Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm (LV thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------------------------

NGUYỄN THỊ HIỆP

ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI THÀNH
THỤC VÀ NỒNG ĐỘ TINH TỚI KHẢ NĂNG HÌNH
THÀNH TIỀN NHÂN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI
LỢN THU TINH ỐNG NGHIỆM

Chuyên ngành: Động vật học

Hà Nội - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện, các
số liệu trong luận văn là trung thực và chính xác.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc
cảm ơn đầy đủ, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hiệp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN!

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Linh,
chủ nhiệm đề tài, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi
để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Bùi Xuân
Nguyên, TS. Nguyễn Thị Ƣớc, những ngƣời thầy đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn
tôi trong công việc chuyên môn cũng nhƣ những kinh nghiệm trong cuộc sống.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán bộ nghiên cứu
Phòng Công nghệ Phôi đặc biệt là TS. Nguyễn Văn Hạnh, Ths. Nguyễn Thị
Hồng, Ths. Nguyễn Thị Nhung, CN. Nguyễn Văn Lâm đã nhiệt tình giúp đỡ,
ủng hộ và góp ý để tôi hoàn thành luận văn này.
Luận văn đƣợc hoàn thành với sự tài trợ của Quỹ Phát triển khoa học và
công nghệ quốc gia trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng của giọt
noãn bào chất đơn tính lên sự hoạt hóa trứng và sự phát triển của phôi” mã số
106.12-2012.93 do TS. Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm.
Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện về
thủ tục hành chính để tôi bảo vệ luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, những ngƣời đã
luôn sát cánh, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

11

tháng

11 năm 2014

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Nguyễn Thị Hiệp
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... .v
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ …vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... ..viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề..................................................................................................... 1
1.2 Mục đích....................................................................................................... 2
1.3 Ý nghĩa ......................................................................................................... 3
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4
2.1

Sự hình thành và phát triển tế bào trứng lợn ............................................ 4

2.1.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng.................................................. 4
2.1.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng ......................................... 6

2.1.3 Sự thành thục của tế bào trứng .............................................................. 9
2.2 Thụ tinh ống nghiệm ở lợn ......................................................................... 10
2.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm và các giai đoạn của quá trình thụ tinh
....................................................................................................................... 10
2.2.2 Sự thành thục tế bào trứng lợn trong ống nghiệm ............................... 13
2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn ............. 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.3 Tình hình nghiên cứu nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm (IVM/IVF) ở
Việt Nam .......................................................................................................... 26
PHẦN III. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 29
3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu.............................................................. 29
3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu .............................................. 29
3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi ............................................ 29
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................ 32
3.4.1 Chuẩn bị môi trƣờng thu và rửa buồng trứng ...................................... 32
3.4.2 Phƣơng pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng..................... 33
3.4.4 Phƣơng pháp phân loại chất lƣợng trứng............................................. 35
3.4.5 Phƣơng pháp đánh giá thành thục sau khi nuôi ................................... 37
3.4.6 Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF).......... 38
3.4.7. Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng phôi nang ..................................... 42
3.4.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 43
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 43
4.1 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới sự thành thục của tế bào trứng lợn... 44
4.2 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng lợn. ... 48
4.3 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển của phôi lợn
thụ tinh ống nghiệm ......................................................................................... 50

4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới kết quả thụ tinh trong ống nghiệm ở lợn
54
4.5 Ảnh hƣởng của nồng độ tinh sự phát triển và chất lƣợng của phôi lợn.... 63
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 70
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




5.1. Kết luận ..................................................................................................... 70
5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 71
DANH MỤC BẢNG

Tên bảng

Trang

Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng
thành thục của tế bào trứng lợn
Bảng 4.2 . Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng
hình thành tiền nhân đực của tế bào trứng lợn.
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát
triển tiếp theo của tế bào trứng lợn
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của
tinh trùng với trứng loại A
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của
tinh trùng với trứng loại B1
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của
tinh trùng với trứng loại B2
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo

của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo
của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B1
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo
của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

43

47

49

53

56

57

61

62

63




DANH MỤC HÌNH

Tên hình

Trang

Hình 2.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng lợn

5

Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng

6

Hình 3. 1. Buồng trứng lợn lai kinh tế

33

Hình 3.2 Trứng lợn loại A, B1, B2

35

Hình 4.1 Trứng lợn ở giai đoạn GV (a) và giai đoạn MI.

44

Hình 4.2 Trứng lợn ở giai đoạn thành thục

45

Hình 4.3-a Tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng, 4.3-b Tế bào trứng

55

lợn đa thụ tinh
Hình 4.4 Phôi ở giai đoạn 4 tế bào (a) và giai đoạn phôi dâu (b)

65

Hình 4.4. Phôi nang (Blastocyst)

66

Hình 4.5 Số tế bào/phôi nang

67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Tên biểu đồ

Trang

Biểu đồ 4.1. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng xâm nhập

58

của tinh trùng
Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành

59

tiền nhân
Biểu đồ 4. 3. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng thụ tinh

60

bình thƣờng của tế bào trứng lợn.
Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng phân chia

64

của tế bào trứng lợn
Biểu đồ 4.5. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành

65

phôi nang
Biểu đồ 4.6. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới chất lƣợng phôi nang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



66

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt
DMSO

Tiếng Anh
Dimethyl Sulfoxide
Equine Chorionic

ECG

Gonadotropin

Nghĩa tiếng Việt
Chất bảo quản lạnh
Gonadotropin nhau thai ngựa
Yếu tố thúc đẩy tăng trƣởng

EGF

Epidermal growth factor

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh bào thai bê

FM

Fertilization medium

Môi trƣờng thụ tinh

FSH

Follicle stimulating hormone

Hormone kích thích nang trứng

GSH

Glutathione

GV

Germinal vesicle

Giai đoạn bóng mầm

GVBD

Germinal Vesicle Break Down

Giai đoạn tan bóng mầm

HCG

Human Chorionic

Gonadotropin

biểu mô

Gonadotropin nhau thai ngƣời

IVC

In vitro Culture

Nuôi phôi

IVF

In vitro fertilization

Thụ tinh ống nghiệm

IVM

In vitro muaturation

Thành thục ống nghiệm

LH

Luteinsing Stimulating
hormone
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hormone thể vàng




MI

Metaphase I

Trung kỳ I

MII

Metaphase II

Trung kỳ II

MPN

Male pronuclear

Tiền nhân đực

NCSU 23

NCSU 37

North Carolina State
University 23
North california state

university 37

NST

Môi trƣờng nuôi trứng, phôi
Môi trƣờng nuôi trứng, phôi
Nhiễm sắc thể

pFF

Porcine follicle fluid

PMSG
TCM

Pregnant mare’s serum
gonadotropin
Tissue Culture Medium

Dịch nang trứng lợn
Huyết thanh ngựa chửa
Môi trƣờng nuôi cấy

TN

Thí nghiệm

tt/ml

Tinh trùng/ml

TTON

Thụ tinh ống nghiệm

vcs

Và cộng sự

ZP

Zona pellucide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Màng trong suốt




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cuộc cách mạng khoa học công nghệ trong sinh học sinh sản mở đầu với
các công nghệ trong lĩnh vực thụ tinh nhân tạo và cấy chuyển phôi trong suốt thế
kỷ 20, đƣợc tiếp tục với nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm (IVM),

thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF), kích hoạt sinh sản vô tính
(trinh sản – parthenogenetic), nuôi phôi ống nghiệm và nhân bản các động vật
bản địa bằng cách chuyển nhân từ các tế bào sinh dƣỡng. Các công nghệ này
góp phần nâng cao năng suất sinh học vật nuôi, bảo tồn đa dạng sinh học.
Lợn đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho con
ngƣời. Ngoài ra, lợn còn có sự tƣơng đồng với con ngƣời về giải phẫu, di truyền
học, sinh lý học (Meuren vcs., 2012) [40]. Do đó, việc tạo ra các sản phẩm phôi
ống nghiệm ở lợn kết hợp với chuyển gene sẽ tạo ra nhiều cơ hội cho việc sử
dụng động vật biến đổi gene nhƣ là thiết bị kiểm tra các phản ứng sinh học của
sản phẩm dƣợc, con cho trong ghép mô khác loài, các dòng tế bào gốc phôi hay
là sử dụng làm mô hình trong nghiên cứu các bệnh ở ngƣời (Nguyễn Thị Ƣớc
vcs, 2008; Katska, 2006) [7, 25]. Hơn nữa, sự phát triển của các công nghệ in
vitro cho phép tạo ra các sản phẩm tế bào trứng thành thục và phôi với số lƣợng
lớn, giá thành thấp hơn so với các sản phẩm tạo ra trong cơ thể.
Kỹ thuật nuôi thành thục trứng lợn trong ống nghiệm (IVM) sử dụng
những tế bào trứng chƣa thành thục thu từ các nang trứng trên bề mặt buồng
trứng. Điều này cho phép khai thác tiềm năng noãn khổng lồ của buồng trứng
lợn. Hơn nữa, thời gian cho sự thành thục của tế bào trứng lợn và ngƣời là tƣơng
tự nhau. Vì vây, nghiên cứu IVM ở lợn là nền tảng ý tƣởng cho kỹ thuật IVM ở
ngƣời. Thành thục trứng bao gồm những thay đổi quan trọng trong nhân và tế
bào chất của trứng. Thành thục nhân xảy ra trong suốt quá trình nối lại giảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




phân. Thành thục tế bào chất cần thiết cho sự thành công của quá trình thụ tinh
và sự phát triển của phôi. Sự thành thục tế bào chất không hoàn toàn của tế bào
trứng xảy ra giải thích cho những vấn đề chính của sự thụ tinh và sự phát triển
của phôi (Melanie, 2007) [39]

Thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization) là một trong những kỹ thuật
chủ yếu tạo phôi ống nghiệm. Con lợn đầu tiên sinh ra từ kỹ thuật này đƣợc
công bố bởi Cheng vcs, 1986. Tiếp theo đó, Matiolli vcs., 1989 công bố về khả
năng phát triển in vitro của trứng lợn thành thục, thụ tinh ống nghiệm. Thụ tinh
ống nghiệm ở lợn bị thách thức bởi hiện tƣợng đa tinh trùng. Hiện tƣợng này
xảy ra ở lợn nhiều hơn so với các loài động vật khác, ngay cả khi thụ tinh trong
cơ thể dƣới các điều kiện thực nghiệm đa dạng (Hunter, 1990) [23]. Mặc dù các
kỹ thuật về thành thục ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm ở lợn đã đƣợc cải thiện
dần dần trong những năm gần đây, tỷ lệ đa tinh trùng cao ở lợn vẫn là một trong
những vẫn đề chính trong hệ thống thụ tinh ống nghiệm ở lợn (Abeydeera, 2001)
[9]
Nhƣ vậy, hai vấn đề chính cần khắc phục để đảm bảo sự thành công trong
thụ tinh ống nghiệm ở lợn là sự không thành thục tế bào chất của trứng lợn và
hiện tƣợng đa tinh trùng. Ở Việt Nam, đây cũng là một trở ngại lớn dẫn đến hiệu
suất thấp trong thụ tinh ống nghiệm. Việc lựa chọn môi trƣờng nuôi thành thục
và nồng độ tinh tối ƣu là điều kiện tiên quyết dẫn đến sự thành công trong thụ
tinh ống nghiệm ở lợn. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Ảnh hƣởng của môi
trƣờng nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự
phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm”
1.2 Mục đích
Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thành thục, sự hình
thành tiền nhân và sự phát triển của tế bào trứng lợn thụ tinh ống nghiệm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân
và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm
1.3 Ý nghĩa

Góp phần tạo nguồn nguyên liệu trứng lợn thành thục phục vụ cho các
nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực công nghệ Phôi trên động vật có vú, đặc biệt
là lợn.
Góp phần hoàn thiện hệ thống TTON trong điều kiện ở Việt Nam. Cung
cấp nguồn nguyên liệu tế bào phôi chất lƣợng tốt phục vụ cho các nghiên cứu
tiếp theo đặc biệt là theo hƣớng y sinh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1Sự hình thành và phát triển tế bào trứng lợn
2.1.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng
Sự hình thành và phát triển nang trứng ở động vật có vú đƣợc chia làm ba
giai đoạn: Từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp, nang thứ cấp và
cuối cùng là nang trứng thành thục (De Graff).
Nang nguyên thủy sinh ra từ biểu mô mầm chỉ có ở cơ thể con vật trong
giai đoạn bào thai. Phân chia nguyên phân của tế bào mầm bắt đầu từ ngày thứ
13 của phôi cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh. Sau khi con vật đƣợc sinh ra thì các
nang nguyên thủy sẽ phát triển thành nang thứ cấp. Nang nguyên thủy thƣờng
bao gồm một tế bào trứng (ovocyt I) và đƣợc bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng,
dẹt. Số lƣợng nang nguyên thủy của lợn rất lớn khoảng 12000 - 86000 nang.
Nang sơ cấp: bao gồm một ovocyt I có đƣờng kính khoảng 30 - 60 m,
nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngoài đƣợc bao bọc bởi một lớp tế bào nang
mỏng. Hạt Balliani là thể noãn đặc biệt: có tính ƣa axit, dạng hạt nhỏ, đóng vai
trò quan trọng trong việc hình thành noãn hoàng. Nang nguyên thủy và nang sơ
cấp là những nang trứng không có xoang nang.
Nang thứ cấp đƣợc hình thành từ sự phát triển của nang sơ cấp, gồm một

ovocyt I đã phát triển lớn hơn, chứa nhiều noãn hoàng hơn. Vỏ của ovocyt I dầy
lên tạo thành màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh.
Nang trứng thành thục (Nang De Graff) do nang thứ cấp phát triển thành
gồm một ovocyt I có đƣờng kính 120 – 150 m, có nhiều noãn hoàng hơn,
nhân to, tròn, rõ, vẫn còn hạt Balliani. Bao quanh tế bào trứng là màng trong
suốt, bên ngoài màng trong suốt là vành phóng xạ. Xung quanh hai bên của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ovocyt I là phần tế bào hạt dày lên để giữ tế bào trứng gọi là đĩa trứng. Nang
trứng thành thục có hai lớp vỏ: lớp vỏ bên ngoài mỏng, lớp vỏ bên trong dày
hơn có chứa các mạch quản, lót trong màng trong là lớp tế bào hạt (lớp tế bào
màng hạt). Giữa lớp màng hạt và màng phóng xạ của trứng là xoang nang chứa
dịch nang có hormone estrogen và protein. Lợn là loài động vật đa thai sinh sản
không theo mùa, một chu kỳ rụng trứng thì có nhiều trứng rụng vì vậy có nhiều
nang trứng thành thục cùng phát triển trong một chu kỳ.
Trong quá trình phát triển từ nang không có xoang thành nang có xoang
trứng đƣợc di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, sau khi từ nang có
xoang phát triển thành nang trứng thành thục thì trứng lại ra bề mặt buồng trứng
để chuẩn bị cho sự rụng trứng.
Giải phẫu miền vỏ buồng trứng của một gia súc cái có hoạt động sinh sản
(Hình 2.1) [59] cho ta thấy nang trứng ở các giai đoạn phát triển khác nhau.
Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy
chúng tách rời và hình thành xoang. Khi xoang đƣợc hình thành tế bào trứng
tiếp tục phát triển cho đến khi thành thục và rụng ra khỏi buồng trứng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hình 2.1 Sự hình thành và phát triển nang trứng lợn
2.1.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng
Cấu tạo buồng trứng
Quá trình hình thành tế bào trứng xảy ra ở lớp vỏ của buồng trứng từ
những noãn bào nguyên thủy đƣợc phân bố vùng ngoại biên. Ở lợn, noãn bào
nguyên thủy đƣợc hình thành từ những biểu mô phôi thai khi cơ thể vẫn còn
trong giai đoạn bào thai. Những nang nguyên thủy này đạt 5000 ở thời điểm sinh
(Black và Ericsion, 1968) [14] và giảm xuống 420.000 ở thời điểm thành thục về
tính (Gosden và Telfer, 1987) [20]. Một số nang nguyên thủy có thể phát triển
thành nang sơ cấp hoặc nang có xoang ở ngày 70 sau khi sinh.

Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng

Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng [58]
Trứng là loại tế bào lớn nhất trong cơ thể chỉ mang n nhiễm sắc thể, có
dạng hình cầu (hình 2.2), ở lợn trứng có đƣờng kính từ 0,12 - 0,17 mm.
Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: Nhân, nguyên sinh chất và màng bao
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




 Nhân: bao gồm lƣới nhiễm sắc thể và nhiều hạt nhân
 Phần nguyên sinh chất: Bao gồm các thành phần chủ yếu là nƣớc, vật chất
hữu cơ, muối khoáng và các vật chất khác.
 Màng: Bao gồm ba lớp màng từ trong ra ngoài: Màng trong, mang giữa và
màng ngoài.

o

Lớp màng trong: Là lớp màng mỏng bao bọc nguyên sinh chất, còn
đƣợc gọi là màng noãn hoàng hay là màng nguyên sinh chất. Màng
này có tác dụng nuôi dƣỡng tế bào trứng đã thụ tinh. Trong màng có
chứa men Muraminidaza.

o

Lớp màng giữa (màng trong suốt): Bao gồm nhiều tế bào, đƣợc sinh ra
từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dƣỡng tế bào trứng. Tác dụng chủ yếu
của màng này là đảm bảo dinh dƣỡng cho tế bào trứng trong buồng
trứng và ngăn không cho tình trùng khác loài có thể đi vào nhân trong
quá trình thụ tinh do trong màng chứa mem Zonalizin đặc hiệu cho
từng loài. Giữa màng trong suốt và màng nguyên sinh chất một khoảng
trống. Khoảng trống này có độ dày khoảng 14 - 24 m, có độ pH 3 - 5,
chứa dịch có nồng độ ion cao.

o

Lớp màng ngoài: Bao gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp.
Những tế bào này đƣợc phân bố xung quanh tế bào trứng nên đƣợc gọi
là màng phóng xạ, hay màng tia. Các tế bào này liên kết với nhau bởi
axít Hyaluronilic. Khi tinh trùng gặp trứng ở phần acrosom (phần đầu
tinh trùng) tiết ra men Hyaluronidaza để phân giải và thủy phân axít
Hyaluronilic làm cho màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện cho quá
trình thụ tinh xảy ra.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Ngoài cùng là lớp tế bào hạt cùng với lớp màng phóng xạ, lớp tế bào hạt
tạo nên cho tế bào trứng lớp tế bào cumulus có vai trò rất quan trọng tới sự phát
triển và chất lƣợng của trứng thành thục
Quá trình phát triển từ noãn bào nguyên thủy đến hình thành trứng trải
qua ba giai đoạn.
Giai đoạn tăng số lƣợng noãn nguyên bào: Nhờ quá trình nguyên phân
liên tiếp nhiều lần mà số lƣợng noãn nguyên bào đƣợc tăng lên. Do cơ chế của
quá trình nguyên phân nên các noãn bào đƣợc hình thành đều mang bộ nhiễm
sắc thể là 2n và đƣợc bao bọc bởi lớp tế bào biểu mô. Giai đoạn này diễn ra khi
cơ thể con cái chƣa thành thục về tính. Đến khi cơ thể thành thục thì các noãn
nguyên bào sẽ lần lƣợt đƣợc phát trình thành trứng thành thục.
Giai đoạn sinh trƣởng: Noãn nguyên bào tích lũy chất dinh dƣỡng, tăng
kích thƣớc và khối lƣợng hình thành nên các noãn bào sơ cấp và noãn bào cấp I,
tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n.
Giai đoạn hình thành trứng: Nhờ cơ chế giảm phân noãn bào cấp I giảm
phân thông qua hai lần phân bào liên tiếp.
- Lần phân bào I: Noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II
(Noãn bào thứ cấp) có khối lƣợng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàn của
noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kích thƣớc bé (cực cầu thứ nhất)
- Lần phân bào II: Noãn bào cấp II phân chia hình thành tế bào trứng lớn
và cực cầu bé thứ hai. Trong lúc đó cực cầu bé thứ nhất cũng phân chia
thành hai cực cầu bé.
Kết quả sau quá trình giảm phân từ một noãn bào cấp I cho một trứng lớn
và ba cực cầu bé. Trứng và cực cầu bé đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội n.
Trứng có khối lƣợng và kích thƣớc lớn vì đã nhận toàn bộ khối noãn hoàng từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

noãn bào cấp I điều đó có ý nghĩa phát triển của trứng, kết thúc giai đoạn giảm
phân thì trứng thành thục.
2.1.3 Sự thành thục của tế bào trứng
Sau khi trải qua quá trình hình thành và đạt đƣợc kích thƣớc cực đại,
trứng sẽ chuyển sang giai đoạn thành thục. Sự thành thục của tế bào trứng bao
gồm thành thục nhân và thành thục tế bào chất.
Thành thục nhân: Là quá trình nối lại giảm phân và đạt tới giai đoạn trung
kỳ II. Trong noãn hoàng chuẩn bị thành thục, nhân có kích thƣớc rất lớn và đƣợc
gọi là túi phôi (Germinal Vesicle - GV). Sau khi bị kích thích bởi các kích dục
tố hoặc điều kiện thích hợp của môi trƣờng nuôi thành thục in vitro, nhân lại
nhanh chóng tiếp tục các kỳ của quá trình giảm phân (Meiosis). Kết thúc quá
trình giảm phân I hình thành nên hai tế bào: Tế bào thứ nhất gồm có nhân và
một chút tế bào bào chất tách ra khỏi noãn bào và nằm ngoài màng sinh chất
nhƣng bên trong màng trong suốt đƣợc gọi là thể cực thứ nhất. Tế bào thứ hai là
noãn bào II. Noãn bào này sẽ bị kìm hãm ở kỳ giữa của lần phân bào giảm
nhiễm thứ hai (giai đoạn Metaphase II) cho đến khi thụ tinh (Nguyễn Mộng
Hùng, 2000) [4]. Sự thành thục của nhân trứng bắt đầu bằng việc tan biến màng
(GVDB), các nhiễm sắc thể đặc lại, điển hình là sự xuất hiện của thể cực thứ
nhất và nhiễm sắc thể ở trạng thái metaphase II.
Quá trình thành thục tế bào chất: Tế bào chất là nơi quan trọng trong việc
tổng hợp các protein thiết yếu, chuẩn bị các điều kiện cho noãn bào có thể thụ
tinh và phát triển phôi sớm. Biểu hiện của sự thành thục tế bào chất là việc tăng
sinh các thể hạt (Mitochondries), xuất hiện thể Golgi, có sự di chuyển các hạt vỏ
(Granules corticales) tới chu vi noãn bào ngay dƣới màng dịch tƣơng. Những hạt
này chứa Ovoperpxidase có tác dụng ngăn không cho nhiều tinh trùng có thể
xâm nhập vào một trứng (ngăn chặn hiện tƣợng đa tinh trùng)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Quá trình thành thục màng noãn bào: Gồm toàn bộ các quá trình cho phép
tinh trùng chấp nhận riêng biệt noãn bào. Màng trong đƣợc tổng hợp ở giai đoạn
tăng trƣởng, đóng vai trò quan trọng trong quá trình thụ tinh, màng có tác dụng
chỉ cho tinh trùng có khả năng thụ tinh mới đƣợc xâm nhập vào noãn bào, tạo
điều kiện thích hợp cho sự phối hợp giữa tinh trùng và trứng, bảo vệ noãn bào
không bị thụ tinh đa tinh trùng. Vùng trong (Zone pellucide) gồm 95% của ba
gycoprotein đƣợc cấu tạo thành các sợi dài hợp nhất: ZP1, ZP2, ZP3. Chỉ có
ZP3 đƣợc tinh trùng chấp nhận và có phản ứng thể đỉnh (Acrosomique). ZP2 có
tác dụng cố định tạm thời đầu tinh trùng trong quá trình thụ tinh (khi tinh trùng
đi qua vùng trong). ZP1 chiếm ít nhất khoảng 10% có tác dụng bảo đảm độ bền
vững của vùng trong cho đến giai đoạn phôi bào.
2.2 Thụ tinh ống nghiệm ở lợn
2.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm và các giai đoạn của quá trình thụ tinh
Thụ tinh ống nghiệm cho động vật có vú lần đầu tiên đƣợc tiến hành trên
thỏ năm 1954 từ những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh (trong tử cung)
với những noãn bao mới rụng. Đến năm 1959, M.C. Chang đã thành công trong
việc tạo ra những con thỏ thụ tinh ống nghiệm đầu tiên. Điều này thể hiện tính
chất bình thƣờng sinh học của kỹ thuật thụ tinh in vitro. Thụ tinh ống nghiệm đã
đƣợc tiến hành thành công trên nhiều loài động vật có vú thể hiện qua sự đánh
giá mô bào hoặc sự phân chia của trứng nhƣ trên thỏ (1954), chuột đồng (1964),
chuột nhắt (1968), ngƣời (1969), bò (1980), ngựa (1989). Trong đó, sự thành
công của kỹ thuật thụ tinh in vitro ghi nhận bằng việc sinh ra con non đƣợc ghi
nhận ở các loài nhƣ thỏ (1959), ngƣời (1978), bò (1981), dê (1985), cừu, lợn
(1986) và ngựa (1990). Các giai đoạn chính của quá trình thụ tinh in vitro và in
vivo có những điểm tƣơng đồng.
Các giai đoạn của quá trình thụ tinh (Nguyễn Hữu Đức, 2005) [2]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




 Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ
 Tƣơng tác tinh trùng với màng trong suốt
 Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt
 Phản ứng thể đỉnh
 Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt
 Sự dung hợp của giao tử đực và giao tử cái
 Sự hoạt hóa tế bào trứng
Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ: Ở phần lớn các loài động
vật có vú, có nhau thai, trứng thành thục in vivo hoặc in vitro đƣợc bao xung
quanh bởi nhiều lớp tế bào cumulus. Những tế bào này tạo thành một đám “ma
trận” giàu axit hyaluronic. Chỉ những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh
mới có thể đi qua đƣợc lớp tế bào cumulus này. Tất cả các tinh trùng khi tiếp
cận với vùng trong suốt đều còn acrosome nguyên vẹn. Hyaluronidaza với một
lƣợng ít ỏi liên kết với màng ngoài của tinh trùng có thể tạo cho chúng xuyên
qua lớp tế bào cumulus một cách thuận lợi.
Tƣơng tác tinh trùng với màng trong suốt: Trƣớc khi qua màng trong suốt,
tinh trùng sẽ bám vào bề mặt màng trong suốt và thực hiện phản ứng acrosome.
Vùng trong suốt đƣợc cấu tạo chủ yếu bởi các glycoprotein mà trong họ có
nhiều dạng đồng phân. Chúng đƣợc xác định ở nhiều loài khác nhau. Ba
glycoprotein chủ yếu là ZP1, ZP2, ZP3. Trong đó, ZP3 là một polypeptide, trên
nó có ghép những chuỗi oligosaccharit đặc biệt có chứa fucose và N-acetyl
glusamin. ZP2 và ZP3 liên kết với nhau để tạo nên những sợi có cầu nối với
nhau bởi ZP1, nó tạo nên cấu trúc ba chiều của vùng trong suốt.
Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt: Vùng trong suốt nhận biết và cố định
đặc hiệu các tinh trùng cùng loài khi chúng đã đƣợc kiện toàn năng lực thụ tinh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Sự kết dính này đƣợc xảy ra bởi tƣơng tác qua lại giữa các phân tử trên một
phần bề mặt của tinh trùng và vùng trong suốt của trứng. Tinh trùng khi đƣợc
gắn vào vùng trong suốt sẽ thực hiện phản ứng thể đỉnh. Điều này giúp bộc lộ
màng trong của acrosome.
Phản ứng thể đỉnh: Phản ứng thể đỉnh đƣợc đặc trƣng bởi sự dung giải
dần dần màng sinh chất và màng ngoài acrosome của tinh trùng. Quá trình này
vừa hình thành những bọng của màng, mặt khác tạo ra những lỗ trống để cho
các chất chứa trong acrosome giải phóng ra ngoài. Phản ứng thể đỉnh xảy ra rất
nhanh và phụ thuộc vào nồng độ của ion Ca2+. Phản ứng này luôn kèm theo việc
tăng nồng độ Ca2+ nội bào và không thể thực hiện trong môi trƣờng thiếu Ca2+
Cảm ứng phản ứng thể đỉnh bởi màng trong suốt của trứng: Ở nhiều loài
giai súc, vùng trong suốt bị hòa tan có cả ứng in vitro với phản ứng thể đỉnh các
tinh trùng cùng loài. ZP3 có tính hai mặt chức năng, một mặt nó đảm bảo cho sự
gắn kết tinh trùng, mặt khác nó phát động phản ứng thể đỉnh của nó. Sự gắn kết
của phối tử ZP3 vào thể tiếp nhận của tinh trùng đã phát động những phân tử
vào những tế bào dẫn đến phản ứng thể đỉnh và nhất là luồng Ca2+ vào là một
trong những chặng đầu của đợt phản ứng.
Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt: Khi thực hiện phản ứng thể đỉnh,
tinh trùng thải những bọng màng lên bề mặt vùng trong suốt, sau đó chui qua
lớp vỏ bọc này theo một đƣờng chéo. Dấu vết lƣu lại trong vùng trong suốt do
tinh trùng xuyên qua là có những bờ mép rõ nét chứng tỏ sự xâm nhập của tinh
trùng đã sử dụng quá trình cơ giới hơn là quá trình enzyme….
Sự dung hợp của giao tử đực và giao tử cái: Sau khi vƣợt khỏi vùng trong
suốt, tinh trùng đi vào khoảng trống quanh noãn hoàng và đi vào tiếp xúc với
màng trong suốt noãn bào. Lúc này nó ngừng chuyển động và hai giao tử dung

hợp. Sự dung hợp xảy ra giữa màng sinh chất bao quanh đai xích đạo của tinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




trùng và màng sinh chất của noãn bào. Màng sinh chất của tinh trùng hòa trộn
với màng sinh chất của noãn bào khi dung hợp. Còn màng trong acrosome thì
hòa trộn trong bào tƣơng noãn bào cùng với nhân tinh trùng.
Sự hoạt hóa tế bào trứng : Noãn bào đƣợc tinh trùng hoạt hóa kèm theo
những biến đổi về trao đổi chất cũng nhƣ những thay đổi quan trọng của tế bào.
Mặc dù những cơ chế ở mức độ phân tử xảy ra trong hoạt hóa còn chƣa đƣợc
hiểu cặn kẽ ở các loài động vật có vú nhƣng ngƣời ta biết rằng thế năng truyền
qua màng và suy huy động hàng loạt Ca2+ nội bào tạo ra những bƣớc ban đầu
của quá trình hoạt hóa trứng. Các biểu hiện ở mức tế bào đi theo sự hoạt hóa: sự
xuất bào của những hạt lớp vỏ, hoàn thành phân chia giảm nhiễm lần hai và
những biểu hiện đặc điểm lớp vỏ của trứng đều đƣợc xác định khá rõ.
Khả năng phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm sau khi thành thục
in vitro đã đƣợc khẳng định ở lợn (Kikuchi vcs., 2002; Mattioli vcs., 1989;
Yoshida vcs., 2003) [28, 37,56] . Tuy nhiên, hiệu suất tạo phôi in vitro ở loài lợn
vẫn khá thấp so với hiệu suất in vivo (Kikuchi vcs., 1999) [29], cũng nhƣ hiệu
suất in vitro ở các loài động vật nuôi và động vật thí nghiệm khác nhƣ bò hay
chuột, mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu với mục đích cải tiến chất lƣợng phôi.
Trong những năm vừa qua, hệ thống nuôi phôi in vitro (IVC) đã đƣợc cải thiện
đáng kể. Tuy nhiên, hệ thống nuôi thành thục trứng (IVM) và TTON vẫn còn
những hạn chế chƣa giải quyết đƣợc. Đó là vấn đề thành thục noãn bào chất
chƣa đầy đủ và vấn đề đa thụ tinh.
2.2.2 Sự thành thục tế bào trứng lợn trong ống nghiệm
Quá trình thành thục in vitro là quá trình sử dụng các môi trƣờng và điều
kiện nhân tạo cần thiết cho các trứng ban đầu chƣa thành thục sau khi nuôi sẽ

thành thục, có khả năng thụ tinh và phát triển sau thụ tinh. Đây là bƣớc tiến căn
bản có ảnh hƣởng trực tiếp tới chất lƣợng trứng, khả năng thụ tinh và sự phát
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




triển của phôi. Cơ sở khoa học chính của quá trình thành thục in vitro là dựa vào
những hiểu biết quá trình thành thục tự nhiên (in vivo).
Sự thành thục ống nghiệm (in vitro) của tế bào trứng động vật có vú lần
đầu tiên đƣợc công bố bởi Pincus. Điều này đƣợc quan sát khi tế bào trứng
nguyên thủy của thỏ tiếp tục giảm phân một cách tự nhiên khi đƣợc giải phóng
từ nang của nó và chuyển vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp (Kay và Brian,
2003) [26]. Ở các loài động vật có vú, quá trình thành thục in vivo noãn bào
đƣợc đặt trong điều kiện tối ƣu, do đó loại trừ đƣợc các ảnh hƣởng bất lợi đến sự
phát triển và thành thục của trứng. Còn quá trình thành thục in vitro rất phức tạp
và chịu nhiều ảnh hƣởng rất nhiều của các yếu tố bên ngoài. Đã có rất nhiều các
nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về vấn đề này nhằm mục đích
giảm thiểu các yếu tố ảnh hƣởng, nâng cao chất lƣợng của trứng thành thục. Các
phƣơng pháp nuôi thành thục tế bào trứng lợn đã đạt đƣợc những kết quả tƣơng
đƣơng với các loài động vật có vú khác, 80-90% tế bào trứng lợn đạt tới giai
đoạn metaphase II sau khi nuôi thành thục ống nghiệm (IVM). Tƣơng tự nhƣ các
loài động có vú khác, một tỷ lệ lớn tế bào trứng lợn thành thục in vitro không đạt
đƣợc sự thành thục tế bào chất. Điều kiện in vitro có thể gây ra một số gián
đoạn. Sự gián đoạn này bao gồm sự di chuyển của ty thể tới lớp tế bào chất bên
trong, tổng hợp protein, dẫn truyền các tín hiệu, các ion (đặc biệt là canxi) và
các chất khác (Katska, 2006) [25]. Hậu quả của những sự gián đoạn này là sự
thành thục không hoàn toàn có thể xảy ra do sự thiết hụt của một số yếu tố cần
thiết cho sự thành thục đầy đủ của tế bào chất. Để nối lại giảm phân, điều kiện
nuôi thành thục ống nghiệm (IVM) đã đƣợc cải thiện trong những năm gần đây,

từ việc nhận ra tầm quan trọng của trạng thái oxi hóa khử và nồng độ
glutathione trong mối liên quan tới cystein trong môi trƣờng nuôi thành thục
(Nagai, 2001) [43].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN