Xác định đồng thời một số kháng sinh quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH
QUINOLON TRONG TÔM VÀ NƢỚC NUÔI TÔM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON
TRONG TÔM VÀ NƢỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH
MÃ SỐ: 60440118

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

HÀ NỘI, 2015

LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian nghiên cứu và học tập tôi đã hoàn thành luận văn cao học
của mình với đề tài: “Xác định đồng thời một số kháng sinh quinolone trong tôm và
nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” dưới sự
hướng dẫn chỉ bảo của PGS. TS Lê Thị Hồng Hảo và các thầy cô, anh chị, các bạn
trong bộ môn Hóa phân tích.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS
Lê Thị Hồng Hảo người đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tôi trong quá trình hoàn
thành luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS Kazuo
HARADA khoa Dược Trường ĐH OSAKA Nhật Bản
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn hóa phân
tích, các ban học viên lớp cao học K24 đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong thời gian
thực hiện đề tài.
Đồng thời tôi cũng xin được cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Pasteur Nha
Trang, Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm khu vực
miền Trung cùng các bạn đồng nghiệp. Xin được cám ơn lãnh đạo và nhân viên chi
Cục Nuôi trồng và Bảo vệ nguồn lợi thủy sản Khánh Hòa đã giúp tôi thực hiện việc
thu thập mẫu thực hiện đề tài.
Trong quá trình thực hiện khóa luận, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng
không tránh khỏi những thiếu sót kính mong ý kiến chỉ bảo, phê bình của quí thầy cô.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng 11 năm 2015

Học viên

Đào Thị Vân Khánh

i

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ---------------------------------------------------------------------------------------1
Chƣơng I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU -----------------------------------------------3
1. 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon ------------------------------------------3
1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon -----------------------------------------3
1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính ------------------------------------------------------5
1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon ----------------------6
1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước-------6
1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới ------8
1.3 Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất nhóm quinolon ------------ 10
1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) --------------------------------------- 10
1.3.2 Phương pháp vi sinh vật---------------------------------------------------------- 11
1.3.3 Phương pháp hóa lý -------------------------------------------------------------- 13
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ------------------------------------------------------------------ 21
2.2 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu ------------------------------------------------- 22
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu ------------------------------------------------------------ 22
2.2.2 Nội dung nghiên cứu -------------------------------------------------------------- 22
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ------------------------------------------------------------ 21
2.3.1 Khảo sát quy trình tối ưu phân tích đồng thời 7 quinolon ------------------- 21
2.3.2 Phương pháp lấy mẫu ------------------------------------------------------------ 23
2.3.3 Xử lý số liệu ------------------------------------------------------------------------ 23
2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu -------------------------- 23
2.4.1. Thiết bị và dụng cụ --------------------------------------------------------------- 23
2.4.2 Hóa chất, chất chuẩn ------------------------------------------------------------- 24

ii

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ---------------------------------------- 25
3.1 Tối ƣu các điều kiện trên thiết bị HPLC ------------------------------------------ 25
3.1.1 Khảo sát bước sóng kích thích và phát xạ của các chất --------------------- 27
3.1.2 Khảo sát pha động ------------------------------------------------------------------29
3.1.3 Khảo sát khoảng tuyến tính của các chất chuẩn -------------------------------36
3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu phân tích ------------------------------------ 36
3.2.1 Giai đoạn làm sạch mẫu sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) ----------------- 36
3.2.2 Khảo sát giai đoạn chiết mẫu --------------------------------------------------- 42
3.3 Thẩm định phƣơng pháp ------------------------------------------------------------- 45
3.3.1 Độ đặc hiệu------------------------------------------------------------------------ 46
3.3.2 Giới hạn phát hiện(LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ---------------------- 48
3.3.3 Độ lặp lại, độ thu hồi ------------------------------------------------------------ 50
3.4. Kết quả phân tích đánh giá dƣ lƣợng kháng sinh ------------------------------ 52
3.4.1. Thu thập mẫu tôm nuôi và nước nuôi tôm ------------------------------------ 52
3.4.2 Kết quả phân tích mẫu ----------------------------------------------------------- 53
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN-------------------------------------------------------------- 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ---------------------------------------------------------------- 57

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Công thức cấu tạo và pKa của các chất ...............................................4
Bảng 1.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC
No.2377/1990 .......................................................................................................6
Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHNBNNPTNT ............................................................................................................6
Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số
46/2007/QĐ-BYT .................................................................................................6
Bảng 1.5: Lượng kháng sinh tiêu thụ và sản phẩm thịt phát hiện có chứa kháng
sinh quinolon ........................................................................................................9

Bảng 3.6: Bước sóng kích thích và phát xạ 07 chất phân tích ...........................29
Bảng 3.7: Chương trình gradient dung môi pha động tối ưu .............................36
Bảng 3.8: Phương trình hồi qui và hệ số tương quan của các chất phân tích ....37
Bảng 3.9 : So sánh diện tích píc dung dịch chuẩn bay hơi và không bay hơi ....39
Bảng 3.10: So sánh độ thu hồi giữa cột SPE C18 và cột HLB ..........................40
Bảng 3.11: Độ thu hồi theo thể tích mẫu nước ban đầu .....................................43
Bảng 3.12: Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với nền mẫu nước ............51
Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến ...................................................................52
Bảng 3.14 : Độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu nước thêm chuẩn ...........................53
Bảng 3.15: Độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu tôm thêm chuẩn .............................54
Bảng 3.16: Danh sách mẫu nước phát hiện chứa tồn dư kháng sinh .................55

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon .......................................................................... 3

Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon ........................................... 3
Hình 1.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon .................................... 4
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định quinolon trong nước và trong tôm .................. 23
Hình 3.5: Phổ hấp thu và phát xạ của 07 chất phân tích........................................28
Hình 3.6: Kết quả khảo sát với 3 hệ dung môi ......................................................30
Hình 3.7: Sắc ký đồ OA và FMQ tại tốc độ dòng: 1,0; 1,5; 2,0mL/phút ..............32
Hình 3.8: Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký theo pH của dung dịch đệm pha
động .......................................................................................................................33
Hình 3.9: Sắc ký đồ 07 chất phân tích ở 3 nồng độ đệm .......................................34
Hình 3.10: Sắc ký đồ tách 07 chất nhóm quinolon ................................................35
Hình 3.11: So sánh diện tích pic các chất khi dùng các dung dịch rửa cột SPE ...41
Hình 3.12: Độ thu hồi theo thể tích rửa giải ..........................................................42

Hình 3.13: Sơ đồ chiết mẫu dự kiến ......................................................................44
Hình 3.14: Sắc ký đồ nền mẫu trắng chiết bằng 3 loại dung môi ..........................45
Hình 3.15: Biểu đồ so sánh 3 dung dịch chiết ......................................................45
Hình 3.16: Khảo sát pH của dung dịch chiết .........................................................46
Hình 3.17: Mẫu trắng nước nuôi tôm và nước nuôi tôm thêm chuẩn ...................49
Hình 3.18: Nền mẫu tôm thêm chuẩn và mẫu tôm ................................................49
Hình 3.19: Sắc ký đồ mẫu nước xác định LOD.....................................................51
Hình 3.20: Sắc ký đồ mẫu tôm xác định LOD ......................................................52
Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu tôm có phát hiện nhiễm ERFX ...................................56

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

Hiệp hội các nhà phân tích hóa học (Association of Official
Analytical Chemists)

ATVSTP

An toàn vệ sinh thực phẩm

BYT

Bộ Y tế

CPFX

Ciprofloxacin

DFLX

Difloxacin

DNFX

Danofloxacin

DAD

Diot Array Detector

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA

Phương pháp miễn dịch enzym (enzyme-linked immunosorbent
assay)

ERFX

Enrofloxacin

HLB

Hydrophilic Lipophilic Balanced (cột cân bằng ưa nước ưa dầu)

FMQ

Flumequine

FDA

Hiệp hội thuốc và thực phẩm (Food and Drug Administration)

FLD

Deetecor huỳnh quang (Fluorescence detector)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-pressure liquid chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitaion)

MPC

Chiết cation hỗn hợp (Mixed-phase cation)

NRFX

Norfloxacin

vi


MRL

Mức dư lượng tối đa (Maximum Residue Levels)

MeOH

Methanol

MeCN

Acetonitrile

MS

Khối phổ (Mass Spectrophotometer)

MBFX

Marbofloxacin

OFLX

Ofloxacin

OA

Oxolinic acid

SRFX

Sarafloxacin

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SPE

Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

QuEChERS

Đơn giản, Dễ dàng, Rẻ, Hiệu quả, Ổn định, An toàn (Quick, Easy,
Cheap, Effective, Rugged and Safe)

RT

Thời gian lưu (Retention Time)

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
(Ultra performance liquid chromatography)

WHO

Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organisation)

Ex

Bước sóng kích thích (ExcitationWavelenght)

Em

Bước sóng phát xạ (EmissionWavelenght)

vii


MỞ ĐẦU
Vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm của toàn xã hội,
của mọi quốc gia trên toàn thế giới. Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh không
những ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất
lao động, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh xã hội...
Trong những năm gần đây sự xuất hiện dư lượng kháng sinh trong thủy hải
sản và thịt gia súc, gia cầm đã ít nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân. Tác
hại của thực phẩm có tồn dư kháng sinh đối với sức khỏe con người đã được nhiều
nghiên cứu chỉ ra như: tạo ra vi khuẩn kháng kháng sinh, gây dị ứng, gây quái thai,
gây rối loạn nội tiết và gây ung thư ở người. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO), Việt Nam nằm trong danh sách các nước có có tỷ lệ sử dụng kháng
sinh cao nhất thế giới hiện nay, không chỉ sử dụng cho con người, các chất kháng

sinh còn được sử dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi. Quinolon (hay còn được gọi
là fluoroquinolone) là một họ kháng sinh có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả
cao nên chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ để chữa bệnh cho người mà còn
được dùng để chữa bệnh cho gia cầm và thủy sản trong công nghiệp. Hậu quả là
giảm hiệu quả của các kháng sinh quinolon đối với các chủng vi khuẩn gây khó
khăn và tốn kém trong điều trị cho người bệnh. Theo thông báo của WHO năm
1999 có tới 11.000 người bị nhiễm khuẩn Campylobacter đã kháng quinolon do ăn
thịt gà có chứa quinolon (năm 1998 là 8.000 người).
Có nhiều phương pháp để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolon như:
phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật),
phương pháp lý hóa. Phương pháp lý hóa sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc
ký lỏng, điện hóa hòa tan, điện di mao quản, các phương pháp đều có độ chính xác,
độ chọn lọc cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm.
Phương pháp được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) sử dụng các loại detector như detector UV, detector huỳnh quang (FLD) và
detector khối phổ (MS).
Việc ứng dụng phương pháp HPLC phân tích nhóm quinlon trong các mẫu

1


môi trường và thực phẩm đã được làm nhiều trên thế giới nhưng ở Việt Nam sử
dụng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang vẫn còn hạn chế đặc biệt là tách
đồng thời nhiều chất với Việt Nam hiện nay chưa có quy trình chính thống nào.
Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở các nghiên cứu khoa học trong và ngoài
nước đã được công bố, với mục đích gia tăng số lượng chất xác định, sử dụng thiết
bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu đề tài:
“Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước
nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao”.

2


Chƣơng I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1. 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon
1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon
Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolon là hợp chất vòng thơm có chứa
nitơ, vị trí thứ 4 có gắn nhóm keton, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn
xuất của quinolon gồm những hợp chất ở các vị trí 1, 2, 6, 8 được gắn thêm các
nhóm thế. Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm
F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [38, 39, 47, 52, 54].

Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon
Do có nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên các chất nhóm quinolon mang tính
acid. Một số quinolon có thêm nhóm amin khác nên có thêm tính base. Chúng tan
trong lipid và thấm được qua màng tế bào. Có thể chia nhóm quinolon thành hai
loại dựa trên pKa: acidic quinolon (AQ) và piperazinyl quinolon (PQ)
- Acidic quinolon: chỉ có một giá trị pKa trong khoảng 6,0 đến 6,9. Trong
nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những
quinolon thuộc thế hệ thứ nhất.
- Piperazinyl quinolon: có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5,5–6,6 và pKa2
khoảng 7,2–8,9. Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation,
dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là danofloxacin, difloxacin, norfloxacin,
ofloxacin, benofloxacin, marbofloxacin, acid pipemidic.

Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon
3

Hình 1.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon
Bảng 1.1: Công thức cấu tạo và pKa của các chất
STT

Tên chất

1

Ciprofloxacin

Công thức cấu tạo

pKa
pKa1: 6,09
pKa2: 8,62

2

Danofloxacin

pKa1: 6,20
pKa2: 9,40

3

Erofloxacin

pKa1: 6,1
pKa2: 7,7

4

Sarafloxacin

pKa1: 5,6
pKa2: 8,2

5

pKa1: 5,7 – 6,1

Difloxacin

pKa2: 7,2 – 7.6

6

Oxolinic acid

pKa: 6,9

7

Flumequine

pKa: 6,5

4

1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính
Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân
bố hầu hết các cơ quan: phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não
tủy... và qua được hàng rào nhau thai. Fluoroquinolon đào thải chủ yếu qua đường
tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận [16, 52].
Cơ chế tác động của fluoroquinolon lên vi khuẩn là ức chế tổng hợp acid
nucleic. Sự nhân đôi DNA bắt đầu bằng phản ứng tách chuỗi DNA ra làm hai, mỗi
bên là một khuôn để gắn nucleotid thích hợp theo nguyên tắc bổ sung.
Enzym DNA polymeras xúc tác sự tổng hợp các liên kết giữa các nucleotid;
enzym DNA gyrase nối các DNA trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng
xoắn. Các quinolon (nalidixic acid và các fluoroquinolon) ức chế mạnh sự tổng hợp
DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzym DNA gyrase. Cơ chế tác động này
hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm. Nhưng cũng có thể do cơ chế ức
chế tổng hợp acid nucleic này mà kháng sinh nhóm fluoroquinolon được cho là có
nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai do đó
khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolon cho động vật
mang thai, động vật sinh sản và làm giống. Ngoài ra các nghiên cứu trên động vật
còn non cho thấy các kháng sinh thuộc nhóm này gây hủy hoại các khớp sụn [34,
54] do đó các kháng sinh nhóm quinolon không được sử dụng trong điều trị bệnh
cho trẻ em.
1.1.3 Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon
Ngày 26/6/1990 Uỷ ban An toàn thực phẩm Châu Âu chính thức ban hành
Quyết định 2377/1990[26] trong đó qui định mức giới hạn tối đa các chất kháng
sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật trong đó giới hạn nhóm quinolon trong
các sản phẩm có nguồn gốc động vật bao gồm:

5


Bảng 1.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990

Tên kháng sinh
Lợn (ppb)
Bò, dê, cừu(ppb)
Danofloxacin
100
200
Difloxacin
400
400
Enrofloxacin
100
100
Flumequin
200
200
Marbofloxacin
150
150
Oxolinic acid (*)
100
(*) Giới hạn cho phép trong cá 100ppb

Gà(ppb)
200
300
100
400
100

Tại Việt Nam, Thông tư số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25 tháng 02năm 2014

quy định Danh mục các loại kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng [1], theo
đó các kháng sinh fluoroquinolon bị cấm sử trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản xuất
khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ, ciproxacin và ofloxacin bị cấm sử dụng trong

chăn nuôi thú y, các chất nằm trong danh mục hạn chế sử dụng bao gồm:
Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHN-BNNPTNT

Tên kháng sinh
Danofloxacin
Difloxacin
Flumequin

Tên kháng sinh
Ciprofloxacin
Oxolinic Acid
Sarafloxacin

MRL (ppb)
100
300
600

MRL (ppb)
100
100
30

Hiện nay, theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007
về quy định mức giới hạn ô nhiễm hóa học và vi sinh vật trong thực phẩm, Bộ Y tế
cũng đã đưa ra mức giới hạn của 4 kháng sinh nhóm quinolon là danofloxacin,

enrofloxacin, flumequine, sarafloxacin.
Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT

Tên kháng sinh
ADI (μg/kg thể trọng/ngày)
MRL (μg/kg)
Danofloxacin
0 - 20
50 (gan lợn); 100 (thịt)
Enrofloxacin
0-3
100
Flumequine
0 - 30
500 (thịt, gan, cá)
Sarafloxacin
0 - 0,3
10 (thịt); 80 (gan, thận)
1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon
1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước
Mặc dù các kháng sinh nhóm quinolon đã được các cơ quan chức năng quản
lý chặt nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thực phẩm trong nước và ngay cả thực

6


phẩm xuất khẩu vẫn bị phát hiện có chứa tồn dư loại kháng sinh này. Việc tồn dư
kháng sinh ở hàm lượng cao cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong thời gian
dài với hàm lượng lớn đồng thời người chăn nuôi không đảm bảo thời gian cách ly
hợp lý đối với vật nuôi trước khi thu hoạch.

Nhiều nghiên cứu trong nước đã khảo sát tình hình sử dụng các loại kháng
sinh trong chăn nuôi, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy sự lạm dụng kháng sinh
là rất phổ biến và tồn dư trong thực phẩm (kể cả đối với những chất đã bị cấm sử
dụng) vẫn chiếm tỷ lệ đáng kể [4, 5, 6, 8, 9]. Người chăn nuôi sử dụng nó dưới
nhiều hình thức khác nhau hoặc phối trộn trực tiếp vào trong thành phần của thức ăn
hoặc đưa vào môi trường nuôi như một hình thức phòng bệnh. Theo nghiên cứu của
Takahiro Yamaguchi đối với các mẫu lợn, bò, gà, tôm và cá nuôi thu thập tại các
tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Khánh Hòa, TP. HCM năm 2012-2013 của cho thấy có tới
7,7% số mẫu được kiểm nghiệm phát hiện nhiễm enrofloxacin (ERFX) với hàm
lượng từ 12–77ppb điều này cho thấy mặc dù đã bị cấm nhưng bằng con đường nào
đó các kháng sinh này vẫn đi vào mẫu thực phẩm để đến với người tiêu dùng [57].
Theo báo cáo của chính phủ Úc năm 2008, thủy sản nhập khẩu của Việt
Nam vào thị trường nước này được giám sát rất chặt chẽ và đã phát hiện những lô
hàng nhiễm kháng sinh quinolon bao gồm ERFX và ciprofloxacin (CPFX) với mức
nhiễm lần lượt là 8,5 – 35 và 2,0 – 33ppb [12].
Các nghiên cứu trên cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
và tồn dư các chất này trong sản phẩm thực phẩm không có dấu hiệu cải thiện, theo
báo cáo kết quả công tác quản lý chất lượng an toàn thực phẩm 9 tháng đầu năm
2015 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn có tới 1,01% mẫu thủy sản nhiễm
dư lượng hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng vượt ngưỡng cho phép và 7,6% mẫu
thịt có dư lượng hóa chất, kháng sinh vượt ngưỡng.
Đối với các mẫu môi trường, tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu đánh giá thực
trạng tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong môi trường. Theo nghiên cứu năm
2006 của TS. Dương Thị Hồng Anh về phân tích đánh giá sự có mặt của các kháng
sinh họ fluoroquionolon trong nước thải bệnh viện, đã phát hiện thấy hàm lượng
kháng sinh ciproxacin và norfloxacin trong nước thải chưa xử lí và đã xử lí tại bệnh
7


viện Hữu Nghị với nồng độ từ 3,5 tới 50,3 µg/L trong đó nồng độ ciproxacin cao

hơn norfloxacin từ 3-5 lần [2].
Năm 2014, cũng theo nghiên cứu của TS. Dương Thị Hồng Anh và cộng sự,
đối với các mẫu nước, bùn, tôm được lấy tại các điểm trong ao nuôi, dọc kênh và
rừng ngập mặn tiếp giáp ở khu vực nuôi tôm quảng canh thuộc xã Giao An, Giao
Thủy, Nam Định vào hai thời điểm thả tôm giống và thu hoạch. Dư lượng kháng
sinh CPFX và norfloxacin (NRFX) được phân tích trong các mẫu sử dụng phương
pháp chiết pha rắn, chiết lỏng áp suất cao và xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao với detector huỳnh quang. Chỉ có dư lượng ciprofloxacin được tìm thấy trong
nước và bùn ở các khoảng nồng độ lần lượt là 0,06 – 0,35 µg/L và 0,22 – 0,40 µg/g.
Kết quả phân tích tại thời điểm đầu vụ nuôi tôm cho thấy người nuôi trồng đã sử
dụng CPFX để khử trùng nước và môi trường. Trong mẫu tôm sản phẩm thu tại khu
vực này không phát hiện thấy CPFX và NRFX [3].
1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy tình hình sử dụng và tồn dư
kháng sinh nhóm quinolon ở mức độ báo động. Theo báo cáo năm 2006 của Tổ
chức đánh giá dược phẩm Châu Âu (European Medicines Evaluation Agency), tổng
lượng kháng sinh quinolon tiêu thụ và khối lượng sản phẩm thịt có chứa kháng sinh
nhóm quinolon tại một số quốc gia được thống kê như sau [27]:
Bảng 1.5: Lượng kháng sinh tiêu thụ và sản phẩm thịt phát hiện có chứa kháng sinh quinolon
Tên nƣớc

Cộng hòa Séc
Đan Mạch
Phần Lan
Pháp
Hà Lan
Tây Ban Nha
Thụy Điển
Anh

Tổng lƣợng kháng sinh
tiêu thụ (tấn)
Fluoro
Nhóm
-quinolon
quinolon
0,8
1
0,1
0,1
<0,1
<0,1
3,6
20,7
0,3
5,0
3,6
0,2
0,2
1,4

Tổng lƣợng sản phẩm thịt (tấn)
Bò

Lợn

Gia cầm

103775
147600

95830
1631000
364000
118524
136300
687000

409102
1762000
193222
2321000
1250000
315141
287500
690000

215802
199994
83730
2010700
564000
229335
99850
1569987

8

Tổng
cộng
728679

2109595
372782
5962700
2178000
663000
523650
2946987


Khảo sát của tác giả Pavlína Navrátilová năm 2011 tại Cộng hòa Séc trong
sữa bò nguyên liệu cho thấy có tới 87,3% số mẫu (n=150) được nghiên cứu phát
hiện nhiễm kháng sinh nhóm này [46]. Hoặc tại vùng Ankara Thổ Nhĩ Kỳ năm
2013 cũng phát hiện tới 118 mẫu/231 mẫu phát hiện dương tính với kháng sinh
nhóm quinolon trong đó thịt gà là 58 mẫu chiếm 45,7% và thịt gà là 60 mẫu chiếm
57,7% [15]. Tại Hàn Quốc khảo sát với 388 mẫu thực phẩm cho thấy có 3,1% số
mẫu phát hiện tồn dư ERFX, CPFX và NRFX với hàm lượng cao: đối với ERFX từ
0,01 đến 0,73 mg/kg, đối với CPFX từ 0,01 đến 0,03 mg/kg; NRFX phát hiện trong
một mẫu ở mức 0,12 mg/kg [19].
Cũng theo nghiên cứu năm 2013 của Silfrany và cộng sự tại Santiago đối với
135 mẫu thịt gà thu thập tại 9 thành phố đã phát hiện tỷ lệ mẫu nhiễm kháng sinh
nhóm quinolon từ 6,25 đên 50% đối với 4/9 địa điểm thu thập mẫu. Nghiên cứu sử
dụng phương pháp ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.Coli để phát hiện sự có mặt
của kháng sinh nhóm quinolon trong mẫu [48].
Theo nghiên cứu mới nhất của Omotoso Adekunbi năm 2015 tại Nigeria, đối
với 320 mẫu thịt xác định các chất CPFX, NRFX, ofloxacin (OFLX) cho thấy có tới
50% mẫu thịt bò, 55% mẫu thịt gà, 40% thịt lợn và 40% mẫu thịt dê phát hiện có
chứa kháng sinh nhóm quinolon [45].
Như vậy có thể thấy rõ tình hình sử dụng kháng sinh quinolon trong chăn
nuôi rất phổ biến và tồn dư của nó trong thực phẩm là điều đáng lo ngại ảnh hưởng
lớn đến sức khỏe người tiêu dùng.

Các nghiên cứu về kháng sinh trong môi trường cho thấy sự có mặt của các
chất này ở rất nhiều các khu vực khác nhau, nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Trung
Quốc nguồn nước cấp cho sinh hoạt [56], nước vùng cảng, nước sông [53], nước
thải bệnh viện đã qua xử lý [55] đều thấy có sự hiện hiện ở hàm lượng cao kháng
sinh nhóm quinolon.
Ngay tại Mỹ, một quốc gia phát triển có sự quản lý chặt chẽ về nguy cơ ô
nhiễm môi trường, nghiên cứu của H. Nakata và cộng sự năm 2004 cũng phát hiện
có ofloxacin trong mẫu với hàm lượng cao nhất là 204ppb. Trong nghiên cứu của
mình, tác giả cũng đã so sánh kết quả phát hiện với một số quốc gia Châu Âu trong
9


các nghiên cứu tương tự. Theo đó mức phát hiện OFLX và lomefloxacin (LMFX) ở
các quốc gia như Pháp (330–510ppb; 180–290ppb), ở Ý (290–580ppb; 180–
320ppb), ở Hy Lạp (460ppb; 290ppb) [33].
Tại Canada, kết quả khảo sát tại 8 hồ xử lý nước thải cho thấy chỉ có 40%
lượng kháng sinh nhóm quinolon giảm xuống sau khi xử lý. Mẫu sau xử lý được
thải trực tiếp ra môi trường vẫn chứa hàm lượng trung bình của CPFX và OFLX lần
lượt là 146 và 179ng/L [32].
1.3 Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất nhóm quinolon
Nhiều phương pháp được sử dụng để xác định các chất nhóm quinolon như:
phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật
học), phương pháp lý hóa. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng.
1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA)
Với ưu thế thời gian phân tích ngắn, các thao tác thí nghiệm đơn giản, có thể
thực hiện tại hiện trường, phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng
nguyên-kháng thể đã trở thành một công cụ khá hiệu quả và được các cơ quan thẩm
quyền chấp thuận cho phép sử dụng với lục đích sàng lọc. Liên minh Châu Âu (tại
Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích sàng
lọc dư lượng các hóa chất kháng sinh cấm.

Với mục đích đưa việc xác hàm lượng sparfloxacin vào xét nghiệm cận lâm
sàng, nghiên cứu của Hua-Jin Zeng và cộng sự năm 2011 đã sử dụng kháng thể thu
được từ việc tạo miễn dịch với sparfloxacin trên thỏ kết hợp với huyết tương bò.
Sau khi tối ưu hóa, phương pháp xác định hàm lượng sparfloxacin từ 5ng/mL đến
2mg/mL với độ thu hồi từ 87,7 đến 106,2% [31].
Các nghiên cứu của Jiang Jinqing năm 2011, sử dụng phương pháp ELISA
gián tiếp để xác định SRFX, difloxacin (DFLX), NRFX và pefloxacin trên nền mẫu
cá dựa vào phản ứng của kháng thể SRFX. Khoảng xác định đối với SRFX trong
dịch chiết từ 0,004 đến 18 ng/mL giới hạn phát hiện 0,002 ng/mL [35]. Đối với nền
mẫu gan gà tác giả cũng đã xác định được hàm lượng NRFX với khoảng xác định từ
0,006 đến 38 ng/mL giới hạn phát hiện 0,04 ng/mL độ thu hồi đạt 90-117,8% [35].
Năm 2012, cũng với kỹ thuật ELISA gián tiếp, tác giả đã tiếp tục phát triển phương
10


pháp cho việc xác định CPFX trong mẫu sữa bò với khoảng xác định từ 0,036 đến
92,5 ng/mL với giới hạn phát hiện là 0,019 ng/mL, hệ số tương quan đạt 0,9844
[36].
Tại Việt Nam, Phạm Kim Đăng và cộng sự đã sử dụng kít ELISA do CER
Vương Quốc Bỉ sản xuất để phân tích tồn dư kháng sinh quinolon trong tôm tại một
số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc. Phương pháp được khẳng định lại bằng phương
pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS). Kết quả cho thấy, bộ kít rất ổn định để
phân tích các quinolon được thử và trong tôm với giới hạn nồng độ phát hiện là
0,07ppb. Tác giả cũng cho rằng khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện
phòng thí nghiệm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định
lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002). Tuy
nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolon và xác định nồng độ chính xác cần
phải khẳng định lại bằng các phương pháp lý hoá khác [4] .
1.3.2 Phương pháp vi sinh vật
Phương pháp dựa vào sự biến đổi màu sắc của chất chỉ thị được bổ sung

vào môi trường trước và sau khi thêm mẫu phân tích. Những mẫu có chứa kháng
sinh sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn và không làm đổi màu chất chỉ thị. Ngược
lại đối với mẫu không chứa kháng sinh hoặc chứa với lượng nhỏ hơn giới hạn phát
hiện, sau thời gian ủ vi khuẩn phát triển làm thay đổi điều kiện môi trường khi đó
màu của chất chỉ thị sẽ khác so với màu sắc ban đầu. Tùy thuộc vào loại vi khuẩn sử
dụng mà thời gian phát hiện nhanh hay chậm.
Nghiên cứu của David Sanz [23] sử dụng test Explorer (ZEULAB, Zaragoza,
Spain) ức chế vi khuẩn G. stearothermophilus để định tính các kháng sinh có mặt
trong các mẫu thịt. Trong test này, mỗi giếng sẽ chứa môi trường thạch aga và vi
khuẩn đích trong sự có mặt của chất chỉ thị pH. Khi test được ủ trong điều kiện
650C các bào tử sẽ phát triển sinh ra môi trường axit và làm đổi màu chất chỉ thị từ
xanh sang vàng. Khi mẫu có chứa các chất ức chế vi khuẩn (các kháng sinh chẳng
hạn) vi khuẩn sẽ không phát triển được do đó môi trường pH không thay đổi.
Nghiên cứu cũng sử dụng test Equinox (ZEULAB, Zaragoza, Spain) đặc hiệu đối
với kháng sinh nhóm quinolon trong nền mẫu thực phẩm. Khác với test Explorer,
11


test Equinox dựa vào sự ức chế phát triển của vi khuẩn E.Coli ATCC 11303. Chất
chỉ thị được sử dụng cho test này là chỉ thị oxy hóa khử. Nguyên tắc hoạt động của
test là khi ủ ở nhiệt độ 37°C các tế bào vi khuẩn sẽ tăng sinh làm thay đổi điện thế
khử của môi trường, nhờ đó chất chỉ thị sẽ chuyển màu (từ xanh sang nâu hoặc vàng
cam). Với những mẫu có chứa tồn dư kháng sinh nhóm quinolon lớn hơn giới hạn
phát hiện sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn E.Coli do đó màu của môi trường sẽ
không thay đổi
Phương pháp này đã được tác giả Godelieve Okerman và cộng sự sử dụng để
phân tích tồn dư của 10 quinolon trong các mẫu thịt gia cầm và cá: ERFX, DNFX,
marbofloxacin (MBFX), SRRFX, NRFX, flumequine (FMQ), oxolinic acid (OA),
nalidixic acid (NA), difloxacin (DFLX), ciprofloxacin (CPFX). Ba loại vi khuẩn
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus cereus ở hai điều kiện pH=6 và pH=8 đã

được khảo sát để lựa chọn điều kiện tối ưu cho từng quinolon. Kết quả cho thấy
FMQ và OA được phát hiện ở điều kiện pH=6 và CPFX, ERFX, DNFX, MBFX,
SRFX, NRFX cho kết quả tốt hơn ở pH=8. Ngoại trừ DFLX cho kết quả giới hạn
phát hiện tốt với vi khuẩn B. subtilis, 9 quinolon còn lại cho kết quả tốt với E.coli
[29].
Phương pháp vi sinh vật có ưu điểm đơn giản, rẻ, trang thiết bị đơn giản. Tuy
nhiên, thời gian kiểm tra thường kéo dài để vi khuẩn phát triển, dễ cho kết quả
dương tính giả, độ nhạy phụ thuộc vào điều kiện của chủng vi sinh vật sử dụng.
Phương pháp này có thể dùng để sàng lọc trước khi sử dụng các phương pháp khác.
1.3.3 Phương pháp hóa lý
1.3.3.1 Phương pháp điện hóa
Nhiều phương pháp điện hóa đã được sử dụng để xác định hàm lượng nhóm
quinolon trong các nền mẫu khác nhau đặc biệt trong các mẫu dược phẩm. Từ năm
1994, nghiên cứu của Corti và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật xung vi phân để xác
định NRFX, cinoxacin(CNFX), pipemidic acid, OA và piromidic acid trong huyết
tương, nước tiểu và dược phẩm. Phương pháp sử dụng kỹ thuật chiết quinolon từ

12


nền mẫu bằng acetonitrile (MeCN) và dung dịch natri hydroxyt 2M, đối với mẫu
nước tiểu cần quá trình làm sạch bằng kỹ thuật chiết pha rắn. Kết quả cho píc hấp
thụ rõ ràng, độ lặp lại, độ chính xác tốt [21].
Nghiên cứu của tác giả Ali A. sử dụng phương pháp von-ampe hòa tan hấp
phụ trên catốt sử dụng đồng (II) như một chất trung gian để xác định hàm lượng
ERFX cho thấy vị trí píc ở -0,3V trên điện cực giọt thủy treo, phương pháp không
chỉ cho phép xác định ERFX trong mẫu huyết tương mà còn trong cả các mẫu mô
sinh học, Cu (II) được sử dụng như là một chất trung gian để tạo phức trong đệm
amoni với loại thuốc này trước khi bị khử trên điện cực bằng kĩ thuật quét sóng
vuông [13].

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thủy sử dụng phương pháp
vol–ampe hòa tan hấp phụ trên điện cực giọt thủy ngân treo, kĩ thuật quét sóng
vuông để xác định CPFX trong các mẫu dược phẩm. Các điều kiện tối ưu đã được
xác định trên nền hệ đệm acetat 0,075M pH=3,8. Đường chuẩn xác định CPFX
trong khoảng nồng độ từ 0,01-0,22ppm với giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng cỡ ppb (LOD = 2,6ppb; LOQ=8,6ppb) [7].
1.3.3.2. Phương pháp trắc quang
Các quinolon xác định bằng phương pháp trắc quang cho khoảng tuyến tính
tuân theo định luật Lambert – Beer trong khoảng nồng độ khác nhau tùy thuộc chất
nghiên cứu. Do cấu trúc có chứa vòng quinolon nên các kháng sinh nhóm quinolon
có khả năng hấp thu trực tiếp tia sáng tại vùng bước sóng tử ngoại hoặc có thể tạo
phức màu với các tác nhân phù hợp.
Với ưu thế nhanh, đơn giản và sử dụng các trang thiết bị rẻ tiền phương pháp
trắc quang được sử dụng chủ yếu trong lĩnh vực dược phẩm để xác định các
quinolon ở hàm lượng lớn. Nghiên cứu mới đây của tác giả Edith Critina sử dụng
phương pháp đo trực tiếp độ hấp thu quang tại bước sóng 275nm để xác định hàm
lượng ciproxacin trong dung dịch thuốc nhỏ mắt. Khoảng tuyến tính của đường
chuẩn được xác định từ 2,0–7, µg/mL với độ lệch chuẩn tương đối trong khoảng từ
1,55 đến 2,47% (n=6) [25]. Cũng tương tự như nghiên cứu trên, tác giả Affo lại sử
dụng bước sóng hấp thu ở 326nm để xác định trực tiếp hàm lượng ciproxacin trong
13


dịch truyền cho độ tuyến tính tốt với khoảng xác định từ 0,002 – 0,012 mg/mL
[14]. Với levofloxacin tác giả Mahfuza tiến hành đo ở bước sóng 292nm trên nền
dung dịch nước:methanol(MeOH):MeCN (9:0.5:0.5) với khoảng tuyến tính từ 1,0–
12,0 μg/mL [43].
Ngoài phương pháp đo trực tiếp các nghiên cứu cũng sử dụng các chất tham
gia phản ứng tạo phức với các quinolon. Trong nghiên cứu của Samia Mostafa đã sử
dụng 3 tác nhân tạo phức khác nhau để xác định CPFX, ERFX và pefloxacin trong

các mẫu dược phẩm dạn tiêm và dạng uống bán trên thị trường. Với tác nhân tạo
phức chloranilic acid tạo phức với các quinolon xác định có bước sóng hấp thu cực
đại ở 520nm. Với tác nhân thứ hai là tetracyanoethylene, phức của ba quinolon trên
với tác nhân này tạo phức cho độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng =335nm đối
với CIP và =290nm đối với cả ERFX và pefloxacin. Tác nhân thứ ba là 2,3dichloro-5,6-dicyano-p-benzoquinon (DDQ), phức này cho độ hấp thụ quang cực
đại ở bước sóng  = 460nm. Với cả ba tác nhân trên, phương pháp đều cho độ chính
xác cao đạt trên 99% [44].
Nói chung các phương pháp trắc quang xác định hàm lượng quinolon chỉ
được sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm để xác định hàm lượng lớn, nền mẫu đơn
giản. Đối với các nền mẫu phức tạp như nền mẫu sinh học, thực phẩm với hàm
lượng chất xác định rất thấp phương pháp không đảm bảo độ đặc hiệu và giới hạn
phát hiện.
1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp này được D. Barrón áp dụng trong nghiên cứu với detector
DAD để phân tích FMQ và OA trong thịt gà trong đó NRFX được sử dụng làm chất
nội chuẩn cho quá trình xác định. Các điều kiện điện di gồm: dung dịch điện di là
dung dịch phosphoric acid 40mM điều chỉnh pH 8,02 bằng NaOH, thế điện di
18kV, nhiệt độ mao quản duy trì ở 250C, bước sóng phát hiện là 250nm. Phương
pháp có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho OA và FMQ tương ứng là 15
và 48ppb và 10 và 30ppb [17].

14


Thay detector PAD bằng detector MS, Francisco J. Lara sử dụng phương
pháp này để phân tích nhiều quinolon hơn: DNFX, SRFX, CPFX, MBFX, ERFX,
DFLX, OA và FMQ. Cột mao quản được sử dụng trong nghiên cứu có chiều dài
96cm, đường kính trong 50µm. Dung dịch điện di là dung dịch CH3COONH4
70mM điều chỉnh pH 9,1 bằng dung dịch NH4OH 5N. Nhiệt độ mao quản duy trì ở
250C và thế điện di là 25kV. Bước sóng phát hiện 275nm. Dòng mang là hỗn hợp

của 2-propanol : nước : formic acid (50:49:1,v/v). Các điều kiện khối phổ được tối
ưu hóa như sau: điện thế mao quản -4kV, áp lực khí phun 10psi, tốc độ khí làm khô
6L/phút, nhiệt độ khí làm khô 1500C [28].
1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng
Phương pháp phổ biến nhất được sử dụng trong việc xác định các kháng
sinh nói chung và kháng sinh nhóm quinolon nói riêng là phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao. Phương pháp dựa trên quá trình quá trình tách xảy ra trên cột
tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏngrắn, lỏng-lỏng). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi
tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và
pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích do cấu trúc phân tử của các chất khác
nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau chúng
di chuyển với tốc độ khác nhau nhờ đó tách ra khỏi nhau [11]. Các chất sau khi
được tách ra khỏi cột sắc ký tùy thuộc vào tính chất của chúng sẽ được phát hiện
trên các detector phù hợp.
Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC: đại lượng đặc trưng cho quá
trình tách sắc ký là thời gian lưu của các chất do vậy dựa vào thời gian lưu của chất
phân tích so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn ta có thể xác định sự có mặt của
chất trong mẫu phân tích (định tính). Ngoài ra do sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện
tích peak chất và nồng độ ta có thể so sánh với diện tích của dãy chất chuẩn để từ đó
xác định được hàm lượng chất phân tích có trong mẫu (định lượng).
Đối với các chất phân tích nhóm quinolon trong cấu trúc phân tử chứa vòng
thơm (vòng quinolon) với các liên kết bội do đó nó có khả năng hấp thụ tia UV (có

15


thể xác định bằng detector UV hoặc DAD, PAD), cũng nhờ vòng thơm này mà các
chất kháng sinh nhóm quinolon có khả năng phát huỳnh quang khi được kích thích
bằng tia sáng có bước sóng phù hợp (có thể xác định bằng detector huỳnh quang).
 Phương pháp HPLC sử dụng detector UV và DAD

Tương tự với phương pháp trắc quang, phương pháp HPLC với detector UV
hoặc DAD cũng lựa chọn bước sóng hấp thu cực đại của chất phân tích để đo trực
tiếp độ hấp thu quang. Tuy nhiên nhờ quá trình tách trên cột sắc ký nên tín hiệu chất
phân tích không bị ảnh hưởng tạp chất do đó độ nhạy và độ đặc hiệu đảm bảo cho
việc phân tích lượng vết các chất.
Nghiên cứu của Cliniqua khi tiến hành tối ưu hóa quá trình xác định hàm
lượng SPFX và ERFX trong sữa dê sử dụng detector DAD ở bước sóng 277nm.
Theo đó mẫu sữa được chiết bằng dung dịch đệm phosphate sau đó làm sạch bằng
cột chiết pha rắn C18 (SPE), CPFX và ERFX sẽ được tách trên cột sắc ký C14 với hệ
dung môi 0,05 M orthophosphoric acid (pH 3,4)–MeCN (87:13 v/v). Phương pháp
cho độ thu hồi đối với ERFX là 84% và CPFX là 88%. Giới hạn phát hiện đối với
cả 2 chất đạt 100ppb [18].
Đối với nền mẫu cá hồi Evaggelia đã chiết 7 kháng sinh nhóm quinolon
bằng dung dịch đệm citrate pH=4,7 kết hợp với rung siêu âm, dịch chiết sau đó
được làm sạch qua cột SPE. Quá trình xác định thực hiện trên HPLC DAD tại bước
sóng 275 nm đối với CPFX, DNFX, ERFX, SRFX và ở bước sóng 255nm đối với
OA, NA và FMQ. Thời gian tách tối ưu cho 7 chất là 25 phút cho hệ số phân giải
đối với các chất lớn hơn 1,5 khi sử dụng chương trình gradient cho hệ dung môi pha
động. Phương pháp cho độ thu hồi rất tốt đối với tất cả các chất trong khoảng từ 95–
101% [24].
Đối với nền mẫu thịt, các tác giả Hu Yu [30] (xác định 3 nhóm kháng sinh
quinolon, tetracyclin, sulfonamid) và ShutingWang [49] (xác định fluoroquinolon,
organophosphorus và N-methyl carbamates) đã thực hiện quá trình chiết sử dụng
chất hấp phụ C18 trộn với mẫu phân tích trong sự có mặt của sodium sulfat. Dung
môi n-hexan với thể tích phù hợp được sử dụng để loại chất béo ra khỏi nền mẫu.

16