Xây dựng quy trình ELISA phát hiện protein e7 của human papillomavirus type 18

TẤC GIẢ: Bùi Hoàng Bảo Ngọc

MỤC LỤC
MUC LUC ..............................................................................................................................i
DANH MUC CẢC BẢNG ....................................................................................................ii
DANH MUC CÁC HÌNH VÀ ĐÒ THI .............................................................................. iii
PHẤN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 .....................................................................................................................
Human papillomavirus và ngụy cơ eâv ung thư cổ từ cung ............................................ 1
1.2 .....................................................................................................................
Cấu trúc vả chức năng của protein E7 ............................................................................ 3
1.3 .....................................................................................................................
Các nghiên cứu ELISA phát hiên protein E6. E7 HP V ................................................. 4
PHẦN 2: MỤC TIÊU - PHƯƠNG PHÁP
2.1

Muc tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 7

2.2

Nôi dung thưc hiên ................................................................................................. 7

2.3

Phương pháp tiến hành ........................................................................................... 7

2.3.1

Phương pháp chuyển gene vảo té bào đông vât bằng Lipofectamine

2000

.............................................................................................................. 7

2.3.2

Phương pháp lai miễn dỉch huỳnh quang (immunofluorescence! .................. 7

2.3.3

Phương pháp ELISA ....................................................................................... 8

2.3.4

Phương pháp xử lý bênh phẩm UTCTC ........................................................ 8

PHẰN 3: KẾT QUẢ
3.1

KIỂM TRA TÍNH ĐÀC HIẼU CỦA KHẢNG THỂ ĐON DÒNG VÀ ĐA

DÒNG

BÂNG

PHƯƠNG

PHÁP

LAI

MIÊN

DICH

HUỲNH

QUANG

(IMMUNOFLUORESCENCE) TRÊN DÒNG TỂ BÂO CHO-K1 CHUYỂN GENE E7
HPV 18 VẢ DÒNG TẾ BẢO UNG THƯ CỒ TỬ CUNG HELA ............................ 10
3.3.1 ..............................................................................................................
Lai với kháng thể đơn dòng ........................................................................................ 11
3.3.2 ..............................................................................................................
i
Lai với kháng thể đa dòng .......................................................................................... 15
3.2

XÂY DƯNG QUY TRÌNH ELISA PHÁT HEN PROTEIN E7 HPV 18

TÁI TỒ HOP TỬ HAI KHẢNG THỂ ĐON DÒNG VẢ ĐA DÒNG ............................ 22


3.2.1

Khảo sát nồng đô kháng thể đa dòng phủ giếng ............................................23

3.2.2

Khảo sát nồng đô ỊcháĩìP thể đơn dòng vả kháng thể thứ cấp đánh dấu

enzyme .......................................................................................................................25
3.2.2.1

Kháng thể đơn dòng ...............................................................................25

3.2.2.2

Kháng thể thứ cấp đánh dấu Alkaline phosphatase (API .......................27

3.2.3

Khảo sát tác nhân block giếng .......................................................................29

3.3

ÁP DƯNG QUY TRÌNH ELISA TRÊN BÊNH PHẲM ......................................30

3.4

XÁC ĐINH ĐỔ NHAY CỦA QUY TRÌNH ELISA ............................................33

PHÀN 4: KÉT LUẬN - Ỷ NGHĨA KHOA HỌC
5.

KẾT LUÂN! ................................................. ! .........................................................35

6.

Ỷ NGHĨA KHOA HOC .........................................................................................35

TẰI LTẼIT THAM KHẢO ..............................................................................................36
PHU LUC ...........................................................................................................................38

ii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Két quà giá tri OD khi khảo sát nồng đô kháng thể đa dòng phủ giếng ■■ . 23
Bảng 3.2: Kêt quà giá tri OD khảo sát nồng đô kháng thể đan dòng ........................... 25
Bảng 3.3: Kẻt quả giá tri OD khảo sát nồng đô kháng thể thứ cấp đánh dấu AP ....
...................................................................................................................................... 27
Bảng 3.4: Kẻt quà giá tri OD khi khảo sát tác nhân block ........................................... 29
Bảng 3.5: Kầt quà ELISA ưên các bênh phẳm UTCTC .............................................. 30
Bảng 3.6: Kầt quả đinh tvpe 1 5 hênh phẩm HPV ........................................................ 32
Bảng 3.7 : Ket quà dựng đường chuẩn xác định độ nhạy của quy trình ELISA .33

iii


DANH MỤC CÀC HĨNH VẢ ĐO THỊ
Hình 1.1: cấu trúc của protein E7..................................................................................... 4
Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp checkerboard .................................................................... 8
Hình 3.1: Kẻt quả lai miễn dich huỳnh quang tế bảo CHO-K1 mang vector pEGFP-F.7 vái
khánp thể đơn dòng quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (100X1 ............................... 12
Hình 3.2: Kết quà lai miễn dich huỳnh quang ưên té bảo CHO-K1 mang vector pEGFP-C2
với kháng thể đon dòng quan sát dưới kinh hiển vi huỳnh quang (100X) .........................13
Hình 3.3: Ket quá lai miễn dich huvnh quang tế bảo HeLa vói kháng thể đơn dòng quan sát
dưỏi kính hiển vỉ huỳnh quang với bưóc sóng kích thích 541 nm (100X1 14
Hình 3.4: Ket quả lai miễn dich huvnh quang tế bảo Heĩ.a lchônp có kháng thể đơn dòng
('chứng âml quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang vái bước sóng kích thlch 541 nm (100X1

...........................................................................................................................................14
Hình 3.5: Kẻt quả lại miễn dich huỳnh quang tế bảo CHO-K1 mang vector PEGEP-E7 với
kháng thể đa dòng quan sát dưói kính hiển vi huỳnh quang (100X1 ■■ ...........................17
Hình 3.6: Kêt quà lai miễn dich huỳnh quang tế bảo CHO-K1 mang vector PEGEP-C2 vói
kháng thể đa dòng quan sát dưới kính hiền vi huvnh quang (100X1 ................................18
Hình 3.7: Ket quá lai miễn dỉch huỳnh nuang trên tế bào HeLa vói kháng thể đa

dòng quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (1 ũ0X1 .................................................... 20
Hình 3.8: Ket quả lai miễn dich huvnh quang trên tế bảo Heĩ.a khônp có kháng thể đa dòng
quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (100X1 ...............................................................21
Hình 3.9: Đồ thi khảo sát nồng đô kháng thể đa dòng phủ giếng ..................................... 24
Hình 3.10: Đồ thi khảo sát nồng đô kháng thể đơn dòng ................................................. 26

iv


Hình 3.11: Đồ thi khảo sát nồng đô kháng thể thứ cấp .................................................... 28
Hình 3.12: Đường chuẩn xác đinh đô Tìhav của quy trình ELIS A ................................. 34

V


PHẦN 1
ĐẶT VÁN ĐÈ


1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Khoảng 15% các ca chết vì ung thư trên toàn thế giới là có liên quan đến các loại
virus khối u trên người. Một toong những virus gây ung thư ở người điển hình và được
nghiên cứu nhiều nhất là human papillomavirus (HPV) - virus gây ung thư cổ tử cung,

bệnh nguy hiểm hàng đầu ờ phụ nữ.
Neu như cứ mỗi 3 phút có 1 người trên thế giới chết vì ung thư phổi thì cứ mỗi
2 phút có 1 phụ nữ chết vi ung thư cổ tử cung. Ở Mỹ, trong năm 2009 ước tính có khoảng
12.000 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung. Với tỉ lệ 26 ca trên 100 ngàn phụ nữ, ung thư cổ
tử cung đã trở thành nguyên nhân ung thư gây tù vong hàng đầu cho phụ nữ ờ Việt Nam
cũng như các nước đang phát triển.
Khuyến cáo ung thư cổ tủ cung năm 2009 đã xác định phòng ngừa là chìa khóa
then chốt trong cuộc chiến chống căn bệnh này. Do đó, một phương pháp tầm soát hiệu
quả căn bệnh này sẽ giúp ngăn ngừa và giảm ti lệ tử vong do nó gây ra. Khoảng 95% các
trường họp ung thư cổ tử cung là có liên quan đến HPV. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có
mối liên hệ mật thiết giữa việc nhiễm lâu dài một số chùng “có nguy cơ cao”, đặc biệt là
HPV type 16 và HPV type 18, với khả năng phát triển bệnh ung thư cổ tù cung. Do đó,
dựa vào mối quan hệ này, ta có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả để phát
hiện sớm sự hiện diện của HPV trong cơ thể, từ đó đưa ra các phương pháp điều trị hiệu
quả.
Vì vậy, với nghiên cứu này chúng tôi mong muốn phát triển một công cụ chẩn
đoán sớm sự hiện diện của HPV các type có nguy cơ cao toong cơ thể thông qua sự hiện
diện của một toong hai protein chính có liên quan đến khả năng gây ung thư của HPV là
protein E7. Dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi đã tạo được kháng thể đơn dòng
và đa dòng kháng protein E7 của HPV 18, đề tài này tiếp nối bằng cách sử dụng hai kháng
thể đó để xây dựng quy trình sandwich ELISA nhằm phát hiện protein E7 HPV 18 trong
bệnh phẩm ung thư cổ tử cung (UTCTC).

1


1.1 Human papillomavirus và nguy cơ gây ung thư cổ tử cung
Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến UTCTC là do nhiễm lâu dài một
loại virus rất phổ biến và dễ lây nhiễm là human papillomavirus (HPV) [1]. Tuy nhiên, chi
một vài type HPV là có khả năng gây nên ung thư. Đó là các type HPV có nguy cơ cao

gồm các type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59; lây truyền qua đường tiếp xúc
tình dục, có khả năng gắn chèn DNA vào bộ gene tế bào chủ, tù đố ảnh hường đến cơ chế
kiểm soát phân bào của tế nào chủ. Nêu nhiễm lâu dài các type HPV thuộc nhóm này sẽ
có nguy cơ mắc UTCTC rất cao. Nhóm này thường được phát hiện trong các trường hợp
tổn thương biểu mô mức độ cao và ung thư xâm lấn. HPV 16 và HPV 18 chịu trách nhiệm
cho hơn 70% các ca UTCTC trên toàn thế giới [5, 4, 3, 2],
HPV là dạng virus cổ, không có màng bao, đường kính khoảng 55 nm, có DNA
mạch đôi dạng vòng, kích thước khoảng 8.000 cặp hase. vỏ capsid hình khối đa điện, gồm
72 capsomer bao quanh bộ gene. Lớp vỏ capsid này gồm 2 protein: 1 protein capsid chính
(Ll) và 1 protein capsid phụ (L2). Không giống như các virus có màng bao là có thể xâm
nhiễm vào cơ thể qua vùng da lành, HPV phải xâm nhiễm qua các vết thương trên da [].
Bộ gene của HPV được chia thành 3 phần: vùng gene sớm, vùng gene muộn và vùng điều
hòa dài. Vùng gene sớm (early gene); nằm phía dưới vùng điều hòa dài; có chiều dài
khoảng 4.500 cặp base; chúa các gene cần thiết cho quá trình sao mã bộ gene virus, quá
trình điều hòa nhân tố phiên mã và hoạt động biến đổi tế bào gây ung thư, đồng thời cũng
có vai trò toong sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào. Gồm 6 ORF mã hóa cho các
protein sớm là El, E2, E4, E5, E6, và E7 [5, 6, 1, 7].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy sự hiện diện của các type HPV nguy cơ cao trong gần
như 100% các trường hợp UTCTC [8]. Trong đó, HPV 16 và HPV 18 là hai type phổ biến
nhất, chiếm hai phần ba các trường hợp ung thư biểu mô tế hào vảy cũng như ung thư tế
hào tuyến. Tám type HPV thường gặp nhất toong UTCTC là 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58 và
35; chịu trách nhiệm cho khoảng 90% các trường hợp ung thư trên toàn thế giới [2],

2


Cơ chế gây ung thư của HPV
Tất cả các type HPV đều phân chia toong nhân của tế bào chủ. Đối với nhóm HPV
chỉ gây ra các tổn thương lành tính thi DNA bộ gene của virus tồn tại độc lập với DNA
của tế bào chủ và nhân đôi như dạng episom hoặc plasmid. Ngược lại, trong các tổn thương

ác tính liên quan tới HPV 16 và HPV 18 thi DNA virus lại thường sát nhập vào bộ gene
của tế bào chủ.
Để có thể sát nhập vào bộ gene tế bào chủ thi phải xảy ra một sự đứt gãy trên bộ
gene virus, thường là ờ vùng E1/E2. Sự đứt gãy này dẫn tới việc mất chức năng của gene
El và E2, từ đó mất kiểm soát sự biểu hiện của E6 và E7, làm cho tế bào bị biến đổi. Vị trí
sát nhập vào bộ gene tế bào chủ khá ngẫu nhiên và dường như không có vai trò nhiều trong
quá trinh phát sinh ung thư.
Hoạt tính gây ung thư của E6 và E7 chủ yếu là do khả năng tương tác với các
protein nội bào có vai trò điều hòa kiểm soát chu trình tế bào như p53 và pRB. Hai protein
này được biết như là các protein ức chế khối u vì nó ức chế sự phân chia và tăng trường
của tế bào. Việc E6 gắn lên p53 và E7 gắn lên pRB dẫn đến sự phân hủy hai protein này,
làm mất chức năng kiểm soát sự tăng trưởng tế bào của chúng và gây phát sinh ung thư
[9].
1.2 Cấu trúc và chức năng của protein E7
Bên cạnh E6, E7 cũng là một nhân tố gây ung thư chính của cấc type HPV có
nguy cơ cao. Protein E7 là một polypeptid nhỏ, có tính acid, gồm khoảng 100 amino acid.
E7 có 3 vùng bảo tồn (CR) là vùng CR1 ờ đầu NH2, vùng CR2 ở giữa và vùng CR3 ờ đầu
COOH [10].
Vùng CRI và CR2 của E7 cho thấy sự tương đồng trình tự với một phần vùng
CR1 và toàn bộ vùng CR2 của adenovirus El A. Cũng giống như ở E1A, hai vùng bảo tồn
này đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động gây ung thư của E7 ờ các type HPV có
nguy cơ cao. Vùng CR1 cần thiết cho hoạt động biến đổi tế bào và phân hủy pRB
(retinoblastoma tumor suppressor protein) nhưng lại không tham gia trực tiếp vào quá trình
gắn lên pRB của E7. Vùng CR2 có chứa motif Leu-X-Cys-X-Glu (LXCXE) cần cho sự
gắn kết giữa E7 và pRB.

3


Kế motif LXCXE là một vị trí phosphoryl hóa của kinase casein n (CK n) cần cho hoạt

động biến đồi tế bào của E7. Vùng CR3 chứa một cẩu trúc gắn kẽm gồm hai motif CysX-X-Cys có chức năng dimer hóa mặc dù vẫn chưa có bằng chứng thuyết phụ nào cho
thấy rằng E7 tồn tại in vivo hay in vitro ờ dạng dimer cũng nhu dạng dimer này là cần
thiết cho hoạt tính sinh học của E7. cấu trúc motif này tuơng tự như protein E6 của HP V,
từ đó cổ thề suy ra hai protein này có một tổ tiên chung.
Các nghiên cứu cẩu trúc của E7 chứng minh là vùng CRI và CR2 của E7 không
gấp cuộn trong khi vùng CR3 gấp cuộn thành dạng cẩu trúc gắn kẽm đặc trung [10,11].

Hình 1.1: cấu trúc của protein E7 pi]
E6 và E7 là hai protein virus duy trì sự biểu hiện và hoạt tính của chúng trong
suốt chu trình sổng của virus cũng như quá trình phát sinh ung thư. Theo một sổ nghiên
cứu, protein E7 được tìm thấy chủ yếu trong nhân, noi mà nỗ liên kết với pRB cũng như
các protein thuộc họ ‘^pocket protein” như pl07 và pl30 thông qua motif LXCLE trên
CR2, để lách thỉch tể bào tiến vào pha

s. Trong tế bào bình thường, các pRB đuợc

phosphoryl hóa vào giai đoạn sám của pha GI và gắn vói nhân tố phiên mã E2F - một tác
nhân điều hòa quan trọng cho quá trình tế bào thóat khôi pha GI và tiến vào pha

s - hỉnh

thành một phức hợp ức chế phiên mã. Bằng cách gắn vào và cảm ứng sự phân hủy pRB
thông qua co chế hình thành các phức hợp ly giải protein (proteosomal), E7 ngăn cân pRB
liên kết với E2F. E2F tợ do sẽ hoạt động như một nhân tố tăng cưởng phiên mã, kích thỉch
tế bào vượt qua pha GI vả tiến vào pha

s một cách không kiểm soát.

4

Protein E7 của các type HPV có nguy cơ thấp có khả năng gắn với pRB giảm gấp 10 lần
so với E7 của các type HPV có nguy cơ cao. Điều này là do sai khác một amino acid (ví
dụ như aspartate ở vị trí thứ 21 trên E7 HPV 16 thay vì glycine ờ vị trí 22 trên E7 HPV 6)
và amino acid này là vị trí quyết định cho việc gắn pRB và khả năng làm biến đổi tế bào
của E7 [10, 11],
Ngoài khả năng gắn và phân hủy pRB, các protein E7 của các type HPV có nguy
cơ cao còn can thiệp vào chu trình phân bào binh thường bằng nhiều cơ chế khác như tương
tác và làm dừng hoạt tính ức chế tăng trưởng của các chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin
(cyclin-dependent kinase inhibitors - CKI) p21 và p27. Các tương tác này làm gia tăng
lượng cyclin E và A, từ đó dẫn đến tinh trạng duy trì tổng hợp DNA trong các tế bào biểu
mô đã biệt hóa [11].
Trong các tế bào bị nhiễm HPV thì lượng protein E7 tăng cao. Do đó, protein
này là một phân tử chỉ thị tiềm năng cho việc phát hiện sự hiện diện của HPV cũng như
nguy cơ dẫn đến UTCTC do HPV gây ra. Chính vì vậy, chúng tôi chọn E7 làm phân tử
mục tiêu cho xét nghiệm HPV của minh.
1.3 Các nghiên cứu ELISA phát hiện protein E6, E7 HPV
Các nghiên cứu phát hiện E6, E7 HPV bằng phương pháp ELISA vẫn còn khá hạn
chế, tính đến nay có không nhiều các công trình như vậy được được công bố. Có các công
trình như của Selvey L. và cộng sự (1992) xây dựng quy trình ELISA phát hiện E7 HPV
16 và 18 trong các dòng tế bào nuôi cấy [12], công trình của Frazer I. và cộng sự (1995)
xây dựng các thử nghiệm miễn dịch để phát hiện UTCTC [13], công trinh của Roger p. và
cộng sự (2006) phát triển một que thù miễn dịch để phát hiện E6 HPV 16 [14].
Các nghiên cứu phát triển quy trình ELISA cho protein E6, E7 của HPV gặp nhiều
khó khăn trong việc xác định độ nhạy của quy trình theo cách này vì không thể biết chinh
xác lượng protein E7 biểu hiện trong tế bào. Có các nghiên cứu của Selvey L. và cộng sự
(1992) [12] trcn quy trinh ELISA phát hiện E7 HPV 18 và E7 trong HeLa cho độ nhạy là
20 pg E7, nghiên cứu của Roger B. p. và cộng sự phát hiện được tối thiểu 2,6 ng protein
E6 HPV16 [14]. Phần lớn độ

5


nhạy của quy trình ELISA phát hiện kháng nguyên hay kháng thể kháng HPV được tính
dựa trên việc so sánh kết quả ti lệ mẫu dương tính và âm tính của quy trình và một quy
trình chuẩn cho xét nghiệm đó, như trong nghiên cứu của Sehr p. và cộng sự (2002) dùng
ELISA để phát hiện kháng thể kháng protein LI của HPV 16. Trong nghiên cứu này nhóm
tác giả đã so sánh kết quả thu được từ quy trình ELISA của mình với kết quả khi xét nghiệm
các mẫu đó bằng phương pháp chuẩn trong xét nghiêm LI là ELISA dựa trên VLP (virus
like particle) [15]. Đồng thời, để xác định khả năng phản ứng chéo của quy trình ELISA
trên LI HPV 16, nhóm tác giả đã thù quy trình trên LI của HPV 18 và 6b và cho thấy quy
trình có phản ứng chéo với hai type này [15].
Tuy chưa có nhiều nghiên cứu phát triển phương pháp ELISA để phát hiện protein
E7 của HPV 18 nhưng với các ưu điểm như nhạy, nhanh, đơn giản, có thể thực hiện với số
lượng mẫu lớn, chứng tôi chọn ELISA làm phương pháp sử dụng trong đề tài này.

6


PHẦN 2
MỤC TIÊU
PHƯƠNG PHÁP


2. MỤC TIÊU - PHƯƠNG PHÁP
2.1

Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng quy trình ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) phát hiện protein E7

của human papillomavirus type 18.
2.2

Nội dung thực hiện
- Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng và đa dòng trên dòng tế bào CHO
được chuyển gene E7 của HP V 18 và dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa bằng
phương pháp lai miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence).
- Xây dựng 1 quy trình ELISA trên mẫu protein E7 HPV 18 tái tổ hợp, sử dụng các
kháng thể đon dòng và đa dòng đã có.
- Áp dụng quy trinh trên một số bệnh phẩm ung thư cổ tử cung.
- Xác định độ nhạy tương đối của quy trình.

2.3

Phương pháp tiến hành

2.3.1 Phương pháp chuyển gene vào tế bào động vật bằng Lipofectamine
2000

Chúng tôi sử dụng Lipofectamine 2000 (Invitrogen) để chuyển vector tái tổ hợp
mang gene E7 HPV 18 vào dòng tế bào CHO-K1 nhằm tạo ra dòng tế bào CHO biểu hiện
protein E7 HPV 18. Dòng tế bào CHO-K1 này sẽ được tiến hành lai miễn dịch huỳnh
quang lần lượt vói kháng thể đon dòng và đa dòng để kiểm tra khả năng gắn đặc hiệu của
kháng thể đối với protein E7 biểu hiện trong tế bào động vật.
Phương pháp này sử dụng Lipofectamine 2000 - một tác nhân lipid tích điện
dương, toong nước tạo thành các liposom - để tương tác với các phần tích điện âm trên
DNA, tạo thành những phức hợp tích điện dương. Các phúc hợp này mang DNA tiến đến
gần màng tế bào tích điện âm, dung hợp với màng tế bào và chuyển vào toong tế bào [16].

7

2.3.2

Phưomg pháp lai miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence)
Đây là phương pháp lai trực tiếp kháng thể lên mẫu tế bào được cố định trên

coverslip. Kháng thể thứ cấp sử dụng có đánh dấu cơ chất phát huỳnh quang. Kết quả được
quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Tế bào được nuôi trong đĩa 6 giếng có sẵn coverslip đã được xử lý với poly - L lysine. Sau đó tế bào được cố định bằng PBS - PFA 4%, làm thấm màng bằng PBS - Triton
XI00 0,2%. Khóa coverslip bằng PBS - BSA 1%. ủ với
1,5 ml kháng thể sơ cấp (kháng thể đơn dòng kháng E7 HPV 18 với nồng độ 2,98 pg/ml
hoặc đa dòng kháng E7 HPV 18 với nồng độ 1,25 pg/ml) toong 1 giờ ờ nhiệt độ phòng.
Rửa bằng PBS - Tween 0,5%. ủ với 1,5 ml kháng thể thứ cấp kháng IgG thỏ hoặc chuột
đánh dấu TRITC (1 pg/ml) toong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, tránh sáng. Rửa lại bằng PBS Tween 0,5%. cố định coverslip lên slide và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

2.3.3

Phưong pháp ELISA
Phương pháp ELISA sử dụng toong đề tài này là sandwich ELISA với kháng thể

đa dòng tù thỏ phủ giếng (capture antibody) để bắt lấy kháng nguyên E7 mục tiêu, kháng
thể đơn dòng từ chuột nhận biết và gắn đặc hiệu với E7 (detection antibody) và cuối cùng
là kháng thể kháng IgG chuột đánh dấu alkaline phosphatase (AP) để phát hiện kháng thể
đơn dòng.
Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng phương pháp checkerboard để khảo sát nồng độ
tối ưu của các thành phần kháng thể đơn dòng, đa dòng và kháng thể thú cấp sử dụng trong
quy trình ELISA. Phương pháp này bao gồm việc pha loãng bậc hai hai thảnh phần trong
phản úng và cố định các thành phần còn lại để xác định mức bão hòa của hai thành phần
khảo sát. Trong đó, một thành phần sẽ được pha loãng theo hàng, thành phần còn lại pha

loãng theo cột của đĩa ELISA [17].

8


1:1 1:2 1 A 18 1161 32t:Ba

■ -y
„ •
12 •

• •••
• •

A

1:4 •
1:8 •

• •
• •

c
0

1:16

•

E

F

B

1:52
1:64

6
H
1z3

4

6

&

7

8

9

10 11 IS

Bình 2.1: Sơ đồ phương pháp checkerboard
23 A Phương pháp xử lý bệnh phẩm UTCTC
Bệnh phim gồm mẫu dịch phết cổ tử cung lấy bằng que phết của các bệnh nhân
UTCTC ở bệnh viện Ung bướu - Thảnh phổ Hồ Chỉ Minh từ tháng 3-2009 đến tháng 52009.
Các bệnh phẩm nảy sẽ được xử lý theo quy trinh sau:

- Mẫu dịch phết cổ tử cung được thu trên tăm bông, cho vào eppendorf, thêm 300 |il
dung dịch PBS - Triton X100 0,1% vào. Giữ ở

-80°c.

-

Giải đông mẫu dịch phết trên đá.

-

Vortex mạnh để các tế bào lâng ra khỏi tăm bông.

-

Lấy tăm bông ra.

-

Ly tâm thu tế bào ở 5000 vòng/phủt trong 5 phút, 4° c.

-

Loại bỏ dịch nổi. Hòa tủa ưong 500 pi PBS - Triton X100 0,1%.

-

Thêm 50 |il SDS 10%.

-

Vortex mạnh.

-

ủ trên đá 15 phủt.

-

Phá màng bằng sóng siêu âm 3 lần, mỗi lần 10 giây.

-

ủ tiếp trên đá 15 phút.
Dịch bệnh phẩm sau khi xử lý được đem đi làm ELISA.

9


PHẦN 3
KẾT QUẢ


3.1 KIÊM TRA TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA KHẮNG THẺ ĐƠN DÒNG VÀ ĐA DÒNG
BẰNG

PHƯƠNG

PHÁP

LAI

MIỄN

DỊCH

HUỲNH

QUANG

(IMMUNOFLUORESCENCE) TRÊN DÒNG TỂ BÀO CHO-K1 CHUYÊN
GENE E7 HPV 18 VÀ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ CÓ TƯ CUNG HELA
Nguồn gốc hai kháng thể sù dụng trong đề tài này:
Kháng thể đơn dòng được tạo ra từ protein E7 HPV 18 tái tổ hợp bằng phương pháp
dung hợp tế bào lách chuột Balb/c được gây đáp ứng miễn dịch với protein E7 và tế bào
ung thư tủy xương tạo thành dòng tế bào lai hybridoma. Sau đó, các dòng tế bào lai được
sàng lọc bằng phương pháp ELISA để chọn ra dòng tế bào lai sản xuất được kháng thể
kháng E7 HPV 18. Tiếp đó, kháng thể đơn dòng được thu nhận và tinh sạch từ các dòng
hybridoma này.
Kháng thể đa dòng được tạo ra bằng cách gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ với protein
E7 HPV 18 tái tổ hợp. Sau đó tiến hành tinh sạch kháng thể tù huyết thanh thỏ.
Như vậy, hai kháng thể đa dòng và đơn dòng sử dụng để xây dựng quy trình ELISA
được tạo ra từ kháng nguyên E7 HPV 18 tái tổ hợp biểu hiện trong E.colì, nên để khẳng
định tính đặc hiệu của hai kháng thể này, chúng tôi biểu hiện protein E7 toong dòng tế bào
động vật hữu nhũ CHO-K1 và tiến hành lai miễn dịch huỳnh quang để kiểm tra. Nhiều
nghiên cứu trên thế giới cũng sử dụng phương pháp này để kiểm tra khả năng gắn đặc hiệu
của kháng thể với protein E7 HPV 16 và HPV 18 như các nghiên cứu của Sigrun Ressler
và cộng sự (2007) [18], Marc Fiedler và cộng sự (2004, 2005) [19, 20]. Chúng tôi sử dụng
dòng CHO-K1 là một dòng tế bào phổ biến trong chuyển gene.
Chúng tôi thực hiện chuyển hai vector khác nhau vào tế bào CHO KI: Vector

pEGFP-E7: gene mã hóa cho protein EGFP và gene mã hóa cho protein E7 HPV 18 được
chèn vào vị trí của hai enzyme cắt giới hạn Bglữ. và Sail toong vùng MCS (Multicloning
site). Như vậy, dòng tế bào CHO-K1 này sẽ biểu hiện protein E7 HPV 18.

10


Vector pEGFP-C2: có gene EGFP nhưng không có gene E7 HPV 18, do đó dòng
tế bào này không biểu hiện protein E7.
Sau đó, chúng tôi tiến hành lai hai dòng tế bào này lần lượt với kháng thể đơn dòng
và đa dòng. Kháng thể thứ cấp sù dụng để phát hiện kháng thể đom dòng và đa dòng là
các kháng thể kháng IgG chuột và IgG thỏ đánh dấu TRITC. Tín hiệu màu xanh lục của
EGFP được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng kích thích 488 nm và tín
hiệu lai của các kháng thể với protein E7 được quan sát ờ bước sóng 541 nm với độ phóng
đại 100X.
Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành lai miễn dịch huỳnh quang hai kháng thể đơn
dòng và đa dòng này với dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa - dòng tế bào biểu hiện
protein E7 HPV 18 để khẳng định khả năng gắn đặc hiệu của hai kháng thể với protein E7
tự nhiên. Thí nghiệm gồm:
-

Tế bào HeLa lai với kháng thể đơn dòng và đa dòng, sau đó lai với kháng thể thứ

cấp đánh dấu TRITC tương tự như CHO-K1.
-

Tế bào HeLa không lai với kháng thể đơn dòng và đa dòng, chỉ lai với kháng thể

thứ cấp đánh dấu TRITC, sử dụng nhu dòng chứng âm cho thí nghiệm.

3.3.1

Lai vói kháng thể đơn dòng
Sau khi tiến hành chuyển hai vector vào tế bào CHO - KI và thực hiện lai miễn

dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng (nồng độ 2,98 pg/ml) trên các dòng tế bào
chuyển gene và trên dòng tế bào HeLa chúng tôi thu được các kết quả sau:

11


Hình 3.1: Kết quả lai miên địch huỳnh quang tể bào CH0-K1 mang vector
pEGFP-E7 với khảng thể đơn dòng quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (100X)
Htoh A1, B1, C1: Té bào CH0-K1 mang vectorpEGFP-E7quan sỗtdướikkìh hiền vi huỳnh quang
với bước sóng kích thích 488 nm.
Hình A2, B2, C2: Té bào CH0-K1 mang vectorpEGFP-E7quan sát dưới kính hiển vì huỳnh quang
với bước sóng kích thích 541 nm.

12


Hình 3.2: Két quả lai miễn dịch huỳnh quang trên tể bào CHO-KI mang vector
pEGFP-C2 với khảng thể đơn dòng quan sát dưởi kính hiển vi huỳnh quang (1Ỡ0X)
Hềìh D1, E1, F1: Tế bào CH0-K1 mang vectorpEGFP-C2 quan sàt dưới kinh hiển vi huỳnh quang
với bước sóng ktoh thích 488 nm.
Htoh D2, E2, F2: Té bào CH0-K1 mang vectorpEGFP-C2 quan sát dưới kinh hiển vi huỳnh quang
với bước sóng klch thích 541 nm.

13

Binh 3.3ỉ Kết quà lai miễn địch huỳnh quang tể bào HeLa với khảng thể đơn dòng
quan sứt dưới kinh hiển vi huỳnh quang với bước sóng kích thích 541 nm
ịlOOX)

I H-2

H-l

Hình 3.4: Kết quả lai miễn dịch huỳnh quang tế bào HeLa không có kháng thể đơn
dòng (chứng âm) quan sổt dưới kinh hiển vi huỳnh quang với bước sóng kích thích
541 nm (100X)
Nhận xét:
Ở hình 3.1: khi quan sát cùng một tể bào CH0-K1 mang vector pEGFP-E7 dưới hai
bước sóng ỉđch thích khác nhau, chúng tôi nhận thấy:
- Khi quan sát với bước sóng lách thỉch 488 nm (các bình Al, Bl, Cl), chúng tôi nhận
thấy, các tế bào CHO-KI nhận đuợc plasmid pEGFP-E7 phát huỳnh quang mảu xanh lục
chính là do sự biểu hiện của protein EGFP ữong tế bào. Điều này, chứng tỏ quá trình
chuyển gene đã thành công, các tế bào này nhện được vector pEGFP-E7 và biểu hiện
proteỉn EGFP.

14


- Khi quan sát vói bước sóng kích thích 541 nm (cấc hình A2, B2, C2), cấc tế bào
tưorng ứng ờ hình Al, Bl, C1 cho tín hiệu huỳnh quang màu đỏ. Điều này chứng tỏ có tín
hiệu lai của kháng thể đơn dòng với protein E7 biểu hiện toong tế bào.
Ở hình 3.2: khi quan sát cùng một tế bào CHO-K1 mang vector pEGFP-C2 dưới hai
bước sóng kích thích khác nhau, chúng tôi nhận thấy:
-

Khi quan sát với bước sóng kích thích 488 nm (các hình DI và El), các tế bào CHO-

K1 nhận được plasmid pEGFP-C2 cũng cho tín hiệu huỳnh quang xanh lục tương tự như
các hình Al, Bl, Cl, cho thấy vector pEGFP-C2 đã được chuyển vào toong tế bào và EGFP
đã được biểu hiện.
-

Ket quả quan sát ở hước sóng kích thích 541 nm (hình D2 và E2) với cùng các tế

hào tương ứng ở hlnh DI và E1 không cho thấy có tín hiệu huỳnh quang nào. Điều đó cho
thấy khi không có protein E7 biểu hiện trong tế bào thì kháng thể đơn dòng không tương
tác với các protein nội bào khác. Tín hiệu huỳnh quang có được ờ các hình A2, B2, C2 là
tín hiệu lai đặc hiệu của kháng thể đơn dòng khi có sự biểu hiện của protein E7 trong các
tế hào CHO-K1. Như rây, kháng thể đơn dòng chi tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV
18 biểu hiện trong tế bào CHO-K1 mà không tương tác với các protein nội bào.
Kết quả lai miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng trên HeLa khi quan sát
dưới hước sóng kích thích 541 nm (hình 3.3 và 3.4) cho thấy:
-

Các tế bào HeLa sau khi lai miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng khi

quan sát dưới kính hiển vi ờ bước sóng kích thích 541 nm cho tín hiệu huỳnh quang đỏ
(hình Fl, F2, F3, F4). Điều đó cho thấy kháng thể đơn dòng có khả năng tương tác với
protein E7 hiểu hiện trong tế hào HeLa.
-

Các tế bào HeLa ờ hình GI và G2 không lai với kháng thể đơn dòng thi tín hiệu

huỳnh quang đỏ rất yếu, hầu như đó chỉ là tín hiệu nền của phản ứng lai miễn dịch huỳnh

quang. Như vậy, khi không có kháng thể đơn dòng, sẽ không có tín hiệu lai. Điều đó khẳng
định màu huỳnh quang đỏ thấy được ờ hình 3.3 là tín hiệu đặc hiệu của tương tác giữa
kháng thể đơn dòng và protein E7 biểu hiện trong tế bào HeLa.

15


Từ kết quả của các thỉ nghiệm trên, có thể kết luận kháng thể đon dòng chủng tôi sử
dụng cỏ khả năng nhận diện và bắt đặc hiệu với protein E7 HPV 18 biểu hiện trong tế bào
CHO-K1 và tế bào HeLa. Điều này cho thấy có thể sử dụng kháng thể đem dòng này trong
thử nghiệm ELISA để phát hiện protein E7 HPV 18 trong bệnh phẩm.
3.3.2 Lai với kháng thể đa dòng
Tương tự như kháng thể đom dòng, chúng tôi sử dụng nồng độ kháng thể đa dòng
là 1,25 pg/ml để tiến hành lai miễn dịch huỳnh quang trên dòng tế bào CHO- KI mang
vector pEGFP-E7 và dòng tế bào CHO-K1 mang vector pEGFP-C2, cũng như dòng tế bào
HeLa.
Két quả như hình 3.5,3.6,3.7 và 3.8:

Hình 3.S: Kầ quả lai miễn địch huỳnh quang tế bào CHO-K1 mang vector
pEGFP-E7 với kháng thể đa đòng quan sát dưởi kính him vi huỳnh quang ỢỠOX)

16


Hhh 11, J1: Tê bào CH0-K1 mang vectorpEGFP-E7quan sất dưới kính hiển vì huỳnh quang vói
bước sóng khh thích 488 nm.
Hình 12, J2: Tế bào CHO-KI mang vector pEGFP-E7 quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với
bước sóng kích thích 541 nm.

-1 ■ 1-2

Hình 3.6: Két quả ỉtù miễn dịch huỳnh quang tế bào CH0-K1 mang veetor pEGFP-C2 với
kháng thể đa dòng quan sát dưới kỉnh hiển vi huỳnh quang ịlOOX) Hình K1, L1: Té bào CH0 -K1
mang vectorpEGFP-C2quan sát dưới kỉnh hiển vi huỳnh quang với bước sóng kích thích 488 nm.
Hềìh K2,12: Tể bào CH0 -K1 mang vectorpEGFP-C2quan sót dưới ktoh hiển vi huỳnh quang với
bước sóng kích thích 541 nm.

17