Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm enzyme cellulase, amylase đến khả năng sinh trưởng và năng suất thịt của gà lương phượng

1

TÓM TẮT
Đe nâng cao khả năng sinh trưởng và sức sản xuất thịt của gia cầm nên tiến hành
“Nghiên cứu sản xuất và đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm enzyme amylase, cellulase đến
khả năng sinh trưởng và năng suất thịt của gà Lương Phượng”.
Nghiên cứu này được bắt đầu bằng nuôi cấy các chủng vi nấm Trichoderma trên môi
trường cảm ứng và tuyển chọn các chủng Trichoderma có khả năng sinh amylase, cellulase.
Sau đó, khảo sát các chủng này trên môi trường bán rắn chứa cơ chất. Cơ chất được sử dụng
là bã khoai mì vì bã khoai mì là phế phẩm công nghiệp rất dồi dào và rẻ tiền. Trong thành
phần chính bã khoai mì đang khảo sát, tinh bột và cellulose chiếm tỷ lệ lần lượt 32,33 % và
6,96 % nên thích hợp làm cơ chất nuôi cấy nấm Trichoderma để thu nhận amylase và
cellulase.
Chế phẩm enzyme - Eplus được tạo ra theo quy trình sản xuất thử nghiệm trong điều
kiện nuôi cấy nấm Trỉchoderma tối ưu là 36 giờ trên môi trường bán rắn chứa bã khoai mì
80 %, độ ẩm 60 %. Trong chế phẩm chứa 12,11 % tinh bột; 2,01 % cellulose; hàm lượng
đường khử 12,79 (mg/ml); hoạt độ enzyme amylase 407,8 (UI/g); cellulase 649,37 Ul/g; đạm
formol 12,22 (g/1).
Khi trộn chế phẩm enzyme - Eplus vào thức ăn tổng hợp và nuôi thử nghiệm trên gà
Lương Phượng, cho thấy: tỷ lệ nuôi sống tích lũy 99 - 100 %; tiêu tốn 2,2 - 2,5 kg thức ăn hỗn
hợp cho 1 kg tăng trọng; trọng lượng trung bình gà trống và mái mười tuần tuổi đạt 1,92 - 2,2
kg và 1,61 - 1,7 kg; năng suất thịt đạt 76 - 79 %. Bổ sung 10 - 15 % chế phẩm enzyme Eplus
vào thức ăn tổng hợp là thích hợp cho nuôi gà Lương Phượng từ ba tuần tuổi trở lên.
Ngoài ra, sử dụng chế phẩm enzyme Eplus hạn chế phân ướt, giảm ô nhiễm môi trường,
giảm được chi phí thuốc trị bệnh cho gà, giảm được chi phí chăn nuôi.


2

Chương 1
ĐẢT VẤN ĐÈ

•

Thức ăn dùng trong chăn nuôi (bắp, tắm, cám, đậu đỗ) có cấu trúc thảnh tế bào thực vật
(cellulose, hemicellulose, pectin) được gọi chung các chất này là NSP. Cơ thể vật nuôi không
có khả năng tiết những enzyme tiêu hóa những cơ chất này (trừ thú ăn cỏ) nên lãng phí một phần
năng lượng từ các NSP không được tiêu hóa. Các NSP là một yếu tố hạn chế dinh dưỡng.Và khi
nuôi gia súc, gia cầm thương phẩm có năng xuất cao, người chăn nuôi cho vật nuôi ăn nhiều
thức ăn để mau đạt trọng lượng xuất chuồng. Với cách cho ăn này thức ăn tiêu hóa không kịp
đã bị thải ra ngoài, không tận dụng hết nguồn dinh dưỡng trong thức ăn, hao tốn thức ăn và tăng
chi phí chăn nuôi, hiệu quả kinh tế giảm.
Vấn đề trên được giải quyết bằng phương pháp bổ sung các hệ enzyme thủy phân vào thức
ăn vật nuôi. Mà một trong những hệ enzyme thủy phân đáng chú ý có nguồn gốc từ vi nấm
Trỉchoderma bởi vi nấm này có khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào như cellulase, amylase,
pectinase, chitinase, xylanase, endo-6 -glucanase và exo-6 - glucanase, protease, lipase, phytase.
Trong đó, enzyme amylase và cellulase có thể thu nhận khi tận dụng bã khoai mì để nuôi vi nấm
Trichoderma do bã khoai mì chứa 32,33 % tinh bột và 6,96 % cellulose. Ngoài ra, tận dụng tốt
nguồn cơ chất bã khoai mì còn góp phần giảm bớt ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối và nấm
mốc độc hại phát triển trên bã khoai mì không sử dụng.
Đe thu nhận hoạt độ amylase và cellulase của vi nấm Trichoderma cao, ổn định cũng như
khảo sát mức độ hoạt động của enzyme trong hệ tiêu hóa vật nuôi nên tiến hành “Nghiên cứu
sản xuất và đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm enzyme amylase, cellulase đến khả năng sinh
trưởng và năng suất thịt của gà Lương Phượng”.
Cellulase là một phức hệ hydrolase gồm từ cellulase Cj đến cellulase Cx và P- glucosidase.
Chúng phân hủy lần lượt cellulose để cuối cùng tạo ra sản phẩm đường glucose. Hiện nay,
cellulase từ vi sinh vật được sản xuất với quy mô công nghiệp và được ứng dụng vào nhiều trong
công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, chăn nuôi động vật ăn cỏ, sản
xuất dược liệu (Nguyễn Đức Lượng,


3

2006). Và amylase là các enzyme đường hoá, có khả năng phân hủy amylose và amylopectin,
glycogen và các polysaccharide tương tự giải phóng glucose. Amylase có khả năng phân hủy
phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông
sản ngô khoai, sắn. Và amylase thường được bổ sung trong các hợp chất hóa học nhằm cải tạo
ao hồ, kích thích tăng trưởng và phát triển mạnh của động vật thủy sản ở các giai đoạn mong
muốn. Trong sản xuất chất tẩy rửa, amylase phân giải các vết bẩn cacbohydrat trong vải và quần
áo. Trong công nghiệp thực phẩm, enzyme amylase được dùng trong công đoạn hồ hóa và thủy
phân tinh bột (Bùi Ái Công, 2005).
Đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về enzyme Trỉchoderma trong đó có Christian p.
Kubicek và ctv (1988), nhận thấy dòng nấm Trỉchoderma reeseỉ QM - 9414 có hiệu quả tốt nhất
trong việc biến cellulose thảnh đường. Đen năm 2000, Gary E. Harman đã nghiên cứu cơ chế
tạo các enzyme phân huỷ lớp cellulose hay chitin như cellulase, chitinase, p - 1,3 glucanase của
Trichoderma. Trong nước cũng có nghiên cứu của Trần Thạnh Phong và ctv (2007), đã tận dụng
bã mía kết hợp với cám mì như nguồn carbon nuôi cấy Trỉchoderma reesei VTT - D - 80133 thu
nhận cellulase. Và năm 2003, Lê Thị Uyên Thảo và ctv đã tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy
Trichoderma harzianum (Việt Nam) trên môi trường bán rắn chứa bã khoai mì. Kết quả hệ
enzyme thu nhận có hoạt độ cellulase 3.243,5 Ul/g, pectinase 106,1 Ul/g, xylanase 10.119,5
Ul/g.
Các thí nghiệm trên chỉ dừng ở giai đoạn nghiên cứu về enzyme chưa thử nghiệm thực tế
nên chưa đánh giá hiệu quả tác dụng của enzyme từ vi nấm Trichoderma, nên nhận thấy cần
nghiên cứu một qui trình sản suất enzyme của vi nấm Trỉchoderma và thử nghiệm chế phẩm
trên thực tế để chế phẩm enzyme được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau và góp phần
mang lại lợi ích cho xã hội.


4

Chuông 2
MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Mục tiêu
Định tính và định lượng enzyme của các chủng Trichoderma để tìm các chủng có hoạt
tính enzyme cao để tạo chế phẩm enzyme amylase và cellulase. Thử nghiệm chế phẩm này trên
gà Lương Phượng nhằm tìm tỷ phối trộn thích hợp của chế phẩm enzyme với thức ăn hỗn hợp.
Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm enzyme đến khả năng sinh trưởng và sức sản xuất thịt của
gà Lương Phượng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Bảo quản giống Trichoderma
Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), phương pháp bảo quản giống Trichoderma phổ biến và
đơn giản là cấy truyền và bảo quản lạnh. Dựa trên sự trao đổi chất theo một khoảng thời gian
nhất định. Sau khoảng thời gian này lại lặp lại công việc trên.
Mục đích của bảo quản giống Trichoderma là sau quá trình bảo quản các tính trạng quan
trọng của giống không bị mất hoặc bị giảm. Trong định tính và định lượng enzyme của
Trỉchoderma thực hiện nhiều lần và thời gian thí nghiệm kéo dài nên cần thiết bảo quản giống
theo phương pháp trên để thí nghiệm không bị gián đoạn và đảm bảo các lần lặp lại thí nghiệm
không bị sai số nhiều. Và đảm bảo đánh giá chính xác hoạt độ của các chủng Trichoderma.
Cách tiến hành: cấy truyền mỗi giống vi sinh vật vào 5 ống nghiệm, nuôi cấy ở nhiệt độ
28 - 32 °c cho đến khi tạo được lượng sinh khối nhất định, mỗi giống lấy một ống dùng cho
nghiên cứu, một ống dùng sản xuất hoặc kiểm tra, một ống dùng cho bảo quản ở nhiệt độ lạnh
4 °c. Sau khoảng một tháng cấy truyền và lặp lại như trên, tuân thủ chu kì cấy truyền và bảo
quản lạnh.
2.2.2. Phương pháp nhân giống
Phương pháp này nhằm nhân số lượng tế bào của vi nấm Trichoderma, tạo khả năng thích
nghi dần cho vi nấm trong điều kiện cơ chất bã khoai mì tăng dần.
+ Phương pháp nhân giống cấp một: mỗi ống nghiệm giống được cho vào 10 ml nước cất
hấp vô trùng, khuấy đều. Hút 5 ml (mật độ tế bào 105 - 106 tế bào/1 ml) cho vào môi trường
nhân giống cấp một, đảo đều. Bảo quản nơi khô ráo và sạch sẽ.


5

+ Phương pháp nhân giống môi trường cấp hai: dùng kẹp lấy bào tử từ bình nhân giống cấp
một rồi cho vào bình môi trường cấp hai, đảo đều, để nơi khô ráo sạch sẽ. (Trần Thanh Thủy,
1999). Giống trên môi trường cấp hai được giữ ở điều kiện thích nghi cao nhất để khả năng phát
triển và sinh enzyme trên môi trường sản xuất của vi nấm Trỉchoderma là tốt nhất.
2.2.3. PhưoTig pháp xác định độ ẩm
Đây là phương pháp hỗ trợ cho người làm thí nghiệm xác định độ ẩm nguyên liệu sử dụng,
tính hệ số khô kiệt của nguyên liệu giúp xác định hàm lượng tinh bột và cellulose chính xác.
Phương pháp này có thể xác định độ ẩm của môi trường nuôi cấy để đảm bảo vi nấm
Trỉchoderma hoạt động tốt và xác định độ ẩm của sản phẩm sau khi nuôi cấy nhằm bảo quản
sản phẩm tốt hơn.
Nguyên tắc: dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu phân tích. Cân trọng lượng
mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm (Đồ Đại Nghĩa,
2005).
Cách tiến hành:

Mẩu cần xác định độ ẩm (nghiền nhỏ).

I
Cân chính xác một lượng nhất định 4g.

1

Cho vào chén đựng mẫu (được sấy khô đến trọng lượng không đổi).

I.'
Cho vào tủ sấy (100 - 105 °c trong 6 - 8 giờ đến khi trọng lượng không đổi).

ĩ

Làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 30 phút) và đem cân.
Tính kết quả

w(%) = — --------- -.100

(1)

m
Trong đó:

w : Độ ẩm của mẫu (%).
mj: Trọng lượng chén và trọng lượng mẫu trước khi sấy (g). m2 :
Trọng lượng chén và trọng lượng mẫu sau khi sấy (g). m : Trọng
lượng mẫu phân tích (g).

2.2.4. Xác định số lượng tế bào
Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2006), số lượng tế bào được xác định bằng phương pháp đếm
trực tiếp bào tử trên buồng đếm hồng cầu.


6
Xác định số lượng bào tử trong lml giống để đảm bảo sổ lượng bào tử vi nấm Trichoderma
không quá nhỏ khi cấy chuyền sang môi trường bán rắn. Ngoài ra, xác định sé lượng bào tử vỉ
nấm Trichoderma cỗ trong sản phẩm nuôi cấy để kiểm tra với số lượng bào tử này cố gây hại
cho bộ máy tiêu hóa cho vật nuôi khi đùng sản phẩm enzyme đã sản xuất theo quỉ trình thử
nghiệm.
Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật,
giữa là phần lõm phẳng, tại đây cỗ kẻ một lưới gồm 400 hình vuông nhỏ có diện tích tổng cộng
là 1 mm2. Ô trung tâm có 25 ô vuông lớn, mẫỉ ô vuông lớn này cố 16 ô vuông nhỏ. Vi thế diện
tích một hình vuông nhỏ là 1/400 mm2 và một hình vuông lởn hơn là 1/25 mm2.

Cách tiến hành: tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau. Đặt lá kính lên khu
vực buồng đếm. Lắc đều dịch tế bào nấm Trỉchoderma và dùng micropipet để lấy dịch cho vào
khe ở mép giữa buồng đếm. Tránh tạo bọt khí. Đặt buồng đếm vào bàn kính hiền vỉ và để yên
vài phút. Chỉnh kính hiền vỉ, với vật kỉnh X 40, tìm mạng ồ đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh
thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lởn (4x4=160 nhỏ).

Hình 2.1 Buồng đếm haemocytometer.
Đếm số tế bào và tính toán: thể tích dịch chứa trên ô trung tâm (gồm 25 ô vuông lớn hay
400 ô vuông nhỏ) là 1 X 0,1 =0,1 mm3 (vì diện tích tổng cộng của ô trung tâm là 1 mm2). Tuy
nhiên, chỉ cần đếm số tế bào trên 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lởn trên ô trung tâm.
Khi đó, số lượng tế bào trong 1 ml (1 g) mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức sau:


7

400-a 103 10"
N --------- ——
-----------AT

(2)

Trong đó: N : sô lượng tê bào trong01,1-6
ml mâu nghiên cứu.
a

: số tế bào trong 5 ô vuông lớn ( 80 ô vuông nhỏ).

b

: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16x5 = 80 ô vuông nhỏ).

400

: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm.

0,

1

103

: số chuyển mm3 thành ml (1000 mm3 = 1 ml).

10"

: độ pha loãng mẫu.

: thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm.

2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose, tinh bột
Theo Nguyễn Quang Tâm (2003), hàm lượng cellulose thô, tinh bột được xác định bằng
phương pháp thủy phân bằng axit và kiềm mạnh.
Sử dụng phương pháp này với mục đích xác định lượng tinh bột, cellulose có trong bã khoai mì
cũng như xác định lượng tinh bột, cellulose có trong sản phẩm trước và sau khi nuôi cấy vi nấm
Trichoderma. Qua đó đánh giá khả năng sử dụng cơ chất của vi nấm Trichoderma.
+ Xác định hàm lượng cellulose
Nguyên tắc: phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền vững của cellulose
trước tác dụng của acid mạnh, kiềm mạnh. Trong khi đó, các chất khác thường đi kèm theo với
cellulose như tinh bột, pectin ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxi hóa, phân
giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp nitric

với acid acetic.
Cách thực hiện: cân 2 g bã khoai mì cho vào bình 500 ml + 200 ml NaOH 0,5 %. Hồi lưu
và đun nhẹ trong 30 phút (lắp ống sinh hàn ngược) không để bọt trào. Lọc qua giấy lọc, rửa cặn
còn lại với NaOH nóng cho cặn celulose + 10ml HC1 10 % trong bình cầu (nhiệt độ thường) +
10 ml nước Javel nhỏ từ từ, vừa cho vừa khuấy đều để yên 5 phút rồi lọc, cho cặn tác dụng với
NaOH 0,5 % ở nhiệt độ 40 °c để hòa tan chất khác, lọc, lặp lại hai lần cho cellulose thật trắng.
Rửa bằng nước sôi, sấy khô đến trọng lượng không đổi, đặt trong bình hút ẩm và cân.

Tính hàm lượng cellulose (%) trong 1 gam mẫu:
Trong đó:

X: hàm lượng cellulose (%).

X=

a 100

w

(3)


8

a: trọng lượng cellulose (g).
W: trọng lượng khô của mẫu thí nghiệm (g).
100: hệ số chuyển đổi thành (%).
+ Xác định hàm lượng tinh bột.
Nguyên tắc: do tinh bột là một polysaccarit, không tan trong nước nhưng có thể tan trong
dung dịch HC1 và có thể kết tủa lại bằng cồn 96 0 nên sau khi loại rửa các tạp chất bằng cồn và

bằng ete, tinh bột được hòa tan trong axit clohidric, rồi kết tủa bằng cồn 96 °. Rửa sạch, cân và
tính hàm lượng tinh bột trong 100 g mẫu phân tích.
Cách tiến hành: cân chính xác 2 g bã khoai mì cho vào phễu sứ ở đáy đã lót giấy lọc cắt
tròn. Rửa bằng ete, bằng cồn rồi bằng nước, mỗi thứ hai lần, bằng cách hút chân không. Cặn và
giấy lọc được chuyển sang một cốc thủy tinh, cho vào 11 ml nước cất với 14 ml HC1 đậm đặc,
khuấy kỹ. Tinh bột hòa tan vào dung dịch. Chuyển sang bình định mức dung dịch. Chuyển sang
bình định mức dung 100 ml, rửa cốc thủy tinh và dồn hết nước rửa vào bình định mức, sau đó
cho nước vừa đủ 100 ml và lọc. Hút lấy 50 ml dịch lọc trên cho vào một cốc thủy tinh, thêm 110
ml cốn 96 ° khuấy đều và để yên trong tủ lạnh (khoảng 10-12 giờ) để cho tinh bột kết tủa hết.
Chuẩn bị hai miếng giấy lọc tròn bằng nhau, sấy khô trong cùng một điều kiện và cân.
Lồng hai miếng giấy lọc vào nhau, giấy số 1 trên giấy số 2, để vào đáy phễu cho thật khít (nếu
hở thì không hút được chân không). Lọc kết tủa tinh bột bằng chân không và bằng cách lọc gạn.
Rửa sạch kết tủa với 200ml cồn 70 %, sau đó với cồn 96 0 cho đến khi hết phản ứng Cl'. Tách
thật khéo hai miếng giấy lọc riêng rẽ (giấy số 1 phải giữ đầy đủ kết tủa, giấy số 2 làm đối chứng
trắng), sấy ở nhiệt độ 130 °c trong một giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân.
Hàm luợng tinh bột trong lOOg bã khoai mì: ( p - P’).100

(4)

Trong đó: p = 2 + P2-PI
P’= 2 + P2 - Pi - PT
PJ : trọng lượng giấy số 1 (g)
p2 : trọng lượng giấy số 2 (g)
PT : trọng lượng của kết tủa (g)
2.2.6. Phương pháp ly trích enzyme thô bằng phương pháp ly tâm lạnh
Bình môi trường đã nuôi cấy, cân 10 g và thêm nước cất vô trùng, đặt lên máy lắc trong
30 phút, chiết dung dịch cho vào ống ly tâm, ly tâm lạnh (4.000 vòng trong 10


9

phút), thu enzyme (Trương Phước Thiên Hoàng, 2001). Enzyme thô được ly trích và kiểm tra
hoạt độ, thông qua đó đánh giá hoạt độ enzyme của Trỉchoderma trong quá trình nuôi cấy ở
những điều kiện khác nhau.
2.2.7. Xác định hàm lượng đường khử
Theo Nguyễn Như Nhứt và Lâm Thị Kim Châu (2006), xác định hàm lượng đường khử
bằng phương pháp Miller.
Trong mỗi giai đoạn nuôi cấy, mỗi tỷ lệ giống và mỗi tỷ lệ cơ chất khác nhau thì lượng
đường khử sinh ra không giống nhau. Để biết sự khác biệt như thế nào thì phương pháp Miller
sẽ cho câu trả lời chính xác. Thông qua xác định lượng đường khử có thể đánh giá hoạt độ
enzyme trên môi trường sản xuất, hỗ trợ việc xác định giai đoạn, tỷ lệ giống và tỷ lệ cơ chất nào
thích hợp cho hoạt động trao đổi chất của vi nấm Trỉchoderma.
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc
thử acid dinitrosalisylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hơp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ
đường khử. Dựa trên đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ
tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Cách thực hiện:
Dựng đường chuẩn glucose: chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, cho vào các ống nghiệm lần
lượt các nồng độ dung dịch glucose 0 - 500 pg/ml, thêm nước cất và thuốc thử DNS. Lắc đều
các ống nghiệm này, dán nylon lên miệng ống nghiệm, đun sôi cách thủy trong 15 phút, làm
lạnh về nhiệt độ phòng (bằng một chậu nước lạnh). Đo độ hấp thụ OD ở bước sóng 530 nm (AG
) với ống số 0 là ống đối chứng (Aw).
Bảng 2.1 Phương pháp dựng đường chuẩn glucose
Ống số

0

1

2

3

4

100
0,1

200
0,2

300

400

Dung dịch glucose chuẩn (ml)

0
0

0,3

0,4

0,5

Dung dịch DNS (ml)

1

1

1

1

1

1

Nước cất (ml)

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Nồng độ dd glucose chuẩn (pg/ml)

5
500

Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn bằng hiệu số: (AG - Aw) Dựng đồ

thị đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD), trục hoành là nồng độ glucose
(mg/ml).


10

c

Tính hệ số glucose: F = --------- - —
A- —
A Gw
A

(5)

A

Trong đó: F : hệ số glucose.
CG: nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml).
AG : độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn.
Aw : độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất.
Chia nồng độ (mg/ml) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch glucose chuẩn để thu được
giá trị hệ số glucose, sau đó tính giá trị hệ số trung bình.
2.2.8. Xác định hoạt tính hệ enzyme cellulase
Nguyên tắc: sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzyme với CMC trong 60 phút và
pH = 5,0. Sau khi ủ, phân tử glucose được phóng thích, đo hàm lượng glucose xác định được
hoạt tính enzyme cellulase (Nguyễn Lân Dũng và ctv,1976).
Khi khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một, cấp hai và môi trường
sản xuất. Ở điều kiện nuôi cấy khác nhau thì hoạt độ cellulase cũng khác nhau. Để tìm điều kiện
nuôi cấy nào có hoạt độ enzyme tối ưu nhất thì cần phải xác định hoạt độ cellulase.

Cách thực hiện:
+ Thực hiện phản ứng thử thật: dùng pipet hút 3 ml dung dịch CMC 0,3 %; 1 ml dung
dịch enzyme và 1 ml dung dịch đệm acetate pH = 5,0. ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 40 °c trong
một giờ. Sau đó lấy hỗn hợp ra khỏi buồng ủ nhiệt, hút lấy 1 ml dung dịch ủ và 1 ml dung dịch
thuốc thử DNS 1 %. Đun sôi cách thủy 5 - 1 0 phút, làm nguội và đo OD (A, = 530 nm), có
được độ hấp thu OD là AK.
+ Thực hiện phản ứng thử không: tương tự phản ứng thử thật nhưng thay 1 ml dịch enzyme
bằng 1 ml dịch enzyme bị bất hoạt (enzyme được đun trong 20 phút ở 100 °C), đo OD (X = 530
nm), có được độ hấp thu OD là AT.
Hoạt độ cellulase (Ul/g) =

2nV
m

Trong đó:

Aj: độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme.
Ak: độ hấp thu OD của phản ứng thử không.
2 : thể tích hỗn hợp phản ứng (ml).
V : thể tích enzyme ban đầu (ml). n : độ pha loãng; m:
khối lượng mẫu phân tích (g).

(6)


11

2.2.9. Xác định hoạt tính amylase
Theo Lê Ngọc Tú và ctv (2000), phương pháp được dừng để xác định hoạt tính amylase
là phương pháp Henkeil.

Thành phần cơ chất trên môi trường nhân giống và môi trường sản xuất không giống nhau thì tỷ
lệ tinh bột cũng khác nhau. Hoạt độ enzyme amylase sinh ra trong những điều kiện ấy luôn có
sự tăng và giảm. Sử dụng phương pháp Henkeil để lựa chọn và tìm ở điều kiện nào enzyme
amylase là tối ưu nhất.
Nguyên tắc: xác định lượng tinh bột bị thủy giải trên cơ sở xác định mức độ giảm cường
độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod. Đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme
có khả năng thủy phân 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 30°C; pH = 6,0.
+ Thực hiện phản ứng thử thật: dùng pipet hút 1 mi dung dịch tinh bột 1 %; 1 mi dung
dịch NaCl 0,1 %; 2 ml dung dịch đệm phosphate 0,05 M (pH = 6,0), lắc đều. Sau đó để yên 1520 phút cho hỗn hợp đạt 30°c. Cho vào hỗn hợp 1 ml dịch enzyme. Tiếp tục lắc đều và giữ cho
hỗn hợp ổn định ở 30 °c trong 30 phút. Sau đó, cho vào hỗn hợp 5 ml HCl 0, 1 N để dừng phản
ứng. Hút lml hỗn hợp phản ứng với 9 ml dung dịch Iod pha loãng 450 lần và đo OD (Ả =560
nm), có được độ hấp thụ OD là MT.
+ Thực hiện phản ứng thử không: tương tự phản ứng thử thật nhưng cho 5 ml HCl vào hỗn
hợp trước khi cho dịch enzyme vào, đo OD (Ằ = 560 nm), có được độ hấp thu OD là Mk.
+ Đường chuẩn tinh bột: từ dung dịch tinh bột 1,0 %; xây dựng đường chuẩn với dung
dịch tinh bột có nồng độ từ 0 - 10 mg/ml. Lắc đều các ống nghiệm, hút 1 ml + 9 ml dung dịch
Iod pha loãng 450 lần, đo OD ở bước sóng 560 nm (Mc). Ống số 0 là ống đối chứng (M0).

Bảng 2.2 Phương pháp dựng đường chuẩn tinh bột
Ống số
Nồng độ tinh bột (mg/ml)
Tinh bột chuẩn (ml)
Nước cat (ml)

0

1

2

3

4

5

0

2

4

6

8

10

0
5

1
4

2
3

3

4

5

2

1

0

Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch tinh bột chuẩn bằng hiệu số: (M0 - Mc).


12

Dựng đồ thị đường chuẩn tinh bột với trục tung là mật độ quang (OD), trục hoành là
nồng độ tinh bột (mg/ml).
Tính hoạt độ amylase (UI/g) =

X.U.IOV

(7)

m

Trong đó: X : số mg tinh bột bị thủy phân. n :
Độ pha loãng.
V : Thể tích enzyme ban đầu (ml).
10

: Thể tích của hỗn hợp phản ứng (ml).

m : Khối lượng môi trường cần đo OD (g).
2.2.10.
2.2.10.1.

Phương pháp xác định nitơ tổng số, nitơ - amin
Xác định nitrogen formol

Theo Vụ Khoa Học Công Nghệ và Chất Lượng Thực Phẩm (2001), xác định nitrogen
formol bằng phương pháp Sorensen.
Sử dụng phương pháp này nhằm xác định lượng đạm formol được sinh ra trong sản phẩm nuôi
cấy vi nấm Trỉchoderma, kiểm tra được lượng đạm có thể hấp thu được có trong chế phẩm
enzyme Eplus.
Nguyên tắc: trong phân tử amino axit, peptit, protein có một đầu chức là carboxylic (COOH) xem như là một axit, còn đầu kia là chức amin (- NH2) xem như là một bazơ; các amin
tự do cũng như ammoniac khi hòa tan thường ở dạng ammonium (NH4 +) kết hợp với một anion
thường là clorua, sulfate, phosphate. Khi cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol,
formol sẽ tác dụng lên nhỏm (- NH2) để tạo thành phức chất metylen.

HỌOC - CH - NH2 + HCHO
I
R

HCOO - c = CH2 + H20 I
R

R - CH4CI + HCHO ---------------------- R - N = CH2 + H20 + HC1
Do vậy sản phẩm là một hợp chất metylen và một chức (-COO) tự do hoặc HC1 có tính
axit, nên có thể định phân bằng NaOH để xác định một cách gián tiếp lượng (-NH2).
Cách tiến hành: trung hòa formol lÁ: lấy 500 ml formol /4, thêm vào đó vài giọt thuốc thử
phenolphtalein, cho NaOH 0,1 N từng giọt cho tới khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt (pH =

9), ta được formol Vi đã trung hòa. Hút 10 ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 10 lần, thêm
vào đó 10ml dung dịch formol V2 đã trung hòa và vài


13

giọt phenolphtalein, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định phân bằng NaOH 0,1N
cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng.
Tính đạm formol (g/1):
Nf = 1,4■ 0,97 ■ (VT — V0)

(8)

Trong đó: Nf : lượng nitơ - amin (g/1).

2.2.10.2.

Vo

: thể tíchNaOH trung bình của 3 lần thử không (ml).

VT

: thể tíchNaOH trung bình của 3 lần thử thật (ml).

Phưotig pháp xác định đạm tổng số

Xác định đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldhal (Vụ Khoa Học Công Nghệ và Chất
Lượng Thực Phẩm, 2001). Theo nguyên tắc là chuyển toàn bộ nitơ trong mẫu thành dạng amon
sulfate, giải phóng NH3 bằng kiềm, hấp thu NH3 bằng axit boric và xác định Nbằng phương

pháp trung hòa dung dịch chuẩn HC1 hoặc H2S04.
Xác định lượng đạm tổng số trước và sau khi sấy khô nhằm kiểm tra trong sản phẩm có thành
phần đạm thối gây hại hay không.
Cách tiến hành: cân 1 g (hoặc lml dung dịch) mẫu cho vào ống đốt, thêm 2 g hỗn hợp
muối và 25 ml H2S04 đậm đặc 5 giọt parafin, cho vào máy phá mẫu, tiến hành phá mẫu cho đến
khi dung dịch có màu trong suốt, để nguội và thêm khoảng 50 ml nước. Tiến hành cất đạm: lắp
ống đốt vào máy cất đạm khoảng 350 giây, NH3 được hấp thu bằng 50 ml dung dịch axit boric
5% đã cho thuốc thử bromocresol. Định lượng NH3 bằng cách chuẩn độ với HC1 0,25N đến khi
chuyển từ màu xanh sang màu tía nhạt.
Tính % khôi lượng N trong mâu N{%) = ---------- ---- - --- — ----------m
Trong đó:

(9)

a : thể tích dung dịch axit chuẩn sử dụng cho mẫu thử (ml).
b : thể tích dung dịch axit chuẩn sử dụng cho mẫu trắng (ml).
N :nồng độ đương lượng axit chuẩn. m : khối lượng mẫu (g).
0,01401 : mili đương lượng gam N (g).

2.2.11.
2.2.11.1.

Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thử nghiệm phân giải amylase, cellulase của các chủng Trichoderma

Nguyên tắc: khi có mặt cơ chất, tế bào vi nấm sẽ tổng hợp enzyme tương ứng thông qua
cơ chế cảm ứng và chính cơ chất là yếu tố kích thích tế bào tiết enzyme thực hiện phản ứng phân
giải (Nguyễn Đức Lượng, 2006).

14

Cách tiến hành: môi trường cảm ứng hệ enzyme amylase và cellulase được chuẩn bị (mục
22.4.2), cấy mỗi chửng Trỉchoderma lên giữa đĩa môi trường. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trong
60 giờ. Sau đó, cho thuốc thử Lugol, lắc đều và để yên 15 phút. Đo đường kính vòng phân giải
tinh bột và CMC. Chọn các chủng Trỉchoderma có đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC
lớn.
2.2.11.2. Tuyển chọn chủng Trichoderma có họat độ amylase và cellulase cao.
Chọn chủng là giai đoạn quan trọng trong sản xuất chế phẩm enzyme. Một chửng tốt sẽ
cho năng suất xử lý bã khoai mì tốt và chất lượng sản phẩm chứa enzyme cao, tăng khả năng
cạnh tranh với các chế phẩm enzyme trên thị trường.
Cách tiến hành: các chủng được chọn (mục 2.3.11.1) nuôi cấy trên môi trường bán rắn
chứa 5 % bã khoai mì, nuôi cấy trong 48 giờ, 3 ml giống (106 tế bào/ml). Ly trích enzyme dạng
thô, định hoạt tính. Chọn chửng Trỉchoderma có hoạt tính enzyme amylase, cellulase cao. Và
tiếp tục khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu trên môi trường bán rắn.
2.2.11.3. Khảo sát điều kiện nuôi cấy Trichoderma trên môi trường bán rắn
Để vi nấm Trỉchoderma có thể hoạt động tốt trên môi trường cơ chất (bã khoai mì) với
lượng lớn thì cần phải có điều kiện nuôi cấy thích hợp. Tiến hành chuẩn bị giống các chửng
Trỉchoderma được chọn; môi trường nhân giống.
+ Khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một, cấp hai
Khảo sát thời gian nuôi cấy: mỗi chủng Trichoderma có giai đoạn phát triển khác nhau,
thời gian để toàn bộ lượng enzyme sinh ra kết hợp được với cơ chất cũng khác nhau. Do đó khảo
sát thời gian nuôi cấy để tìm giai đoạn lượng đường khử sinh ra nhiều nhất và khi đó hoạt độ
enzyme cũng là cao nhất.
Cách tiến hành: nuôi cấy các chủng Trichoderma với các giai đoạn (giờ) là 24; 36; 48;
60 và 72 trên môi trường bán rắn đã chuẩn bị sẵn, cùng tỷ lệ giống (106 tế bào/ml đối với môi
trường nhân giống cấp một; 106 tế bào/g đối với môi trường nhân giống cấp hai). Đo hoạt tính
enzyme amylase, cellulase. Xác định thời gian sinh enzyme cao nhất.
- Khảo sát thể tích giống, tỷ lệ giống: lượng cơ chất nhất định được nuôi cấy trong khoảng
thời gian cố định thì chỉ phù hợp với tỷ lệ giống xác định.

Cách tiến hành: Môi trường nhân giống được chuẩn bị (phụ lục 1). Nuôi cấy các chủng
Trichoderma trong thời gian tối ưu đã xác định với thể tích (ml) giống thay đổi


15

1; 2; 3; 4 và 5 đối với môi trường nhân giống cấp một và tỷ lệ (%) giống thay đổi 1; 2; 3; 4 và 5
đối với môi trường nhân giống cấp hai. Đo hoạt tính enzyme amylase, cellulase. Xác định thể
tích và tỷ lệ giống phù họp với môi trường nhân giống cấp một và hai.
+ Khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường môi trường sản xuất Khi thay đổi điều kiện sống
từ môi trường nhân giống sang môi trường sản xuất thì cơ chế cảm ứng cơ chất của Trỉchoderma
diễn ra mạnh mẽ nhất với giai đoạn nuôi cấy, tỷ lệ giống, tỷ lệ cơ chất hoàn toàn khác. Nên tìm
điều kiện nuôi cấy Trỉchoderma thích hợp nhất trên môi trường sản xuất là cần thiết để thu nhận
lượng enzyme amylase và cellulase tối đa.
Cách tiến hành:
-

Khảo sát thời gian nuôi cấy: môi trường sản xuất (phụ lục 1) được nuôi cấy trong với

các giai đoạn (giờ) 24; 30; 36; 42; 48 và 62, tỷ lệ giống cấp hai là 3 % (106 tế bào/g). Đo hoạt
tính enzyme amylase, cellulase. Chọn thời gian tối ưu sinh enzyme amylase và cellulase nhiều
nhất.
-

Khảo sát tỷ lệ giống thích hợp: tương tự khảo sát tỷ lệ giống trên môi trường nhân giống

cấp hai.
-

Khảo sát tỷ lệ bã khoai mì: trong giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng tốc độ phản

ứng sẽ tăng. Nhưng khi tốc độ phản ứng cực đại, dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng
cũng hoàn toàn không có khả năng tăng theo (Nguyễn Đức Lượng, 2006). Do đó, cần khảo sát
tỷ lệ bã khoai mì nhằm tìm tỷ lệ cơ chất phù hợp với tỷ lệ giống cấp hai đã xác định. Và ở thời
điểm khảo sát, lượng enzyme amylase và cellulase thu được là cao nhất.
Cách tiến hành: môi trường sản xuất được chuẩn bị, nhưng thay đổi tỷ lệ (%) bã khoai mì
lần lượt 70; 75; 80; 85 và 90, nuôi cấy trong khoảng thời gian và tỷ lệ giống cấp hai thích hợp
đã xác định. Đo hoạt độ enzyme amylase và cellulase. Chọn tỷ lệ bã khoai mì thích hợp nhất.
2.2.11.4. Nuôi cấy các chủng Trỉchoderma ở điều kiện tối ưu
Sau khi xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu, tiến hành nuôi cấy trên môi trường sản
xuất để thu nhận enzyme amylase và cellulase của các chủng Trichoderma. Sau khi thu nhận,
trộn chủng Trichoderma có enzyme amylase cao với chủng có enzyme cellulase cao, để sản
phẩm sau cung có hoạt độ enzyme cao.


16

Cách tiến hành: chuẩn bị bình giống cấp hai (mục 2.3.11.3) và nuôi cấy các chủng
Trỉchoderma đã chọn (mục 2.3.11.2) nuôi cấy trong điều kiện tối ưu xác định (mục 2.3.11.5).
Thu sản phẩm nuôi cấy. Sau đó, trộn hai chế phẩm enzyme amylase, cellulase của hai chủng T.
13 3 và T.92 theo tỷ lệ 1:1, tạo chế phẩm Eplus có enzyme cao.
2.2.12. Xác định các chỉ tiêu của chế phẩm enzyme
Chuẩn bị sản phẩm nuôi cấy (mục 2.3.11.4). Phối trộn các sản phẩm có hàm lượng
enzyme amylase, cellulase theo tỷ lệ 1 : 1 và sấy thông gió 50 °c đến khi độ ẩm còn 10 - 13 %,
tạo ra sản phẩm sinh học Eplus. Tiến hành xác định các chỉ tiêu: cellulose, tinh bột, đạm tổng
số, đạm formol, pH trước và sau khi nuôi cấy; độ ẩm sau khi sấy thông gió; đếm số bào tử; hàm
lượng glucose.
2.2.13. Khảo sát tỷ lệ trộn vào thức ăn cho gia cầm
Khảo sát ảnh hưởng hệ enzyme thủy phân lên tăng trọng và sức sản xuất thịt của gà Lương
Phượng nhằm tìm tỷ lệ trộn chế phẩm enzyme với thức ăn gia cầm.

Cách tiến hành: gồm 2 giai đoạn +
Nuôi gà con (1-3 tuần tuổi).
Vệ sinh tẩy uế chuồng trại, khử trùng bằng vôi sống; rơm chặt nhỏ bảo đảm khô, hút
ẩm tốt, sạch, được khử trừng trước khi đưa vào. Trải dày 15-17 cm. Chuẩn bị chụp sưởi:
bóng điện 50 w® 100W/chụp.
Sàn chuồng sàn lưới bằng kẽm kích thước 2 mét X 1 mét X 1 mét.
Chuẩn bị thức ăn, nước uống. Cho gà uống nước sạch, trong có pha thuốc Bio Vitamin Plus (lg/1). Cho gà ăn thức ăn Con Cò dành cho gà từ 1 - 42 ngày tuổi. Chế độ
nhiệt trong chuồng: Điều chỉnh độ cao chụp sưởi phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường và
tuổi của gà.
Chế độ chiếu sáng: đèn chiếu sáng công suất 25 - 30W, tuần đầu: 24 giờ/ngày/đêm; tuần
thứ 2: 23 giờ/ngày/đêm; tuần thứ 3 trở đi: 23 - 22 giờ/ngày/đêm. Độ thông thoáng khí: có
thiết bị làm thông khí.
+ Nuôi gà dò (3 tuần tuổi ): phân 5 lô và bố trí 5 lô thí nghiệm đảm bảo sự lặp lại, đồng đều
(3 tuần tuổi, 8 trống và 12 mái) và đánh số từ 1 - 20 theo trọng lượng giảm dần để tiện cho việc
theo dõi tăng trọng. Cho ăn ban ngày với cám Con Cò trộn chế phẩm Eplus theo năm tỷ lệ như
sau : 0 % ( lô đối chứng), lô I (5 %), lô n (10 %), lô m (15 %) và lô IV (20 %).
+ Tiêm chủng cho gia cầm: đảm bảo tiêm vaccine đúng cách, đủ liều.


17

Bảng 2.3 Lịch tiêm chủng phòng bệnh cho gà Lương Phượng
Ngày tuổi

Thuốc

Cách dùng

7

Newcastle

Nhỏ mắt

10
13

Đậu
Gumboro

Đâm màng cánh
Nhỏ mắt

15 - 18

Avicoc

Uống

21
25

Lasota
Gumboro

Uống
Nhỏ mắt

30

H5N1

Tiêm dưới cánh

Đánh giá kết quả thử nghiệm chế phẩm enzyme trên cơ sở số liệu theo dõi:
- Trọng lượng trung bình (g) của các lô qua các tuần.
- Tăng trọng tuyệt đối (g/con/ngày).
- Lượng thức ăn tiêu thụ, trong mỗi tuần (g/con/tuần).
- Lượng thức ăn tích lũy (g/con).
- Tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng (kg).
- Tỷ lệ nuôi sống tích lũy (%) .
- Khảo sát quầy thịt.
- Phân tích thống kê và khẳng định kết quả.
2.2.14.

Phương pháp đánh giá sinh trưởng và sức sản xuất thịt của gia cầm

Khi gia cầm được nuôi trong những môi trường như nhau nhưng khác khẩu phần thức ăn
thì khả năng sinh trưởng và sức sản xuất thịt khác nhau. Phương pháp nêu trên giúp đánh giá sự
khác biệt sinh trưởng và sức sản xuất thịt giữa lô có dùng chế phẩm enzyme Eplus ở tỷ lê khác
nhau và lô không dùng chế phẩm Eplus.
2.2.14.1.

Chỉ tiêu về sinh trưởng

+ Trọng lượng bình quân:

yM

TLBQ = ỹ—

(9)

Trong đó: TLBQ: trọng lượng bình quân (g); IM : trọng lượng gà cân được (g); X N: Số
gà lúc cân (con).
+ Tăng trọng tuyệt đối:

p -P
JYTĐ _ ^ 7
_____ N~1

(10)


18

Trong đó, TTTĐ: tăng trọng tuyệt đối (g/con/ngày); PN: trọng lượng bình quân ở tuần n
(g); p N_j: Trọng lượng bình quân ở tuần n-1 (g).
2.2.14.2. Chỉ tiêu về tiêu tốn thức ăn
+ Lương thức ăn tiêu thu :

____ ỴTATT
LTATT -

—

(11)

ỵ^SGĩT
Trong đó, LTATT: lượng thức ăn tiêu thụ (g/con/tuần); ^ TATT : tổng lượng thức ăn trong

tuần (g); ỴsSGTT : tổng số gà trong tuần (con).
+ Lượng thức ăn tích lũy (g/con): là lượng thức ăn mỗi gà tiêu thụ mỗi tuần cộng dồn lại cho
tới khi cân gà.
„
_ ỴTAtt
+ Tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng: TTtt - ^ —
2_TTttr

(12)

Trong đó, TTtt: tiêu tốn thức ăn cho 1 kg tăng trọng (kg); ỴjTAtt: tổng lượng thức ăn trong
tuần (g); Y^TTttr : tổng tăng trọng trong tuần (g).
2.2.14.3. Chỉ tiêu về sức sống
Tỉ lệ nuôi sống tích lũy (%): số gà sống đến thời điểm khảo sát so với tổng số gà đầu kỳ:
TLNSTL =^-100
SG0

(13)

Trong đó, TLNSTL: tỷ lệ nuôi sống tích lũy (%); SGf. số gà ở thời điểm khảo sát (con);
SG0: số gà ban đầu (con).
2.3.14.4.

Chỉ tiêu về khảo sát năng suất thịt gà

Theo Bùi Hữu Đoàn (2009), phương pháp giải phẫu có thể xác định sức sản xuất của gà.
Tiến hành mổ khảo sát lúc gà đạt được 10 tuần tuổi, lấy ở mỗi lô 4 con ( 2 trống, 2 mái) có trọng
lượng từng con ở lô này tương đương trọng lượng từng con ở lô khác. Cân trọng lượng sống (g,
TLS), cân trọng lượng sau cắt tiết, cân trọng lượng sau nhổ lông. Tiến hành mổ khảo sát các chỉ
tiêu sau:

+ Tỷ lệ móc hàm : là trọng lượng sau khi cắt tiết, bỏ lông, bỏ lòng.
TLMH =^^100
TLS

(14)

Trong đó, TLMH: tỉ lệ móc hàm (%); TIMH\ trọng lượng móc hàm (g).
+ Tỷ lệ quầy thịt:trọng lượng sau khi cắt tiết, bỏ lông, bỏ lòng, bỏ đầu, bỏ cổ, bỏ chân.
ĨTQT = ^^100 TLS

(15)


19

Trong đó, TTQT: tỷ lệ quầy thịt (%); tlQT: trọng lượng quầy thịt (g).
+ Tỷ lệ ống tiêu hóa (dạ dày cơ và ruột): TLOTH =
(16)
^Q
Q
Trong đó, TLOTH: tỷ lệ ống tiêu hóa (%); ŨOTH: trọng TLS
lượng ống tiêu hóa (g).
+ Tỷ lệ gan:

TLG =^-.100
TLS
Trong đó, TLG: tỷ lệ gan (%); tỉG: trọng lượng gan (g).

+ Tỷ lệ tim:

+

-100
TLS
Trong đó, TLT: tỷ lệ tim (%); tlT: trọng lượng tim (g).

(18)

Tỷ lệ ức:

(19)

TLU = ^ - 1 0 0
TLS
Trong đó, TLU: tỷ lệ ức (%); tlư: trọng lượng ức (g).

+ Tỷ lệ đùi:

+

TLT =

(17)

TLĐ =

■ 100
TLS
Trong đó, TLĐ: tỷ lệ đùi (%); tlĐ: trọng lượng đùi (g).

(20)

Năng suất thịt:

NST = ĨỈQ -----NTad ^QQ
TLS

(21)

Trong đó, ŨQT: trọng lượng quầy thị (g); NTad: trọng lượng nôi tạng ăn được (g). Nội
tạng ăn được: mề (bỏ vật chất bên trong), gan, tim, phổi, thận, mỡ nội tạng.
2.2.16. Phưưng pháp xử lý sổ liệu
+ Phần mềm phần mềm Exel: xử lý số liệu thô, vẽ đồ thị.
+ Phần mềm STATGRAPHICS Plus version 5.1 xử lý ANOVA.


20

Chương 3
KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả định tính bằng đo đường kính vòng phân giải
Thực hiện thí nghiệm theo mục 2.3.11.1, đo đường kính vòng phân giải và kết quả
trình bày ở bảng 3.1 và 3.2 .Các số liệu trong hai bảng trích từ phụ lục 3.
Bảng 3.1 Đường kính (mm) vòng phân giải CMC
Kí hiệu

Tên chủng Trỉchoderma

Đường kính (mm)

T.16

Trichoderma asperellum

48,33 ± 1,667

T.17

Trichoderma sinensis

29,00 ± 1,527

T.20

Trichoderma asperellum

T.38

Trichoderma virens

18,00 ± 1,000
25,33 ± 1,202

T.41

Trichoderma virens

14,33 ± 0,819

T.48

Trichoderma asperellum

38,67 ± 0,667

T.74

Trichoderma virens

44,67 ± 1,155

T.87

Trichoderma longibrachiatum

50,67 ± 0,667

T.92

Trichoderma virens

71,67 ± 0,882

T.103

Trichoderma virens

30,00 ± 0,577

T.130

Trichoderma spp

34,00 ± 1,000

T.133

Trichoderma asperellum

60,00 ± 1,155

T.139

Trichoderma spp

31,33 ± 3,667

T.159

Trichoderma spp

21,33 ± 0,333

T.168

Trichoderma harzia.num

31,00 ± 0,577

T.185

Trichoderma koningu

36,33 ± 0,667

T.208

Trichoderma spp

14,00 ± 0,577r

T.221

Trichoderma spp

41,67 ± 0,882

T.223

Trichoderma spp

43,00 ± 1,528

T.225

Trichoderma spp

52,67 ± 1,450

Trong cùng một cột và khác tên chủng Trỉchoderma, các giá trị sai số có kỉ tự theo sau

khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05; F=139,90).


21

Trong môi trường cảm ứng chứa CMC, các chủng T.87, T.92, T.133 và T.221 có khả
năng thực hiện cơ chế cảm ứng tốt với cơ chất, enzyme cellulase tiết ra nhiều hơn các chủng còn
lại nên đường kính phân giải lớn và rõ hơn. Trong đó chửng T.92 (d = 71,67 mm) có đường kính
phân giải CMC lớn nhất. Chọn các chủng Trỉchoderma này tiếp tục khảo sát hoạt tính enzyme
cellulase trên môi trường bán rắn chứa 5% bã khoai mì.
Bảng 3.2 Đường kính (mm) vòng phân giải tinh bột của hệ enzyme amylase trên môi trường
cảm ứng enzyme amylase

Kí hiệu

Tên chủng Trichoderma

Đường kính (mm)

T.16

Trichoderma asperellum

T.17

Trichoderma sinensis

14,33 ± 1,202

T.20

Trichoderma asperellum

5,000 ± 0,577

T.38

Trichoderma virens

T.41

Trichoderma virens

2,333 ± 0,333

T.48

Trichoderma asperellum

21,00 ± 0,577

T.74

Trichoderma virens

4,667 ± 0,333

T.87

Trichoderma longibrachỉatum

32,33 ± 1,453

T.92

Trichoderma virens

42,67 ± 1,453

T.103

Trichoderma virens

24,33 ± 0,667

T.130

Trichoderma spp

21,00 ± 0,577

T.133

Trichoderma asperellum

14,00 ± 0,577

T.139

Trichoderma spp

T.159

Trichoderma spp

0,000 ± 0,000
9,000 ± 0,577

T.168

Trichoderma harzianum

7,667 ± 0,333

T.185

Trichoderma koningu

16,33 ± 0,882

T.208

Trichoderma spp

3,667 ± 0,667

T.221

Trichoderma spp

31,33 ± 0,667

T.223

Trichoderma spp

21,00 ± 0,577

T.225

Trichoderma spp

2,333 ± 0,333

9,333 ± 0,333

13,667 ±1,856

Trong cùng một cột và khác tên chủng Trichoderma, các giả trị sai sổ có kỉ tự theo sau khác nhau
có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05; F=193,67). Các giá trị trích từ phụ lục 3.


22

Qua kết quả đo đường kính bảng 3.1 và 3.2, thấy rằng các chủng Trichoderma được khảo
sát có hệ enzyme amylase và cellulase kém. Chọn các chủng T.92, T.87, T.133 và T.221 để khảo
sát sơ lược hoạt tính enzyme amylase trên môi trường bán rắn cấp một có chứa 5%bã khoai mì.
Sau đó, chọn chửng Trỉchoderma có hoạt tính enzyme amylase cao để khảo sát điều kiện nuôi
cấy để thu nhận enzyme amylase.
3.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và đo hoạt tính enzyme amylase, cellulase

Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu của các chủng Trỉchoderma được chọn lần lượt được
trình bày ở các bảng 3.3; 3.4; 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9 và 3.10.
Bảng 3.3 Kết quả hoạt tính enzyme amylase, cellulase của T.87, T.92, T.133, T.221
Chủng
Trỉchoderma

Hoạt độ amylase * (UÌ/g)

Hoạt độ cellulase (Ul/g)

T.133

1228,17+ 28,315a

4388,22 +296,759a

T.221

801,976 ±70,11 lb

3939,267 +216,068a

T.87

1036,02 +49,573c

3989,473 + 526,41 la

T.92

1279,18 + 12,021a

4209,511 + 302,498a

Trong cùng một cột và khác tên chủng Trichoderma, các giá trị sai số của hoạt độ amylase cỏ
kỉ tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05; FAmyiaSe=22,55). Các giá
trị sai so của hoạt độ cellulase có kỉ tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống
kê (P > 0,05; Fceiiuiase=0,49). số liệu trích từ phụ lục 5.
Kết quả bảng 3.3, hoạt độ amylase và celluase của chủng T.133 và T.92 cao hơn hoạt độ
chủng T.221 và T.87. Trong thời gian 48 giờ, bào tử chủng T.211 và T.87 rất nhiều, già và có
màu xanh đặc trưng của Trỉchoderma trong khi bào tử T.92 và T.133 có màu trắng phủ đầy môi
trường nuôi cấy. Lượng enzyme sinh ra nhiều khi bào tử còn non nên trong thời điểm khảo sát
hoạt độ amylase và cellulase các chửng T.92 và T.133 cao, chọn chủng T.92 và T. 133 để khảo
sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống và sản xuất.
Tiếp tục khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một với thời gian
nuôi cấy khác nhau và thể tích giống khác nhau. Sản phẩm sau khi nuôi cấy được lấy 10 g, pha
loãng mẫu 100 lần bằng 100 ml nước cất, lắc mẫu 20 phút, ly tâm lạnh thu enzyme thô, xác định
hoạt độ enzyme amylase và cellulase, tìm khoảng thời gian và thể tích nuôi cấy tối ưu thích hợp
trên môi trường nhân giống cấp một. có hoạt độ enzyme amylase và cellulase nhiều nhất.


23

Bảng 3.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một
Chủng
Trichoderma

Thời gian nuôi
cấy (giờ)

T.92

T.133

Hoat đô amylase (UUg)

Hoat đô cellulase (UI/g)

24

296,37 ± 49,83

1965,7 + 210,78

36

380,27 ± 53,49

2165,5 + 221,67

48
60

916,37 + 61,79
1105,9 + 40,57

3989,5 + 526,41
4525,4 + 191,77

72

429,77 +64,92

506,03 +72,645

24

187,37+ 8,722

790,27 + 40,169

36

324,83 + 12,86

2052,3 + 5,0720

48
60

837,8 + 106,49
1068,7 + 4,956

2492,3 + 159,65
5746,3 + 483,05

72

171,77 + 12,97

2008,5 + 116,46

Trong cùng một cột của chủng T.92 và khác thời gian nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme có sự khác
biệt về mặt thong kê (P < 0,05; FAmyiase=43,45 và FCeiiuiase= 31,08). Trong cùng một cột của chủng
T.133 và khác thời gian nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme có sự khác biệt về mặt thong kê (P < 0,05;
FAmyiase=98,l 1 và FCeiiuiase= 63,10). số liệu trích từ phụ lục 5.

Bảng 3.5 Khảo sát thể tích giống môi trường nhân giống cấp một
Chủng

Thể tích giống

Trỉchoderma (mĩ)

T.92

T.133

Hoạt độ amylase
(UI/g)

Hoạt độ cellulase
(UI/g)

1

1119,63 +37,53

1810,13 +118,64

2

1286,73 +36,42

2759,23 + 250,88

3

1435,50 + 15,20

4715,33 +230,27

4
5

958,800 +31,49
827,530 + 30,95

3726,08 +23,229
3906,52 + 26,688

1

717,533 +30,86

3358,35 + 128,42

2

1121,33 +28,74

3878,08 +372,73

3

1153,50 + 148,28

5642,96 + 338,94

4

1055,43 + 44,02

3398,55 + 140,54

5

1023,63 + 62,93

2654,01 + 137,06

Trong cùng một cột của chủng T.92 và khác thể tích nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme có sự khác biệt
về mặt thong kê (P < 0,05; FAmyiase=60,69 và FCeiiuiase= 47,89). Trong cùng một cột của chủng T.133
và khác thể tích nuôi cay, các giá hoạt độ enzyme có sự khác biệt về mặt thong kê (P < 0,05; F Amylase—
5,09 và FCeiiuiase= 30,97). số liệu trích từ phụ lục 5.


24

Kết quả bảng 3.4, thấy khoảng thời gian 60 giờ cả hai chủng T.92 và T. 133 có hoạt độ

amylase và cellulase cao nhất. Khoảng thời gian 24 - 48 giờ, vi nấm Trỉchoderma tận dụng chất
dinh dưỡng có sẵn trong môi trường nên lượng enzyme tiết ra chưa nhiều. Thời gian nuôi cấy
càng dài, khi chất dinh dưỡng có sẵn đã hết, Trichoderma phân tiết enzyme nhiều để phân giải
cơ chất và thời điểm 60 giờ lượng enzyme tiết ra nhiều nhất. Trong môi trường nhân giống cấp
một, lượng cơ chất rất ít (5 % bã khoai mì), khi cơ chất cạn dần thì lượng enzyme phân tiết giảm
nên thời điểm khảo sát 72 giờ hoạt độ enzyme amylase và cellulase thấp.
Trong quá trình phân giải cơ chất, Trỉchoderma thủy phân môi trường bán rắn với một
lượng vừa đủ nhu cầu tồn tại. Nên lượng enzyme tiết ra tỷ lệ thuận với thể tích giống. Các thể
tích khảo sát được nêu trong bảng 3.5, ở thể tích giống 3 ml có hoạt độ enzyme amylase và
cellulase cao nhất, phù hợp lượng cơ chất có trong môi trường nhân giống cấp một. Nuôi cấy 60
giờ, với thể tích giống 4-5 ml, bào tử phát triển rất nhiều, lượng enzyme rất ít.
Sau khi khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp một, chọn bình giống
tốt nhất và tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp hai.

Bảng 3.6 Khảo sát thời gian nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp hai
Chủng

Thời gian nuôi

Trỉchoderma cấy (giờ)

T.92

T.133

Hoạt độ amylase (UI/g)

Hoạt độ cellulase (UI/g)

24

683,933 +36,109

2136,7 + 44,105

36
48

1047,77+ 104,33
1384,07 + 122,38

3385,8 + 122,99
4656,8 +212,83

60

825,633 + 51,42

1743,6+61,470

24

567,967 + 13,607

1359,4 +76,113

36

737,867+21,7552

2954,2 + 122,99

48
60

1130,03 +24,916
980,733 +9,905

5658,7 +89,81
1933,52 + 132,72

Trong cùng một cột của chủng T.92 và khác thời gian nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme có sự khác
biệt về mặt thống kê (P< 0,05; FAmyiase=12,49, FCeiiuiase=105,13). Trong cùng một cột của chủng T.133
và khác thời gian nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme có sự khác biệt về mặt thống kê (P< 0,05;
FAmyỉase~ ỉ 81,5Ố và Fceiiuiase= 315,25). sổ liệu trích từ phụ lục 5.


25

Giai đoạn 48 giờ, lượng enzyme amylase và cellulase sinh ra nhiều nhất. Với khoảng thời
gian này, bào tử Trỉchoderma sản sinh enzyme nhiều nhất, lượng đường khử sinh ra cực đại.
Sau khoảng thời gian này, lượng enzyme giảm dần nhờ cơ chế điều hòa của chúng.

Bảng 3.7 Khảo sát tỷ lệ trộn giống cấp một vào môi trường nhân giống cấp hai
Chủng
Giống
Trỉchoderma (%)

T.92

T.133

Hoat đô amylase ’ (UÌ/g)

Hoat đô cellulase (ỦI/g)

1

623,83 ± 49,69

1932,32 ± 54,458

2

855,017 ± 46,03

3049,07 ± 216,37

3

1404,0 ± 70,61

5544,23 ± 275,31

4

1057,87 ± 123,5

2001,41 ± 34,607

5

927,33 ± 78,48

1165,74 ± 121,45

1

193,90 ± 13,01

1485,41 ± 143,08

2

644,90 ± 71,69

2158,09 ± 53,049

3

1161,4 ± 40,99

6280,13 ± 552,56

4
5

506,43 ± 74,003
225,53 ± 4,817

1818,97 ± 48,667
924,613 ± 53,723

Trong cùng một cột của chủng T.92 và khác tỷ lệ giống, các giá trị hoạt độ enzyme có sự khác biệt về
mặt thong kê (P < 0,05; FAmyiase=26,66 và Fceiiuiase=l 58,37). Trong cùng một cột của chủng T. 133 và
khác khác tỷ lệ giong nuôi cấy, các giá trị hoạt độ enzyme có sự kh ác biệt về mặt thống kê (P < 0,05;
FAmyiase=68,8 và FCeiiuiase= 36,64). sổ liệu trích từ phụ lục 5.

Trên môi trường nhân giống cấp hai, tỷ lệ giống cấp một 3 % là thích hợp nhất. Hoạt độ
enzyme tối ưu sinh ra trên môi trường nhân giống cấp hai nhiều hơn môi trường nhân giống cấp
một vì nồng độ cơ chất tăng thì cơ chế cảm ứng cơ chất cũng tăng, nên lượng enzyme sinh ra
nhiều hơn.
Chọn được bình nhân giống cấp hai tốt nhất, tiếp tục khảo sát điều kiện nuôi cấy trên môi
trường sản xuất. Tương tự trên môi trường nhân giống cấp một và cấp hai, khảo sát thời gian
nuôi cấy, tỷ lệ trộn giống cấp hai, tỷ lệ bã khoai mì trên môi trường sản xuất. Đo hoạt độ enzyme
amylase và cellulase, xác định thời gian nuôi cấy tối ưu, tỷ lệ giống cấp hai, tỷ lệ bã khoai mì
thích họp nhất trên môi trường sản xuất. Kết quả khảo sát này được trình bày trong bảng 3.8; 3.9
và 3.10.