Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới artemisinin và hoạt tính kháng u

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-------------------------------------

PHAN HẢI PHONG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT MỚI
ARTEMISININ VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG U

Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
(Kỹ thuật hóa học)

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. TRẦN KHẮC VŨ

Hà Nội, 2016
1


LỜI CAM ĐOAN

Tác giả cam đoan rằng: Luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu tổng hợp các dẫn
xuất mới artemisinin và hoạt tính kháng u” được hoàn thành dưới sự hướng dẫn
của PGS.TS. Trần Khắc Vũ - Bộ môn công nghệ Hóa dược và Hóa chất bảo vệ
thực vật -Viện kỹ thuật hóa học - trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Các kết quả
trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ
công trình nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Phan Hải Phong

2


LỜI CẢM ƠN

Đề tài này được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ
bản của quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia NAFOSTED, mã
số 104.01-2013.01.
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự
giúp đỡ, động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình.
- Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành tới PGS.TS Trần Khắc Vũ, người đã
hướng dẫn tôi rất tận tình và chu đáo trong quá trình thực hiện luận văn.
- Cảm ơn các thầy cô và các cán bộ ở phòng thí nghiệm Hóa dược, phòng
thử nghiệm sinh học, Viện công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi hết mình trong quá
trình làm luận văn.
- Cảm ơn Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Kỹ thuật Hóa học và
Bộ môn Hóa dược & Bảo vệ thực vật đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành
công việc của mình.
- Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã trao đổi và giúp đỡ giải
quyết những vướng mắc trong quá trình thực hiện.

3


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT …………………………...………...

7

DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ ……………………...

8

MỞ ĐẦU …………………………………...…………………………………..

9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………..…...…...

11

1.1. ARTEMISININ (ART) …………………………………………......…...

11

1.1.1. Giới thiệu chung về artemisinin và cây thanh hao hoa vàng……..….

11

1.1.2. Cấu tạo, tính chất hóa, lý của artemisinin …………………..…….…

12

1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ART ……………………………...

13

1.2.1. Chiết xuất bằng phương pháp thông thường……………….………...

13

1.2.2. Phương pháp chiết xuất artemisinin bằng vi sóng …………………..

14

1.2.3. Phương pháp sử dụng CO2 siêu tới hạn ……………………………..

15

1.2.4. Phương pháp sử dụng sóng siêu âm …………………………………

15

1.2.5. Sản xuất artemisin từ vi sinh vật …………………………………….

15

1.2.6. Sinh tổng hợp artemisinin ……………..…………………………….

16

1.2.7. Phương pháp tổng hợp toàn phần và bán tổng hợp artemisinin ……..

16

1.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA ART VÀ DẪN XUẤT ………….…….

17

1.3.1. Hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét ………………………………

17

1.3.2. Hoạt tính kháng virus …………………………………………...…...

18

1.3.2.1. Tác dụng chống lại cytomegalovirus ở người (HCMV)…...…….

18

1.3.2.2.Hoạt tính phổ rộng chống lại các virus Herpes …………...….....

19

1.3.2.3. Hoạt tính kháng virus viêm gan B (HBV)………………...……..

20

1.3.2.4. Hoạt tính chống lại virus viêm gan C (HCV)……….…….…….

20

1.3.2.5. Hoạt tính kháng HIV-1……………………………….………….

21

1.3.3. Hoạt tính kháng u ……………………………………...…………….

21

1.4. MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA ARTEMISININ ……………..……...……

22

4


1.4.1. Một số dẫn xuất điển hình và ứng dụng ………………………...…..

22

1.4.1.1. Dẫn xuất dihydroartemisinin (DHA) …………………...………..

22

1.4.1.2. Dẫn xuất artemether (ARM) ………….………………………...

22

1.4.1.3. Dẫn xuất artesunate (ARS) ……….……………………..……...

23

1.4.2. Một số dẫn xuất mới có hoạt tính của ART ……………..……..……

23

1.4.2.1. Dẫn xuất ete, este ………………………………………..……...

23

1.4.2.2. Dẫn xuất 10-triazoleartemisinin…….……….………..………...

24

1.4.2.3. Một số dẫn xuất ete của ART chứa amine………..…..…………

26

1.4.2.4. Các dẫn xuất 10-deoxoartemisinin………………………..……..

27

1.4.2.5. Dẫn xuất amide …………………………………..……………...

30

1.4.2.6. Dẫn xuất của ART chứa nhóm bazơ Mannich …………….…….

32

1.4.2.7. Dẫn xuất của ART ghép với AZT…………………...…………...

33

CHƯƠNG 2: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM …...

34

2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong tổng hợp ……………….…….

34

2.1.1. Thiết bị ……………………………………………………….……...

34

2.1.2. Hóa chất ………….…………………...…………………..………...

34

2.2. Các phương pháp sử dụng trong tổng hợp và tinh chế sản phẩm …….…

34

2.2.1. Xác định nhiệt độ nóng chảy …………………..…………………....

34

2.2.2. Sắc ký cột ……………………………...………………….…………

35

2.2.3. Sắc ký bản mỏng ………….………………………………….……...

35

2.3. Các phương pháp thực nghiệm trong nghiên cứu cấu trúc sản phẩm ….

35

2.3.1. Phổ hồng ngoại (FT-IR) ………….………………….……….……...

35

2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ………………………………...

35

2.3.3. Phổ khối (MS) ……….………………………………………...….....

35

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM ……………………...………………………...

36

3.1. Tổng hợp 10β-azidoartemisinin …………...……………………..……...

36

3.2. Tổng hợp 10β-aminoartemisinin ………………..………………..……...

37

5


3.3. Tổng hợp các hợp chất trung gian 10β-aminoartemisinin chứa nhóm
cacboxylic …………………………………...……………………….…………

37

3.4. Tổng hợp các hợp chất trung gian10β-aminoartemisinin chứa mạch
suberic acid và adipic acid …………………………………………...…..……..

41

3.5. Tổng hợp các hợp chất dime hóa của artemisinin …………….…...…….

43

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………….……………………...

50

4.1. Về tổng hợp 10β-azidoartemisinin…………………………..…………...

50

4.2. Về tổng hợp 10β-aminoartemisinin …………...…………....…………...

51

4.3. Về các hợp chất trung gian 10β-aminoartemisinin chứa nhóm
cacboxylic ………………………………………………………………...…….

52

4.4. Về tổng hợp các dime artemisisinin ……………………………………..

55

4.5. Về hoạt tính kháng u của các hợp chất …………………………….....…

56

KẾT LUẬN …………………………………………………………...………...

59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………...……………….……...

60

PHỤ LỤC ………………………….…………………………………………...

65

6


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

HCV

Hepatitis C virus

HBV

Hepatitis B virus

HCMV

Human cytomegalovirus

1

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic
Resonance spectroscopy)

H-NMR

13

C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Cacbon 13 Nuclear
Magnetic Resonance spectroscopy)

δ (ppm)

Độ dịch chuyển hóa học (tính theo phần triệu)

MS

Phổ khối lượng

HRMS

Phổ khối phân giải cao

TLC

Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV

Ultraviolet

s

Singlet

d

doublet

t

Triplet

q

Quartet

dd

Doublet doublet

m

Multiplet

rt

Nhiệt độ phòng (room temprature)

PPh3

Triphenyl photphine

THF

Tetrahydrofuran

CDI

Carbonyl dimidazol

EDC

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)

DMAP

Dimethyl aminoprydin

IC50

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển

7


DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 1

Bảng kết quả nghiên cứu khả năng ức chế HCMV của artesunate….. 18

Bảng 2

Các dẫn xuất ete và este của artemisinin…………………………….

24

Bảng 3

Hoạt tính gây độc tế bào một số dẫn xuất amide…………………….

31

Bảng 4

Các hợp chất trung gian (42a-g)……………………………………..

54

Bảng 5

Các dimer (43a-g)……………………………………………………

56

Bảng 6

Hoạt tính gây độc tế bào của các dimer (43a-g)…………………….. 57

Hình 1

Cây thanh hao hoa vàng…………………………………...…………

11

Hình 2

Sơ đồ mô tả quá trình chiết xuất artemisinin………………………...

14

Sơ đồ 1

Tổng hợp DHA từ ART……………………………………………...

22

Sơ đồ 2

Tổng hợp ARM từ DHA……………………………………………..

22

Sơ đồ 3

Tổng hợp ARS từ DHA……………………………………………...

23

Sơ đồ 4

Tổng hợp các dẫn xuất triazole của ART……………………………

25

Sơ đồ 5

Tổng hợp một số dẫn xuất ete của ART chứa nhóm amine…………. 26

Sơ đồ 6

Tổng hợp các dẫn xuất 10-deoxoartemisinin………………………...

Sơ đồ 7

Tổng hợp các dẫn xuất amide của ART……………………………... 30

Sơ đồ 8

Tổng hợp các dẫn xuất của ART chứa nhóm bazơ Manich…………. 32

Sơ đồ 9

Tổng hợp dẫn xuất ghép giữa DHA và AZT………………………...

33

Sơ đồ 10 Điều chế 10β-azidoartemisinin………………………………………

50

Sơ đồ 11 Tổng hợp các hợp chất trung gian chứa nhóm acid cacboxylic 42a-e

52

Sơ đồ 12 Tổng hợp các hợp chất trung gian chứa nhóm acid cacboxylic 42f,g

53

Sơ đồ 13 Tổng hợp các dimer artemisinin 43a-g………………………………

55

8

29


MỞ ĐẦU
Ung thư là căn bệnh đã có từ lâu và có tỉ lệ tử vong cao chỉ sau các bệnh về
tim mạch. Nó là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào không
theo tổ chức và không kiểm soát được, có khả năng tồn tại và phát triển ở các tổ
chức lạ. Các tế bào này có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển
trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển theo mạch máu đến phát triển ở các mô ở
xa (di căn), gây nguy hiểm cho tính mạng con người. Ước tính mỗi năm, thế giới
có khoảng 11 triệu trường hợp mới mắc ung thư và có đến 6 triệu người chết vì
căn bệnh này. Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư nói chung là khá cao, vào khoảng
250-300/100 ngàn người [1, 2].
Artemisinin là một sản phẩm tự nhiên của cây Thanh Hao hoa vàng. Nó là
một hợp chất mà có thể được chuyển hóa thành các dẫn xuất khác nhau, điển hình
như artesunate (AS) và artemether (AM), thường được gọi là artemisinin và dẫn
chất (ARTs). ARTs ngoài việc được biết đến rộng rãi trong các hoạt động điều trị
bệnh sốt rét, chúng còn được biết đến trong hoạt động chống ung thư tiềm năng
cả trong invitro và in vivo vài năm qua. ARTs có tác dụng ức chế sự tăng trưởng
tế bào ung thư và gây độc tế bào chọn lọc. Trong một vài nghiên cứu, ARTs đã
được chứng minh là có tác dụng gây độc đối với một số dòng tế bào ung thư và ít
độc đối với các tế bào bình thường [3].
Gần đây artemisinin thu hút được sự quan tâm nghiên cứu ngày càng tăng.
Một số dẫn xuất mới của artemisinin cho thấy tác dụng kháng một số dòng tế bào

ung thư rất tiềm năng, đặc biệt một số dẫn xuất dimer hoặc trimer artemisinin thể
hiện hoạt tính rất tiềm năng in vitro [4]. Nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính - cấu
trúc của các dẫn xuất tổng hợp cho thấy vai trò quan trọng của cầu peroxide đến
hoạt tính ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư. Tiếp tục tìm kiếm
các hợp chất mới có tác dụng kháng ung thư, chúng tôi định hướng tổng hợp các
hợp chất mới là các dimer của artemisinin với liên kết amide bền vững ở vị trí C10.

9


Vì vậy, chúng tôi đặt vấn đề “Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới
artemisinin và hoạt tính kháng u”.
Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu :
- Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới dimer trên cơ sở bộ khung
artemisinin
- Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào đối với các dẫn xuất bán tổng hợp được.

10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. ARTEMISININ (ART)
1.1.1. Giới thiệu chung về artemisinin và cây thanh hao hoa vàng
Cây thanh hao hoa vàng có tên khoa học là artemisia annua L. là một loài
thảo dược vốn mọc hoang ở miền nam Trung Quốc và miền bắc Việt Nam. Nó là
cây thân thảo sống trong vòng 1 năm, cao từ 1-3m, lá mọc so le, phiến lá nhẵn,
dọc gân chính và thân non có lông thưa ngắn; cụm hoa là những đầu nhỏ, tụ lại ở
ngọn, thân, cành, quả hình trứng, lá và hoa có mùi thơm đặc trưng, vị đắng [5].

Hình 1. Cây thanh hao hoa vàng
Năm 1972, trong một chương trình nghiên cứu có tên là Dự án 523 được
thành lập bởi quân đội Trung Quốc, Tu Youyou [6] đã phát hiện ra artemisinin,
một hợp chất lacton sesquiterpene tự nhiên được tìm thấy trong phần lá của cây
artemisia annua (Qinghao) - chứa cầu endoperoxide đóng vai trò quan trọng
trong chống sốt rét. Trong những phản ứng lâm sàng đầu tiên cho thấy khả năng
11


kháng bệnh sốt rét của artemisinin cao và ít độc. Tuy nhiên, nó có nhược điểm là
độ hòa tan thấp trong nước hoặc dầu làm giảm sinh khả dụng. Thêm vào đó là
khả năng tái phát bệnh cao. Để khắc phục điểm này, một nghiên cứu biến đổi cấu
trúc của artemisinin đã được thực hiện [5], dẫn đến một số các dẫn xuất nổi tiếng
của artemisinin đã được công bố như: artenimol, artesunate, artemether và nhiều
dẫn xuất khác. Trong số đó artesunate và artemether đã được đưa vào sử dụng
lâm sàng trị sốt rét rất hiệu quả. Tuy nhiên, tình trạng kháng thuốc và tái phát
bệnh đã được báo cáo trong những năm gần đây.
1.1.2. CẤU TẠO, TÍNH CHẤT HÓA, LÝ CỦA ARTEMISININ
- Công thức phân tử: C15H22O5
- Công thức cấu tạo:

ART (1)
- Tên IUPAC: (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-Octahydro-3,6,9-trimethyl3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10(3H)-one.
- Khối lượng phân tử: 282,33g/mol
- ART là một lactone sesquiterpene, có chứa vòng lactone và cầu peroxide.
Trong phân tử ART có năm nguyên tử oxi, trong đó, hai oxi tạo thành cầu
peroxide; hai oxi khác tham gia vào cấu trúc vòng lactone. Cấu hình không gian
của ART cho thấy có 7 trung tâm bất đối xứng (là một chất quang hoạt) [7].
* Tính chất vật lý:
- ART dược dụng là tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, vị hơi đắng.

12


- Tan được trong CHCl3, EtOH, ete dầu hỏa và axeton; tan ít trong nhexane, benzene, toluene và hầu như không tan trong nước.
- Nó bị thủy phân và phân hủy trong các dung môi phân cực ở nhiệt độ
cao; dễ phân hủy trong môi trường axit, bazơ.
- Điểm nóng chảy 156-157oC
- Có thể chiết tách ART bằng dung môi n-hexane (như Trung Quốc đã thực
hiện) hay bằng xăng công nghiệp nhằm giảm giá thành.
Artemisinin tinh khiết khá bền vững dưới tác dụng của nhiệt độ, nó không
bị phân hủy ở nhiệt độ chảy của nó và cũng không biến đổi ở nhiệt độ cao hơn độ
chảy của nó 50oC trong vòng 5 phút, vì vậy có thể tinh chế bằng phương pháp
thăng hoa. Artemisinin dễ bị phân hủy trong môi trường axit, kiềm. Liên quan
đến bệnh sốt rét, artemisinin thực sự góp phần làm thay đổi tình huống vô vọng
mà thế giới đang phải đối mặt. Ngoài ra, gần đây hợp chất này còn được phát
hiện là chất rất tiềm năng ức chế một số dòng tế bào ung thư với cơ chế tương tự
bệnh sốt rét.
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ART
Cho đến nay, có một số phương pháp khác nhau để chiết xuất artemisinin
phục vụ cho nhu cầu của con người. Có thể kể ra một số phương pháp chiết xuất
sau đây.
1.2.1. Chiết xuất bằng phương pháp thông thường
Phương

pháp

phổ

biến

là

sử

dụng

dung

môi

n-hexan

để

chiết xuất artemisinin. Đây là phương pháp truyền thống. Tuy nhiên, để giảm giá
thành hiện nay xăng công nghiệp được sử dụng thay thế cho n-hexan. Quá trình
chiết được minh họa như ở hình 2 [7].

13


Lá khô thanh hao hoa vàng
Xay

Xăng công
nghiệp

Bột lá
Chiết ở 40-50oC

Dịch chiết

Dịch cô đậm đặc

Cất loại dung môi

Kết tinh trong 24-48h, loại sáp

Artemisinin thô

EtOH

Hòa tan nóng
Tẩy màu
Lọc bỏ than
Kết tinh lại trong 24h

Artemisinin tinh khiết
Hình 2. Sơ đồ mô tả quá trình chiết xuất Artemisinin
1.2.2. Phương pháp chiết xuất artemisinin bằng vi sóng
Một phương pháp được sử dụng để tăng hiệu suất chiết artemisinintừ cây
thanh hao hoa vàng là phương pháp MAE - còn gọi là phương pháp sử dụng vi
sóng do Jin-yu và các cộng sự nghiên cứu. Đây là một phương pháp chiết xuất
mới nhưng vẫn sử dụng các dung môi truyền thống. Các dung môi thường sử
dụng trong phương pháp này là ethanol, trichloromethane, cyclohexan, n-hexan,
hay ether dầu hỏa.
Nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp MAE có nhiều lợi thế so với các
phương pháp khác, chẳng hạn như thời gian ngắn hơn, sử dụng ít dung môi, hiệu
suất chiết xuất cao hơn, sản phẩm tốt hơn với chi phí thấp hơn. Cụ thể, trong điều

kiện tối ưu của phương pháp, chiết xuất với dầu dung môi là tốt nhất, thời gian
14


của bức xạ vi sóng là 12 phút, đường kính của nguyên liệu không vượt quá
0,125mm, tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu lớn hơn 11,3, hiệu suất của quá
trình đạt tới 92,1% [8].
1.2.3. Phương pháp sử dụng CO2 siêu tới hạn
Phương pháp sử dụng ethanol 16,25% và CO2 siêu tới hạn sẽ thu được
artemisinin với hiệu suất cao (lên tới 98,2%), thời gian chiết xuất nhanh (chỉ mất
2h chiết xuất so với 16h của phương pháp Soxhlet). Tuy nhiên, dòng CO2 siêu tới
hạn không có tính chọn lọc, artemisinin sẽ bị lẫn nhiều tạp chất [9].
1.2.4. Phương pháp sử dụng sóng siêu âm
Phương pháp chiết bằng cách sử dụng sóng siêu âm đã được Rhianna
Briars và các cộng sự nghiên cứu. Phương pháp này đã giải quyết được nhiều vấn
đề tồn tại tại ở các phương pháp cổ điển khác. Đó là việc tăng khả năng hòa tan
của artemisinin trong các dung môi nhờ sự hỗ trợ của sóng siêu âm, thời gian
chiết xuất được rút ngắn. Quá trình làm việc ở nhiệt độ thấp, lượng tạp chất sẽ
được hạn chế, artemisinin thu được sẽ tinh khiết hơn, chi phí năng lượng cho quá
trình cũng được giảm thiểu đáng kể [10].
1.2.5. Sản xuất artemisinin từ vi sinh vật
Hiện nay vì giá thành của thuốc chiết xuất từ cây Thanh hao hoa vàng là
quá đắt cho nên người ta đã tiến hành tách được 2 gen từ cây này liên quan đến
việc tổng hợp ra acid artemisinic. Axit này chỉ qua vài phản ứng hóa học sẽ dễ
dàng chuyển thành artemisinin. Sau đó người ta đã chuyển thành công 2 gen này
vào tế bào men rượu (Saccharomyces cerevisiae).Việc đưa chủng nấm men mang
gen tái tổ hợp sinh artemisinin vào sản xuất trong các nồi lên men đã làm hạ giá
thành xuống chỉ còn 10% so với phương pháp tách chiết từ Thanh hao hoa vàng
và có thể không còn cần tới đất để sản xuất cây này nữa trong tương lai. Đó là
một thành tựu tuyệt vời của nhóm nghiên cứu ở trường Đại học Berkeley

(California, Hoa Kỳ) mới công bố tháng 4-2006 [11].

15


1.2.6. Sinh tổng hợp artemisinin
Dược thảo artemisinin đã được sử dụng để trị liệu cho nhiều loại bệnh, đặc
biệt là bệnh sốt rét ở nhiều nơi. Các nhà khoa học đã có nhiều nỗ lực cải tiến về
thực vật học (gồm nuôi cấy, tạo giống) và hóa học (gồm ly trích, tổng hợp). Mục
đích chính là gia tăng hiệu năng sản xuất artemisinin để đáp ứng nhu cầu của các
nạn nhân ở các vùng sốt rét trên thế giới. Tuy nhiên, việc cung cấp số lượng lớn
artemisinin cho dân số lớn nằm trong các vùng có nguy cơ sốt rét là rất khó, nếu
không muốn nói là bất khả thi, vì phương pháp trích ly có năng suất thấp. Ngoài
ra, kinh phí sản xuất nằm ngoài khả năng tài chính của nhiều nước, nhất là những
nước đang phát triển mà phần lớn bị đe doạ bởi bệnh sốt rét [12].
Vì những khó khăn nêu trên, những nhà nghiên cứu y tế, sinh học đã lưu
tâm đến kỹ thuật tách dòng (cloning) để mong tìm được giải pháp hữu hiệu hơn
nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất lượng lớn artemisinin. Nhưng khác với kỹ thuật
tổng hợp các protein trị liệu đã được áp dụng thành công như insuline, growth
hormone, cytokine, lymphokine, erythropoietin v.v. việc sử dụng phương pháp
tách dòng để tạo hoạt chất artemisinin rất phức tạp. Lý do vì chu trình tổng hợp
hóa chất thiên nhiên như artemisinin cần sự tham gia của nhiều enzyme và sự
phối hợp của những enzyme này để tạo ra hoạt chất. May mắn thay, bộ môn
Synthetic Biology đã ra đời và tổng hợp Amorphadiene (tiền chất của
artemisinin) cũng là ứng dụng thành công đầu tiên của kỹ thuật này cách đây 3
năm ở phòng thí nghiệm của J. Keasling tại Đại học California, Berkely [13].
1.2.7. Phương pháp tổng hợp toàn phần và bán tổng hợp artemisinin
Để khắc phục nhược điểm của artemisinin là khả năng hòa tan kém
cả trong nước lẫn trong dầu của nó, cũng như làm giảm khả năng tái phát
và tăng hiệu lực điều trị người ta đã bán tổng hợp ra hàng loạt các dẫn chất

khác nhau mang trong mình nhóm háo nước, háo dầu từ artemisinin. Với
xu hướng này người ta đã tạo ra một khối lượng khá lớn dẫn xuất của
artemisinin,

sàng

lọc

để

tìm

ra

thuốc

mới.

Trong

số các

thuốc

mới này phải kể đến các hợp chất thuộc dẫn chất của dihydroartemisinin (DHA)
16


là artesunat, artemether, arteether đặc biệt là acid artelinic. Vì đây là chất
vừa hòa tan được trong nước dưới dạng muối, vừa bền vững trong dung

dịch kiềm nên có thể làm thuốc tiêm và theo các nhà khoa học thì đây là
chất có nhiều hứa hẹn trong điều trị [17, 18, 19].
1.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA ART VÀ DẪN XUẤT
1.3.1. Hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét
Sốt rét là căn bệnh do các ký sinh trùng đơn bào Plasmodium gây ra, trong
đó Plasmodium falciparum chiếm phần lớn. Chúng lây lan từ người này sang
người khác thông qua vết cắn của muỗi, ký sinh trùng xâm nhập đầu tiên vào tế
bào gan, sau đó chúng đến các tế bào hồng cầu làm ảnh hưởng đến hệ miễn dịch.
Bệnh sẽ tiến triển nhanh và mạnh hơn khi các ký sinh trùng đó lây lan đến thận,
phổi và não, lúc đó tế bào hồng cầu bị nhiễm làm tắc nghẽn các mạch máu của
não, lấy đi oxy và dẫn đến co giật, bất tỉnh và tử vong [14a].
Artemisinin dùng để điều trị sốt rét có hiệu quả cao, thậm chí với cả ký sinh
trùng sốt rét Plasmodium falciparum đã kháng chloroquin. Khác với các thuốc
sốt rét hiện đang dùng có cấu trúc dị vòng chứa nitrogen, artemisinin là
mộtsesquiterpen lacton có cầu endoperoxid. Cầu nối này rất quan trọng đối với
tác dụng chống sốt rét của thuốc. Artemisinin có tác dụng mạnh đối với thể phân
liệt, nhưng thực tế không có tác dụng trên thể ngoại hồng cầu, thể thoa trùng và
thể giao tử. Artermisinin có tác dụng diệt thể vô tính gây sốt trong hồng cầu,
thuốc ít độc, hấp thụ nhanh nhưng thời gian bán phân hủy cũng ngắn [14a].
Thuốc tập trung chọn lọc vào tế bào nhiễm ký sinh trùng và phản ứng với
hemin (hemozoin) trong ký sinh trùng.In vitro, phản ứng này sinh ra các gốc tự
do độc hại có thể phá hủy các màng của ký sinh trùng. Nhiều thử nghiệm cho
thấy, với artemisinin thời gian cắt cơn sốt và thời gian sạch ký sinh trùng trong
máu nhanh hơn so với cloroquin, quinin, mefloquin hoặc phối hợp mefloquin/
sulphadoxin/ pyrimethamin ở người bệnh sốt rét do kí sinh trùng đơn bào P.
falciparum không biến chứng. Kết quả rõ nhất là với sốt rét do P.
falciparum kháng chloroquin và biến chứng thể não cả ở người lớn và trẻ em.
17

Một trong những vấn đề chủ yếu của artemisinin là tỷ lệ tái phát cao trong vòng
một tháng sau khi điều trị nên có khuynh hướng phối hợp với mefloquin để tránh
tái phát sớm [14a].
1.3.2. Hoạt tính kháng virus
1.3.2.1. Tác dụng chống lại cytomegalovirus ở người (HCMV)
HCMV là nguyên nhân gây bệnh chính ở các bệnh nhân suy giảm miễn
dịch, gồm các bệnh nhân AIDS và những bệnh nhân ghép tạng và là nguyên nhân
nhiễm bẩm sinh phổ biến dẫn đến các bất thường cơ thể như câm điếc bẩm sinh.
Tất cả các thuốc kháng cytomegalovirus có sẵn hiện nay gồm ganciclovir,
foscarnet và cidofovir có đích tác dụng là DNA polymerase của virus [14b].
Dùng các thuốc này bị hạn chế do tính độc, nồng độ hữu dụng trong huyết tương
thấp khi dùng đường uống (ngoại trừ khi uống tiền chất valganciclovir), gây quái
thai, kháng thuốc. Các hạn chế này cùng với quá trình điều trị lặp lại và kéo dài
để điều trị nhiễm HCMV, tạo ra một nhu cầu càng tăng cho việc cần đến các
thuốc kháng virus mới, đặc biệt đối với các thuốc có độ độc tính thấp và hoạt tính
tác dụng chống lại các biến thể HCMV đã kháng thuốc.
Các nhà khoa học Trung Quốc là những người tiên phong trong việc
nghiên cứu vấn đề rằng có thể artemisinincó một hoạt tính kháng virus.
Artesunate đã được chứng minh là một thuốc ức chế nhân lên HCMV hiệu lực
cao và dung nạp tốt, điều này gợi ý về nhu cầu đánh giá thêm về lâm sàng, về vai
trò của artesunate trong điều trị nhiễm HCMV. Artesunate ức chế sự nhân lên
trong ống nghiệm của HCMV và virus herpes simplex type 1 (HSV-1). Kết quả
nghiên cứu được thể hiện trong bảng sau [14b]:
Bảng 1. Bảng kết quả nghiên cứu khả năng ức chế HCMV của artesunate
Kiểm
tra độ
nhạy

Dạng
herpesvirus

Tiểu họ
herpesvirus

Dòng virus

Kiểu phân tích

1

HCMV

B

AD169

Ống nghiệma

2

HCMV

B

AD169

Ống nghiệma

18

Sự ức chế
tại 15 µM,
%

IC50,
µM

3.9±0.6
81

5.8±0.4


3

HCMV

B

Towne

Ống nghiệma

> 99

4

HCMV

B

Các chủng lâm
ở bệnh nhân

Ống nghiệma

82

5

HCMV

B

Các chủng lâm
ở bệnh nhân

Ống nghiệma

69

6

HCMV

B

Đột biến kháng
ganciclovir

Ống nghiệma

7

HCMV

B

Đột biến đa
kháng

Thử lâm sàngb

8

RCMV

β

Maastricht

Ống nghiệma

9

RCMV

β

Maastricht

Mô hìnhc

10

MCMV

β

Smith

Ống nghiệma

15

11

HHV-6A

β

U1102

Ống nghiệmd

76

12

HSV-1

α

Các chủng lâm
ở bệnh nhân

Ống nghiệma

83

13

EBV

γ

B95-8

Ống nghiệmd

63

6.9±0.2

38

3.8±1.0
6

7.21±2.

25

Ghi chú :
EBV: Epstein-Barr virus; HCMV: human cytomegalovirus; HHV-6A: human
herpesvirus

6A;

HSV-1:

herpes

simplex

virus

1;

MCMV:murine

cytomegalovirus; RCMV: rat cytomegalovirus.
a

: Phân tích sự nhân rộng các nguyên bào sợi bị nhiễm sơ cấp của virus

b

: Thử nghiệm lâm sàng với bệnh nhân nhiễm HCMV sau khi ghép tế bào gốc

tạo máu

c

: Sao chép của virus đã phân tích ở chuột suy giảm miễn dịch

d

: Phân tích virus nhân rộng trong tế bào nhiễm lympho.
1.3.2.2. Hoạt tính phổ rộng chống lại các virus Herpes
Hoạt tính kháng virus của artesunate không chỉ hạn chế để phân biệt các

dòng virus phòng thí nghiệm; nó cũng hiệu quả chống lại các dòng được phân lập
19


trên lâm sàng của HCMV và các dòng đột biến với đề kháng chống lại các thuốc
kháng virus qui ước như ganciclovir và cidofovir [14b]. Dữ liệu mới cho thấy
rằng các herpesviruses khác từ tất cả các tiểu họ (α, β, và γ) cũng nhạy cảm với
artesunate - đó là: epstein-Barr virus, herpes simplex virus 1, và human herpes
virus 6A. Các dữ liệu này gợi ý rằng artesunate có một phổ hoạt tính rộng chống
lại herpesviruses. Hiện nay các herpesviruses từng được phân tích có biểu thị
nhạy cảm tương tự với artesunate (IC50 < 10 μM). Một số herpesviruses được
phân tích cho thấy những sự nhạy cảm khác nhau với artesunate và artemisinin;
artemisinin không có tác dụng chống herpesvirus 6A ở người và tác dụng chống
lại HCMV kém. Điều này cho thấy rằng artesunate, một thuốc bán tổng hợp có
tiềm năng kháng herpesvirus hơn là thuốc gốc tự nhiên, artemisinin.
1.3.2.3. Hoạt tính kháng virus viêm gan B (HBV)
Họ Hepadnaviridae gồm một nhóm các virus đặc hiệu cao mà toàn thể
chúng có một DNA polymerase mã hóa virus với tác dụng của một enzyme sao
chép ngược. Một thành viên của họ này là HBV ở người có đặc điểm là có thể
phát triển nhanh ở gan với nồng độ cao. Virus này thuộc giống

Orthohepadnavirus gây viêm gan cấp bùng phát hoặc bệnh gan mãn tính, mà có
thể tiến triển đến xơ gan, cuối cùng là ung thư gan nguyên phát. Mặc dầu có
vaccine viêm gan hiệu lực và an toàn để chống lại HBV thì nhiễm virus này vẫn
còn là một vấn đề sức khỏe chính trên thế giới. Dù đã có nhiều chiến lược dược
học đang được thực hiện hiện nay để điều trị các bệnh nhân bị nhiễm HBV (ví
dụ, dùng IFN và một dẫn xuất nucleoside, lamivudine) nhưng trị liệu kháng virus
hiệu lực chống lại nhiễm HBV đã chưa được phát triển một cách đầy đủ.Trong
một vài nghiên cứu gần đây, artesunate được báo cáo là có hoạt tính kháng HBV
ở giá trị IC50 = 0,5 µM [14b].
1.3.2.4. Hoạt tính chống lại virus viêm gan C (HCV)
Nhiễm virus viêm gan C thường gây ra viêm gan mãn tính, mà có thể tiến
triển đến xơ gan và ung thư gan nguyên phát. Vấn đề trở nên nghiêm trọng do
thiếu vaccine hiệu lực chống lại virus viêm gan C và vì thuốc điều trị ngoài các
20


tác dụng không mong muốn và không hiệu quả đối với một nửa bệnh nhân bị
nhiễm. Paeshuyse và cộng sự báo cáo rằng artemisinin ức chế sự nhân lên HCV
tại các nồng độ khác nhau. Artemisinin được báo cáo có hoạt tính hợp lực kháng
virus mà không gây ảnh hưởng đến các tế bào vật chủ [14b].
1.3.2.5. Hoạt tính kháng HIV-1
Artesunate được thông báo là có hoạt tính chống HIV-1. Sự ức chế một
phần được biểu thị trên 2 dòng của HIV-1, dòng HIV-1 ái tính CCR5 (ái tính M)
trong Ba-L (trong các tế bào PM1) và dòng HIV-1 ái tính CXCR4 (ái tính T)
trong NL4–3 (trong các tế bào Jurkat). Sự nhân lên của cả hai dòng HIV-1 bị ức
chế một phần bởi artesunate ở 600 nM. Birku và cộng sự [15] đã nghiên cứu hiệu
quả của artemisinin diệt ký sinh trùng Plasmodium falciparum ở các bệnh nhân
có hoặc không đồng nhiễm HIV. Điều thú vị, Birku và cộng sự quan sát thấy rằng
các bệnh nhân nhiễm HIV cho thấy sự đào thải P.falciparum bị trì hoãn, điều này
cho thấy rằng sự khoẻ mạnh của hệ miễn dịch vật chủ ảnh hưởng đến hoạt tính

của thuốc kháng sốt rét [15]
1.3.3. Hoạt tính kháng u
ART và hàng loạt dẫn xuất đang được nghiên cứu và thử nghiệm in vitro
về tác dụng điều trị ung thư gan, ung thư ruột kết, trực tràng hay ung thư vú. Các
nhà khoa học Trung Quốc đã thử nghiệm hoạt tính sinh học và báo cáo tác dụng
chống ung thư quan trọng đối với tế bào gan ở người. Trong cấu trúc ART và dẫn
xuất có chứa cầu peroxide, khi cầu peroxide tiếp xúc với nồng độ sắt cao (phổ
biến trong các tế bào ung thư), các phân tử trở nên không ổn định và xảy ra phản
ứng oxy-hóa khử. Các tác động tới tế bào ung thư được mô tả theo các bước [16]:
- Ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư, gây chết tế bào theo chu trình
- Ức chế quá trình tạo mạch đến các tế bào ung thư
- Làm gián đoạn quá trình di căn của ung thư
- Điều chỉnh lại thụ thể trong nhân tế bào trước các nhiễu loạn tín hiệu bên
ngoài tác động lên tế bào.
21


1.4. MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA ARTEMISININ
Mặc dù ART đã được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh sốt rét
nhưng vẫn còn nhiều hạn chế bởi sinh khả dụng thấp, hấp thu kém, kém tan trong
nước … dẫn đến hiệu quả chưa cao. Vì vậy, bán tổng hợp các dẫn xuất của ART
đã và đang được phát triển. Hiện nay, đã có rất nhiều loại dẫn xuất của ART được
tổng hợp thành công, đặc biệt trong đó phải kể đến các hợp chất tiêu biểu sau:
1.4.1. Một số dẫn xuất điển hình và ứng dụng
1.4.1.1. Dẫn xuất dihydroartemisinin (DHA) (2)
Dihydroartemisinin được điều chế bằng khử hóa ART bằng NaBH4 trong
MeOH ở nhiệt độ 0-5oC. Sản phẩm thu được ở dạng hỗn hợp 2 đồng phân, được
sử dụng cho nhiều chuyển hóa khác nhau [17].

1

2

Sơ đồ 1: Tổng hợp DHA từ ART
1.4.1.2. Dẫn xuất artemether (ARM) (3)
Dẫn xuất ARM được bán tổng hợp từ DHA bằng phản ứng ete hóa giữa
DHA và CH3OH, với sự có mặt của xúc tác acide Lewis hoặc acide proton, thời
gian phản ứng trong khoảng 5-10h, hiệu suất phản ứng đạt khoảng 90% [18,19].

+ CH3OH
BF3(Et)2O

3

2

Sơ đồ 2: Tổng hợp ARM từ DHA
22


1.4.1.3. Dẫn xuất artesunate (ARS) (4)
ARS được bán tổng hợp bằng cách cho DHA phản ứng với anhydride
succinic trong dung môi là pyridine và 4-dimethylamino pyridine ở nhiệt độ 3040oC trong vòng 5-8 giờ [18,19].

Pyridine,

+
30-400C, 5-8h

2

2

Sơ đồ 3: Tổng hợp ARS từ DHA

4

1.4.2. Một số dẫn xuất khác có hoạt tính của ART
1.4.2.1. Dẫn xuất ete, este
Trong số các hợp chất tổng hợp ra và thử nghiệm sinh học và lâm sàng cho
tới nay, ba dẫn xuất ete và este đã thành thuốc là artesunate, artemether và
arteether. Artesunate có tác dụng mạnh hơn artemisinin 5,5 lần, có thể tan hoàn
toàn trong nước nên có thể làm thuốc tiêm lẫn thuốc viên. Còn artemether,
arteether có tác dụng gấp 2,5 lần artemisinin, có thể tan trong dầu nên có thể chế
thành thuốc tiêm trong dầu để sử dụng cho các bệnh nhân hôn mê hoặc bị sốt
nặng [18].
Ngoài tác dụng trị sốt rét hiệu quả cao hơn nhiều lần so với artemisinin,
các dẫn xuất ete và este của artemisinin còn có hoạt tính gây độc tế bào với một
số dòng ung thư khác nhau như HepG2 (tế bào ung thư gan), LS174T (tế bào ung
thư trực tràng). Các dẫn xuất ete và este tiêu biểu của artemisinin như [19]:

ART

AD1

ARS, AD2-8
23

DHA

Bảng 2. Các dẫn xuất ete và este của artemisinin
Mã

Tên

R

ART Artemisinin

-

ARS

COCH2CH2COOH

Artesunate

DHA Dihydroartemisinin

H

AD1

Anhydrodihydroartemisinin

-

AD2

10-dihydroartemisinyl acetate

COCH3

AD3

10-dihydroartemisinyl butyrate

COCH2CH2CH3

AD4

10-(2’-butyloxy) dihydroartemisinin

CH2CH(CH3)2

AD5

10-dihydroartemisinyl 2’-propylpentanoate

COCH(C3H7)2

AD6

10-dihydroartemisinyl 2’,2-dimethylpropionate

COC(CH3)3

AD7

10-dihydroartemisinyl perfluoropropionate

COC2F5

AD8

10-dihydroartemisinyl dimethylcarbamate

CON(CH3)2

1.4.2.2. Dẫn xuất 10-triazoleartemisinin
10-triazoleartemisinin là một dẫn xuất đầy hứa hẹn. Các thử nghiệm in
vitro cho thấy hầu hết các hợp chất này đều thể hiện hoạt tính ức chế mạnh sự
tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư khác nhau. Hiện nay các nhà khoa học
đang nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tối ưu khác để tổng hợp dẫn xuất
này. Trong đó phải kể đến phương pháp của Seokjoon Lee cùng cộng sự [20,21].
Theo sơ đồ này, từ nguyên liệu ban đầu là DHA (2) đem phản ứng với
NaN3 trong dung môi CH2Cl2 với sự có mặt của xúc tác là trimethylsilyl bromide
thu được sản phẩm là hỗn hợp 5, 6, 7. Sau đó đem từng sản phẩm phản ứng với
các R-alkyl (a-h) trong hỗn hợp dung môi là CH2Cl2 : H2O (tỉ lệ 1:1) sử dụng xúc
tác CuSO4, L-sodium ascorbate thu được sản phẩm 8, 9 và 10.

24


TMSBr, NaN3

2

+

+

DCM

5

7

6
CuSO4
Sodium ascorbate
CH2Cl2 : H2O (1:1)

8

9

10

Sơ đồ 4: Tổng hợp các dẫn xuất triazole của ART
Trong đó gốc R bao gồm:

a

e

b

c

f

g

d

h

Cũng theo hướng này, gần đây Trần Khắc Vũ và cộng sự cũng đã tổng hợp
một loạt các triazole mới của artemisinin và đánh giá hoạt tính kháng u với một
số dòng tế bào ung thư. Một số dẫn xuất thể hiện hoạt tính ức chế khá tốt ở mức
micromol [22].

25