Đánh giá đa hình di truyền của một số giống cam bằng kỹ thuật RAPD và ISSR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------

TRẦN THỊ THU THỦY
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ
GIỐNG CAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ ISSR.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2012 - 2016

Thái Nguyên – năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------

TRẦN THỊ THU THỦY
Tên đề tài:
ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ
GIỐNG CAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ ISSR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Lớp
: K 44 - CNSH
Khoa
: CNSH - CNTP
Khóa học
: 2012 - 2016
Giảng viên hƣớng dẫn 1: TS. Dƣơng Văn Cƣờng
Giảng viên hƣớng dẫn 2: PGS. TS. Đào Thanh Vân

Thái Nguyên – năm 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi đã nhân đƣợc sự giúp đỡ, hƣớng dẫn, chỉ
bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành khóa luận:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Dƣơng Văn Cƣờng và ,
giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khoá luận này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Đào Thanh Vân, Phó trƣởng phòng Đào
tạo sau đại học, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu cây trồng ôn đới, Trƣờng Đại học
Nông lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài
và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Ma Thị Trang, KS. Vũ Hoài Nam, cán bộ
phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và Công nghệ gene, Viện Khoa học Sự Sống, Đại học
Thái Nguyên, đã trực tiếp chỉ bảo kĩ năng làm việc, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học
tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống - Đại học
Thái Nguyên, các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều
kiện để tôi học tập và hoàn thành khoá luận này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những
ngƣời đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện
khoá luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, ngày

tháng

Sinh viên
Trần Thị Thu Thủy

năm 2016


ii

DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 2.1. Thành phần dinh dƣỡng của cam tƣơi (tính trên 100g) ........................... 5
Bảng 2.2: Diện tích, năng suất, sản lƣợng cam, quýt trên thế giới 2005 – 2010 ..... 7
Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam ở một số nƣớc vùng châu Á năm 2010 ............. 7
Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam quýt giai đoạn 2006 - 2010 ............................... 8
Bảng 2.5. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới........ 19
Bảng 2.6. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền trên Cam, quýt ở Việt Nam. .. 30
Bảng 3.1. Danh sách 19 mẫu cam nghiên cứu....................................................... 32
Bảng 3.2. Trình tự các mồi RAPD và mồi ISSR sử dụng ..................................... 33
Bảng 3.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 33
Bảng 3.4. Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài .................................. 34
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng RAPD và ISSR .................................................. 36
Bảng 4.1. Những thông số thay đổi qua các quy trình. ......................................... 39
Bảng 4.2. Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ DNA............................................. 42
Bảng 4.3. Số phân đoạn DNA xuất hiện ở từng mẫu tƣơng ứng với từng mồi ...... 52
Bảng 4.4. Tỷ lệ sự phân đoạn đa hình ................................................................... 53
Bảng 4.5. Hệ số tƣơng đồng di truyền của 20 mẫu cam, quýt ............................... 54


iii

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 3.1. Chu trình nhiệt phản ứng PCR .............................................................. 37
Hình 3.2. Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình trong PCR-RAPD 37
Hình 4.1. Kết quả điện di DNA tổng số mẫu 10, 20. ............................................ 40
Hình 4.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR của hai mẫu 10, 20 tách từ quy
trình 2 và 3 với mồi OPM-13 .............................................................. 40
Hình 4.3. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số từ 20 mẫu cam, quýt đƣợc tách
theo quy trình 3 ................................................................................... 42
Hình 4.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi

OPA-08 ............................................................................................... 43
Hình 4.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OPB-18 ............................................................................................... 44
Hình 4.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OPC-08 ............................................................................................... 45
Hình 4.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OPG-16 ............................................................................................... 46
Hình 4.8. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OPG-17 ............................................................................................... 46
Hình 4.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OPM-13 .............................................................................................. 47
Hình 4.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OPA-04 ............................................................................................... 48
Hình 4.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OPQ-18 ............................................................................................... 49
Hình 4.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OPT-01 ............................................................................................... 49
Hình 4.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 20 mẫu cam, quýt với mồi
OP0-04 ................................................................................................ 50


iv
Hình 4.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của 20 mẫu cam, quýt với mồi T1 ... 50
Hình 4.15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của 20 mẫu cam, quýt với mồi T2. 51
Hình 4.16. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của 20 mẫu cam, quýt với mồi T3 ... 51
Hình 4.17. Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu....... 56


v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AFLP

: Amplified Fragment Length Polymorphism

Bp

: Base pair – Cặp bazơ nitơ

Cs

: Cộng sự

CTAB

: Cetyl trimetyl ammonium bromide

DNA

: Deoxyribonucleic acid

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

FAO

: Food and Agriculture Organization

FHB

: Fusarium hesd blight

ISSR

: Inter – simple sequence repeat

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RAPD

: Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

: Restriction fragment length polymorphism

SSR

: Simple sequence repeat

TAE

: Tris-acetate - EDTA

TE

: Tris - EDTA


vi

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................. v
MỤC LỤC .............................................................................................................vi
Phần 1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
1.2. Mục đích đề tài ................................................................................................ 2
1.3. Yêu cầu đề tài .................................................................................................. 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài. ........................................................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học. ......................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn. .......................................................................................... 2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3
2.1. Tổng quan về cây cam, quýt. ........................................................................... 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại. ............................................................................... 3
2.1.2. Giá trị của cây cam, quýt. ............................................................................. 4
2.2. Tình hình sản xuất cam, quýt trên thế giới và Việt Nam. ................................. 6
2.2.1. Tình hình sản xuất cây cam, quýt trên thế giới. ............................................ 6
2.2.2. Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam. ............................................. 8
2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền. ..................... 8
2.3.1. Kỹ thuật RAPD. ............................................................................................ 8
2.3.2. Kỹ thuật ISSR. ............................................................................................ 10
2.3.3. Một số kỹ thuật khác. .................................................................................. 11

2.4. Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và trong
nƣớc .............................................................................................................. 12
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. ............................................................. 12
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ................................................................ 28


vii
Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 32
3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ................................................................... 32
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................. 32
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 32
3.2. Thiết bị, hóa chất nghiên cứu ......................................................................... 33
3.2.1. Thiết bị nghiên cứu ..................................................................................... 33
3.2.2. Hóa chất ...................................................................................................... 34
3.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 34
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................ 34
3.4.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA ..................................................................... 34
3.4.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số ................ 35
3.4.3. Phƣơng pháp PCR-RAPD ........................................................................... 36
3.4.4. Phƣơng pháp phân tích đa hình ................................................................... 37
3.4.5. Phƣơng pháp phân tích và xử lí số liệu ....................................................... 37
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 38
4.1. Tối ƣu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá cam quýt ......................... 38
4.2. Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD và ISSR. ........ 43
4.2.1. Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD với từng mồi.
...................................................................................................................... 43
4.2.2. Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng ISSR với từng mồi . 50
4.3. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống cam nghiên cứu dựa trên giản
đồ phả hệ DNA. ............................................................................................ 54
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 59

5.1. Kết luận.......................................................................................................... 59
5.2. Đề nghị. ......................................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây cam (citrus sinensis (L) Osbeck) thuộc họ Rutaceae là một trong những
cây ăn quả lâu năm có hƣơng vị thơm ngon, giá trị dinh dƣỡng cao đƣợc nhiều
ngƣời ƣa chuộng. Trong thành phần quả cam chứa nhiều vitamin nhƣ: vitamin A,
B1, C, B9; chất xơ; các chất khoáng vi lƣợng; chứa nhiều chất chống oxy hóa có tác
dụng lớn trong phòng ngừa tim mạch, chống khối u, chống viêm [1]. Ngoài ra vỏ
cam còn chứa một lƣợng lớn tinh dầu mang mùi thơm đặc trƣng đƣợc sử dụng trong
công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dƣợc phẩm.
Ở Việt Nam hiện nay, cây cam đƣợc trồng ở nhiều vùng miền hình thành các
vùng trồng cam nổi tiếng nhƣ cam Xã Đoài (Nghệ An), cam sành Bố Hạ (Bắc
Giang), cam sành Hàm Yên (Tuyên Quang), cam canh (Hà Nội)… mang lại lợi ích
kinh tế cao. Theo thống kê của Bộ NN & PTNN năm 2011, diện tích cây có múi
đƣợc trồng ở nƣớc ta đạt 124,057 ha, trong đó diện tích trồng cam chiếm 70,300 ha
(xấp xỉ 56%). Tuy nhiên ở mỗi vùng địa lý khác nhau sẽ phát triển những giống
cam khác nhau do ảnh hƣởng của điều kiện tự nhiên, khí hậu, thổ nhƣỡng và quá
trình chọn lọc tự nhiên tạo nên sự đa dạng về mặt di truyền cho các giống cam.
Việc đánh giá đa hình di truyền của các loài cam, quýt là cần thiết nhằm cung
cấp các thông tin cần ứng dụng trong công tác nghiên cứu chọn giống, sử dụng hợp
lý và bảo tồn các nguồn gene quý trong tự nhiên và trong sản xuất [8].
Để có thể đánh giá độ tƣơng đồng di truyền của các giống cam, quýt ngoài các
chỉ thị về hình thái, cần có những đánh giá sâu hơn về mặt di truyền do các đặc

điểm hình thái đƣợc hình thành từ kết quả tƣơng tác giữa kiểu gene và môi trƣờng.
Trong những năm gần đây việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng
dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng giữa các
loài với nhau. Các chỉ thị phân tử có độ chính xác cao, nhanh chóng và không bị
phụ thuộc vào các đặc điểm hình thái.


2
Hiện nay có một số phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong đánh giá đa dạng di
truyền trên cây cam, quýt nhƣ ISSR, SSR, RAPD…Trong số đó RAPD (Random
amplified polymorphic DNA) và ISSR (Inter – simple sequence repeat) là các kỹ
thuật đƣợc sử dụng rộng rãi trong đánh giá đa dạng di truyền ở cam, quýt [3, 4,
17, 21, 22].
Chính vì vậy, để có thể đánh giá đƣợc sự đa dạng di truyền của các giống cam
trên địa bàn tỉnh Tuyên Quang chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá đa
hình di truyền của một số giống cam bằng kỹ thuật RAPD và ISSR”.
1.2. Mục đích đề tài
Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống cam nghiên cứu bằng phƣơng
pháp RAPD và ISSR.
1.3. Yêu cầu đề tài
- Tách chiết đƣợc DNA tổng số từ lá cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng
RAPD và ISSR.
- Phân tích đƣợc các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ
thuật RAPD và ISSR.
- Phân tích đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các giống cam nghiên cứu dựa
trên sơ đồ phả hệ DNA.
1.4. Ý nghĩa của đề tài.
1.4.1. Ý nghĩa khoa học.
Phân tích đa dạng di truyền của các giống cam bằng phƣơng pháp RAPD và
ISSR sẽ cung cấp thêm số liệu, thông tin và khả năng ứng dụng chỉ thị phân tử

trong công tác chọn, tạo các giống, bảo tồn nguồn gene.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn.
Phân tích đa dạng di truyền ở các giống cam giúp ứng dụng trong công tác
chọn giống, lai tạo những giống có năng suất, chất lƣợng cao.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây cam, quýt.
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại.
2.1.1.1. Nguồn gốc.
Cây cam là một loại cây ăn quả thuộc họ cây có múi, cho đến nay chƣa có tài
liệu nào nói chính xác về nguồn gốc của cây ăn quả có múi. Tuy nhiên nhiều kết
quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng cam, quýt có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới Đông Nam châu Á, sự lan trải của cam quýt trên thế giới gắn liền với lịch
sử buôn bán đƣờng biển và các cuộc chiến tranh trƣớc đây. Cam, quýt đƣợc di
chuyển từ ấn Độ đến Châu Phi bởi các thuyền buôn, di chuyển đến Châu Mỹ bởi
các nhà thám hiểm và thuyền buôn ngƣời Tây Ban Nha và Bồ đào Nha, sau đó
chúng đƣợc trồng rộng rãi và phổ biến.
Giống Cam ngọt (Citrus sinensis Osbeck) đƣợc xác định có nguồn gốc ở miền
Nam Trung Quốc, Ấn Độ và miền Nam Indonexia. Sau đó đƣợc mang đến trồng ở
Châu âu, Địa Trung Hải và Châu Phi vào thế kỷ 13 đến thế kỷ 17 [15].
Giống cam Washington Navel trên thế giới hay có tên gọi cam Navel ở Việt
Nam đƣợc cho là dạng đột biến tự nhiên từ một giống cam ngọt, giống này đƣợc
phát hiện ở Bhia Brazil, lần đầu tiên đƣợc trồng ở úc năm 1928, ở Florida (Mỹ) năm
1835, ở California năm 1970 và nó nổi tiếng ở Washington D.C. Sau đó đƣợc trồng
khắp các vùng trồng cam, quýt trên thế giới [29].
Tóm lại cam, quýt có nguồn gốc ở miền Nam Châu Á và đƣợc lan trải khắp

trên thế giới qua buôn bán đƣờng biển, các cuộc chiến tranh trƣớc đây.
2.1.1.2. Phân loại
Cam, quýt thuộc:

Giới Plantae
Bộ Rutales
Họ Rutaceae
Chi Citrus


4
Hiện nay, tồn tại hai hệ thống phân loại cam quýt đƣợc nhiều ngƣời áp dụng.
Cách phân loại thứ nhất, theo Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160 – 162 loài
(Specias). Tanaka đã quan sát, ghi chép tỉ mỉ đặc điểm hình thái của các giống đã
biến dị này và phân chúng thành một loài mới hoặc giống mới có tên khoa học
đƣợc bắt đầu bằng tên giống hay tên loài đã phát sinh ra chúng và kết thúc bằng
chữ “Horticulturre’’. Cách phân loại thứ hai của Swingle đã chia cam quýt ra làm
16 loài. Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn thƣờng sử dụng hệ thống phân loại của
Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết tới từng
giống [1].
2.1.2. Giá trị của cây cam, quýt.
Cam, quýt là một trong những sản phẩm có giá trị và đƣợc nhiều ngƣời ƣa
chuộng, nó mang lại nguồn dinh dƣỡng quý cho con ngƣời. Không chỉ có ý
nghĩa về kinh tế, nguồn dinh dƣỡng mà cam quýt còn có giá trị cao về dƣợc
liệu. Hiện nay, sản phẩm của cây cam, quýt ngoài cung cấp cho thị trƣờng
trong nƣớc còn là nguồn xuất khẩu sang các nƣớc trong khu vực góp phần vào
tăng trƣởng nền kinh tế.
- Giá trị dinh dƣỡng: Quả cây có múi có nhiều chất dinh dƣỡng nên giá trị
sử dụng rất cao. Trong 100g thịt quả có chứa 6 - 12% đƣờng, chủ yếu là
đƣờng sacaroza. Hàm lƣợng vitamin C trong quả khoảng 40 - 90 mg/100g

tƣơi, 0,4 - 1,2% các acid hữu cơ, trong đó có nhiều loại acid có hoạt tính
sinh học cao. Trong quả còn có chứa các chất khoáng và dầu thơm, ngoài ra
còn một số dƣỡng chất thiết yếu khác [1].


5
Bảng 2.1. Thành phần dinh dƣỡng của cam tƣơi (tính trên 100g)
Thành phần

Hàm lƣợng

Đơn vị

Múi

Vỏ

Nƣớc

88,06

75,95

%

Protein

0,9

-

%

Sacharose

3,59

1,22

%

Glucose

1,25

3,49

%

Fructose

1,45

3,24

%

Acid hữu cơ

1,41

0,22

%

Cellulose

0,47

3,49

%

Pectin

1,41

0,22

%

Ca

34

-

mg %

P

23

-

mg %

Fe

0,4

-

mg %

Vitamin A

0,09

-

mg %

β – Carotene

0,4

0,09

mg %

Vitamin B1

0,04

0,02

mg %

Vitamin B2

0,06

-

mg %

PP

0,75

1,27

mg %

Vitamin C

65

170

mg %

- Giá trị công nghiệp và dƣợc liệu: Trong vỏ quả có chứa tinh dầu đƣợc dùng
nhiều trong công nghiệp thực phẩm và công nghiệp mỹ phẩm. Ở nhiều nƣớc trên
thế giới, ngƣời ta đã dùng các loại quả thuộc chi Citrus làm thuốc chữa bệnh. Ở
thế kỷ XVI, ở Trung Quốc và Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh
dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dƣới da. Ở Mỹ vào những năm 30
của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng các quả cam quýt kết hợp với insulin để
chữa trị bệnh đái tháo đƣờng. Ở Nga, bắt đầu từ thế kỷ XI, quả cây có múi đã
đƣợc sử dụng để phòng ngừa và chữa trị trong y học dân gian. Ở nƣớc ta, nhân
dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu [1].


6
- Giá trị kinh tế: Cây ăn quả có múi là một trong những loại cây lâu năm,
nhanh cho thu hoạch. Một số loài có thể cho thu hoạch quả ở năm thứ 2 sau khi
trồng. Ở nƣớc ta, năng xuất trung bình của cam quýt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đạt tới
16 tấn/ha. Cây cam quýt có thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15 - 30 năm.
Trong trƣờng hợp đất tốt, đƣợc chăm sóc đầy đủ và áp dụng các biện pháp kỹ thuật
thâm canh cao, trong các điều kiện khí hậu thích hợp và không bị sâu bệnh gây hại
nặng, tuổi thọ của cam quýt có thể kéo dài trên 50 năm [1].
- Giá trị sinh thái, môi trƣờng: Cây có múi là cây ăn quả lâu năm đƣợc trồng
trong các vƣờn cây của gia đình hộ nông dân hoặc trồng trên đồi tại các trang trại.
Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt, bƣởi tiết ra oxy trong không khí làm
không khí trở nên trong lành. Trong những chừng mực nhất định các chất bay hơi từ
cây cam quýt có tác dụng diệt một số loài vi khuẩn làm cho không khí trở nên sạch
hơn, môi trƣờng sống của con ngƣời tốt hơn. Cam quýt trồng trên các đồi đất, bên
cạnh việc cho quả còn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nƣớc ngăn cản dòng chảy
mạnh trên mặt đất sau các trận mƣa lớn, do đó có ý nghĩa lớn trong việc làm giảm

quá trình xói mòn, rửa trôi đất. Ở vùng trung du và miền núi, cam quýt đƣợc trồng
trong các vƣờn rừng, vƣờn đồi trong các hệ thống VAC và VACR là phƣơng thức
canh tác đƣợc áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều
ƣu điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững [1].
2.2. Tình hình sản xuất cam, quýt trên thế giới và Việt Nam.
2.2.1. Tình hình sản xuất cây cam, quýt trên thế giới.
Mặc dù cam, quýt có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á nhƣng hiện nay cam,
quýt đƣợc trồng phổ biến ở nhiều vùng trên thế giới, với hơn 100 quốc gia.
Theo thống kê của FAO năm 2011 tình hình xuất nhập khẩu cam, quýt trên thế
giới nhƣ sau: Nhập khẩu 37,13 nghìn tấn có giá trị 31.272,38 nghìn USD; xuất khẩu
63,71 nghìn tấn có giá trị 38.112,3 nghìn USD. Sản phẩm cam, quýt có giá trị
thƣơng mại rất lớn trong nền kinh tế thế giới.


7
Bảng 2.2: Diện tích, năng suất, sản lƣợng cam, quýt trên thế giới
2005 – 2010
Năm

Diện tích

Năng suất

Sản lƣợng

(ha)

(tấn/ha)

(tấn)

2005

7.920.811

14,06

111.375.240

2006

8.233.589

14,28

117.591.695

2007

8.633.025

13,40

115.698.791

2008

8.697.925

14,02

121.936.794

2009

8.684.866

14,14

122.833.294

2010

8.645.339

14,31

123.694.474

(Nguồn: FASTAT/FAO Statistics - năm 2012)
Từ năm 2005 đến năm 2010 diện tích trồng cam trên thế giới tăng từ 7920811
ha lên 8645339 ha. Bên cạnh đó, năng suất và sản lƣợng cam cũng tăng liên tục
theo các năm.
Theo số liệu thống kê chƣa đầy đủ của FAO về tình hình sản xuất cam ở một
số nƣớc châu Á năm 2010 nhƣ sau:
Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam ở một số nƣớc vùng châu Á năm 2010
Năm 2010
STT

Vùng, lãnh thổ

Diện tích

Năng suất

Sản lƣợng

(ha)

(tạ/ha)

(tấn)

1

Trung Quốc

375.789

133,141

5.003.289

2

Ấn Độ

617.200

101,557

6.268.100

3

Inđônêxia

58.000

350,460

2.032.670

4

Thái Lan

21.500

173,349

372.700

5

Việt Nam

61.500

118,602

729.400

(Nguồn: FASTAT/FAO Statistics - năm 2012)
Diện tích trồng cam lớn nhất ở khu vƣc Châu Á là Trung Quốc với trên 3 triệu
ha, năng suất đạt 133,141 tạ/ha và sản lƣợng 5.003.289 tấn. Đứng thứ 2 là Ấn Độ
với diện tích 617.200 ha, năng suất đạt 101,557 tạ/ha, Inđônexia là nƣớc có năng
suất cao nhất 350,460 tạ/ha.


8
2.2.2. Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam.
Nƣớc ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, thích hợp với nhiều loại cây trồng
trong đó có các loài cây ăn quả, đặc biệt là cam, quýt. Cam, quýt đƣợc trồng phổ
biến ở nhiều vùng trên khắp cả nƣớc. Có nhiều vùng trồng cam quýt cho năng suất
cao, phẩm chất tốt có tiếng trong nƣớc phải kể đến vùng trồng cam nhƣ: Đồng Bằng
Sông Cửu Long, vùng cam Trung du miền núi phía Bắc với nhiều giống cam đặc
sản, chất lƣợng nhƣ: Cam Vinh, cam Yên Bái, cam Bắc Quang, quýt Bắc Sơn, cam
sành Hàm Yên...
Theo Bộ NN & PTNT về tình hình sản xuất cam, quýt trong giai đoạn 2006 –
2010 nhƣ sau:
Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam quýt giai đoạn 2006 - 2010
STT

Năm

Tình hình sản xuất
cam, quýt

2006

2007

2008

2009

2010

1

Diện tích (1000 ha)

62.2

65.1

63.2

63.9

60.9

2

Năng suất (tạ/ha)

98.1

100.1

107.6

105.0

118.6

3

Sản lƣợng (1000tấn)

611.0

648.2

676.7

683.5

720.1

(Nguồn: Cơ sở dữ liệu bộ NN & PTNT 2012)
Nhìn vào bảng thống kê ta thấy diện tích sản xuất cam, quýt tăng từ năm 2006
với 62.2 nghìn ha lên 65.1 nghìn ha năm 2007 sau đó giảm dần đến năm 2010
xuống còn 60.9 nghìn ha. Năng suất trung bình năm 2006 rất thấp chỉ đạt 98.1 tạ/ha
và chúng tăng dần đến năm 2010 đạt năng suất 118.6 tạ/ha. Tổng sản lƣợng cam,
quýt trong năm 2010 đạt cao nhất là 720.1 nghìn tấn.
2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền.
2.3.1. Kỹ thuật RAPD.
2.3.1.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) đƣợc định nghĩa là
sự đa hình các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên. Chỉ thị phân tử RAPD dựa
trên kỹ thuật PCR với sự bắt cặp ngẫu nhiên của các đoạn mồi ngắn (10 nucleotide)
có trình tự biết trƣớc với mạch khuôn, nhân những đoạn có trình tự bổ sung với


9
trình tự mồi. Mồi sử dụng cho phản ứng RAPD là các mồi ngẫu nhiên có nhiệt độ
kéo dài mồi thấp từ 34 – 370C. Mặc dù là mồi ngẫu nhiên nhƣng vẫn phải đủ 2 tiêu
chí là tỷ lệ GC tối thiểu là 40% và không có trình tự các bazơ đầu xuôi và ngƣợc
giống nhau [8].
Về cơ bản kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo 3 bƣớc:
-

Tách chiết DNA tổng số.

-

Thực hiện phản ứng PCR nhân gene, điện di trên gel agarose hay gel

polyacrylamide.
-

Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng

(NTSYSpc, UPGMA cluster, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần
gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.
Sản phẩm PCR – RAPD thƣờng đƣợc điện di trên gel agarose 1.5 - 2% hay
điện di trên gel polyacrylamide.
2.3.1.2. Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật RAPD so với các kỹ thuật sinh

học phân tử khác
 Ƣu điểm:
Kỹ thuật RAPD cho phép đánh giá toàn bộ hệ gene của sinh vật mà không
cần biết trƣớc trình tự hệ gene của đối tƣợng nghiên cứu, đem lại tính đa hình cao.
Kỹ thuật RAPD đơn giản, dễ thực hiện, thời gian thực hiện ngắn và ít tốn
kém, chỉ cần sử dụng một lƣợng DNA ít, cho phép tiến hành với số lƣợng mẫu lớn.
Với một bộ mồi ta có thể sử dụng đƣợc với các loài khác nhau trong khi các
mẫu dò RFLP chỉ có thể dùng đƣợc cho các loài có quan hệ gần gũi. Tính đa dạng
thu đƣợc từ các chỉ thị RAPD đƣợc đánh giá cao hơn so với kỹ thuật RFLP trong
trƣờng hợp thực hiện trên cùng một vật liệu và cho phép phát hiện đƣợc tính đa
dạng ngay trong cả các đoạn chứa các trật tự nucleotide lặp lại [20].
Bên cạnh đó, RAPD còn là một kỹ thuật lấy dấu DNA có độ nhạy cao, có
hiệu quả trong việc xác định kiểu gene, lập bản đồ di truyền, lập bản đồ gene liên
kết và phân tích con lai F1.
Mỗi mồi có thể nhân bản nhiều vị trí trong hệ gene, cho phép phát hiện ra
những đột biến hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần gũi, xác định tính đa dạng sinh


10
học và nguồn gốc di truyền của các giống thực vật, động vật và vi sinh vật hay còn
gọi là phƣơng pháp phân loại phân tử.
 Nhƣợc điểm:
Bên cạnh những ƣu điểm trên RAPD vẫn có những hạn chế nhất định nhƣ
sản phẩm PCR không ổn định giữa những lần nghiên cứu do đặc điểm của mồi là
ngẫu nhiên và ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp, chịu ảnh hƣởng của điều kiện phản ứng
và chỉ tạo ra đƣợc các chỉ thị trội do đó không phân biệt đƣợc các cá thể đồng hợp
với các cá thể dị hợp [8].
2.3.1.3. Một số ứng dụng của kỹ thuật RAPD.
Các nghiên cứu cho thấy kỹ thuật RAPD là một phƣơng pháp rất hiệu quả
trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản

đồ di truyền. Kỹ thuật RAPD cũng đƣợc sử dụng để nhận biết và phân loại các
giống cây khác nhau, xác định sự đa hình di truyền của các cây tái sinh có nguồn
gốc từ mô sẹo.
Kỹ thuật RAPD đƣợc sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân
thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo hoặc
phân loại.
Chỉ thị RAPD còn là công cụ hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để
phân biệt các giống hay loài khác nhau. Sun và cs (2003) đã sử dụng 160 mồi
RAPD để phân tích tính đa hình DNA của 35 giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB
(Fusarium hesd blight) và phát hiện ra 3 chỉ thị RAPD liên quan đến tính kháng
bệnh FHB [39]
Orozco và cs (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di
truyền và tiến hóa của các giống cà phê đƣợc lai tạo từ các loài bố, mẹ ở các vùng
sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai có đặc
tính quý [31].
2.3.2. Kỹ thuật ISSR.
Kỹ thuật ISSR (Inter – simple sequence repeat) đƣợc định nghĩa là kỹ thuật
dựa trên PCR dùng để nhân đoạn gene nằm giữa 2 vùng lặp lại giống hệt nhau và
ngƣợc chiều nhau. Kỹ thuật này sử dụng các tiểu vệ tinh nhƣ các mồi trong phản


11
ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại
đơn giản với độ dài khác nhau. Các tiểu vệ tinh sử dụng nhƣ mồi trong kỹ thuật
ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc 5 nucleotide. Các mồi sử dụng có thể không phải mồi
neo hoặc là mồi neo ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa kéo đến các
chuỗi bên cạnh. Kỹ thuật ISSR sử dụng mồi dài (15 đến 30 nucleotide) vì vậy nhiệt
độ bắt mồi cao dẫn đến độ ổn định cao của phản ứng. Sản phẩm có độ dài 200-2000
bp nên có thể phân tách trên cả gel agarose và polyacrylamide. Kỹ thuật ISSR đƣợc
sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di

truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gen, xác định cây trồng, phân tích
nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome và đánh giá con lai [8].
Kỹ thuật ISSR có một số lợi thế so với các kỹ thuật khác là có thể phân biệt
đƣợc các kiểu gen gần và không cần thông tin về trình tự gen của cây nghiên cứu.
Giống nhƣ RAPD, ISSR là kỹ thuật nhanh, dễ tiến hành. Nó ƣu việt hơn RAPD là
cho nhiều thông tin và có thể lặp lại ở các thí nghiệm do mồi dài hơn. Nhƣợc điểm
chủ yếu của ISSR là tạo ra các chỉ thị trội và sự dị đồng nhất của các sản phẩn nhân
bản do sự di chuyển đồng thời.
2.3.3. Một số kỹ thuật khác.
Chỉ thị RFLP (Restriction Fragmennt Length Polymorphism)
Đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu thị sự
khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra khi cắt đồng thời DNA bằng các
enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA. Đa hình DNA đƣợc xác
định bằng cách lai đoạn dò DNA đánh dấu với DNA sau khi cắt bằng enzyme cắt
giới hạn và đƣợc thấm truyền lên màng lai bằng phƣơng pháp Southern Blot. Kết
quả tạo ra các phân đoạn DNA khác nhau [8].
RFLP là chỉ thị đồng trội do đó có thể phát hiện đƣợc các alen khác nhau của
một locus trong hệ gen nhân, hệ gene ti thể hay hệ gene lục lạp bằng một mẫu dò
đặc hiệu. Chỉ thị RFLP có mức đa hình cao và khả năng lặp lại cao, cho phép phân
tích đồng thời nhiều mẫu, tuy nhiên không đƣợc sử dụng rộng rãi do: cần DNA có
chất lƣợng cao, cần có các đoạn DNA dò. Kỹ thuật RFLP đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu lai tạo hay chuyển gene vào cá thể khác, đánh giá đa dạng di truyền [8].


12
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism):
Kỹ thuật AFLP đƣợc sử dụng để phát hiện đa hình DNA. Phân tích AFLP
đƣợc kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi hay còn
gọi là chuỗi tiếp hợp (adapter) để nhân chọn lọc các phân đoạn DNA đƣợc cắt hạn
chế. Các cặp mồi thƣờng tạo đƣợc từ 50 đến 100 băng trong một phân tích. Số

lƣợng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi. Kỹ thuật AFLP
cho phép lấy dấu DNA từ bất kỳ nguồn gốc nào. Kỹ thuật này có một số ƣu điểm
nhƣ: có độ tin cậy và lặp lại cao; không cần thông tin về trình tự DNA của cơ thể
nghiên cứu; cho nhiều thông tin do có khả năng phân tích số lƣợng lớn locus đa
hình với một tổ hợp mồi trên một gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số
liệu có thể lƣu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh.Có thể dùng phân biệt các cá thể
rất gần nhau, lập bản đồ genome [13].
Kỹ thuật SSR (Simple sequence Repeats)
Chỉ thị SSR là sự khuếch đại các đoạn lặp đơn giản (những đoạn DNA lặp lại
một cách có trật tự, phân bố nhiều trong khắp hệ gene của sinh vật nhân chuẩn). Chỉ
thị phân tử SSR là những đoạn DNA ngắn gồm một số nucleotide lặp lại liên tiếp,
mỗi đơn vị có chiều dài từ 4 đến 6 cặp bazơ số lƣợng đơn vị lặp lại thay đổi từ 1 đến
40 đơn vị.
Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các
đoạn trình tự SSR. Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến sự thay đổi độ
dài đoạn lặp lại đƣợc nhân lên và xác định khi chạy điện di tren gel agarose hay gel
polyacrylamide.
SSR là các marker đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin cậy nên đƣợc sử
dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tƣợng cây trồng, nó
còn đƣợc sử dụng trong lập bản đồ gene, chọn giống phân tử.
2.4. Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và
trong nƣớc
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.
Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tính đa dạng di truyền của
chi Citrus bằng các chỉ thị sinh học phân tử.


13
Abkenar và cs (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đặc điểm phân tử và
khoảng cách di truyền giữa các loài Citrus ở Nhật. Đối tƣợng nghiên cứu gồm 31

loài Citrus khác nhau, trong đó có 6 loài cam chua, 4 loài “Yuzu” và 21 loài họ
hàng. Sử dụng 27 mồi kết quả có 108 chỉ thị đƣợc tạo thành, 76 chỉ thị là đa hình,
trung bình là 2,8 chỉ thị trên một mồi. Cây phân loại cho thấy các loài cam chua rất
khác với các tloài “Yuzu” và họ hàng của chúng. Các loài “Yuzu” có mối quan hệ
gần gũi nhau, tuy nhiên sự đa dạng di truyền ở các loài khá cao, biểu lộ các nguồn
gốc khác nhau của chúng. Trong nghiên cứu này, một số mồi RAPD có thể giúp
phân biệt giữa các loại cây trồng gần gũi nhƣ OPA-17 và OPE-20 chỉ có ở
“Kabosu” mà không có ở “Aka kabosu”; mồi OPA-20, OPB-05 và OPE-16 phân
biệt các cây chỉ có ở “Aka kabosu” mà không có ở “Kabosu” [11].
Kỹ huật RAPD đã đƣợc sử dụng để phân biệt các cây con có nguồn gốc từ
phôi tâm đƣợc tạo thành từ phép lai giữa các giống quýt Montenegrina (Citrus
deliciosa Tenore) và King (Citrus nobilis Loureiro). Phôi tách ra từ hạt giống, sau
đó đƣợc nhân giống invitro và đƣợc trồng ở điều kiện nhà kính. 4 mồi ngẫu nhiên
đƣợc sử dụng với 54 mẫu cây có nguồn gốc hữu tính từ tổng 202 cá thể. Phân tích
di truyền đã sắp xếp các cá thể vào các nhóm riêng biệt với khoảng cách di truyền
lớn nhất là 20% [25].
Machado và cs (1996) đã dùng chỉ thị RAPD đánh giá đa hình di truyền của
39 loài quýt Địa Trung Hải. Sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên, kết quả thu đƣợc 111
băng, trung bình mỗi mồi có 2,2 chỉ thị RAPD. Thuật toán UPGMA đƣợc sử dụng
để phân tích các nhóm cho thấy sự khác biệt di truyền thấp giữa các loài quýt Địa
Trung Hải, trong khi các dạng lai của chúng với các loài Citrus khác lại có sự khác
biệt lớn hơn về di truyền. Bằng kỹ thuật RAPD cho thấy giữa các mẫu có sự khác
nhau về di truyền khá thấp, có thể chúng là một dòng đơn. Với sự đa hình thấp và số
lƣợng dạng lai lớn có thể đƣa ra giả thuyết tất cả các loài quýt Địa Trung Hải là
dạng lai của loài quýt Citrus reticulate Blanco [22].
Dehesdtani và cs (2007) đánh giá đa dạng di truyền của các cây cam ngọt
(Citrus sinensis Navel) trồng ở Mazandaran (Iran) bằng chỉ thị RAPD với 21 mồi


14

ngẫu nhiên và 52 mẫu lá của các cây có ba hình thái quả khác nhau là: vỏ nhẵn, vỏ
nhám và nửa nhám. Bốn mồi đã tạo ra các băng đa hình có tính lặp lại. Trong số các
băng tạo ra từ 4 mồi có 70,13% là băng đa hình, sự đa hình di truyền cao nhất là ở
nhóm vỏ nhẵn và vỏ nhám [17].
Malik và cs (2012) đã đánh giá đa dạng di truyền cam (Citrus sinensis (L.)
Osbeck) giống cây của Ấn Độ bằng chỉ thị RAPD. Sử dụng 20 mồi ngẫu nhiên và
22 giống C. sinensis để phân tích về hình thái và di truyền. Tổng cộng có 99 băng
đƣợc tạo ra, trong đó có 51 băng đa hình (chiếm 51,83%). Mức độ đồng dạng di
truyền đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,48-1,00 (trung bình 0,77) cho
thấy giữa các giống có mức độ đa dạng di truyền thấp mặc dù có sự biến đổi về hình
thái cao. Cây phân loại tách các giống thành 2 nhóm chính, trong đó 2 giống Delta
Valencia và Sweet Orange cho thấy sự khác biệt với các giống còn lại. Một số mồi
tạo ra các băng đặc biệt có thể sử dụng để nhận biết các giống. Nghiên cứu này chỉ
ra sự đa dạng di truyền thấp trong các giống C. sinensis, và có thể giải thích bởi
thực tế có nhiều sự thay đổi kiểu hình do một số đột biến soma [23].
Naz và cs (2014) đã tiến hành nghiên cứu tính chất phân tử và mối quan hệ di
truyền giữa các giống Citrus khác nhau ở Pakistan. Mối quan hệ di truyền giữa 17
giống cam, quýt thƣơng mại quan trọng, bao gồm những giống địa phƣơng và một
số giống lai đã đƣợc đánh giá bằng kỹ thuật RAPD với 15 mồi đƣợc lựa chọn trong
số 25 mồi. Tổng số 188 băng với 153 băng đa hình, trung bình 13 băng mỗi mồi. Hệ
số Jaccard đã đƣợc sử dụng để phân tích sự tƣơng đồng di truyền hoặc không giống
nhau giữa các giống. Cây phân loại đã tách 17 giống cam quýt thành 4 cụm chính,
giá trị tƣơng đồng di truyền quan sát thấy là 0,66 với hai giống Kinnow và kinnow
không hạt (Mandarin), và hai giống Meiwa và Marumi (quất) cho thấy giá trị khác
biệt tối đa (0,85). Sự khác biệt về di truyền giữa các giống cam quýt cao nghiên cứu
này cho thấy rằng chúng không có nguồn gốc tƣơng tự nhau [30].
Rima El-Mouei và cs (2011) đã nghiên cứu về đặc điểm và ƣớc lƣợng về tính
đa dạng di truyền trong các giống Citrus gốc ghép bằng sử dụng 10 microsatellite
và 17 mồi RAPD. Các phân tích DNA cho biết các đặc tính của tất cả các mẫu và

15
phát hiện các mức độ khác nhau về tính đa hình di truyền. Chỉ thị cụ thể, phân biệt
gốc ghép, đã đƣợc các định và có thể sử dụng nhƣ là điểm đánh dấu hỗ trợ trong
việc nhân giống. Sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các gốc ghép có giá trị
cao nhất trong cam chua và thấp nhất ở quýt Cleopatra.
Dữ liệu dựa trên chỉ thị SSR và RAPD đã đƣợc sử dụng để ƣớc tính sự khác
nhau về di truền và thiết lập cây di truyền phản ánh mối quan hệ giữa các gốc ghép
khác nhau. Kết quả phân tích RAPD: sử dụng 17 mồi để phân tích 31 mẫu, thu đƣợc
143 băng; trong đó có 119 băng đa hình và 24 băng đơn hình. Số lƣợng các băng
dao động từ 4 ( mồi OPS-04) đến 12 (mồi OPB-20) với mức trung bình 8,4 băng
mỗi mồi. Mức độ đa hình cao với các cặp mồi khác nhau, nó dao động từ 40%
(OPB-04, OPE-13) đến 100% (OPM-08, OPK-03 và OPG-14). Phân tích
Microsatellite: 10 mồi SSR đƣợc dùng trong nghiên cứu này đã thành công ở tất cả
các kiểu gene và phát hiện đa hình giữa các gốc ghép Citrus Syria; tổng số alen
đƣợc tạo ra bởi 10 mồi là 48 alen, khoảng từ 2 alen (Org-8, Org-29 và Org-31) đến
9 alen (Org-23) mỗi locus, với trung bình 4,8 alen/locus; số lƣợng cao nhất của các
alen (22) đã đƣợc phát hiện ở ba lá trong một cuống trong khi số thấp nhất (16)
đucợ phát hiện ở quýt Cleopatra; giá trị đa hình cao nhất ở cặp mồi Org-20 (0,77)
và tối thiểu (0,39) ở cặp mồi Org-8.
Chỉ thị cụ thể và đa dạng di truyền: mồi cụ thể đã đƣợc xác định trong nghiên
cứu này, nó tạo ra các đoạn đặc biệt và cụ thể hoặc alen trong một kiểu gene rõ
ràng; sự đa dạng di truyền đƣợc đánh giá cho mỗi gốc ghép, giá trị thấp nhất phát
hiện ở Sanki trong khi cao nhất ở cam chua. Phân tích phát sinh loài: các thông tin
dựa vào dữ liệu RAPD và SSR đã sử dụng để tính toán sự giống nhau và khoảng
cách di truyền giữa các gốc ghép khác nhau, các giá trị thu đƣợc đƣợc sử dụng để
thiết lập cây di truyền tạo ra bởi UPGMA cho thấy rằng tất cả các gốc ghép đƣợc
phân loại thành 2 nhóm chính, đầu tiên là của P. trifoliata và các giống lai của nó;
và bao gồm các phần còn lại của gốc ghép, nhánh thứ hai đƣợc chia thành các nhóm
riêng biệt, đầu tiên gồm các kiểu gene của cam quýt chua (M. sanki và M.

cleopatra) và cụm thứ hai là tập hợp phần còn lại của các kiểu gene [33].


16
Baig và cs (2008) đã nghiên cứu về đặc tính phân tử và phân tích tính đa dạng
di truyền của cây có múi bằng kỹ thuật RAPD. Trong số 40 mồi, 25 mồi đã đƣợc
lựa chọn để đánh giá tƣơng đồng di truyền và mối quan hệ của 18 cây có múi, trong
đó có 13 loài và 5 giống lai. Tạo ra 250 băng có 231 băng đa hình và một số loài
hoặc chỉ thị RAPD cụ thể cho giống đó. Hệ số Jaccard đƣợc sử dụng để tính toán sự
tƣơng đồng di truyền. UPGMA sử dụng để tạo ra cây di truyền tách biệt rõ ràng
Jatti-Khatti từ tất cả các cụm lớn với hệ số tƣơng đồng 0,61. Giá trị tƣơng đồng di
truyền trung bình quan sát trên tất cả các kiểu gene là 0,63; với hai giống cam ngọt
Jaffa và Blood red cho thấy sự tƣơng đồng lớn nhất (82%). Các Jatti-Khatti và King
Mandarin có di truyền đa dạng nhất. Các biến thể di truyền giữa các giống khá cao
cho thấy nguồn gốc khác nhau của chúng [12].
Ebtsam M. Hamza (2013) đánh giá đa dạng di truyền của một số giống cây
Citrus ở Ai Cập dựa vào chỉ thị microsatellite và RAPD. Sử dụng 2 chỉ thị này để
phân tích 19 cây Citrus trồng ở Ai Cập. Phân tích RAPD với 9 mồi cho tổng số 71
băng, trong đó 49 băng đa hình. mặt khác, đánh dấu microsatellite cho kết quả 37
alen từ 8 cặp mồi SSR. SSR và RAPD đã đƣa ra một số băng và alen cụ thể cho
phép phân biệt giữa cây trồng và một số giống. Phân tích phát sinh loài đã chứng
minh sự tƣơng đồng di truyền và mối quan hệ giữa 5 giống thuộc Citrus phân tích,
hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng 0,626 – 0,879. Cam chua, chanh
tây Rangpur, chanh Volkamer và macrophylla đƣợc xếp cùng 1 nhóm và cụm khác
gồm quýt và Citrang Troyer. Trong khi đó Citrang C35 và quýt Balady ở nhóm
khác. kết quả này có thể là do nguồn gốc của các giống cây trồng và chứng minh ý
kiến cho rằng quýt là bố mẹ của cam chua và sau đó là bố mẹ của chanh Volkamer
và tất cả các giống quýt có thể đƣợc bắt nguồn từ sự lai tạo của nó hoặc lai chéo với
các loài Citrus khác. Nếu không, giống quýt có thể đƣợc tạo ra từ đột biết của loài
quýt thực. Chỉ thị RAPD và SSR có thể đƣợc sử dụng hiệu quả trong các định gene

trong quá trình nhân giống 18].
Bastianel và cs (2001) đã sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá sự tƣơng đồng về
mặt di truyền của 15 giống Citrus ở Brazil, gồm 4 giống cam ngọt (C. sinensis