Ảnh hưởng của kích thước và phương thức cấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi in vitro một số giống hoa cúc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======
NGUYỄN DOÃN THỊ HUYỀN

ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC,
PHƯƠNG THỨC CẤY MẪU ĐẾN
KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI IN VITRO
MỘT SỐ GIỐNG HOA CÚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến thầy giáo
PGS.TS Nguyễn Văn Đính – người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo
điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân trọng cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều
kiện để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của thầy La Việt Hồng và cô Mai Thị Hồng cùng tập thể, cán bộ Phòng thí
nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa
luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới những người thân, bạn bè đã luôn ở bên

động viên, giúp đỡ và khích lệ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 12, tháng 4, năm 2016.
Sinh viên

Nguyễn Doãn Thị Huyền


LỜI CAM ĐOAN
Khóa luận tốt nghiệp: “Ảnh hưởng của kích thước và phương thức
cấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi in vitro một số giống hoa cúc” là công
trình nghiên cứu của cá nhân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.
Nguyễn Văn Đính. Các kết quả nghiên cứu của khóa luận này là trung thực và
các thông tin trích dẫn trong khóa luận này đều được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 12, tháng 4, năm 2016.
Sinh viên

Nguyễn Doãn Thị Huyền


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6-Benzyl amino purin

KI:

Kinetin

IBA:

Indol butyric acid

GA3:

Gibberellic acid

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

Cs:

Cộng sự


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục đích và nội dung nghiên cứu ............................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn...................................................... 2

NỘI DUNG ....................................................................................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc ....................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc.......................................................................... 3
1.1.2. Vị trí phân loại........................................................................................ 3
1.1.3. Một số đặc điểm thực vật học ............................................................... 3
1.2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc ở trên thế giới và Việt Nam ................. 6
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới............................................... 6
1.2.2. Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam ............................................... 7
1.3. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro về cây hoa cúc trên thế giới và
ở Việt Nam .................................................................................................... 8
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro về cây hoa cúc trên thế giới.. 8
1.3.2. Tình hình nghiên cứu in vitro về cây hoa cúc ở Việt Nam ................. 9
1.4. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước mẫu và phương thức
cấy mẫu đến sinh trưởng của cây in vitro ................................................... 10
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 13
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 13
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................ 13
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí ngiệm ............................................................... 13
2.3.1. Thiết bị .................................................................................................. 13
2.3.2. Dụng cụ................................................................................................. 13


2.4. Môi trường nuôi cấy ............................................................................. 13
2.5. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................... 14
2.6. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 14
2.6.1. Chuẩn bị vật liệu thực vật .................................................................... 14
2.6.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm............................................................ 14
2.6.3. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 16
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 17

3.1. Tạo vật liệu khởi đầu............................................................................ 17
3.2. Đánh giá khả năng tái sinh chồi in vitro của các giống hoa cúc nuôi cấy
in vitro ......................................................................................................... 19
3.2.1. Số chồi/mẫu .......................................................................................... 19
3.2.2. Chiều cao chồi ...................................................................................... 21
3.2.3. Số lá/chồi .............................................................................................. 23
3.3. Ảnh hưởng của kích thước mẫu đến quá trình nhân nhanh chồi cúc... 23
3.4. Ảnh hưởng của phương thức cấy đến sự phát triển của chồi mới
phát sinh ...................................................................................................... 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 28


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng bề mặt của dung dịch Javen đối với đỉnh sinh
trưởng của cây hoa cúc ................................................................... 17
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến số chồi/mẫu ở một số giống cúc............ 20
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến chiều cao chồi ở một số giống cúc ........ 21
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến số lá/chồi ở một số giống cúc ................ 23
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy đến số chồi/mẫu của cây
hoa cúc ............................................................................................ 24
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của phương thức cấy đến sự phát triển của chồi cúc... 25



DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Các mẫu cúc sạch sau 4 tuần vào mẫu ............................................ 18
Hình 3.2. Sự sinh trưởng của giống cúc vàng hè sau 6 tuần ........................... 20
Hình 3.3. Sự sinh trưởng của giống cúc chi đỏ sau 6 tuần ............................. 21

Hình 3.4. Sự sinh trưởng của giống cúc đỏ cờ sau 6 tuần .............................. 22
Hình 3.5. Sự sinh trưởng của giống cúc kim cương sau 6 tuần ...................... 22
Hình 3.6. Sự sinh trưởng của giống cúc thạch bích sau 6 tuần ....................... 23
Hình 3.7. Sự sinh trưởng của chồi cúc chi đỏ ở 3 nhóm kích thước mẫu sau
6 tuần nuôi cấy ................................................................................ 25
Hình 3.8. Ảnh hưởng của phương thức cấy đến sự phát triển chồi
ở cây cúc vàng hè ............................................................................ 27


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay, khi xã hội phát triển, không chỉ chất lượng đời sống vật chất
của con người được cải thiện mà đời sống tinh thần cũng không ngừng tăng
lên, và hoa là vẻ đẹp không thể thiếu trong cuộc sống hiện đại, hoa tô điểm
cho cuộc sống, thoả mãn nhu cầu thưởng thức cái đẹp của con người. Và
trong vô vàn loài hoa, không thể không kể đến hoa cúc - một loài hoa trồng
chậu và cắt cành được rất nhiều người ưa chuộng và phổ biến trên thế giới.
Cúc đẹp không chỉ bởi màu sắc phong phú và hình dáng đa dạng mà còn ở
mùi hương kín đáo và đặc tính bền. Với các ưu thế đó, hoa cúc đang được các
nhà trồng hoa chú trọng đầu tư và phát triển [9].
Trong xu thế hội nhập, cùng với chính sách mở cửa của nhà nước, nhiều
nhà đầu tư nước ngoài không ngừng đưa vào Việt Nam những giống cúc đẹp
và có giá trị kinh tế cao. Chính vì vậy, hiện nay sản phẩm hoa cúc rất đa dạng
về chủng loại, phong phú về màu sắc. Việc xuất hiện liên tục của những giống
hoa cúc ngoại nhập, bên cạnh các giống hoa nội địa, đã giúp mở rộng sản xuất
để đáp ứng nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng. Theo đó, nhu cầu về giống
cũng tăng theo, và phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến.
Trong những năm gần đây, một trong những phương pháp hiện đại được ứng
dụng rộng rãi đó là phương pháp nhân giống in vitro bởi những ưu điểm như:

tạo ra được lượng lớn cây giống từ mô, cơ quan với kích thước nhỏ 0,1 – 10
mm; cây giống tạo ra sạch bệnh, có khả năng nhân nhanh các giống sạch
bệnh; có thể điều chỉnh khả năng tái sinh của cây theo ý muốn; hệ số nhân
giống cao, có khả năng sản xuất số lượng lớn cây trong thời gian ngắn; có thể
tiến hành quanh năm và cây giống in vitro có thể bảo quản trong một thời
gian dài trong điều kiện in vitro [2]. Quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi in

1


vitro phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như giống (yếu tố di truyền), môi trường
nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, ánh sáng… Ngoài ra, quá trình
này còn chịu ảnh hưởng của kích thước mẫu và phương thức cấy mẫu. Vì vậy,
nhằm góp phần đáp ứng nhu cầu về nguồn cây cúc giống sạch bệnh, chất
lượng cao bằng kĩ thuật in vitro, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Ảnh hưởng của kích thước và phương thức cấy mẫu đến khả năng tái
sinh chồi in vitro một số giống hoa cúc”.
2. Mục đích và nội dung nghiên cứu
2.1. Mục đích
Tạo vật liệu khởi đầu, nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước mẫu,
phương thức cấy và khả năng tái sinh chồi của 5 giống hoa cúc, góp phần vào
việc hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo vật liệu khởi đầu.
- Đánh giá khả năng tái sinh chồi của các giống hoa cúc nuôi cấy in vitro.
- Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy đến quá trình tái sinh và nhân
nhanh chồi cúc.
- Ảnh hưởng của phương thức cấy đến sự phát triển của chồi mới
phát sinh.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp, bổ sung dẫn liệu mới về kĩ
thuật nuôi cấy in vitro cây hoa cúc.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng
và hiệu quả kinh tế cao của 5 giống cúc trên.

2


NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc
1.1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc
Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp. được định nghĩa từ
Chrysos (vàng) và Anthemon (hoa) bởi Linneaus năm 1753, có nguồn gốc từ
Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước Châu Âu. Chen (1985) đã chứng minh
được rằng cúc được trồng ở Trung Quốc từ 500 năm trước công nguyên [11].
1.1.2. Vị trí phân loại
Trong hệ thống phân loại thực vật, Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978)
đã xếp hoa cúc vào lớp Hai lá mầm (Dicotyledonae), phân lớp Cúc
(Asterydae), bộ Cúc (Asterales), họ Cúc (Asteraceae), phân họ giống hoa Cúc
(Asteroidae), chi (Chrysanthemum) [1].
Bộ Cúc có một họ duy nhất là họ Cúc (Asteraceae hay compositae) được
xem là họ lớn nhất của ngành hạt kín và giới thực vật. Bao gồm 1000 chi, hơn
20000 loài, có những chi có tới 1000 loài. Họ Cúc phân bố trên khắp nơi trên
trái đất, sống được trong nhiều điều kiện khí hậu, môi trường đất đai khác
nhau. Dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhưng thân
gỗ thấp bé [8].
1.1.3. Một số đặc điểm thực vật học

Rễ: Theo Dowrick và Bayoumi (1996) rễ cúc thuộc loại rễ chùm, khả
năng ăn sâu kém, chủ yếu phát triển theo chiều ngang. Khối lượng bộ rễ lớn
do sinh nhiều rễ phụ và lông hút nên khả năng hút nước và dinh dưỡng mạnh.
Những rễ này không phát sinh từ mầm rễ của hạt mà bắt nguồn những vị trí
trên mấu của thân cây, hay còn gọi là “mắt” ở phần sát trên mặt đất, từ những
đặc điểm này mà trong sản xuất thường ít vun cao để không làm ảnh hưởng

3


đến chất chất lượng cành mang hoa.
Theo Nguyễn Xuân Linh (2000) cũng khẳng định rễ hoa cúc thuộc loại
rễ chùm, chỉ khi cây thực sinh còn nhỏ mới có rễ chính rõ ràng. Đầu chóp rễ
cúc có sức phân nhánh mạnh, trong điều kiện đất thích hợp thì rất nhanh hình
thành bộ rễ có nhiều nhánh, điều đó có lợi cho sự hút nước và dinh dưỡng. Rễ
của cây nhân từ phương pháp vô tính đều phát sinh từ thân và đều là rễ bất
định. Thân cúc bất kể ở đốt hay giữa lóng đều dễ hình thành rễ bất định, vì
vậy cây hoa cúc là một loài cây dễ nhân giống từ thể sinh dưỡng [5].
Thân: Cây hoa cúc thuộc loại thân thảo có nhiều đốt giòn, dễ gẫy, khả
năng phân cành mạnh. Thường những giống cúc đơn có thân mập thẳng còn
giống cúc chùm thân nhỏ và cong. Theo Vanruiten, De Jong (1984) [32],
chiều cao cây, mức độ phân cành, độ mềm hoặc cứng của cành phụ thuộc vào
đặc tính di truyền của giống, giống cúc thấp nhất chỉ cao 20 – 30 cm, còn
giống cúc cao nhất có thể cao trên 3 m. Theo Vanderkamp (2000) [33] cũng
cho rằng thân đứng hay bò, cao hoặc thấp, đốt dài hay ngắn, sự phân cành
mạnh hoặc yếu còn phụ thuộc vào từng giống. Các giống thân dài, thường
phân cành ít, thích hợp trồng trên nền đất có giàn cao. Giống thân cao, cành
cứng thích hợp với việc trồng hoa cắt cành. Giống cành nhiều, cảnh nhỏ và
mềm thích hợp với việc tạo hình.
Lá: Theo Cockshull và Hughes (1972), lá cây hoa cúc mọc cách và thành

vòng xoắn trên thân. Lá phẳng hoặc hơi nghiêng về phía trên hoặc hơi bị gấp.
Trên một cành thì lá gần gốc nhỏ, càng lên phía trên lá càng to dần. Kích
thước lá thường thay đổi theo điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng trọt. Cây
sinh trưởng kém thì lá nhỏ, mỏng, cứng, hơi chếch về phía trên, màu xanh
nhạt không bóng hoặc hơi vàng. Đủ dinh dưỡng, cây sinh trưởng khoẻ, lá to
và mềm, phiến lá dày, chóp lá hơi cong xuống, lá xanh thẫm và bóng. Biểu
hiện màu sắc và trạng thái lá thường là những chỉ tiêu để đánh giá trạng thái

4


sinh trưởng của cây. Lá cúc thường sống 70 - 90 ngày, hiệu suất quang hợp
của lá mạnh nhất là ở lá thứ 4 tính từ đỉnh ngọn trở xuống [15]. Cũng theo
Cockshull (1985) đã mô tả, lá cúc thường xẻ thuỳ, có răng cưa, lá đơn mọc so
le nhau, mặt dưới lá được phủ bởi một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân lá hình
mạng lưới. Mỗi nách lá có khả năng phát triển thành một nhánh. Phiến lá to
hay nhỏ, dày hay mỏng, xanh đậm hoặc nhạt còn tuỳ thuộc vào đặc tính của
các cành nhánh phía dưới để tập trung cho hoa ở phía trên sinh trưởng, phát
triển tốt, tạo tán đẹp [14].
Hoa: Theo Cornish, Stevenson (1990) [16] và Okada (1994) [26] đã
miêu tả cúc là hoa lưỡng tính hoặc đơn tính với nhiều màu sắc khác nhau,
đường kính hoa từ 1,5 – 12 cm, có thể là đơn hay kép và thường mọc nhiều
hoa trên 1 cành, phát sinh từ các nách lá. Hoa cúc chính là gồm nhiều hoa nhỏ
hợp lại trên một cuống hoa, hình thành hoa tự đầu trạng mà mỗi cánh thực
chất là một bông hoa. Những cánh hoa nằm phía ngoài thường có màu sắc
đậm hơn và xếp thành nhiều tầng, việc xếp chặt hay lỏng còn tuỳ thuộc vào
giống. Cánh có nhiều hình dạng khác nhau, cong hoặc thẳng, có loại cánh
ngắn đều có loại dài, xoè ra ngoài hay cuốn vào trong.
Theo Zagorski, Asches, Winder (1983) [34] hoa cúc có 4 - 5 nhị đực
dính vào nhau bao xung quanh vòi nhuỵ. Vòi nhuỵ mảnh, hình chỉ chẻ đôi.

Khi phấn chín, bao phấn nở tung phấn ra, nhưng lúc này nhuỵ còn non chưa
có khả năng tiếp nhận hạt phấn. Bởi vậy hoa cúc tuy lưỡng tính mà thường
biệt giao, nghĩa là không thể thụ phấn trên cùng hoa, nếu muốn lấy hạt giống
phải thụ phấn nhân tạo. Nên trong sản xuất việc cung cấp cây con chủ yếu
thực hiện bằng phương pháp nhân giống vô tính.
Quả và hạt: Theo Anderson (1998) [11] đã mô tả quả là quả bế khô,
hình trụ hơi dẹt chỉ chứa một hạt. Hạt có phôi thẳng và không có nội nhũ.
Ishiwara (1984) [21]: Quả cúc là quả bế, khi chín các lớp vỏ quả khô không

5


nứt. Trong quả có một hoặc nhiều hạt, có thể dùng những quả này để nhân
giống hữu tính cho cúc. Quả cúc rất nhỏ, dài chừng 2 - 3 mm, rộng 0,7 - 1,5
mm, trọng lượng 1000 hạt khoảng 1 g, có nhiều hình dạng khác nhau như
hình kim, hình gậy, hình trứng, hình tròn dài… thẳng hoặc hơi cong, hai đầu
cùng bằng hoặc một đầu nhọn, có lớp vỏ hạt rất mỏng màu đen, phôi thẳng,
không có nội nhũ, chất dinh dưỡng được tích trữ ở lá mầm.
1.2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc ở trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới
Cúc là cây hoa có giá trị kinh tế quan trọng trong ngành công nghiệp hoa
cắt cành (sau cây hoa hồng) [30]. Hiện nay, ngành sản xuất hoa cúc trên thế
giới đang phát triển mạnh và mang tính thương mại cao. Sản xuất hoa đã
mang lại lợi ích kinh tế to lớn cho nền kinh tế các nước trồng hoa trên thế
giới, nhất là đối với các nước đang phát triển. Hoa cúc được trồng nhiều nhất
ở Nhật Bản, Pháp, Mỹ, Trung.
Ở Nhật Bản, cúc được coi là quốc hoa, thậm chí ở các nhà hàng, người ta
có thể trang trí một bữa ăn với toàn hoa cúc. Tiếp sau Nhật Bản, những nước
trồng nhiều hoa cúc là: Hà Lan, Colombia và Trung Quốc.
Hà Lan là một trong những nước lớn nhất thế giới về xuất khẩu hoa nói

chung và hoa cúc nói riêng. Diện tích trồng cúc ở Hà Lan chiếm 30% tổng
diện tích trồng hoa tươi. Năng suất hoa tươi từ năm 1990 - 1995 tăng trung
bình từ 10-15%/1 ha. Hàng năm, Hà Lan đã sản xuất hàng trăm triệu cành hoa
cắt và hoa chậu phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm trên 80 nước
trên thế giới. Năm 1998, Hà Lan sản xuất 866 triệu cành và năm 1999, sản
xuất 1046 triệu cành cúc cắt.
Một trong những nguyên nhân quan trọng góp phần tạo ra sự thành công
của Hà Lan là sử dụng phương pháp nhân giống in vitro để sản xuất cây con.
Sau Hà Lan là Colombia - năm 1990 thu được 150 triệu USD từ việc xuất khẩu

6


hoa cúc, đến năm 1992 đã lên đến 200 triệu USD (Murray và Robyn, 1997).
Nhật Bản có nhu cầu sử dụng hoa cúc rất lớn. Diện tích trồng hoa cúc
chiếm 2/3 tổng diện tích trồng hoa. Năm 1991, diện tích trồng hoa cúc ở Nhật
Bản và 614 ha ngoài trời và 1150 ha nhà kính (FAO, 1998, Mae, S. O, 1993).
Tuy vậy, hàng năm, Nhật Bản vẫn phải nhập một lượng lớn hoa cúc từ Hà
Lan và một số nước khác trên thế giới. Năm 1996, Nhật Bản đã chọn Việt
Nam là một trong những nước sẽ xuất khẩu hoa cúc cho Nhật Bản.
Một số nước khác như Thái Lan, cúc đã được trồng quanh năm với số
lượng cành cắt hàng năm là 50.841.500. Trung Quốc cũng là nơi có nguồn
hoa cúc phong phú, việc xuất khẩu hoa cúc được chú trọng ở màu sắc hoa và
hình dạng hoa. Đây cũng là nước có kĩ thuật tiên tiến trong việc sản xuất hoa
cúc khô [9].
1.2.2. Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam
Hoa cúc được du nhập vào Việt Nam từ thế kỷ 15, đến đầu thế kỷ 19 đã
hình thành một số vùng nhỏ chuyên cung cấp cho nhân dân. Một phần để
chơi, một phần phục vụ việc cúng lễ và một phần dùng làm dược liệu. Nếu xét
về cơ cấu chủng loại tất cả các loại hoa thì trước những năm 1997 diện tích

hoa hồng nhiều nhất, chiếm 31% nhưng từ năm 1998 trở lại đây diện tích hoa
cúc đã vượt lên chiếm 42%, trong đó, hoa hồng chỉ còn 29,4%. Riêng ở Hà
Nội, tổng sản lượng hoa cúc năm 1999 đạt 41,3 tỷ đồng, xuất khẩu sang
Trung Quốc 3,6 tỷ đồng, tốc độ tăng hàng năm khoảng 10% (Nguyễn Xuân
Linh và cộng sự, 2002) [5]. Hiện nay, hoa cúc được trồng khắp nước ta, nó có
mặt ở mọi nơi từ núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị nhưng
chủ yếu tập trung ở các vùng hoa truyền thống của thành phố, khu công
nghiệp, khu du lịch, nghỉ mát như Ngọc Hà, Quảng An, Nhật Tân (Hà Nội),
Đằng Hải, Đằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu
Sơn, thành phố Thanh Hoá (Thanh Hoá), Gò Vấp (thành phố Hồ Chí Minh),
thành phố Đà Lạt (Lâm Đồng) với tổng diện tích trồng hoa khoảng 2000 ha.

7


Riêng Hà Nội và Đà Lạt là những nơi lý tưởng cho việc sinh trưởng và phát
triển của hầu hết các giống cúc được nhập từ nước ngoài (Đặng Văn Đông,
2000) [9].
1.3. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro về cây hoa cúc trên thế giới và
ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro về cây hoa cúc trên thế giới
Năm 1952, lần đầu tiên tại Pháp, Morell và Martin đã tạo được những
hoa cúc sạch bệnh nhờ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, cũng theo phương pháp
này, Mori (1971), Asatani (1972) và Paludan (1974) đã thu được những giống
sạch virut B, Veinmottle, Stunt và Comlex virues (Horst, 1990) [20].
Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các bộ phận khác của
cây hoa cúc để nuôi cấy như đoạn thân, mẫu lá... Kaul, Miller, Hutchison,
Richards (1990) cho thấy các đoạn thân có khả năng tái sinh chồi cao hơn các
mẫu lá.
Năm 1990, Kenneth và Toress [23] đã nuôi cấy thành công từ giai đoạn

thân và lá của giống hoa cúc tím trên môi trường MS. Tỉ lệ hình thành chồi
đạt 100% và trung bình các cây nuôi cấy mô này sau 3 - 4 tháng là ra hoa.
Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện
thành công bởi Sussex (1989) [29], kết quả thí nghiệm cho thấy phương pháp
tối ưu, để mẫu có tỷ lệ sống sót và tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là bảo quản chồi
đỉnh cúc trước nuôi cấy 2 ngày trong điều kiện lạnh dần từ 0,2oC đến 4oC với
10% Dimethyl sulfoxide và 3% Glucose, có nhiều giống đã đạt các tỉ lệ này
tới 100% ha.
Năm 1990, khi nghiên cứu về ảnh hưởng của thành phần môi trường
dinh dưỡng, Lunegent và Wardley [24] đã kết luận khi đoạn thân cúc cao 1 - 2
cm và cho phát triển trong môi trường nuôi cấy Benziladenin thì chúng hình
hành 2 - 3 chồi so với mẫu bản và không có rễ bất định, còn trong môi trường
0,1 - 0,2 mg/l Indolebutylic axit thì hình thành 1 - 2 chồi và có rễ bất định.

8


Để hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô hoa cúc, việc nghiên cứu giai đoạn
cuối cùng là đưa cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng. Năm 1990,
Robert và Smith [28] đã nghiên cứu bảo vệ rễ bằng chất đệm Cellulose
sorbarods trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng đã làm giảm bớt thiệt hại
trong quá trình đưa cây ra ngoài và cho vào 1 lít môi trường ra rễ dạng lỏng
0,5 - 4 mg Paclobutrazol thì sẽ giảm được độ héo của cây khi ra ngoài sản
xuất làm thân ngắn hơn, rễ to nhiều và tăng diệp lục trên 1 đơn vị diện tích lá.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu in vitro về cây hoa cúc ở Việt Nam
Theo Nguyễn Quang Thạch, thì khả năng tái sinh và nhân giống của cây
cúc là rất cao, từ 410 đến 610 lần trong một năm. Nguồn cấy mô ban đầu là các
đỉnh sinh trưởng, các mầm bất định ở nách lá, mô lá.., ngoài ra việc nuôi cấy
mô cũng có thể dùng đoạn thân, lá, đài, cánh hoa, nhị,… làm mẫu cấy. Việc
khử trùng mẫu cấy cây hoa cúc thường dùng HgCl2 0,1% với thời gian khử

trùng từ 5 - 10 phút hoặc sử dụng Ca(OCl)2 5 - 7% trong khoảng 15 - 20 phút,
hoặc sử dụng H2O2 10% trong 5 - 15 phút. Môi trường dinh dưỡng chính
trong nuôi cấy mô cây hoa cúc là MS, tuỳ vào mô nuôi cấy và giai đoạn của
quá trình nuôi cấy mà có thể bổ sung hàm lượng chất kích thích sinh trưởng
khác nhau như IAA, IBA, NAA, hoặc BAP, Kinetin.
Nguyễn Bá Nam và cs (2012) [7] đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại
mẫu cấy và điều kiện chiếu sáng đến khả năng tái sinh chồi cây hoa cúc, trong
nghiên cứu này, các nguồn chiếu sáng khác nhau được sử dụng để nghiên cứu
tác động của chúng đến khả năng tái sinh chồi từ các mẫu cấy lá và lớp mỏng
tế bào thân cắt dọc của cây Cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat. cv.
“Jimba”) in vitro. Hai nguồn mẫu này được cấy trên môi trường MS có bổ
sung 30 g/l saccarozơ, 8 g/l agar, 0,5 mg/l NAA và 2 mg/l BA và nuôi cấy
dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100 % LED đỏ, 100 % LED xanh,
50 % LED đỏ + 50 % LED xanh, 70 % LED đỏ + 30 % LED xanh, 80 %

9


LED đỏ + 20 % LED xanh, 90 % LED đỏ + 10 % LED xanh, ánh sáng đèn
huỳnh quang (Neon) và trong tối. Kết quả thu được sau bốn tuần nuôi cấy cho
thấy, 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 30 % ánh sáng LED xanh là tỉ lệ phù
hợp cho sự tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá và gián tiếp từ lớp mỏng tế bào
thân cây cúc so với các điều kiện chiếu sáng còn lại. Những chồi thu được
dưới điều kiện chiếu sáng này là nguồn mẫu thích hợp phục vụ cho quy trình
nhân giống cây cúc.
Nguyễn Thị Nhật Linh và cs (2012) [4] đã nghiên cứu ảnh hưởng của
than hoạt tính (AC) đến khả năng định hướng rễ ở cây hoa cúc và cây Hồng
môn. Trong nghiên cứu này, tác giả đã tiến hành cấy các chồi vào môi trường
được phân thành 2 phần, một phần không có AC và phần còn lại bổ sung các
nồng độ AC tối ưu đã khảo sát ở hai đối tượng cây cúc (3 g/l AC) và Hồng

môn (2 g/l AC) bằng cách thay đổi vị trí lớp AC trong môi trường nuôi cấy
(trên, giữa hoặc dưới). Kết quả cho thấy, hầu hết các rễ phát sinh trong lớp
môi trường có AC (trên 80% rễ). Ngoài ra, các kết quả cũng cho thấy sự định
hướng rễ của cây Hồng môn phụ thuộc vào vị trí lớp AC nhiều hơn ở cây cúc.
Vị trí lớp môi trường có AC ở dưới là tối ưu cho sự phát triển của cây và rễ in
vitro của cả cây cúc và cây Hồng môn. Mặt khác, những cây sinh trưởng và
phát triển tốt trong điều kiện in vitro cũng sinh trưởng và phát triển tốt ở điều
kiện ex vitro; điều này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu nhân giống vô tính
cây trồng.
1.4. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước mẫu và phương
thức cấy mẫu đến sinh trưởng của cây in vitro
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự ảnh hưởng của
kích thước mẫu và phương thức cấy mẫu đến quá trình nhân nhanh trong nuôi
cấy mô, tế bào thực vật. Tuy nhiên những nghiên cứu về phương diện này trên
cây hoa cúc là rất ít, các nghiên cứu chủ yếu mới chỉ dừng lại ở mức xây dựng

10


quy trình nhân giống in vitro các giống hoa cúc.
Năm 2007, khi nghiên cứu về ảnh hưởng của thành phần môi trường
dinh dưỡng và kích thước mẫu cấy (cánh hoa cúc) đến sự phát sinh mô sẹo và
sự phát sinh chồi ở cây hoa cúc, Nahid và cs [22] đã kết luận rằng, trong các
kích thước mẫu và môi trường nuôi cấy mà tác giả đề cập thì ở kích thước
mẫu là 7 mm nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l
NAA thì tỉ lệ phát sinh mô sẹo là cao nhất (96,00%), và ở kích thước mẫu 7
mm nuôi cấy trên các môi trường MS bổ sung 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l KI; 1
mg/l KI + 0,1 mg/l NAA thì tỉ lệ phát sinh chồi là cao nhất (83,33%).
Năm 2013, Mazri đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 3 nhóm kích
thước mẫu: < 3 cm; 3 – 4 cm và 4,5 – 6 cm lên sự tạo chồi của cây Chà là

(Phoenix dactylifera L.) trên môi trường MS bổ sung 1 g/l Polyvinyl pyrrolidone + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l Ki và nhận thấy rằng, sau 3 tháng
nuôi cấy, ở nhóm chiều cao 4,5 – 6 cm cho chồi mới có chiều cao trung bình
cao nhất (14,2 cm) [25]. Cùng năm ấy, Boullani cũng tiến hành nghiên cứu
ảnh hưởng của 4 nhóm kích thước mẫu: 1 cm; 1 - 1,5 cm; 1,5 – 2 cm và > 2
cm đến sự tạo chồi của cây Atisô. Tác giả đã tiến hành khử trùng hạt và nuôi
cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l IBA + 0,1 mg/l GA3 sau đó cắt lấy
chồi và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l Ki + 0,1 mg/l NAA. Kết
quả cho thấy, tỉ lệ tạo chồi cao nhất đạt được ở kích thước mẫu 1 – 1,5 cm với
17 chồi/mẫu [27].
Vào năm 2001, Elizabete và cs khi nghiên cứu về cây Phyllanthus
stipulatus (1 cây thuộc họ Diệp hạ châu) đã đưa ra kết luận: đối với phương
thức cấy thẳng đứng, tạo mô sẹo tốt nhất ở môi trường MS bổ sung 0,5 µM
NAA (điều kiện có ánh sáng) hoặc đối với phương thức cấy nằm ngang là môi
trường MS có bổ sung 0,5µM NAA hoặc 1,25 – 5µM BA (điều kiện trong

11


bóng tối) [18].
Khi nghiên cứu về cây Quercus robus (1 loài sồi), Ana M. Vieitez và cs
(1994) đã nhận thấy rằng: ở phương thức cấy thẳng đứng, sự phát triển của
chồi bị suy giảm dần sau nhiều lần tái sinh, tuy nhiên, phương thức cấy nằm
ngang trên môi trường GD (Gupta and Durzan, 1986) có bổ sung 0,89 µM BA
đã hạn chế được tình trạng này [12].

12


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 5 giống cúc: chi đỏ, đỏ cờ, kim cương, thạch
bích và vàng hè do phòng sinh lý thực vật, khoa Sinh – KTNN, Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 10/2014 đến tháng 10/2015 tại
phòng Sinh lý thực vật của trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.3.1. Thiết bị
Các thiết bị được sử dụng trong các thí nghiệm: Cân kĩ thuật (Hãng
GM612, Đức), tủ lạnh sâu (Hãng FRIGO), máy đo pH (Hãng HM30G/TOA,
Đức), nồi hấp khử trùng (Hãng HV – 110/ HIRAYAMA, Nhật), tủ lạnh
Hitachi (Hãng 31AG5D, Thái Lan), máy cất nước hai lần (Trung Quốc),
Buồng cấy vô trùng (Hãng AV- 110/TELSTAR), máy khuấy từ nhiệt (Hãng
ARE/VELP, Italia), Cân phân tích (Hãng Sartorius, Đức), tủ ấm (Hãng
UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức).
2.3.2. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, panh cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, bình xịt
cồn,…
2.4. Môi trường nuôi cấy
Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có bổ
sung saccarozơ, agar, và các chất điều hoà sinh trưởng.
pH môi trường: 5,8
Môi trường nuôi cấy được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ
117oC, 1atm trong 15 phút.

13


2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo: Ánh sáng: 3000

lux, quang kì: 16 giờ/ ngày, nhiệt độ phòng: 25oC - 27oC, độ ẩm trung bình:
70 - 74%.
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Chuẩn bị vật liệu thực vật
Ngoài tủ cấy vô trùng: Thu mẫu ngoài tự nhiên là các chồi đỉnh. Cắt, rửa
sạch dưới vòi nước chảy, lắc xà phòng, sau đó rửa sạch bằng nước cất và đem
vào tủ cấy vô trùng.
Trong tủ cấy vô trùng: Lắc mẫu bằng nước cất khử trùng 3 - 4 lần. Sau
đó lắc mẫu trong etanol 70% trong 5 phút và rửa lại bằng nước cất khử trùng
3 - 4 lần.
2.6.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần
nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu/TN.
*Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu khởi đầu
Mẫu tự nhiên sau khi thu về, cắt mẫu là đốt thân dài 3 - 4cm, rửa xà
phòng dưới vòi nước chảy, sau đó rửa lại nước sạch 2 - 3 lần.
Tiếp đó đưa mẫu vào tủ cấy, tiến hành khử trùng làm sạch mẫu cấy.
Trước hết khử trùng sơ bộ qua cồn (70% (v/v)/5 phút) rồi rửa nước cất 2 - 3
lần, rửa mẫu bằng Javen (từ 5 - 15%/5 - 15 phút tương ứng với các công thức:
T1: Javel 5%/5 phút; T2: Javel 5%/10 phút; T3: Javel 10%/ 10 phút; T4: Javel
10%/ 15 phút và T5: Javel 15%/10 phút) rồi rửa lại nước cất 4 - 5 lần, thấm
khô, đưa mẫu vào cấy.
Mẫu được cấy trên môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962)
có bổ sung 30g saccarozơ/l, 7 g agar/l, pH = 5,8.

14


Các thí nghiệm làm tương tự lần lượt với các giống hoa cúc nhằm tìm ra
công thức tối ưu để tạo vật liều khởi đầu cho từng giống cúc. Mẫu sau khi

được khử trùng trong tủ cấy sẽ cắt thành từng đoạn 1 cm, sau đó được cấy vào
môi trường MS cơ bản, đặt lên giàn cấy và theo dõi tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu
sạch, tỉ lệ mẫu sạch nhưng chết trong 1 tuần.
Số mẫu bị nhiễm
Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)
=
Tổng số mẫu cấy
Tổng số mẫu sạch

Tỉ lệ mẫu sạch sống (%)

=

x 100

x 100

Tổng số mẫu cấy

Tỉ lệ mẫu sạch chết (%)

Tổng số mẫu sạch nhưng chết
=

x 100

Tổng số mẫu cấy
*Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng tái sinh chồi in vitro của các giống
hoa cúc.
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS có bổ sung 30g saccarozơ/l, 7

g agar/l, pH = 5,8 và bổ sung BAP 0,7 mg/l (theo La Việt Hồng và cs, 2014)
[3]. Sau 6 tuần theo dõi, tiến hành đo các chỉ tiêu: số chồi/ mẫu, số lá/chồi,
chiều cao chồi (cm).
*Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy đến quá trình nhân
nhanh chồi cúc.
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS có bổ sung 30g saccarozơ/ l, 7
g agar/l, pH =5,8 và BAP 0,7 mg/l. Các mẫu đỉnh sinh trưởng của mỗi giống
được cắt chia làm 3 nhóm chiều cao: 1 cm, 2 cm, 3 cm. Theo dõi số lượng
chồi được tạo ra trong 6 tuần của từng nhóm.

15


*Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của phương thức cấy mẫu đến sự phát triển
chồi mới phát sinh
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS có bổ sung 30g saccarozơ/ l, 7
g agar/l, pH =5,8 và BAP 0,7 mg/l.
Từ kết quả của Thí nghiệm 3, các mẫu đỉnh sinh trưởng (được cắt theo
chiều cao thuộc nhóm cho hệ số nhân chồi cao nhất) của mỗi giống được cấy
thành 2 nhóm phương thức: thẳng đứng, nằm ngang. Theo dõi chiều cao chồi
của mỗi nhóm trong 6 tuần.
2.6.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được được phân tích thống kê theo các tham số: giá trị
trung bình, độ lệch chuẩn,… Sự sai khác giữa các giá trị trung bình được
kiểm tra bằng phương pháp giới hạn sai khác nhỏ nhất trên chương trình
Excel 2010 [6].

16