Sơ đồ chiết cây lược vàng

PHẦN 1: TỔNG QUAN


PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu.
Mẫu thân và rễ cây Lược vàng (Callisa fragrans) được thu hái vào tháng ….
tại…….. Tên khoa học được TS. Nguyễn Văn Bách, Viện Sinh thái và tài nguyên
sinh vật giám định. Mẫu tiêu bản (CF) được lưu tại Phòng Hoạt chất sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. (hay tại trường?, lựa chọn).
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Hóa chất và dụng cụ.
- Hóa chất: Metanol, axeton, clorofom, n-hexan, etyl axetat, điclometan,
nước cất, v/v.
- Dụng cụ: Máy cất quay chân không, cốc thủy tinh, ống nghiệm, phễu thủy
tinh, bản mỏng silica gel, capilla, v/v.
2.2.1. Thu thập và xử lý mẫu.
 Thu thập mẫu:
Phương pháp thu thập mẫu thực vật tuân thủ theo các yêu cầu về thực vật
học để tiện cho lưu trữ, phân loại và giám định thực vật. Các mẫu đều có thông tin
về địa điểm, tên thông thường, sử dụng dân gian, bộ phận thu hái, ảnh mẫu, v/v.
Các mẫu thực vật thu được, được giám định tên và phân loài theo các tiêu
chuẩn phân loại thực vật.
Tạo tiêu bản mẫu: Các mẫu tiêu bản được lưu giữ trong kho bảo quản, để
đảm bảo mẫu không bị hỏng và mất tiêu bản, tiện cho việc tra cứu và tìm thông tin
sau này.
Lập lý lịch mẫu, gồm số thứ tự, họ, tên khoa học, lá, khối lượng khô, tỉnh,
xã, ngày thu, ghi chú.
 Phương pháp xử lý mẫu:


Mẫu thực vật được thái nhỏ, phơi khô, gắn ký hiệu và xay nhỏ, bảo quản

trong kho có máy hút ẩm ở 400C.
2.2.3. Phương pháp tạo dịch chiết.
 Chiết dung môi: Là phương pháp dùng một dung môi thích hợp hòa tan chất
cần tách thành một pha lỏng (gọi là dịch chiết) phân chia khỏi pha lỏng (hoặc
pha rắn) chứa hỗn hợp các chất còn lại. Tách lấy dịch chiết, giải phóng dung
môi sẽ thu được chất cần tách. Từ xa xưa, nhân dân ta đã biết dùng phương
pháp chiết, chẳng hạn ngâm thảo dược vào rược để sử dụng các hoạt chất tan
vào rược, ngâm lá cây chàm giã nhỏ trong nước để tách lấy phẩm chàm
nhuộm vải, v/v. Ngoài phương pháp ngâm chiết lạnh thông thường, trong
phòng thí nghiệm hiện nay hay sử dụng các dụng cụ hỗ trợ như Soxhlet để
tăng tính liên tục bằng dung môi nóng nhằm tiết kiệm thời gian và hiệu quả
của việc chiết.
Tạo dịch chiết phục vụ sàng lọc hoạt tính theo quy trình chiết mẫu thực vật
sau:


Tùy vào từng đối tượng và hướng nghiên cứu cụ thể mà nguyên liệu

chiết được dùng dùng ở dạng tươi hay khô. Mẫu thực vật thường được phơi khô
và sấy khô trước khi ngâm chiết.


Cân mẫu và xay mẫu.



Lựa chọn dung môi chiết mẫu. Ưu tiên sử dụng các loại không độc, có

hiệu suất chiết cao như cồn 96 oC, metanol, v/v.


Mẫu được chiết bằng dung môi lựa chọn trên thiết bị siêu âm

Powersonic (405, 220W) ở nhiệt độ 400C, thời gian 30 phút.


Dịch chiết được lọc qua giấy lọc (Whatman, d=240 nm, No. 1) gộp lại

và tiến hành cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40 0C, thu được cao
chiết.
 Sắc ký lớp mỏng:


Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký
được dùng để phân tích và so sánh các chất có trong hỗn hợp ở các mẫu thử.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất, thường
là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất
trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi
thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa
trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phổ biến hiện nay trong ngành khoa học
hóa, sinh, dược học với các nhiều mục đích khác nhau bởi tính ưu việt cũng như độ
nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ, nhanh, dễ dàng thực hiện. TLC dùng để phân
tích định tính, định lượng, độ tinh khiết của hợp chất và hỗ trợ sắc ký cột.
-Chuẩn bị mẫu phân tích: Hòa tan mẫu trong dung môi thích hợp (1mg/ml),
sau đó dùng capilla hút dịch mẫu bằng lực mao quản chuyển dung dich mẫu lên
trên chất hấp phụ ở vị trí của tuyến xuất phát.
-Dung môi khai triển: Các dung môi trong TLC đều được làm khan và chưng
cất lại khi sử dụng. Hệ dung môi được pha theo tỉ lệ phù hợp và được siêu âm (lắc)
cho đều trong bình triển khai, đậy nắp kín. Để yên đến khi dung môi trong bình ổn

định.
-Triển khai bản mỏng: Cắt bản mỏng với kích thước phù hợp, có hai tuyến
dung môi là tuyến trên và tuyến dưới. Dùng kẹp đưa bản mỏng đã chấm mẫu vào
bình sắc ký, đậy nắp và quan sát. Khi dung môi chạy đến tuyến dung môi trên, gắp
bản mỏng ra, không để dung môi chạy hết bản mỏng.
-Phát hiện vết chất trên bản mỏng: Chúng tôi sử dụng đèn tử ngoại có bước
sóng λ = 254 nm và λ= 360 nm, hoặc sử dụng thuốc thử.
-Đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị R f và ghi màu sắc các vệt chất.
Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá lượng chất trong mẫu, khả năng phân giải
của dung môi và khả năng phân tách sắc ký điều chế.


Hình : Mô tả Sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Viết một vài câu từ phần thực nghiệm của chị thảo


PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu mẫu tạo dịch chiết.
Dựa vào các các công trình nghiên cứu trước đây và các thí nghiệm thực tế,
chúng tôi ưu tiên lựa chọn dung môi cồn 96 oC, và nước, và phương pháp chiết
chiết nóng (chiết Soxhlet) [a, b]. Nguyên liệu thực vật sau khi thu hái được loại bỏ
phần hư hỏng, phơi khô và xay nhỏ. Dựa vào việc phân tích sắc ký lớp mỏng TLC
và đặc điểm hình thái thực vật, nhận biết và so sánh các chất có trong mẫu chiết
định hướng cho phép thử sinh học, (chèn hình TLC đã chấm lần trước vào đây) đối
tượng nghiên cứu cây Lược vàng (Callisa fragrans) được chia làm ba loại để tạo
các loại cao chiết: Lá (ký hiệu: CFL, phần trên mặt đất), Rễ (ký hiệu: CFR, phần
dưới mặt đất), Rễ Lá (ký hiệu: CFRL, dạng trộn). Dưới đây là quy trình cụ thể tạo
các loại cao chiết.
Quy trình tạo các loại cao chiết cây Lược vàng

Lá Callisa fragrans (2,0 kg) khô được xay nhỏ, đem chiết nóng (chiết
Soxhlet) với cồn 96 oC/10 lít trong 4 h. Dịch chiết cồn thu được (8 lít) được cô
quay dưới áp suất giảm thu được dịch chiết cồn dạng lỏng sánh. Dịch chiết này tiếp
tục được hòa với nước tỉ lệ 1:1, và chiết với etyl axetat, cô cất loại bỏ dung môi thu
được hai loại cao chiết tương ứng, cao etyl axetat (ký hiệu: CFL-EEt, 5.8545 g,
phần chứa chủ yếu các lớp chất không phân cực), cao chiết cồn nước (ký hiệu:
CFL-EW, 73.2244 g, phần chứa chủ yếu các hợp chất phân cực). Phần bã sau khi
chiết cồn, tiếp tục được đun với nước 5 lít, 3h, cô cất loại bỏ dung môi thu được
cao chiết nước (ký hiệu: CFL-W, 23.702 g).


Tương tự với trường hợp rễ cây Lược vàng, thu được các cao chiết tương
ứng cao etyl axetat (ký hiệu: CFR-EEt, 20.01 g), cao chiết cồn nước (ký hiệu: CFREW, 37.6464 g), và cao chiết nước (ký hiệu: CFR-W, 8.8479 g).
Cuối cùng, rễ khô (0.5 kg, phần dưới mặt đất) được trộn đều với lá khô (0.5
kg, phần trên mặt đất), lặp lại quá trình chiết như hai bộ phận trên thu được cao
chiết cồn của rễ và lá trộn lẫn (ký hiệu CFRL, 70 g). Sơ đồ từng quy trình chiết cụ
thể được nêu như trên hình vẽ.
CFL
(2kg bột khô)
Chiết Soxhlet
10 lít EtOH 960, 4 h

Bã sau khi chiết
Dịch chiết EtOH
(8 lít)

1, Đun H2O, 5 lít, 3h
2, Cô cất dung môi

Cô cất dung môi

CFL-W
23.702 g

Dịch chiết
Sau khi cô quay một phần
1, Thêm nước, 1:1
2, Chiết với EtOAc
EtOAc
CFL-EEt
5.8545 g

Sơ đồ 1: Quy trình tạo cao chiết lá cây Lược vàng Callisa fragrans

CFL-EW
73.2244 g


CFR
(1 kg bột khô)
Chiết Soxhlet
10 lít EtOH 960, 4 h

Bã sau khi chiết
Dịch chiết EtOH
(9 lít)

1, Đun H2O, (5 lít), 3h
2, Cô cất dung môi

Cô cất dung môi

CFR-W
8.8479 g

Dịch chiết
Sau khi cô quay một phần
1, Thêm nước, 1:1
2, Chiết với EtOAc
EtOAc

CFR-EEt
20.01 g

CFR-EW
37.6464 g

Sơ đồ 2: Quy trình tạo cao chiết rễ cây Lược vàng Callisa fragrans
CFRL
(0.5 kg lá + 0.5 kg rễ bột khô)
Chiết Soxhlet
10 lít EtOH 960, 4 h
Dịch chiết EtOH
(8 lit)
Cô cất dung môi
Cao chiết
(CFRL, 70 g)

Sơ đồ 3: Quy trình tạo cao chiết rễ lá cây Lược vàng Callisa fragrans

Nhận xét: Như vậy với việc chiết với các dung môi phân cực cồn và nước,
dung môi không phân cực etyl axetat các bộ phận khác nhau của cây Lược vàng,
chúng tôi đã tạo được 7 loại cao chiết khác nhau. Trong đó, cao chiết phần trên mặt
đất của cây thu được với hiệu suất cao hơn phần dưới mặt đất.


Tài liệu tham khảo
[a] Joash Ban Lee Tan, Wei Jin Yap, Shen Yeng Tan, Yan Yan Lim, Sui Mae Lee,
“Antioxidant content, antioxidant activity, antibacterial activity of five plants from
the Commelinaceae family”, Antioxidants, 2014, 3, 758-769.
[b] là tài liệu tham khảo bên viện dược liệu họ làm… chị viết vào
Lưu ý: lấy tài liệu [a] làm form để cho chị viết theo, Antioxidants là tên tạp chí.
Tất cả các chứng cứ khoa học đều phải có trích dẫn thì mới được đánh giá cao
KÝ HIỆU M TRONG SƠ ĐỒ ĐƯỢC ĐỔI LẠI LÀ E, ví dụ CFR-MEt ĐƯỢC
CHUYỂN THÀNH CFR-EEt.
PHẦN 1, PHẦN 2, PHẦN 3… ĐƯỢC VIẾT CÁCH, VÍ DỤ VIẾT HẾT PHẦN 1
MÀ VẪN CÒN KHOẢNG TRẮNG THỪA THÌ PHẦN 2 CŨNG KHÔNG ĐƯỢC
VIẾT LIỀN, SANG TRANG MỚI THÌ VĂN BẢN MỚI ĐẸP.