Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VŨ THANH TRÀ

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG CÓ KHẢ NĂNG
KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 70 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS. Chu Hoàng Mậu
2. TS. Trần Thị Phƣơng Liên

Thái Nguyên - 2012


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên. Các
số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả đã được công bố
riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này.

Tác giả

Vũ Thanh Trà


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và
TS. Trần Thị Phương Liên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong học tập,
nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải và các cán bộ
Phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS. Nguyễn
Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết và các cán bộ Bộ môn Miễn
dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN,
Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã
ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ
và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh.
Công trình được thực hiện và hoàn thành với việc sử dụng các trang
thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng
Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào
thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng
thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa
Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên).
Tác giả luận án

Vũ Thanh Trà

iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ................................................................................................... i
Lời cảm ơn ...................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................iii
Danh mục các từ viết tắt.................................................................................. v
Danh mục các bảng .........................................................................................vii
Danh mục các hình ..........................................................................................viii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4
1.1.

Cây đậu tương và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương .........................................
4

1.1.1. Cây đậu tương ..............................................................................................
4
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương .........................................................
5
1.2.

Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương ..................................
9

1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương .........................................................................
9
1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương...................................................
13

1.3.

Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương .........................
17

1.3.1. Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái ........................................................
17
1.3.2. Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học .................................................
18
1.3.3. Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA ................................................
20
1.4.

Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương ................................................
26

1.5.

Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương ..................................................
29

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U ..................33
2.1.

Vật liệu .........................................................................................................
33

2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh ...................................................
33
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................

37
2.1.3. Máy móc và thiết bị ......................................................................................
37
2.1.4. Mồi của phản ứng RAPD và SSR ................................................................
38
2.2.

Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................
40

2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo ..............................................................
40


iv

2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa sinh ...........................................................
43
2.2.3. Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA........................................
44
2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein ....................................................
48
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................53
3.1.

Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương
nghiên cứu .......................................................................................................
53

3.2.

Phân tí ch đặc điể̉m hóa sinh hạt của các giống đậu tương ên
nghi
cứu.... 58

3.2.1. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid trong các hạt của
các giống đậu tương nghiên cứu .....................................................................
58
3.2.2. Phân tích tính hàm lượng và thành phần amino acid trong hạt của
một số giống đậu tương ....................................................................................
61
3.3.

Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng
khác nhau với bệnh gỉ sắt ................................................................................
64

3.3.1. Phân tí ch tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân
tử RAPD..............................................................................................................................
64
3.3.2. Phân tí ch tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị
phân tử SSR
3.4.

..................................................................................................
70

Phân tích tính đa hình protein lá của một số giống đậu tương
phản ứng khác nhau vớ́i bệnh gỉ sắt ................................................................
76

3.4.1. Kết quả phân tích sự đa hình protein ở lá của một số giống đậu
tương bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE .........................................................
77
3.4.2. Phân tích các protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều ......................
79
3.4.3. Nghiên cứu tí nh đa hì nh protein của các giống đậu tương bằng kỹ
thuật điện di hai chiều ......................................................................................
90
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................99
1. Kết luận .......................................................................................................99
2. Đề nghị ........................................................................................................100
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN........101
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................102


v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
µl
2DE
AFLP

Microliter
Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều
Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các
phân đoạn được nhân bản
APS
Ammonium persulfate
AUDPC

Area Under Disease Progress Curve
Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh
AVRDC
Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát
triển rau màu Châu Á, Đài Loan
bp
Base pair - cặp bazơ
CHAPS
3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio]
cm
Centimeter
CTAB
Cetylmethylammonium bromide
DNA
Deoxyribonucleic acid - ADN
dNTPs
Deoxynucleotide Triphosphates
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamine tetra acetic acid
ESI-Q
Elecspray ionization Q Trap- Phương pháp khối phổ sử dụng tí nh
TRAP
năng bẫy ion kết hợp nguồn ion hóa bằng cách phun chùm điện tử
EtBr
Ethidium bromide
HPLC
High-performance liquid chromatography
-Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IAA
Indole-3-acetamide
IEF
Isoelectric Focusing – Phương pháp điện di theo điểm đẳng điện
IMA
Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria
INTSOY
International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu
tương Quốc tế, Hoa Kỳ
IPG
Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định
IRRI
International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc
tế, Philippin
Kb
Kilo base


vi

kDa
mA
MAS
ml
MS/MS
NST
OD
PCR
PEG
PIC

Kilo Dalton
MiliAmpe
Marker Assisted Selection -Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử
Mililiter
Mass spectrometry/ Mass spectrometry - Khối phổ liên tục
Nhiễm sắc thể
Optical Density- Mật độ quang học
Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase
Polyethylene glycol
Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình

PMSF
PR protein
QTL
R gen
R protein
RAPD

Phenylmethanesulphonylfluoride
Pathogenesis-related protein - Protein liên quan đến mầm gây bệnh.
Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng
Resistant gen – Gen kháng bệnh
Resistant protein - Protein khángbệnh
Random amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân
bản ngẫu nhiên
Restriction fragment length polymorphism - Đa hình về chiều dài
phân đoạn cắt hạn chế
Ribonucleic acid
Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống

Sodium dodecyl sulfate
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis - Điện di biến tính trên
gel polyacrylamide có SDS
Simple Sequence Repeat - Trình tự lặp lại đơn giản
Tris acetate EDTA
Trichloracetic acid
N,N,N‟,N‟ Tetramethylethylenediamine
Phương pháp phân nhóm
Volt – Vôn
Weight/volume - Khối lượng/thể tích

RFLP
RNA
SAR
SDS
SDSPAGE
SSR
TAE
TCA
TEMED
UPGMA
V
w/v


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu ....................................................

33
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD ...........................................................
38
Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR .......................................................
39
Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến ......................
46
Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide ......................................................................
49
Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt ..................................
53
Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipid trong hạt của 50 giống đậu tương ......................
59
Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giống đậu tương................................
63
Bảng 3.4. Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu
.........................
67
Bảng 3.5. Kết quả phân tí ch sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR
....................................
72
Bảng 3.6. Danh sách các protein của lá đậu tương giống ĐT 2000 được
nhận diện bằng phương pháp khối phổ ...........................................................
84
Bảng 3.7. Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm
và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh(ĐT12 và VMK)...................................
92
Bảng 3.8. Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau giữa thí
nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh ĐT12 và VMK .........................
93

Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh
gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) và giống
kháng (ĐT2000, CBU8325) .....................................................................
96
Bảng 3.10. Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm
với và giống kháng bệnh gỉ sắt .................................................................
97


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.

Trang
Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh
bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (B) ..............................................
10

Hình 1.2.

Hình ảnh nấm P. pachyrhizi gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương chụp
dưới kính hiển vi điện tử .................................................................................
12

Hình 1.3.

Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm .........................................
14

Hình 1.4.

Sơ đồ phân tách protein bằng diện di 2-DE ....................................................
19

Hình 2.1.

Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng
thí nghiệm .......................................................................................................
42

Hình 2.2.

Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry ............................
43

Hình 3.1.

Hình ảnh lá của các giống đậu tương ở 3 mức độ phản ứng
với bệnh gỉ sắt ..................................................................................................
57

Hình 3.2.

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 ..............................................
65

Hình 3.3.

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18 ...............................................
66

Hình 3.4.

Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương
đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân
nhóm UPGMA .................................................................................................
69

Hình 3.5.

Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C), Satt
005 (D) của 50 giống đậu tương ......................................................................
71

Hình 3.6.

Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản
ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR ..................................
74

Hình 3.7.

Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá
đậu tương VMK, CBU8325, ĐT12 và ĐT 2000 ............................................
78

Hình 3.8.

Hình ảnh điện di 2-DE so sánh mức độ biểu hiện protein lá đậu
tương giống ĐT2000 ở thời điểm 6 (A) ngày và 9 ngày (B) ...............................
79


ix

Hình 3.9.

So sánh sự đa dạng về protein lá đậu tương của các giống
ĐT12, ĐT2000, CBU8325 và VMK ...............................................................
81

Hình 3.10. Kết quả phân tích và nhận diện protein catalase bằng sắc ký khối phổ ...........................................................................................................
83
Hình 3.11. Sơ đồ phân nhóm chức năng protein lá đậu tương giống
ĐT2000 ............................................................................................................
89
Hình 3.12. So sánh đa dạng protein lá đậu tượng đối chứng và thí nghiệm
của 2 giống sau khi gây nhiễm bệnh9 ngày (ĐT12 và VMK) ..............................
91
Hình 3.13. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9
ngày của 2 giống nhiễm bệnh gỉ sắt (ĐT12, VMK) và 2
giống kháng bệnh gỉ sắt (ĐT2000 và CBU8325) ............................................
95


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....