tumefaciens đ

ng pháp đ n gi n nh t đ chuy n gen vào n m s i. Ph

c coi là

ng pháp ATMT chuy n

gen vào n m d a trên c ch chuy n đo n T-DNA trên Ti-plasmid có m t trong t

bào vi khu n sau đó tích h p ng u nhiên vào h gen n m. Các gen c n chuy n s
đ

c g n vào vùng T-DNA, sau đó đ

cho chuy n vào n m. Ph

c bi n n p vào vi khu n A. tumefaciensdùng

ng pháp chuy n gen này đã đ

c th c hi n thành công

trên nhi u loài n m s i khác nhau[12, 23, 62, 63, 93].
Chuy n gen vào n m thông qua vi khu n A. tumefaciens c n m t h th ng
g m hai plasmid là plasmid tr giúp (vir helper)có ch acác gen vir (virulence) giúp
v n chuy n T-DNA vào t bào ch , và m t vector nh th (binary vector)ch a đo n TDNA đã đ

c c i bi n cho m c đích chuy n gen[63]. Trên vectornh th cóch a gen

kháng kháng sinh dùng đ ch n l c vi khu n mang vector và vùng T-DNA gi i h n
b i hai biên LB (left border) và RB (right border) có ch a marker ch n l c th
chuy n gen và m t vùng DNA có th đ

c c i bi n tùy vào m c đích chuy n gen[27,

74]. Mô hình h th ng vector nh th hi n trong Hình 1.4.

H̀nhă1.4.Mô hình t ng quát v h th ng vector nh th cho chuy n gen vào n m
thông qua vi khu n A. tumefaciens[46]

M t trong nh ng u đi m l n nh t c a ph

ng pháp chuy n gen nh vi khu n

A. tumefaciens là có th t o ra m t lo t các th đ t bi n ng u nhiên do

T-DNA t

t bào vi khu n chèn ng u nhiên vào h gen c a vi n m. M t s nghiên c u ch ra
r ng A. tumefaciens chèn T-DNA vào h gen c a n m ch y u ch
đ n và đo n T-DNA này có th phá h y m t gen duy nh t

d ng m t b n

th bi n n p t

ng ng.


T vi c nghiên c u các th đ t bi n chèn ng u nhiên có th giúp xác đ nh ch c n ng
c a gen.Ngoài ch c n ng bi u hi n và t o các th đ t bi n ng u nhiên, ph
chuy n gen b ng A. tumefaciens còn đ
trao đ i chéo t
Ph

ng pháp

c s d ng trong vi c xóa các gen nh c ch

ng đ ng trong t bào n m[49].

ng pháp chuy n gen thông qua vi khu n A. tumefaciens đã đ

chuy n thành công

c ghi nh n

m t s loài n m s ithu c chi Aspergillus (A. fumigatus, A.

awamori, A. japonicas, A. niger), tuy nhiên ch a có m t nghiên c u nào đ c p đ n
vi c chuy n gen vào A. oryzae thông qua vi khu n A. tumefaciens[12, 23, 62, 63, 93].

1.2.3.3. u và nh

c đi m c a ph

ng pháp

Chuy n gen vào n m thông qua vi khu n A. tumefaciens th c hi n đ n gi n
h n nhi u so v i các ph

ng pháp khác, tuy nhiênth i gian ti n hành dài h n do c n

th i gian đ ng nuôi c y c m nggi a n m và vi khu n [62]. Nguyên li u c a chuy n
gen có th s d ng h s i ho c bào t n m mà không c n b t c khâu x lý b xung
nào nh chuy n gen qua protoplast hay chuy n gen b ng xung đi n. Th m chí, ch s
d ng ph

ng pháp này m i kh thi đ i v i m t s loài n m[90, 102]. Hi u qu

chuy n gen vàon m s ikhi s d ng vi khu n Agrobacterium thu đ

c s th chuy n

cao h n nhi u l n so v i chuy n gen b ng t bào tr n nh PEG [61, 86]. Bên c nh
đó, các nghiên c u g n đây c ng ch ra r ng vi c xóa gen
DNA t
ph

n m nh c ch trao đ i

ng đ ng nh A. tumefaciens đ t hi u qu cao h n so v i xóa gen b ng các

ng pháp khác. Hi u qu xóa gen khi s d ng protoplast ch đ t 1%-50%, nh ng

khi s d ng vi khu n A. tumefaciens hi u qu có th đ t đ n 97% [11].

1.2.3.4.
Ph

ng d ng c a ph

ng pháp chuy n gen vào n m b ng vi khu n A. tumefaciens đã đ

ch ng minh l i th h n các ph
đ u có th đ
ph

ng pháp ATMT trong c i bi n di truy n

ng pháp chuy n gen thông th

c

ng. Nguyên li u ban

c s d ng nh s i n m, t bào tr n ho c bào t . Chuy n gen b ng

ng pháp ATMT t o m t t l cao các th đ t bi n ng u nhiên do T-DNA chèn

vào h gen v t ch [12, 61, 68]. Ngoài ra, chuy n gen b ng ph

ng pháp này có th


t o ra các trao đ i chéo t

ng đ ng. Do đó là công c h u ích đ xóa và xác đ nh các

ch c n ng c a gen [63].
xác đ nh ch c n ng c a m t genc th , ph

ng pháp h u hi u nh t là gây

đ t bi n xóa ho c làm h ng gen đó. Xóa m t gen c
cerevisiaeđ t hi u qu cao và ch c n hai đo n t
trình t mã hóa[91].Tuy nhiên,
h n.Xóa gen s d ng ph
các ph

Saccharomyces

ng đ ng nh (50 bp)

n m s i c n hai đo n t

ng pháp ATMT đ

th

hai phía

ng đ ng kích th

cl n

c ghi nh n là có hi u qu cao h n so

ng pháp chuy n gen khác. Hi u qu xóa gen dao đ ng t 14% đ n 75%, cao

h n h n so v i các ph

ng pháp chuy n gen thông th

ng[63].

1.2.4. Markerăs ăd ngătrongăch năl căcácăch ngăchuy năgen
Hi n nay, marker dùng trong ch n l c các th chuy n geng m 2 lo i là gen
kháng kháng sinhvà các gen liên quan đ n sinh t ng h p m t hay nhi u h p ch t
thi t y u trong quá trình sinh tr

ng c a n m.

1.2.4.1. Gen kháng kháng sinh dùng trong chuy n gen
Các lo i kháng sinh kháng n m thông d ng nh t đ

n m
c s d ng trong ch n l c

th chuy n gen là hygromycin B, phleomycin và nourseothricin. Hygromycin B là
m t lo i kháng sinh thu c nhóm aminoglycoside, đ

c s n xu t t x

khu n

Streptomyces hygroscopicus. Chúng có th tiêu di t vi khu n, n m và các t bào nhân
chu n b ng cách c ch t ng h p protein[76]. Phleomycin đ

c s n xu t b i x

khu n Streptomyces verticillus, là m t kháng sinh ph r ng có hi u qu ch ng l i h u
h t các lo i vi khu n, n m s i, n m men, th c v t và t bào đ ng v t. Kháng sinh
phleomycin thu c nhóm kháng sinh glycopeptide, gây ch t t bàob ng cách bám vào
DNA và làm phá v s i kép c a DNA d n đ n các ho t đ ng c a t bào b ng ng và
ch t[9]. Nourseothricin, v i tên th

ng m i là clonNAT, thu c nhóm kháng sinh

aminoglycoside có ngu n g c t loài x khu n thu c chi Streptomyces. Kháng sinh

nàyho t đ ng b ng cách gây l i mã hóa trong quá trình d ch mã d n t i không t ng


h pđ

c protein. ClonNAT đ

c dùng r t ph bi n làm marker ch n l c th chuy n

gen g m c vi khu n, n m men, n m s i và t bào th c v t [39].

1.2.4.2. Gen tr d

ng dùng làm marker cho chuy n gen

Ch ng n m đ t bi n tr d

ng là các ch ng m t kh n ng sinh t ng h p m t

lo i axit amin ho c m t h p ch tc n thi t trong quá trình sinh tr

ng, vi c m t kh

n ng t t ng h p khi n chúng không còn kh n ng sinh tr

ng trên môi tr

thi u mà c n ph i b sung thêm axit amin ho c h p ch t t

ng ng. Gen tr d

đ

ng t i
ng

c s d ng nhi u nh t trong ch n l c th chuy n gen là gen pyrG (mã hóa protein

tham gia quá trình t ng h p uridine/uracil)[49, 59, 94]. Ngoài ra còn có các gen tr
d

ng khác c ng đ

c s d ng nh adeA(gen mã hóa enzyme tham gia t ng h p

adenine), met(gen mã hóa enzyme tham gia t ng h p methionine), trp(gen mã hóa
enzyme tham gia quá trình t ng h p tryptophan), argB (gen mã hóa enzyme tham gia
quá trình t ng h p arginine)…[30, 116].
Các marker dùng cho ch n l c các th chuy n gen gi vai trò h t s c quan
tr ng, quy t đ nh s thành công c a quá trình chuy n gen. Ph n l n các nghiên c u
chuy n gen vào n m s i s d ng các ch t kháng sinh di t n m. Tuy nhiên, các kháng
sinh này th

ng có giá thành r t cao, khi n vi c chuy n gen b h n ch . Bên c nh đó,

nhi u loài n m s i (tiêu bi u là A. oryzae) có kh n ng kháng t nhiên v i nhi u lo i
kháng sinh ho c ch b

c ch

n ng đ kháng sinh r t cao.Do đó vi c s d ng

kháng sinh trong ch n l c th chuy n gen là không kh thi[96].
đi m này, m t s loài n m s i đã đ
d

kh c ph c nh

c c i bi n di truy n đ có th s các gen tr

ng d ng làm các marker chuy n gen. Chuy n gen vào các ch ng tr d

gi m chi phí, an toàn đ i v i môi tr

c

ng giúp

ng và có ti m n ng ng d ng vào s n xu t th c

ti n.

1.2.4.3. Marker pyrG
Uridine 5’-monophosphate (UMP) và uracil là nh ng h p ch t quan tr ng
trong quá trình sinh tr

ng và phát tri n c a t bào, b i chúng liên quan đ n s t ng

h p các axit nucleic c n thi t cho m i t bào s ng. Sinh t ng h p UMP đ

c th c


hi n b i enzyme orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase)
đ

c mã hóa b i gen pyrG

n m s i ho c gen URA3

n m men [13, 49]. Gen pyrG

giúp t bào n m t t ng h p UMP trong quá trình sinh tr

ng. Tuy nhiên v i nh ng

ch ng đ t bi n h ng gen pyrG, chúng ch có th sinh tr

ng đ

môi tr

c trong đi u ki n

ng ngo i bào có b sung uridine ho c uracil. Khi gen pyrG đ

các ch ng đ t bi n này, chúng có th sinh tr
nhi u nghiên c u tr

ng bình th

c đ a tr l i

ng. Chính vì lý do đó

c đây đã s d ng gen pyrG làm marker ch n l c trong quá

trình chuy n gen [13, 58, 73, 104, 107].
V i ch ng t nhiên (wild type), ho t đ ng c a enzyme OMP decarboxylase
mã hóa b i gen pyrGs chuy n hóa h p ch t 5-fluoroorotic acid (5-FOA) không đ c
thành ch t gây đ c t bào là 5-fluorouracil. Ng

c l i, các ch ng b đ t bi n sai h ng

v gen pyrG s không th chuy n hóa h p ch t 5-FOA và các ch ng này có th sinh
tr

ng bình th

ng trên môi tr

b sung vào môi tr

ng ch a 5-FOA.Chính vì v y 5-FOA th

ng đ

c

ng trong quá trình ch n l c các ch ng vi n m đ t bi n h ng

ho c m t gen pyrG. Vi c đ a gen pyrGquay tr l i th đ t bi n t
đ t bi n t t ng h p uridine/uracil và sinh tr

ng đ

ng ng s giúp th

c trên môi tr

ng t i thi u

(không b sung uridine/uracil)[116].
Nhi u nghiên c u đã đ

c ti n hànhnh m t o ra các ch ngn m s i tr d

uridine/uracil, trong đó có các loài thu c chi Aspergillus. Ph
đ t o ch ng đ t bi n tr d
môi tr

ng

ng pháp ph bi n nh t

ng uridine/uracil là chi u tia UV sau đó sàng l c trên

ng ch n l c có ch a h p ch t 5-FOA, uridine và uracil[34, 49, 104]. Ngoài

cách chi u UV, th đ t bi n tr d

ng uridine/uracil còn đ

c t o ra nh ph

ng

pháplo i b tr c ti p gen pyrG thông qua vi c chuy n c u trúc xóa gen pyrGvào t
bào n m. Nh c ch trao đ i chéo t
th đ

ng đ ng, gen pyrG trong h gen c a n m có

c lo i b đ t o ra th đ t bi n m t kh n ng t ng h p uridine/uracil[25, 49,

116].

1.2.5. M tăs ăgenăch ăth ădùngătrongăchuy năgen ăviăn m


Gen ch th mã hóa các protein t

ng ng đ

c s d ngtrong đánh giá hi u

qu chuy n gen ho c dùng nh d u hi u đ sàng l c các th chuy n gen. S có m t
c a gen ch th khi n các t bào/khu n l c c a th chuy n gen có ki u hình khác bi t
và d dàng phân bi t v i các ch ng t nhiên.Gen ch th không gây nh h
ch c n ng sinh lý c ng nh sinh tr

Ng

ng đ n

ng c a các th chuy n gen[33].

c l i v i marker ch n l c b o v th chuy n gen trên môi tr

ng ch n

ch n l c và gây ch t ho c ng n ch n s phát tri n c a ch ng t nhiên, gen ch th
đ

c s d ng đ sàng l c các ch ng chuy n gen làm cho các t bào/khu n l c ch a

gen ch th có đ c đi m có th quan sát tr c quan b ng m t. Các gen ch th có th
đ

c g n li n v i gen đích và đ

c đi u khi n d

i cùng m t promoter ho c bi u

hi n đ c l p mà không có gen đích đi kèm.M t s các gen ch th hay đ
nh : GFP, DsRed, GUS, lacZ…[40, 69, 72]. Các gen ch th đ

c s d ng

c dùng ph bi n

trong chuy n gen n m s i là gen mã hóa protein hu nh quang xanhGFP và gen mã
hóa protein hu nh quang đ DsRed.

1.2.5.1. Gen mã hóa hu nh quang xanh (GFP)
Gen GFPcó chi u dài 720 bp đ

c phân l p l n đ u tiên t

s a

Aequoreavictoria b i Osamu Shimomura n m 1962.GFP mã hóa protein có kích
th

c 238 axit amin (26,9 kDa). Protein này phát ánh sáng hu nh quang màu xanh lá

cây khi ti p xúc v i ánh sáng b

c sóng 509 nm (Hình 1.5)[78, 89].

Trong l nh v c sinh h c phân t , genGFP th
ch th trong chuy n gen và bi u hi n gen. GFPth

ng đ

ng đ

c s d ng nh m t gen

c đ a vào t bàothông qua

các k thu t chuy n gen vàs tích h p c a GFP trong h gen c a t bào có th đ
b n v ng qua các th h sau.

n nay, GFP đã đ

c bi u hi n

c sinh v t nhân s và nhân chu n, trong đó có n m s i[52].

nhi u loài, bao g m


H̀nhă1.5.Bi u hi n genGFP n m s iAspergillus fumigatus[35]
Gen hu nh quang GFPr t h u ích trong vi c nghiên c u xác đ nh v trí c a
protein ho c ki m tra m c đ bi u hi n c a m t gen mong mu n. Trong nghiên c u
phát tri n các ph

ng pháp chuy n gen, bi u hi n gen ch th GFPđã đ

minh là thành công trên nhi u loài n m s i nh

c ch ng

Aspergillus fumigatus [35],

Aspergillus oryzae[56], Aspergillus nidulans[5], Aspergillus niger[21], Fusarium
oxysporum[48]…

1.2.5.2. Gen mã hóa hu nh quang đ (DsRed)

Gen mã hóa protein hu nh quang đ DsRedcó chi u dài 678 bp đ

c phân l p

t m t loài san hô thu c chi Discosoma. Protein DsRed g m 226 axit amin v i kích
th

c 28 kD, phát hu nh quang màu đ và tín hi u hu nh quang m nh nh t khi đ

quan sát d

i ánh sáng b

c sóng 583 nm[3].Do đ c tính t

quang GFP nên DsRed c ng đ

ng t nh gen hu nh

c s d ng làm gen ch th trong nghiên c u

loài sinh v t khác nhau. Riêng v i n m s i, gen DsRed đ

c

nhi u

c bi u hi n thành công

trên nhi u loài nh Sordaria macrospora[15], Fusarium oxysporum[70],Acremonium

chrysogenum[32], Aspergillus fumigatus[44]…Các t bào nh n đ
có màu đ d

i kính hi n vi hu nh quang v i b

c gen DsRed s

c sóng phù h p (Hình 1.6).


H̀nhă1.6. Bi u hi n gen DsRed

n m s iFusarium oxysporum[70]


Ch

ngă2.ăV T LI UăVẨăPH

NGă

PHÁP
2.1. Nguyên li u
2.1.1. Ch ngviăsinhăv t
Các ch ng vi sinh v t s d ng trong nghiên c u đ

c li t kê trong B ng 2.1.

B ng 2.1. Các ch ng vi sinh v t dùng trong nghiên c u
STT

Tênăch ng

Phơnălo i

Ngu năg c

1

RIB40

A. oryzae

National Research Institute of Brewing
(Nh t B n)

2

AUT1-PlD

A. oryzae

B mônCông ngh Sinh h c,

ih c

Tokyo, Nh t B n
3

VTCCF 032

A. oryzae

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh Sinh
h c, HQGHN

4

VTCCF 040

A. oryzae

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh Sinh
h c, HQGHN

5

VTCCF 047

A. oryzae

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh

Sinh

h c, HQGHN
6

VTCCF 048

A. oryzae

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh

Sinh

h c, HQGHN
7

VTCCF 051

A. oryzae

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh Sinh
h c, HQGHN


8

VTCCF 053

A. oryzae

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh

Sinh

h c, HQGHN
STT

Tênăch ng

Phơnălo i

9

VTCCF 912

A. oryzae

Ngu năg c
Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh

Sinh

h c, HQGHN
10

VTCCF 914

A. oryzae

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh

Sinh

h c, HQGHN
11

VS1

A. oryzae

Phòng Genomic- Phòng thí nghi m Tr ng
đi m Công ngh Enzyme và Protein,
Tr

ng

i h c Khoa h c T nhiên

12

NRRL 3357

A. flavus

ARS (NRRL) Culture Colection (M )

13

VTCCF 013

A. flavus

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh sinh
h c, HQGHN

14

N402

A. niger

CBS Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan)

15

VTCCF 015

A. fumigatus

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh sinh
h c, HQGHN

16

VTCCF

A. fumigatus

Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh sinh
h c, HQGHN

1414
17

FGSC A4

A. nidulans

Fungal Genetics Stock Center (M )

18

DH5

E. coli

[22]

19

AGL1

A. tumefaciens

[43]


Ch ngA. tumefaciens AGL1 là ch ng đã đ c c i bi n di truy n và đ c
s d ng làm sinh v t trung gian đ chuy n gen vào n m. Ch ng AGL1 mang gen
kar kháng kháng sinh kanamycin s d ng trong ch n l c các ch ng mang vector
nh th .
Ch ng A. oryzae AUT1-PlD có ngu n g c t ch ng R)B

b xóa gen pyrG trong h gen v{ đ

d ng marker pyrG.

cs

Ch ng n{yđ~

d ng tr c ti p đ chuy n gen s

2.1.2.ăThi tăb ăvƠăhóaăch t
Các hóa ch t đ

sinh h c phân t

c s d ng trong nuôi c y vi sinh v t và trong các thí nghi m

g m: glucose, sucrose, KCl, NaCl, MgSO4, KH2PO4, K2HPO4,

FeSO4, MnSO4, glycerol, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl,
SDS…Các hóa ch t v i đ tinh khi t cao đ

c mua t

nh ng hãng uy tín nh

Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Biozym.
Các m i dùng cho ph n ng PCR do công ty IDT (Singapore) t ng h p. Danh
sách m i đ

c li t kê

B ng 2.2.

B ngă2.2. M i PCR dùng trong nghiên c u

Tênăm i

Tr̀nhăt ă(5’-3’)

ITS1

TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS4

TCCTCCGCTTATTGATATGC

Enzyme
gi iăh n

Kíchă
th c

Tham
kh o
[114]

486[114]
599 bp

ATGGCCGCCGGGGGCTCT

[10]

AFB-F

AAGCAAACCAAGACCAACAAG

[10]

AFB-R

AACAAGTCTTTTCTGGGTTCTA

Aof-ITS-F

116 bp
P1
P2

[10]

GGGGAATTCGAGCTCTGAAATCAAATC
CTGCCTACC

EcoRI

AAAGGGCCCCTCGAGTGCACTAGCCAC

XhoI

1,41 kb